Summary
このプロトコルは、げっ歯類の脳サンプルの同じセット上の虚血性脳損傷の3つの最も重要なパラメータを測定する新しい技術を記述する。1つの脳サンプルのみを使用することは、倫理的および経済的コストの面で非常に有利である。
Abstract
世界的に罹患率と死亡率の最も一般的な原因の1つは虚血性脳卒中である。歴史的に、虚血性脳卒中を刺激するために使用される動物モデルは、中大脳動脈閉塞(MCAO)を含む。梗塞領域、脳浮腫および血液脳関門(BBB)の内訳は、MCAO後の脳損傷の程度を反映するパラメータとして測定される。この方法の重要な制限は、これらの測定は通常、異なるラットの脳サンプルで得られ、適切なサンプルサイズのために安楽死させられる必要がある多数のラットのために倫理的および財政的負担を引き起こします。ここでは、同じラット脳の中で梗塞領域、脳浮腫およびBBB透過性を測定することによってMCAOに続く脳損傷を正確に評価する方法を提示する。この新しい技術は、脳卒中の病態生理を評価するより効率的な方法を提供する。
Introduction
世界的に罹患率と死亡率の最も一般的な原因の1つは脳卒中です。世界的に、虚血性脳卒中は全脳卒中症例の68%を占め、米国では虚血性脳卒中が脳卒中症例1,2の87%を占める。脳卒中の経済的負担は、米国では240億ドル、欧州連合(EU)では450億ユーロに達すると推定されています。脳卒中の動物モデルは、その病態生理学を研究し、評価のための新しい方法を開発し、新しい治療オプションを提案するために必要です4.
虚血性脳卒中は、大脳動脈の閉塞で起こり、通常は中大脳動脈またはその枝の1つである5。したがって、虚血性脳卒中のモデルは、歴史的に中大脳動脈閉塞(MCAO)6、7、8、9、10、11、12を含む。MCAOに続いて、 神経損傷は、2,3,5トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色法13、脳浮腫(BE)を乾燥または半球量14、15、16、および血液脳関門(BBB)透過性を、エバンスブルー17を用いた透過性を測定することによって最も一般的に評価される。
従来のMCAO法は、3つの脳の測定のそれぞれのために別々の脳のセットを使用しています。サンプルサイズが大きい場合、これは、倫理的および財政的な考慮事項を追加して、安楽死させた動物のかなりの数になります。これらのコストを軽減する別の方法は、MCAO後げっ歯類の脳の単一のセットで3つのパラメータすべての測定を含むであろう。
以前の試みは、同じ脳サンプル内のパラメータの組み合わせを測定するために行われています.同時免疫蛍光染色法20 は、他の分子及び生化学的分析21 と同様に、同じ脳試料中でTTC染色後に記載されている。我々は以前に脳浮腫を評価するために脳半球の体積を計算し、同じ脳セット15で梗塞領域を計算するためにTTC染色を行った。
本プロトコルでは、同じ齧歯類脳の中でIZ、BE、BBB透過性を判定することで虚血性脳損傷を測定する改変MCAO技術を提示する。IZはTTC染色法により測定され、BEは半球体積を算出して求められ、BBB透過性は分光法19により得られる。このプロトコルでは、内部頸動脈(ICA)へのモノフィラメントカテーテルの直接挿入および固定に基づく改変MCAOモデルを用いた、および中大脳動脈(MCA)22への血流のさらなる遮断を用いた。この修飾方法は、従来のMCAO法16,22と比較して死亡率および罹患率の低下率を示す。
この新しいアプローチは、MCAO後の神経損傷を測定するための財政的に健全で倫理的なモデルを提供します。虚血性脳損傷の主なパラメータのこの評価は、その病態生理学を包括的に調査するのに役立ちます。
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Protocol
以下の手順は、ヘルシンキ宣言及び東京宣言及び欧州共同体の実験動物使用に関するガイドラインに従って行われた。実験はまた、ネゲブのベングリオン大学で動物ケア委員会によって承認されました.
