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Neuroscience

설치류 뇌 샘플의 단일 세트에서 뇌졸중 후 뇌 부종, 경색 영역 및 혈액 뇌 장벽 고장 측정

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61309
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜은 설치류 뇌 샘플의 동일한 세트에서 허혈성 뇌 손상의 세 가지 가장 중요한 매개 변수를 측정하는 새로운 기술을 설명합니다. 하나의 뇌 샘플만 사용하는 것은 윤리적 및 경제적 비용 면에서 매우 유리합니다.

Abstract

전 세계적으로 사망률과 사망률의 가장 흔한 원인 중 하나는 허혈성 뇌졸중입니다. 역사적으로, 허혈성 뇌졸중을 자극하는 데 사용되는 동물 모델은 중간 뇌동맥 폐색(MCAO)을 포함한다. 경색 영역, 뇌 부종 및 혈액 뇌 장벽 (BBB) 고장은 MCAO 후 뇌 손상의 정도를 반영하는 매개 변수로 측정됩니다. 이 방법에 대한 중요한 제한은 이러한 측정이 일반적으로 다른 쥐 뇌 샘플에서 얻어져 적절한 샘플 크기에 대해 안락사해야 하는 많은 수의 쥐로 인해 윤리적 및 재정적 부담을 초래한다는 것입니다. 여기서 우리는 쥐 두뇌의 동일한 세트에서 경색 영역, 뇌 부종 및 BBB 투과성을 측정하여 MCAO 다음 뇌 손상을 정확하게 평가하는 방법을 제시합니다. 이 새로운 기술은 뇌졸중의 병리생리학을 평가하는 보다 효율적인 방법을 제공합니다.

Introduction

전 세계적으로 사망률과 사망률의 가장 흔한 원인 중 하나는 뇌졸중입니다. 전 세계적으로 허혈성 뇌졸중은 모든 뇌졸중 사례의 68%를 나타내며, 미국에서는 허혈성 뇌졸중이뇌졸중사례1,2의87%를 차지합니다. 미국의 뇌졸중 경제적 부담은 미국2억 4천만 달러, 유럽연합3에서450억 유로에 달하는 것으로 추산된다. 뇌졸중의 동물 모델은 병리 생리학을 연구하고, 평가를 위한 새로운 방법을 개발하고, 새로운 치료 옵션을 제안하기 위해 필요하다4.

허혈성 뇌졸중은 주요 뇌동맥의 폐색, 보통 중간 뇌동맥 또는 그 가지5중 하나를 다듬어 발생한다. 따라서, 허혈성 뇌졸중의 모델은 역사적으로 중뇌 동맥 폐색(MCAO)6, 7,8,9,10,11,12를포함하였다. MCAO에 이어, 신경상해는 2,3,5-triphenyltetrazolium 염화 (TTC) 염색 방법을 사용하여 광원 영역 (IZ)을 측정하여 가장 일반적으로 평가된다13,뇌 부종 (BE) 건조 또는 계산 반구체 볼륨을 사용하여14,15,16,및 혈액 뇌 장벽 (BBB) 천피법 기술을 사용하여19,19

전통적인 MCAO 방법은 세 가지 뇌 측정각각에 대해 별도의 뇌 세트를 사용합니다. 큰 샘플 크기의 경우, 이것은 윤리적 및 재정적 고려 사항과 함께 상당한 수의 안락사 동물을 초래합니다. 이러한 비용을 완화하는 다른 방법은 MCAO 이후 설치류 두뇌의 단일 세트에서 세 가지 매개 변수의 측정을 포함한다.

동일한 뇌 샘플에서 매개 변수의 조합을 측정하기 위해 이전 시도가 이루어졌습니다. 동시 면역형성 염색방법(20)뿐만 아니라 다른 분자 및 생화학적분석(21)은 TTC가 동일한 뇌 샘플에서 염색한 후 설명되었다. 우리는 이전에 뇌 부종을 평가하기 위해 뇌 반구 볼륨을 계산하고 같은 뇌 세트15에서광원 영역을 계산하기 위해 TTC 염색을 수행했다.

