Summary
Этот протокол описывает новый метод измерения трех наиболее важных параметров ишемической черепно-мозговой травмы на том же наборе образцов мозга грызунов. Использование только одного образца мозга является весьма выгодным с точки зрения этических и экономических издержек.
Abstract
Одной из наиболее распространенных причин заболеваемости и смертности во всем мире является ишемический инсульт. Исторически сложилось так, что животное модель, используемая для стимулирования ишемического инсульта включает в себя окклюзию средней мозговой артерии (MCAO). Зона инфаркта, отек мозга и распад гемо-мозгового барьера (BBB) измеряются как параметры, отражающие степень черепно-мозговой травмы после MCAO. Существенным ограничением этого метода является то, что эти измерения, как правило, получены в различных образцах мозга крыс, что приводит к этическим и финансовым бременем из-за большого количества крыс, которые должны быть усыпляются для соответствующего размера выборки. Здесь мы представляем метод точной оценки черепно-мозговой травмы после MCAO путем измерения зоны инфаркта, отек мозга и BBB проницаемости в том же наборе крыс мозга. Этот новый метод обеспечивает более эффективный способ оценки патофизиологии инсульта.
Introduction
Одной из наиболее распространенных причин заболеваемости и смертности во всем мире является инсульт. Во всем мире ишемический инсульт составляет 68% всех случаев инсульта, в то время как в Соединенных Штатах ишемический инсульт составляет 87% случаевинсульта 1,2. Подсчитано, что экономическое бремя инсульта достигает $ 34 млрд вСоединенных Штатах 2 и 45 млрд евро в Европейском союзе3. Модели инсульта животных необходимы для изучения его патофизиологии, разработки новых методов оценки и предложить новые терапевтическиеварианты 4.
Ишемический инсульт происходит при окклюзии основной мозговой артерии, обычно средней мозговой артерии или одной из ее ветвей5. Так, в моделях ишемического инсульта исторически задействованы окклюзия средней мозговой артерии(MCAO) 6,7,8,9,10,11,12. Вслед за MCAO, неврологические травмы чаще всего оценивается путем измерения зоны инфаркта (ИЗ) с использованием 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (TTC)окрашивания метод 13, отек мозга (BE) с помощью сушки или расчета объемов полушария14 , 15,16,игемовогомозга барьер (BBB) проницаемость по технике спектрометрии с использованием Эванс синийокрашивания 17,18,19.
Традиционный метод MCAO использует отдельные наборы мозгов для каждого из трех измерений мозга. Для большого размера выборки, это приводит к значительному числу усыпляемых животных, с дополнительными этическими и финансовыми соображениями. Альтернативный метод для облегчения этих расходов будет включать измерения всех трех параметров в одном наборе мозгов грызунов после MCAO.
Предыдущие попытки были сделаны для измерения комбинаций параметров в том же образце мозга. Одновременно иммунофторесцентныеметоды окрашивания 20, а также другиемолекулярно-биохимические анализы 21 были описаны после окрашивания ТТК в том же образце мозга. Ранее мы вычислили объемы полушария мозга для оценки отеков мозга и выполнили Окрашивание ТТК для расчета зоны инфаркта в том же наборемозга 15.
В настоящем протоколе мы представляем модифицированный метод MCAO, который измеряет ишемическую черепно-мозговую травму путем определения проницаемости ИК, BE и BBB в том же наборе мозгов грызунов. Я измеряется TTC окрашивания, BE определяется путем расчета объема полушария, и BBB проницаемость получена методами спектрометрии19. В этом протоколе мы использовали модифицированную модель MCAO, основанную на прямой вставке и фиксации монофильтрного катетера во внутреннюю соонную артерию (ICA) и дальнейшем блокировании притока крови к средней мозговой артерии (MCA)22. Этот модифицированный метод показывает снижение уровня смертности и заболеваемости по сравнению с традиционным методомMCAO 16,22.