実験手順のための1.ラットの準備
- 成人オスのスプレイグ・ドーリーラットを、あから過ぎの病理を伴わず、それぞれ300〜350gの重さを選択する。
- 実験前に12時間の明暗サイクルで、室温で全てのラットを22°Cで維持します。
- 食べ物と水がアドリビタムで利用できることを確認してください。
- 6:00 a. .m~ 2:00 p.m の間ですべての手順を実行します。
2. 手術用のラットの準備
- イオブルラン(誘導で4%、維持のために2%)と24%の酸素(1.5 L /分)でラットを30分間麻酔します。
- 彼らはペダル離脱反射を持っていないことを確認することにより、ラットの麻酔のレベルをテストします。
- 24ゲージのカテーテルを尾静脈に挿入します。
注意:血管拡張のための尾の温暖化は行われません。- テーブルの上にネズミを置いて、上の位置に置きます。医療テープを使用して、ラットの四肢4本すべてを貼り付けます。
- 温度測定のためのプローブを手術前にラット直腸に入れる。
- 手順の間、37°Cのコア体温を支える加熱プレートを維持する。
- 保護のためにラットの目の両方に軟膏を追加します。
- 手術領域を剃り、10%ポビドネヨウ素の3つのアプリケーションで消毒し、続いて70%イソプロピルアルコールを行います。
3. 右側中大脳動脈閉塞
注:MCAOは、以前に説明した16、22、23のように、マクガリーら24およびUluçら.25によって記述された楽器を使用して、修正された技術によって行われる。
- 外科的ピンセットと湾曲した刃のはさみで首の腹側の正中線で皮膚および表面性筋膜を解剖する。
- 筋肉三角形を識別します, ICAからなります, 外耳頸動脈 (ECA) と一般的な頸動脈 (CCA).
- 血管手術用のマイクロ鉗子で、右のCCAとICAを迷走神経から慎重に分離します。
- 正しい CCA と ICA を公開します。血管手術用のマイクロクリップまたは特別な止血帯を使用して、CCAからICAへの血流を遮断します。血管手術用マイクロシザーを使用してICAを切開(約1mm)します。
- モノフィラメントカテーテル(4-0ナイロン)をICAを介して直接挿入し、右CCAの分岐点から約18.5〜19mmをウィリスの円に入れ、軽度の抵抗に達するまで、MCA26を閉塞させる。
- CCAの分岐の上のICAの周りにリゲート。
- シャム操作制御グループの場合、手順 3.5 および 3.616、22の代わりにナイロンスレッドの挿入を実行します。
- 腹腔内注射により0.9%塩化ナトリウムの5mLを投与する。
- 縫合によって創傷を閉じ、ラットを回復領域に連れて行く。
注:麻酔が終わる数分後、ラットは目を覚まし、ケージの周りを独立して移動します。 - MCAOの後23時間で、2%のエバンスブルーを生理食アルカリ(4mL/kg)23、26をカニューレ27を介して両方の操作されたグループの尾静脈に注入する。
注:これは、血液脳透過性トレーサーとして使用されます。60分間循環させます。
4. 梗塞領域の決定
- 前述の9、15、18、19、26のように MCAO の後の24時間で IZを測定します。
注:体重の20%以上を失った、または発作や片麻痺を発症したラットは、実験から除外されます。 - ラットが自然呼吸を停止するまで、インスピレーションを受けたガス混合物を20%の酸素と80%の二酸化炭素に置き換えることによってラットを安楽死させる。
- はさみと外科用鉗子を使用して、肋骨ケージの下の腹壁を通して5〜6センチメートルの横切開で胸を開きます。
- はさみと外科用鉗子で肋骨のケージの全長に沿って横隔膜切開を行う。
- 慎重に肺を置き換え、リブケージを左右28の鎖骨まで切り取る。
- 心臓の左心室を通って正常な生理液の200 mLとパーフューズ。
- 穿刺またははさみで心臓の右心房を切開します。
- ギロチンを使用して切断を行い、脳組織を収集します。
- 虹彩はさみを使用して、両側の後頭蓋表面の遠位縁に前部マグナムからカットします。
- 嗅球、腹側表面に沿った神経質なつながり、頭蓋骨の側側表面を脳から分離する。
- 頭から脳を取り除きます。
- .009"ステンレススチール、コーティングされていない、単一エッジカミソリブレードを備えた2mm厚い水平セクションを作成することで、6つの脳スライスを作成します。
- 37°Cで30分間インキュベートして0.05%TTCで行います。
- 顕微鏡スライド上に脳組織を配置し、1600x1600 dpiの解像度でこれらの6脳スライスの光学スキャンを実行します(例えば 、補足1 を参照してください)。
- チャンネルミキサー機能(画像/調整/チャンネルミキサー)を使用して、フォトエディタ(例えばアドビフォトショップCS2)で青いフィルタを追加し、画像をJPEGファイル形式で保存します。
注: 青いフィルターを適用すると、イメージはグレースケールで表示されます。 - 保存したイメージを ImageJ 1.37v29,30で開きます。