본 프로토콜에서는 동일한 설치류 뇌 세트에서 IZ, BE 및 BBB 투과성을 결정하여 허혈성 뇌 손상을 측정하는 수정된 MCAO 기술을 제시합니다. IZ는 TTC 염색에 의해 측정되고, BE는 반구체 부피를 계산하여 결정되고, BBB 투과성은분광법(19)에의해 얻어진다. 본 프로토콜에서, 우리는 내부 경동맥(ICA)에 모노필라멘트 카테터의 직접 삽입 및 고정을 기반으로 수정된 MCAO 모델을 사용하고, 중형 뇌동맥(MCA) (MCA)22로의혈류를 더욱 차단하였다. 이러한 수정방법은 기존의 MCAO방법(16,22)에비해 사망률과 이환율의 감소율을 나타낸다.

이 새로운 접근 법은 MCAO 후에 신경 상해를 측정하기 위한 재정적으로 건전하고 윤리적인 모형을 제공합니다. 허혈성 뇌 손상의 주요 매개 변수의이 평가는 포괄적으로 병리 생리학을 조사하는 데 도움이 될 것입니다.

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Protocol

헬싱키와 도쿄 선언의 권고와 유럽 공동체의 실험동물 사용 지침에 따라 다음과 같은 절차가 진행되었습니다. 실험은 또한 네게브의 벤 구리온 대학에 동물 관리 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 실험 절차를 위해 쥐를 준비

  1. 300에서 350 g 사이 각 무게는 과잉 병리학 없이 성인 남성 Sprague-Dawley 쥐를 선택합니다.
  2. 모든 쥐를 22°C의 실온에서 유지하며 실험 전에 12시간의 빛과 어두운 주기를 유지합니다.
  3. 음식과 물을 사용할 수 있는지 확인 합니다.
  4. 6:00 a.m 및 2:00 p.m 사이의 모든 절차를 수행합니다.

2. 수술을 위한 쥐 준비

  1. 이소플루란(in흡입은 4%, 유지보수2%)과 24%의 산소(1.5L/분)로 30분 동안 쥐를 마취시합니다.
    1. 그들은 페달 철수 반사가없는 보장하여 쥐의 마취 수준을 테스트합니다.
  2. 24 게이지 카테터를 꼬리 정맥에 삽입합니다.
    참고: 혈관 확장을 위한 꼬리 온난화는 수행되지 않습니다.
    1. 쥐를 테이블에 올려놓는 자세를 취합니다. 의료 용 테이프를 사용하여 쥐의 사지 네 마리를 모두 부착하십시오.
  3. 수술 전에 온도 측정을 위한 프로브를 쥐 직장에 놓습니다.
  4. 시술 중에, 37°C 코어 체온을 지지하기 위해 가열판을 유지한다.
  5. 보호를 위해 쥐의 눈에 연고를 넣습니다.
  6. 수술 부위를 면도하고 10% 포비도요오드의 3가지 응용 프로그램으로 소독한 다음 70%의 이소프로필 알코올을 사용한다.

3. 오른쪽 중위 뇌동맥 폐색

참고: MCAO는 이전에 설명된 바와 같이 수정된 기술에 의해 수행되며,16,22,23,맥게리 외 24 및 Uluç 외25에의해 기술된 계측기의 사용과 함께.