Этот новый подход обеспечивает финансово-звуковую и этическую модель для измерения неврологических травм после MCAO. Такая оценка основных параметров ишемической черепно-мозговой травмы поможет всесторонне исследовать ее патофизиологию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующие процедуры были проведены в соответствии с рекомендациями Хельсинкской и Токийской деклараций и Руководящих принципов использования экспериментальных животных Европейского сообщества. Эксперименты были также одобрены Комитетом по уходу за животными в Университете Бен-Гуриона в Негеве.
1. Подготовка крыс к экспериментальной процедуре
- Выберите взрослых самцов крыс Спраг-Доули без явной патологии, каждая весом от 300 до 350 г.
- Поддерживайте всех крыс при комнатной температуре при температуре 22 градусов по Цельсию, с 12 часами световых и темных циклов перед экспериментом.
- Убедитесь, что пища и вода доступны объявление libitum.
- Выполните все процедуры с 6:00 .m до 14:00 .m.
2. Подготовка крыс к операции
- Обезболивать крыс в течение 30 мин с изофлураном (4% для индукции и 2% для обслуживания) и 24% кислорода (1,5 л/мин).
- Проверьте уровень анестезии у крыс, гарантируя, что они не имеют педаль вывода рефлекс.
- Вставьте катетер 24-го калибра в хвостовую вену.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хвост потепление для вазодилатации не выполняется.- Поместите крыс на стол в положении лежа. Используйте медицинскую ленту, чтобы прикрепить все четыре конечности крыс.
- Поместите зонд для измерения температуры в прямую кишку крысы перед операцией.
- Во время процедуры, поддерживать нагревательной пластины для поддержки температуры тела 37 градусов по Цельсию.
- Добавить мазь в обоих глазах крысы для защиты.
- Бритье хирургической области и дезинфицировать с тремя приложениями 10% povidone-йода следуют 70% изопропилового спирта.
3. Правая сторона средней мозговой артерии окклюзии
ПРИМЕЧАНИЕ: MCAO выполняется по модифицированной технике,как описано ранее 16,22,23, с использованием инструментов, описанных McGarry et al.24 и Ulu' et al.25.
- Рассекают кожу и поверхностную фасцию на брюшной средней линии шеи хирургическим пинцетом и ножницами с изогнутыми лезвиями.
- Определите мышечный треугольник, состоящий из ICA, внешней сонной артерии (ЭКА) и общей сонной артерии (CCA).
- Тщательно отделяйте правые CCA и ICA от блуждающего нерва с микросилами для сосудистой хирургии.
- Разоблачить право CCA и ICA. Блокируйте приток крови, поступающий из CCA в ICA, используя либо микро-клипы или специальные турникеты для сосудистой хирургии. Сделайте разрез (примерно 1 мм) на ICA с помощью микросхем для сосудистой хирургии.
- Вставьте монофильтрный катетер (4-0 нейлона) непосредственно через ICA, около 18,5-19 мм от точки бифуркации правой CCA в круг Уиллиса до достижения легкого сопротивления, чтобы окквил MCA26.
- Ligate вокруг ICA над bifurcation CCA.
- Для фиктивной контрольной группы выполните вставку нейлонового потока вместо шагов 3.5 и 3.616,22.
- Администрирование 5 мл 0,9% хлорида натрия путем внутриперитонеальной инъекции.
- Закройте рану швом и возьмите крысу в зону восстановления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через несколько минут после окончания анестезии, крыса проснется и двигаться самостоятельно вокруг клетки. - На 23 ч после MCAO, вводить 2% Эванс синий в солевой раствор (4мл/кг) 23,26 в хвостовую вену для обеих эксплуатируемых групп через канюлю27.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это используется в качестве кровевидного проницаемости трассировщика. Разрешить циркулировать в течение 60 минут.