注 : このコンピュータ プログラムでは、しきい値機能を使用して、黒または白のピクセルを分離して計算します ( 図 1を参照)。 - 画像の6つの脳のスライスのそれぞれについて、メインメニューから「ポリゴン選択」ツールを使用して、各半球(右の負傷したイプシララルと左の傷のない矛盾)を別々の画像ファイルとして選択して保存します。
- ImageJ ソフトウェアのメイン メニューから自動しきい値関数を使用して、 イメージ/調整/しきい値を選択して IZ を決定するためのカットオフを設定し、1 つの脳セットの各半球のピクセル数を測定します。
メモ:マクロは、ImageJソフトウェアのこの手順で使用することができます(コードについては 補足2 を参照してください)。カットオフは、白に変換するピクセルと、グレーの陰影に応じて黒に変換するピクセルを決定するための重要なパラメータです(例として 、補足 3 と 補足 4 を 参照)。次に、ImageJ は白と黒のピクセルを比較して IZ を決定します。染色プロトコルとスキャナの設定に基づいて、一定のカットオフ値0.220を使用しました。 - イプシ側および逆側大脳半球(RICH)法13,23を用いて組織膨潤のIZ補正の測定を行う(補足5の例を参照)。
注: 梗塞のサイズは、対側半球の割合として評価されます。
5. 脳浮腫の測定31
注意:BE32、33の測定にはImageJ1.37vを使用してください。
- MCAOの後に24時間を測定してください。BE の計算には、左と右半球の体積のデータを使用します (単位)。
- 1600x1600 dpi の解像度で光学スキャンを実行します( 例えば、補足 1 を 参照)。
- 脳半球を選択し、上記のセクション 4.17-4.19 で説明したように、ImageJ 1.37v で BE を決定するためのカットオフを設定します。
- 次の式を使用してRICH法によって計算される、影響を受けない対側半球の標準面積の割合としてBE領域を表現する(補足5の例を参照して、23,34。
注: BE の範囲は、対側半球の割合として評価されます。
6. BBBの中断の決定
- MCAO の後で BBB の中断を測定します。
- 左右半球を6つのスライスに分け、それぞれをマイクロ遠心分離チューブに入れます。
- 50%トリクロロ酢酸の4 mLにおける脳組織の1gの計算に基づいて、トリクロロ酢酸で脳組織の各スライスを均質化する。
- 20分間10,000 x g で遠心分離機。
- 上清液を1:3に96%エタノールで希釈する。
- 分光光度測定ソフトウェアを利用して発光分光度測定を行い、プレートを設置し、次のパラメータを用いてサンプル読み取りを行います:蛍光強度励起波長620nm(帯域幅10nm)および発光波長680nm(帯域幅10nm)23,35;モッドトップ;数肉25;マニュアル100;1秒、1mm振る。
注: 励起波長は 620 nm (帯域幅 10 nm) で、発光波長は 680 nm (帯域幅 10 nm) を使用してください。23,35
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Representative Results
梗塞ゾーン測定
独立サンプルt-テストでは、永久的MCAOを受けた19匹のラットが、3.57ラット対シャム=0.31%± ±1.9、t(28.49)=7.56、p<0.01(図2)と比較して脳梗塞容積が有意に増加したことを示した(図2A)。データは、SDの反側半球±平均パーセントとして表されます。
脳浮腫測定
独立サンプルt検定は、永久的なMCAOを受けた19匹のラットが16匹のシャム作動ラットと比較して24時間後に脳浮腫の程度の有意な増加を示したことを示した(MCAO=12.31%± 8.6対シャム=0.64%±10.2、t(29.37)=3.61、p=0.011、2Bを参照)。 データは、SDの反側半球±平均パーセントとして表されます。
血液脳関門透過性
独立サンプルt検定は、永久的MCAOを受けた19匹のラットが16匹のシャム操作ラットと比較して24時間後にBBB破壊の程度の有意な増加を示したことを示した(MCAO=2235 ng/g ± 1101対シャム=94 ng/g ±36、t(18.05)=8.47 p<0.01dを参照)。 データは脳組織のng /gで測定され、SD±平均として提示される。
| グループ | 時間 | 手順 |
| シャム手術 (16匹ラット) | 0 | MCAOの誘導と偽式基へのフィラメントの挿入 |
| MCAO (19匹) | ||
| シャム手術 (16匹ラット) | 23h | エヴァンスブルーの注射 |
| MCAO (19匹) | ||
| シャム手術 (16匹ラット) | 24h | IZ、BE、およびBBB破壊の測定のための脳コレクション |