  1. 수술 핀셋과 곡선 블레이드가 있는 가위를 목의 복부 중간선에 피부와 피상적 인 근막으로 해부하십시오.
  2. ICA, 외부 경동맥(ECA) 및 일반적인 경동맥(CCA)으로 구성된 근육 삼각형을 식별합니다.
  3. 혈관 수술을 위한 마이크로포스프로 오른쪽 CCA와 ICA를 미주 신경과 조심스럽게 분리합니다.
  4. 올바른 CCA와 ICA를 노출합니다. 혈관 수술을 위한 마이크로 클립 또는 특수 지혈대를 사용하여 CCA에서 ICA에 오는 혈류를 차단합니다. 혈관 수술을 위한 현미경을 사용하여 ICA에 절개를 (약 1 mm)합니다.
  5. ICA를 통해 직접 모노필라멘트 카테터(4-0 나일론)를 삽입하고, 오른쪽 CCA의 분기점에서 약 18.5-19mm를 윌리스 원안으로 삽입하여 온화한 저항에 도달할 때까지MCA(26)를폐백한다.
  6. CCA의 분기 위의 ICA 주위에 리게이트.
  7. 샴 조작 제어 그룹의 경우 3.5 단계 및 3.616,22대신 나일론 스레드삽입을 수행하십시오.
  8. 관면 주입에 의해 염화 나트륨 0.9 %의 5 mL을 투여하십시오.
  9. 봉합사로 상처를 닫고 쥐를 회복 영역으로 가져 가라.
    참고 : 마취가 끝난 후 몇 분 후에 쥐가 깨어나 케이지 주위를 독립적으로 움직입니다.
  10. MCAO 후 23h에서, 식염수 (4 mL / kg)23,26 캐뉼라(27)를통해 두 수술 그룹에 대한 꼬리 정맥에 2 % 에반스 블루를 주입한다.
    참고: 이것은 혈액 뇌 투과성 추적자로 사용됩니다. 60분 동안 순환합니다.

4. 경색 지대 의 결정

  1. MCAO 후 24h에서 측정된 IZ는 이전에 설명 된 바와 같이9,15,18,19,26.
    참고: 체중의 20% 이상을 잃었거나 발작또는 헤미플기아를 개발한 쥐는 실험에서 제외됩니다.
  2. 쥐가 자발적으로 호흡을 중단할 때까지 영감 받은 가스 혼합물을 20%의 산소와 80%의 이산화탄소로 대체하여 쥐를 안락사시하십시오.
  3. 가위와 외과 용 집게를 사용하여 갈비뼈 아래복벽을 통해 5-6cm 측면 절개로 가슴을 엽니다.
  4. 가위와 외과 용 집게로 늑골 케이지의 전체 길이를 따라 횡격막 절개를 수행하십시오.
  5. 조심스럽게 폐를 대체하고, 갈비뼈를 통과하여 오른쪽과왼쪽면(28)의쇄골까지 잘라낸다.
  6. 심장의 왼쪽 심실을 통해 일반 식염수 200mL로 퍼퓨즈.
  7. 가위로 심장의 오른쪽 아트리움을 구멍을 뚫거나 절개하십시오.
  8. 기요틴을 사용하여 참수 작업을 수행하고 뇌 조직을 수집합니다.
  9. 홍채 가위를 사용하여, 양쪽에 후방 두개골 표면의 단면 가장자리에 포라멘 매그넘에서 잘라.
  10. 후각 전구, 복부 표면을 따라 신경 연결 및 두개골의 등대 표면을 뇌에서 분리합니다.
  11. 머리에서 뇌를 제거합니다.
  12. .009" 스테인리스 스틸, 코팅되지 않은 단일 엣지 면도날로 2mm 두께의 수평 단면을 만들어 6개의 뇌 슬라이스를 생성합니다.
  13. 0.05% TTC에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  14. 현미경 슬라이드에 뇌 조직을 배치하고 1600x1600 dpi의 해상도와 이 6 뇌 슬라이스의 광학 스캐닝을 수행 (예를 들어 보충 1 참조).
  15. 채널 믹서기능(이미지 > 조정 > 채널 믹서)을사용하여 사진 편집기(예: 어도비 포토샵 CS2)가 있는 파란색 필터를 추가하고 이미지를 JPEG 파일 형식으로 저장합니다.
    참고: 파란색 필터를 적용하면 이미지가 회색 으로 표시됩니다.
  16. ImageJ 1.37v29,30에서저장된 이미지를 엽니다.
    참고: 이 컴퓨터 프로그램은 임계값 함수를 사용하여 검은색 또는 흰색 픽셀을 격리하고 계산합니다(그림 1참조).
  17. 이미지의 6개의 뇌 슬라이스 각각에 대해 각 반구(오른쪽 부상 된 ipsilateral 및 손상되지 않은 위반)를 메인 메뉴에서 "다각형 선택"도구를 사용하여 별도의 이미지 파일로 선택하고 저장합니다.
  18. Image > Adjust > 임계값을선택하여 ImageJ 소프트웨어의 메인 메뉴에서 자동 임계값 함수를 사용하여 IZ를 결정하기 위한 컷오프를 설정하고 단일 뇌 세트의 각 반구의 픽셀 수를 측정합니다.
    참고: Macros는 ImageJ 소프트웨어의 이 단계에 사용할 수 있습니다(코드에 대한 보충 2 참조). 컷오프는 흰색으로 변환할 픽셀과 회색 음영에 따라 검은색으로 변환할 픽셀을 결정하는 중요한 매개 변수입니다(예: 보충 3보충 4 참조). ImageJ는 흰색과 검은색 픽셀을 비교하여 IZ를 결정합니다. 스테닝 프로토콜 및 스캐너 설정을 기반으로 0.220의 일정한 컷오프 값을 사용했습니다.
  19. Ipsilateral 및 콘트라탈 대뇌 반구 (RICH) 방법의 비율을 사용하여 조직 부종에 대한 IZ 보정의 측정을 수행 (보충 5의예 참조).
    Equation 1
    참고: 경색 크기는 반구의 백분율로 평가됩니다.