4. Определение зоны инфаркта
- Измерьте ИК на 24 ч после MCAO,как описаноранее 9,15,18,19,26.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы, которые потеряли более 20% своего веса или развитых судорог или гемиплегии исключены из эксперимента. - Euthanize крысы, заменив вдохновил газовой смеси с 20% кислорода и 80% углекислого газа, пока крыса перестает дышать спонтанно.
- Откройте грудь с 5-6 см боковой разрез через брюшную стенку под грудной клеткой с помощью ножниц и хирургических типсов.
- Выполните диафрагматический разрез по всей длине грудной клетки с ножницами и хирургическими миппами.
- Тщательно вытесняя легкие, прорезать грудную клетку до ключицы справа и слева28.
- Перелив с 200 мл нормального солевого раствора через левый желудочек сердца.
- Прокол или резвиться правого атриума сердца с ножницами.
- Выполните обезглавливание с помощью гильотины и собирать ткани мозга.
- Используя ножницы радужной оболочки глаза, вырезать из foramen magnum к дистальной кромке задней поверхности черепа с обеих сторон.
- Отделить обонятельные луковицы, нервные соединения вдоль брюшной поверхности и спинной поверхности черепа от мозга.
- Удалите мозг из головы.
- Производить 6 ломтиков мозга, создавая 2 мм толщиной горизонтальные секции с 0,009 "нержавеющей стали, без покрытия, один край лезвие бритвы.
- Инкубация в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию в 0,05% TTC.
- Поместите ткани мозга на слайды микроскопа и выполните оптическое сканирование этих 6 ломтиков мозга с разрешением 1600x1600 dpi (см. дополнение 1, например).
- Добавьте синий фильтр с фоторедактором (например, Adobe Photoshop CS2) с помощью функции Channel Mixer (изображение и настройкии функции Channel Mixer)и сохраните изображение в формате файла JPEG.
ПРИМЕЧАНИЕ: После применения синего фильтра изображение будет отображаться в сером масштабе. - Откройте сохраненное изображение в ImageJ 1.37v29,30.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта компьютерная программа использует пороговую функцию для изоляции и расчета пикселей, которые являются черными или белыми (см. рисунок 1). - Для каждого из 6 ломтиков мозга изображения, выберите и сохраните каждое полушарие (правый раненый ипсилатеральный и левый невредимым контралатеральный) в качестве отдельного файла изображения с использованием инструмента "полигон выбор" из основного меню.
- Установите отсею для определения ИК с помощью функции автоматического порога из основного меню программного обеспечения ImageJ, выбрав изображение и отрегулируйте пороговое значение иизмерьте количество пикселей в каждом полушарии одного набора мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Макрос может быть использован для этого шага в программном обеспечении ImageJ (см. Дополнение 2 для кода). Отрезание является критическим параметром для определения того, какие пиксели преобразовать в белый, а какие преобразовать в черный в зависимости от оттенка серого (см. Дополнение 3 и дополнение 4 в качестве примеров). ImageJ затем сравнивает белые и черные пиксели, чтобы определить ИК. Основываясь на протоколе окрашивания и настройках сканера, мы использовали постоянное значение выреза 0.220. - Выполните измерение коррекции ИК для отеков тканей с помощью соотношения ипсилатеральных и контралатеральных полушарий головного мозга (RICH)метод 13,23 (см. пример в дополнение 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер инфаркта оценивается как процент от контралатерального полушария.
5. Определение отека мозга31
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ImageJ 1.37v для измерения BE32,33.
- Мера BE 24 h после MCAO. Для расчета BE используйте данные из объема левого и правого полушария (в единицах).
- Выполните оптическое сканирование с разрешением 1600x1600 dpi (см. дополнение 1, например).
- Выберите полушария мозга и установите отрезание для определения BE с ImageJ 1.37v, как описано выше в разделах 4.17-4.19.
- Выразите область BE в процентах от стандартных областей незатронутого контралатерального полушария, рассчитанного методом RICH с использованием следующего уравнения (см. пример в дополнении 5)23,34.