| MCAO (19匹) |
表 1: プロトコルタイムライン MCAOの23時間後に、エバンスブルー溶液を注入した。1時間後(MCAO後24時間)、脳の収集を行い、IZ、BEおよびBBB透過性を全群で測定した。
図1:シャム作動ラットおよびMCAOラットの代表的な脳スライス。
(A-B)元のスキャンされたイメージ。(C-D)グレースケールへの変換。(E-G)しきい値機能。(G-H)青いフィルターの適用。(I-J)ブルーフィルターアプリケーション後のしきい値機能。(K-L)脳浮腫を評価するために閾値機能を使用する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:シャム作動ラットと比較したMCAOラットの組織学的転帰
(A) 梗塞ゾーンMCAO後の19ラットの梗塞帯容積は、手術後24時間のシャム作動ラット16匹に比べて有意に増加した(*p<0.01)。(B) 脳浮腫.MCAO後の19ラットの脳浮腫容積は、手術後24時間のシャム作動ラット16匹と比較して有意に増加した(*p<0.01)。(C) 血液脳関門透過性MCAO後の19ラットの血液脳関門透過率は、手術後24時間のシャム作動ラット16匹に比べて有意に増加した(*p<0.01)。値は、SD±逆半球の平均割合として表され、独立サンプルt検定によると脳組織±SDのng/gにおけるエバンスブルー外挿指数を意味する。結果は、p< 0.05のときに統計的に有意であると考えられ、p < 0.01の場合は非常に有意であると考えられた。この図はKutsらから変更されました23この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足1:脳スライスのスキャン例。こちらをダウンロードしてください。
補足2:自動閾値機能および測定ピクセル用にImageJソフトウェアで使用することができるマクロ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足 3: 自動しきい値の例。こちらをダウンロードしてください。
補足 4: 各半球の測定ピクセルの例。こちらをダウンロードしてください。
補足 5: サンプル分析。こちらをダウンロードしてください。
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Discussion
本プロトコルの主な目標は、虚血性損傷の3つの主要なパラメータの一貫した測定を実証することであった:IZ、BEおよびBBB透過性。この分野の以前の研究は、同じサンプルでこれらのパラメータの1つまたは2つを一緒に実行する可能性を実証しました。この3部構成の方法が提供するコスト削減に加えて、手術とその後の安楽死化しなければならない動物の数を制限するより望ましい生物倫理モデルも提供します。すべての組織学的手法と同様に、この方法は虚血性傷害を動的に観察できないことによって制限される。
画像分析では、イメージ解析に 4 つのコンピュータ プログラムが使用されました: イメージ J 1.37v、アドビフォトショップ CS2、マイクロソフト Excel 365、および IBM SPSS 統計 22.ImageJは梗塞帯と脳浮腫の拡張を測定するために使用された。アドビフォトショップは、青色がBBBの内訳を示すため、脳組織に対するエバンスブルーの影響を制限するために使用されました。梗塞領域を計算する前に、画像から青色を除去する必要があるが、その色は梗塞帯の正確な測定を認めないので( 図1B、1D、1F参照)。データ処理には Excel と SPSS が使用されました。
ImageJコンピュータソフトウェアで梗塞ゾーンを評価する技術は、健康な半球の白黒ピクセルと梗塞半球のピクセルとの比較に基づいています。梗塞半球では、梗塞帯はTTCで染色されない。したがって、測定された 図1B の白色領域によって示される。プログラムが梗塞ゾーンを正しく計算するためには、ピクセルを灰色の色の様々な強度の陰影に変換する必要があります( 図1F,1Jを参照)。エバンズブルー( 図1B参照)によって引き起こされる青色は、梗塞帯の評価に影響を与える可能性があります( 図1Fを参照)。したがって、最初のステップは、青いフィルターを使用して青の色を削除し、イメージを白黒のイメージに変換することです ( 図 1Jを参照)。私たちはアドビフォトショップを使用しましたが、他のコンピュータプログラムもRawTherapeePortableなどのこの目的のために使用することができます。
その後、測定手順を標準化するために、ImageJを用いて、1つの脳セットの全6個のスライスに梗塞帯を算出するための均一なパラメータを確立しました。これは、各セットの 6 つのスライスすべてが同じ条件で染色され、スキャンされ、統合されたカットオフ パラメータが必要なため、必要です。カットオフは、白に変換するピクセルと、グレーの陰影に応じて黒に変換するピクセルを決定するための重要なパラメータです( 図 1D,1Hを参照)。この目的のためにメインメニューのしきい値機能を使用しました。画像解析の最後のステップは、梗塞帯と脳浮腫の計算でした。