5. 뇌 부종의 결정31

참고: BE32,33의측정을 위해 ImageJ 1.37v를 사용합니다.

  1. MCAO 후 24h를 측정합니다. BE 계산의 경우 왼쪽 및 오른쪽 반구 볼륨(단위)의 데이터를 사용합니다.
  2. 1600x1600 dpi의 해상도로 광학 스캐닝을 수행합니다(예: 보충 1 참조).
  3. 뇌 반구를 선택하고 4.17-4.19 섹션에서 위에서 설명한 대로 ImageJ 1.37v로 BE를 결정하기 위한 컷오프를 설정합니다.
  4. 다음 방정식을 사용하여 RICH 방법에 의해 계산된 영향을 받지 않는 반구의 표준 영역의 백분율로 BE영역을 표현한다(예참조 5)23,34.
    Equation 2
    참고: BE의 범위는 반구의 백분율로 평가됩니다.

6. BBB 중단 결정

  1. MCAO 후 24시간 BBB 중단을 측정합니다.
  2. 좌우 반구를 6개의 조각으로 나누고 각각을 마이크로센심분리기 튜브에 넣습니다.
  3. 트리클로로아세산에서 뇌 조직의 각 조각을 균질화하여 50% 트리클로로아세산의 4mL에서 뇌 조직 1 g의 계산에 기초하여 균질화한다.
  4. 원심분리기 10,000 x g에서 20분 동안.
  5. 96% 에탄올로 상피 액체 1:3을 희석합니다.
  6. 분광광광광원측정을 활용하여 발광 분광성 측정을 수행하고, 플레이트를 설치하고, 다음 매개 변수를 사용하여 샘플 판독을 수행합니다: 620 nm(대역폭 10 nm)의 형광 강도 흥분 파장 및 680 nm(대역폭 10 nm)23,35; 모드 상단; 숫자 살 25; 수동 100; 1 초, 1 mm를 흔들어.
    참고: 620nm(대역폭 10nm)의 내분 파장과 680nm(대역폭 10nm)의 방출 파장을 사용합니다. 23,35

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Representative Results

비원지 측정

독립적인 견본 t-시험은 16개의 sham-작동 한 쥐에 비해 뇌 경색 볼륨의 상당한 증가를 입증 했다 19 쥐 표시 (MCAO=7.49% ± 3.57 대 샴 = 0.31% ± 1.9, t(28.49) = 7.56, p lt&01 (그림). 데이터는 SD에 ± 반대 반구의 평균 백분율로 표현됩니다.