ПРИМЕЧАНИЕ: Степень BE оценивается как процент от контралатерального полушария.
6. Определение нарушения BBB
- Мера BBB нарушения 24 ч после MCAO.
- Разделите правое и левое полушария на шесть ломтиков и положите каждое из них в микроцентрифугную трубку.
- Гомогенизировать каждый кусочек ткани мозга в трихлороатетической кислоте, основываясь на расчете 1 г ткани мозга в 4 мл 50% трихлороактической кислоты.
- Центрифуга при 10 000 х г в течение 20 мин.
- Разбавить супернатант жидкость 1:3 с 96% этанола.
- Выполните спектрофотометрию люминесценции, используя программное обеспечение спектрофотометрии, устанавливая пластину и выполняя показания образца, используя следующие параметры: Флуоресцентная интенсивность возбуждения длины волны 620 нм (ширина 10 нм) и длина волны выбросов 680 нм (ширина 10нм) 23,35; Мод сверху; Номер Плоть 25; Руководство 100; Встряхивание 1 сек, 1 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте восклицательный длина волны 620 нм (ширина 10 нм) и длину волны выбросов 680 нм (ширина 10 нм). 23,35
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Измерение инфарктной зоны
Независимый образец t-test показал, что 19 крыс, которые прошли постоянный MCAO продемонстрировали значительное увеличение объема инфаркта мозга по сравнению с 16 фиктивных крыс (MCAO 7,49% ± 3,57 против. Шам - 0,31% ± 1,9, т(28,49) - 7,56, р-н; 0,01 (см. рисунок 2А)). Данные выражаются как средний процент контралатерального полушария ± SD.
Измерение отеков мозга
Независимый образец t-test показал, что 19 крыс, которые прошли постоянный MCAO продемонстрировали значительное увеличение степени отека мозга после 24 ч по сравнению с 16 фиктивных крыс (MCAO -12,31% ± 8,6 против. Шам - 0,64% ± 10,2, т(29,37) - 3,61, р - 0,01, д - 1,23 (см. рисунок 2B).). Данные выражаются как средний процент контралатерального полушария ± SD.
Проницаемость геммоградного барьера
Независимый образец t-test показал, что 19 крыс, которые прошли постоянный MCAO продемонстрировали значительное увеличение степени распада BBB после 24 ч по сравнению с 16 фиктивных крыс (MCAO-2235 нг/г ± 1101 против. Шам No 94 нг/г ± 36, т(18,05) и 8,47 п.л.; 0,01, д 2,7 (см. рисунок 2С)). Данные измеряются в нг/г ткани мозга и представляются как среднее ± SD.
| Группы | Время | Процедуры |
| Шам работает (16 крыс) | 0 | Индукция MCAO и вставка нити для фиктивной группы |
| МКАО (19 крыс) | ||
| Шам работает (16 крыс) | 23ч | Инъекция Эванс синий |
| МКАО (19 крыс) | ||
| Шам работает (16 крыс) | 24ч | Сбор мозгов для измерений нарушения из-под ИЕ, BE и BBB |
| МКАО (19 крыс) |
Таблица 1: Хронология протокола. На 23 ч после MCAO, Эванс синий раствор был введен. Через час (24 ч после MCAO) был проведен сбор мозгов, и во всех группах были измерены проницаемость ИК, BE и BBB.
Рисунок 1: Представитель мозга ломтиками фиктивных и MCAO крыс.
(A-B) Оригинальное отсканированное изображение. (C-D) Преобразование в серый масштаб. (E-G) Функция порога. (G-H) Применение синего фильтра. (I-J) Функция порога после применения синего фильтра. (K-L) Использование пороговой функции для оценки отеков мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Гистологические результаты КРЫС MCAO по сравнению с фиктивными крысами.