梗塞ゾーン測定は、組織学的染色または放射線技術(例えば、計算断層撮影36、陽電子放射断層撮影、磁気共鳴画像23、36など)を含む様々な技術によって行うことができる。研究室での以前の研究は、TTC15、26との染色を使用して梗塞の体積の評価を実証している。この方法は、ニューロンのTTCとミトコンドリアデヒドロゲナーゼの化学反応に基づいています。デヒドロゲナーゼが豊富な健康な組織は、この染色で赤で着色されています。しかし、壊死細胞では、有機化合物37の酸化に関与する系の損傷によるこの色変化は起こらない。我々のこれまでの研究では、この組織学的手法とこの領域23の脳画像スキャンの結果との間に高い相関関係を示した。
脳浮腫の測定は、生体内およびインビトロの両方で評価することができる。脳浮腫は、細胞内水38、39、40、41の増加につながるナトリウムおよびカルシウムイオンチャネルおよびトランスポーターの活動における病理学的変化から生じる。あるいは、細胞外水を増加させるBBB損傷によって腫れが起こり得る。42これまでの研究では、脳浮腫は、湿潤および乾燥技術に基づいて決定され、その後に組織水分量43の計算が行われた。このプロトコルで提示する方法の利点は、そのシンプルさと正確さ他の既存の技術23、44、45と比較します。
BBB破壊検出に最も有用な方法は、エバンスブルー注入後の発光分光法である。BBB透過性の測定は、アルブミンに結合するエバンスブルーの注入に基づいています。さらに、アルブミンの分子量は66kDaであり、エバンスブルー961 Daの分子量よりもはるかに重要である。従って、BBB透過性の測定は、損傷したBBBを貫通するアルブミンの分子質量によって正確に決定され、それによってエバンスブルーを移す。上記の技術に加えて、他の技術、特に様々なデックストランスと放射性分子の組み合わせに基づくものがあり、これを一緒に、より正確な結果を与える。発光分析によるBBBの分解の測定は、より正確であるが、より高価な技術に比べて、安価で使いやすいです。この方法を用いて、梗塞帯と脳浮腫の測定と共にBBB破壊の評価を行った。MCAOの誘導前にBBB透過性の評価のためのエバンスブルーの注入は、これら2つのパラメータ23を測定する精度に影響を与えない。
本プロトコルは、同じ脳試料上の虚血性脳損傷の3つの最も重要な決定因子を測定するための新しい技術を提示する。この方法は、他の脳損傷のモデルにも適用できます。.このプロトコルは虚血性傷害の病態生理学の研究に寄与する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
マリナ・クシェリアヴァ、マクシム・クリヴォノソフ、ダリーナ・ヤクメンコ、エフゲニア・ゴンチャリク生物学・生態学・医学部、オレス・ホンチャリク、ドニプロ大学、ドニプロ、ウクライナの皆様のご支援、そして私たちの議論への貢献に感謝します。得られたデータは、ルスラン・クッツ博士課程の一部です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
| 27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
| 3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
| Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
| Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
| Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
| Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
| Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
| ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Office 365 ProPlus | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
| Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
| Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |
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