뇌 부종 측정

독립적인 샘플 t-test는 영구 MCAO를 받은 19마리의 쥐가 16마리의 sham 조작 쥐(MCAO=12.31%± 8.6% ± 샴 = 0.64% ± 10.2, t(29.37) = 3.61, p.2=0.2(0.0)에 비해 24시간 후 뇌 부종의 정도가 현저한 증가를 보였다고 밝혔다. 데이터는 SD에 ± 반대 반구의 평균 백분율로 표현됩니다.

혈액 뇌 장벽 투과성

독립적인 견본 t-시험은 영구 MCAO를 겪은 19마리의 쥐가 16개의 sham-조작 쥐에 비해 24시간 후에 BBB 고장의 정도에 있는 중요한 증가를 보여주었다는 것을 표시했습니다 (MCAO= 2235 ng/g ± 1101 대 샴 = 94 ng/g ± 36, t(18.05 = 8.47 p&2C). 데이터는 뇌 조직의 ng/g에서 측정되고 평균 ± SD로 제시됩니다.

그룹 시간 절차
샴 작동 (16 쥐) 0 MCAO의 유도 및 가짜 운영 그룹에 대한 필라멘트의 삽입
MCAO (쥐 19개)
샴 작동 (16 쥐) 23시간 에반스 블루의 주입
MCAO (쥐 19개)
샴 작동 (16 쥐) 24시간 IZ, BE 및 BBB 중단 측정을 위한 뇌 수집
MCAO (쥐 19개)

표 1: 프로토콜 타임라인입니다. MCAO 후 23 h에서 에반스 블루 솔루션이 주입되었습니다. 한 시간 후 (MCAO 후 24 시간), 뇌 수집이 수행되었고, IZ, BE 및 BBB 투과성을 모든 그룹에서 측정했다.

Figure 1
그림 1: 가짜 조작 및 MCAO 쥐의 대표적인 뇌 조각.
(A-B) 원본 스캔 이미지. (C-D) 그레이스케일로 변환합니다. (E-G) 임계값 함수입니다. (G-H) 파란색 필터의 적용. (I-J) 파란색 필터 응용 프로그램 후 임계값 함수입니다. (K-L) 임계값 함수를 사용하여 뇌 부종을 평가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: MCAO 쥐의 조직학적 결과 가짜 조작 쥐에 비해.
(A)경색 영역. MCAO 후 19마리의 쥐에서 의한 경포지대 부피는 수술 후 24시간 동안 16마리의 토끼 수술쥐에 비해 현저히 증가하였다(*p&01). (B)뇌 부종. MCAO 후 19마리의 쥐에서 뇌 부종 부피가 수술 후 24시간 동안 16마리의 토끼 수술쥐에 비해 현저히 증가하였다(*p&01). (C)혈액 뇌 장벽 투과성. MCAO 후 19 마리의 쥐에서 혈액 뇌 장벽 투과성이 수술 후 24 h인 16 개의 sham 수술 쥐에 비해 현저히 증가했습니다 (*p & 0.01). 값은 SD± 반구의 평균 백분율로 표현되었고 독립적 인 샘플 t-test에 따라 SD± 뇌 조직의 ng /g에서 에반스 블루 사치 지수를 의미합니다. 결과는 p< 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었으며, p&01일 때 매우 유의했습니다. 이 그림은 Kuts 외.23에서수정되었습니다.