(A)Зона инфаркта. Объем инфаркта в 19 крыс после MCAO был значительно увеличен по сравнению с 16 фиктивных крыс 24 ч после операции (0,01). (B)Отек мозга. Объем отеков мозга у 19 крыс после того, как MCAO был значительно увеличен по сравнению с 16 фиктивными крысами 24 ч после операции (0,01). (C)Проницаемость гемового мозга. Проницаемость геммозефалический барьер у 19 крыс после MCAO был значительно увеличен по сравнению с 16 фиктивных крыс 24 ч после операции (0,01). Значения были выражены как средний процент контралатерального полушария ± SD и средний Эванс синий экстравазии индекс нг / г ткани мозга ± SD в соответствии с независимыми образцами t-тест. Результаты считались статистически значимыми, когда p'lt; 0.05, и весьма значительными, когда p lt; 0.01. Эта цифра была изменена из Kuts et al.23 Пожалуйста, нажмитездесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Дополнение 1: Пример сканирования ломтиков мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнение 2: Macros, которые могут быть использованы в программном обеспечении ImageJ для функции автоматического порога и измерения пикселей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнение 3: Пример авто порог. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнение 4: Пример измеренных пикселей на каждом полушарии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнение 5: Анализ образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основная цель настоящего протокола состояла в том, чтобы продемонстрировать последовательные измерения трех основных параметров ишемической травмы: проницаемости ИЭЗ, BE и BBB. Предыдущие исследования в этой области продемонстрировали возможность совместного выполнения одного или двух из этих параметров в одной выборке. Помимо сокращения расходов, что этот метод из трех сторон предлагает, он также обеспечивает более желательно биоэтической модели, которая ограничивает количество животных, которые должны управляться, а затем усыплены. Как и во всех гистологических методах, метод ограничен неспособностью динамически наблюдать ишемические травмы.
В анализе изображений использовались четыре компьютерные программы: ImageJ 1.37v, Adobe Photoshop CS2, Microsoft Excel 365 и IBM SPSS Statistics 22. ImageJ был использован для измерения расширения зоны инфаркта и отек мозга. Adobe Photoshop был использован для ограничения влияния Эванс синий на ткани мозга, так как синий цвет указывает bbb разбивка. Перед расчетом зоны инфаркта необходимо удалить синий цвет с изображения, так как цвет не позволяет точно измерять зону инфаркта (см. рисунок 1B, 1D, 1F). Excel и SPSS использовались для обработки данных.
Методика оценки зоны инфаркта с помощью компьютерного программного обеспечения ImageJ основана на сравнении черно-белых пикселей в здоровом полушарии с пикселями в инфарктном полушарии. В инфарктном полушарии зона инфаркта не окрашена ТТК; таким образом, он указывается белым регионом на рисунке 1B, который измеряется. Для того, чтобы программа правильно рассчитала зону инфаркта, необходимо преобразовать пиксели в оттенки различной интенсивности серых цветов (см. рисунок 1F, 1J). Синий цвет, вызванный синим цветом Evans (см. рисунок 1B), может повлиять на оценку зоны инфаркта (см. рисунок 1F). Таким образом, первый шаг заключается в удалении синего цвета с помощью синего фильтра, а затем преобразовать изображение в черно-белое изображение (см. рисунок 1J). Мы использовали Adobe Photoshop, но другие компьютерные программы также могут быть использованы для этой цели, такие как RawTherapeePortable.
Затем мы установили единые параметры для расчета зоны инфаркта во всех 6 срезах одного набора мозга с помощью ImageJ для стандартизации процедуры измерения. Это необходимо, поскольку все 6 ломтиков из каждого набора были окрашены и отсканированы в одинаковых условиях и требуют единого параметра отсеи. Отрезание является критическим параметром для определения того, какие пиксели преобразовать в белый, а какие преобразовать в черный в зависимости от оттенка серого (см. Рисунок 1D, 1H). Для этого мы использовали функцию Threshold из основного меню. Заключительным шагом в анализе изображения был расчет зоны инфаркта и отека мозга.