보충 1: 뇌 슬라이스의 예제 스캔. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 2: 자동 임계값 기능 및 측정 픽셀에 대 한 ImageJ 소프트웨어에서 사용할 수 있는 매크로. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 3: 예제 자동 임계값. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 4: 각 반구에서 측정된 픽셀의 예입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 5: 샘플 분석. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

현재 프로토콜의 주요 목표는 허혈성 상해의 세 가지 주요 매개 변수인 IZ, BE 및 BBB 투과성에 대한 일관된 측정을 입증하는 것이었습니다. 이 분야의 이전 연구는 동일한 샘플에서 이러한 매개 변수 중 하나 또는 두 개의 매개 변수를 함께 수행 할 가능성을 입증했습니다. 이 3부법이 제공하는 비용 절감 외에도, 또한 수술해야 하는 동물의 수를 제한하고 이후에 안락사해야 하는 보다 바람직한 생물학적 모델을 제공한다. 모든 조직학적 기술에서와 마찬가지로, 이 방법은 허혈성 손상을 동적으로 관찰할 수 없다는 것에 의해 제한됩니다.

이미지 분석에는 ImageJ 1.37v, 어도비 포토샵 CS2, 마이크로소프트 엑셀 365, IBM SPSS 통계 22의 네 가지 컴퓨터 프로그램이 사용되었습니다. ImageJ는 경색 영역과 뇌 부종의 확장을 측정하는 데 사용되었습니다. 어도비 포토샵은 파란색이 BBB 고장을 나타내기 때문에 에반스 블루가 뇌 조직에 미치는 영향을 제한하는 데 사용되었습니다. 경피 영역을 계산하기 전에 색상이 경색 영역의 정확한 측정을 허용하지 않기 때문에 이미지에서 파란색을 제거해야합니다 (그림 1B, 1D, 1F참조). Excel 및 SPSS는 데이터 처리에 사용되었습니다.

ImageJ 컴퓨터 소프트웨어로 경색 영역을 평가하는 기술은 건강한 반구의 흑백 픽셀과 멀리 있는 반구의 픽셀을 비교하는 것입니다. 광반구에서 광원 영역은 TTC로 얼룩지지 않습니다. 따라서 측정된 도 1B의 흰색 영역으로 표시됩니다. 프로그램이 경피 영역을 올바르게 계산하려면 픽셀을 회색 색상의 다양한 강도의 음영으로 변환할 필요가 있습니다(그림 1F, 1J참조). 에반스 블루(그림 1B참조)로 인해 발생하는 파란색은 경색 영역의 평가에 영향을 줄 수 있습니다(그림 1F참조). 따라서 첫 번째 단계는 파란색 필터를 사용하여 파란색을 제거한 다음 이미지를 흑백 이미지로 변환하는 것입니다(그림 1J참조). 우리는 어도비 포토샵을 사용하지만, 다른 컴퓨터 프로그램은 RawTherapee포터블과 같은이 목적을 위해 사용할 수 있습니다.

그런 다음 측정 절차를 표준화하기 위해 ImageJ를 사용하여 설정된 뇌의 6개 슬라이스 에서 경색 영역을 계산하기 위한 균일한 매개변수를 설정했습니다. 각 세트의 모든 6개 슬라이스가 동일한 조건에서 염색되고 스캔되어 통합된 차단 매개 변수가 필요하기 때문에 필요합니다. 컷오프는 흰색으로 변환할 픽셀과 회색 음영에 따라 검은색으로 변환할 픽셀을 결정하는 데 중요한 매개 변수입니다(그림 1D, 1H참조). 우리는이 목적을 위해 메인 메뉴에서 임계 값 함수를 사용했다. 이미지 분석의 마지막 단계는 경색 영역과 뇌 부종의 계산이었습니다.