Измерение зоны инфаркта может быть выполнено с помощью различных методов, включая гистологическое окрашивание или радиологическиеметоды, такие как компьютерный томограф 36,позитронно-эмиссионная томография и магнитно-резонанснаятомография 23,36. Предыдущие исследования в лаборатории продемонстрировали оценку объема инфаркта с использованием окрашивания тТК15,26. Этот метод основан на химической реакции между ТТК и митохондриальными дегидрогеназами нейронов. Здоровые ткани, богатые дегидрогеназами, окрашены красным цветом с этим окрашивание. Однако, в некротических клетках, это изменение цвета не происходит из-за повреждения в системе, которая участвует в окислению органических соединений37. В наших предыдущих исследованиях, мы продемонстрировали высокую корреляцию между этой гистологической техники и результаты сканирования изображения мозга этой области23.
Измерения отеков головного мозга можно оценить как в виво, так и в пробирке. Отек головного мозга является результатом патологических изменений в деятельности ионных каналов натрия и кальция и транспортеров, которые приводят к увеличениювнутриклеточной воды 38,39,40,41. Кроме того, отек может произойти при повреждении BBB, что увеличивает внеклеточную воду. 42 В предыдущих исследованиях отек головного мозга определялся на основе влажных и сухих методов, за которыми следовал расчет содержания водыв тканях 43. Преимуществом метода, который мы представляем в этом протоколе, является его простота и точность по сравнению сдругими существующими методами 23,44,45.
Наиболее полезным методом обнаружения поломки BBB является люминесценция спектроскопии после инъекции Эванса. Измерение проницаемости BBB основано на инъекциях синего Эванса, который связывается с альбумином. В свою очередь, молекулярная масса альбумин составляет 66 кДа и гораздо более значительна, чем молекулярный вес Эванс синий 961 Da. Таким образом, измерение проницаемости BBB определяется именно молекулярной массой альбумин, которая проникает через поврежденный BBB, тем самым передавая Эванс синий. В дополнение к описанным выше методам существуют и другие методы, в частности методы, основанные на сочетании различных декстрансов и радиоактивных молекул, которые в совокупности дают более точные результаты. Измерение пробоя BBB по спектрометрии люминесценции дешевле и проще в использовании, по сравнению с более точными, но более дорогими методами. Мы использовали этот метод для оценки нарушения BBB вместе с измерениями зоны инфаркта и отека мозга. Инъекция Эванс синий для оценки проницаемости BBB до индукции MCAO не влияет на точность измерения этих двух параметров23.
Настоящий протокол представляет собой новый метод измерения трех наиболее важных детерминантов ишемической черепно-мозговой травмы на том же образце мозга. Этот метод может быть также применен к моделям других травм головного мозга. Этот протокол будет способствовать изучению патофизиологии ишемической травмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Благодарим Марину Кушерову, Максима Кривоносова, Дарину Якуменко и Евгению Гончару из кафедры физиологии, биологии, экологии и медицины, Олеся Гончара, Днепровского университета, Днепра, Украины за поддержку и полезный вклад в наши дискуссии. Полученные данные являются частью докторской диссертации Руслана Куца.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
| 27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
| 3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
| Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
| Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
| Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
| Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
| Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
| ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Office 365 ProPlus | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
| Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
| Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |
References
- Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
- Wilkins, E., et al. European cardiovascular disease statistics 2017. , (2017).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
- Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
- Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
- Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- O'Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
- Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
- Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. , (2019).
- Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
- Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
- Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
- Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology - Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
- Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
- Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
- Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
- McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. , e55277 (2017).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. , e1978 (2011).
- Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
- Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. , e3564 (2012).
- Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. , e52675 (2015).
- Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018).
- Boyko, M., et al. Pyruvate's blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997).
- Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
- Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
- Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
- Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
- Di Napoli, M. Caplan's Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
- Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
- Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
- Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
- Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
- Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).