광원 영역 측정은 계산된토모그래프(36),양전자 방출 단층 촬영 및 자기 공명영상(23,36)과같은 조직학적 염색 또는 방사선 기술 등 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. 실험실에서의 이전 연구는 TTC15,26로염색을 사용하여 경피량의 평가를 입증했다. 이 방법은 뉴런의 TTC와 미토콘드리아 탈수소 효소 사이의 화학 반응을 기반으로합니다. 탈수소효소가 풍부한 건강한 조직은 이 얼룩으로 빨간색으로 착색됩니다. 그러나, 괴사 세포에서, 이러한 색 변화는 유기화합물(37)의산화에 참여하는 시스템의 손상으로 인해 발생하지 않는다. 우리의 이전 연구에서, 우리는이 조직 학적 기술과이 영역의 뇌 이미지 스캔결과 사이의 높은 상관 관계를 입증23.

대뇌 부종의 측정은 생체 내 및 체외 모두에서 평가될 수 있습니다. 대뇌 부종은 나트륨과 칼슘 이온 채널 및 수송기의 활동의 병리학적 변화로 인해 세포내수38,39,40,41의증가로 이어진다. 또는, 붓기는 세포외 수를 증가 BBB 손상에 의해 발생할 수 있습니다. 42 이전 연구에서는, 뇌부종은 습식 및 건식 기술에 기초하여 결정되었고, 그 다음에 는 조직 수분함량(43)의계산에 선행되었다. 이 프로토콜에 존재하는 방법의 장점은 다른 기존기술(23,44,45)과비교하여 단순함과 정확도입니다.

BBB 고장 검출을 위한 가장 유용한 방법은 에반스 블루 주입 후에 발광 분광기입니다. BBB 투과성의 측정은 알부민에 결합 에반스 블루의 주입을 기반으로합니다. 차례로, 알부민의 분자 질량은 66 kDa이며 에반스 블루 961 Da의 분자량보다 훨씬 더 중요하다. 따라서, BBB 투과성의 측정은 손상된 BBB를 통해 관통하는 알부민의 분자 질량에 의해 정확하게 결정되어 에반스 블루를 전달한다. 위에서 설명한 기술 외에도, 다른 기술, 특히 다양한 덱스트랜스와 방사성 분자의 조합에 기초하여 더 정확한 결과를 제공합니다. 발광 분광법에 의한 BBB 고장 측정은 더 정확하지만 더 비싼 기술에 비해 더 저렴하고 사용하기 쉽습니다. 우리는 경포지대 및 뇌 부종의 측정과 함께 BBB 중단의 평가를 위해이 방법을 사용했습니다. MCAO의 유도 전에 BBB 투과성 평가를 위한 에반스 블루의 주입은 이들 두파라미터(23)를측정하는 정확도에 영향을 미치지 않는다.

본 프로토콜은 동일한 뇌 샘플에서 허혈성 뇌 손상의 가장 중요한 결정요인 3가지를 측정하는 새로운 기술을 제시합니다. 이 방법은 다른 뇌 손상의 모델에도 적용 될 수있다. 이 프로토콜은 허혈성 상해의 병리생리학의 연구 결과에 기여할 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 메리나 쿠체리아바, 막심 크리보노소프, 다리나 야쿠멘코, 에브게니아 곤차릭 생리학과, 생물학 학부, 생태학 및 의학, 올레스 혼차르, 드니프로 대학, 드니프로, 우크라이나 에 대한 지원과 우리의 토론에 도움이 기여에 감사드립니다. 수집된 데이터는 루슬란 쿠츠 박사 학위 학위 의 일부입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
SPSS Statistics 22 IBM
Office 365 ProPlus Microsoft - Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017

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References

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신경 과학 문제 164 혈액 뇌 장벽 (BBB) 중단 뇌 부종 경색 영역 허혈성 뇌졸중 중간 뇌 동맥 폐색 (MCAO) 쥐 모델
설치류 뇌 샘플의 단일 세트에서 뇌졸중 후 뇌 부종, 경색 영역 및 혈액 뇌 장벽 고장 측정
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Frank, D., Gruenbaum, B. F.,More

Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).

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