Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Tek Bir Kemirgen Beyin Örneklerinde İnme Sonrası Serebral Ödem, Enfarktüs Bölgesi ve Kan-Beyin Bariyeri Kırılımının Ölçülmesi

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61309
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, aynı kemirgen beyin örnekleri kümesinde iskemik beyin hasarının en önemli üç parametresini ölçmenin yeni bir tekniğini açıklar. Sadece bir beyin örneği kullanmak etik ve ekonomik maliyetler açısından oldukça avantajlıdır.

Abstract

Dünya genelinde morbidite ve mortalitenin en sık nedenlerinden biri iskemik inmedir. Tarihsel olarak, iskemik inmeyi uyarmak için kullanılan bir hayvan modeli orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO) içerir. Enfarktüs bölgesi, beyin ödemi ve kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması MCAO sonrası beyin hasarının boyutunu yansıtan parametreler olarak ölçülür. Bu yöntemin önemli bir sınırlaması, bu ölçümlerin normalde farklı sıçan beyin örneklerinde elde edilmesi ve uygun bir örnek boyutu için ötenazi yapılması gereken çok sayıda sıçan nedeniyle etik ve finansal yüklere yol açtır. Burada, aynı sıçan beyin kümesinde enfarktüs bölgesini, beyin ödemini ve BBB geçirgenliğini ölçerek MCAO'yu takiben beyin hasarının doğru bir şekilde değerlendirilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yeni teknik, inmenin patofizyolojisini değerlendirmek için daha verimli bir yol sağlar.

Introduction

Dünya genelinde morbidite ve mortalitenin en sık nedenlerinden biri inmedir. Küresel olarak, iskemik inme tüm inme vakalarının% 68'ini temsil ederken, Amerika Birleşik Devletleri'nde iskemik inme, inme vakalarının% 87'sini oluşturur1,2. İnmenin ekonomik yükünün Amerika Birleşik Devletleri'nde2 ve Avrupa Birliği'nde 45 milyar Euro'ya ulaştığı tahmin edilmektedir3. İnmenin hayvan modelleri patofizyolojisini incelemek, değerlendirme için yeni yöntemler geliştirmek ve yeni terapötik seçenekler önermek için gereklidir4.

İskemik inme, genellikle orta serebral arter veya dallarından biri olan majör bir serebral arterin tıkanması ile ortaya çıkar5. Bu nedenle, iskemik inme modelleri tarihsel olarak orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO)6, 7,8,9,10,11,12'yikapsamıştır. MCAO'yu takip ederek, nörolojik yaralanma en sık 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) boyama yöntemi13, beyin ödemi (BE) kullanılarak enfarktüs bölgesi (IZ) ölçülerek değerlendirilir. ) Evans mavi boyama17 , 18,19kullanarak bir spektrometre tekniği ile kurutma veya hesaplama hemisferik hacimleri 14 , 15,16vekan beyin bariyeri (BBB) geçirgenliği kullanarak.

Geleneksel MCAO yöntemi, üç beyin ölçümünün her biri için ayrı beyin kümeleri kullanır. Büyük bir örneklem boyutu için, bu, ek etik ve finansal hususlarla birlikte önemli sayıda ötenaziye tabi hayvanla sonuçlanır. Bu maliyetleri hafifletmek için alternatif bir yöntem, MCAO sonrası kemirgen beyinlerinin tek bir kümesindeki üç parametrenin de ölçümünü içerecektir.

Aynı beyin örneğindeki parametrelerin kombinasyonlarını ölçmek için önceki girişimler yapılmıştır. Aynı beyin örneğinde TTC lekelemeden sonra eşzamanlı immünoresan boyama yöntemleri20 ve diğer moleküler ve biyokimyasal analizler21 tanımlanmıştır. Daha önce beyin ödemini değerlendirmek için beyin yarımküre hacimlerini hesapladık ve aynı beyin setinde enfarktüs bölgesini hesaplamak için TTC boyama yaptık15.

Mevcut protokolde, aynı kemirgen beyin kümesinde IZ, BE ve BBB geçirgenliğini belirleyerek iskemik beyin hasarını ölçen değiştirilmiş bir MCAO tekniği sunuyoruz. IZ TTC boyama ile ölçülür, BE yarım küre hacmi hesaplanarak belirlenir ve BBB geçirgenliği spektrometre yöntemleri ile elde edilir19. Bu protokolde, monofilament kateterin iç karotid artere (ICA) doğrudan yerleştirilmesine ve sabitlenmesine ve orta serebral artere (MCA) kan akışının daha fazla engellenmesine dayanan modifiye bir MCAO modeli kullandık22. Bu değiştirilmiş yöntem, geleneksel MCAO yöntemi16,22'yekıyasla ölüm ve morbidite oranının azaldığını göstermektedir.

Bu yeni yaklaşım, MCAO'dan sonra nörolojik hasarı ölçmek için finansal açıdan sağlam ve etik bir model sunmaktadır. İskemik beyin hasarının ana parametrelerinin bu değerlendirmesi, patofizyolojisinin kapsamlı bir şekilde araştırılmasına yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıdaki prosedürler Helsinki ve Tokyo Bildirgesi'nin önerilerine ve Avrupa Topluluğu Deney Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Yönergelere göre gerçek yapılmıştır. Deneyler, Negev Ben-Gurion Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından da onaylandı.

1. Sıçanların deneysel prosedüre hazırlanması

  1. Her biri 300 ila 350 g ağırlığında, açık patolojisi olmayan yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlarını seçin.
  2. Deneyden önce 12 saatlik açık ve karanlık döngülerle tüm sıçanları oda sıcaklığında 22 °C'de koruyun.
  3. Yiyecek ve suyun mevcut reklam libitum olduğundan emin olun.
  4. Tüm işlemleri 06:00.m ile 14:00 .m arasında gerçekleştirin.

2. Sıçanların ameliyata hazırlanması

  1. Sıçanları izofluran (indüksiyon için% 4 ve bakım için% 2) ve% 24 oksijen (1.5 L / dk) ile 30 dakika uyuşturun.
    1. Pedal çekme refleksine sahip olmadıklarından emin olarak sıçanlardaki anestezi seviyesini test edin.
  2. 24 kalibrelik kateteri kuyruk damarına yerleştirin.
    NOT: Vazodilasyon için kuyruk ısıtma işlemi yapılmaz.
    1. Sıçanları masaya bir supine pozisyonunda yerleştirin. Farelerin dört uzuvlarını yapıştırmak için tıbbi bant kullan.
  3. Sıcaklık ölçümü için probu ameliyattan önce sıçan rektumuna yerleştirin.
  4. İşlem sırasında, 37 °C çekirdek vücut sıcaklığını desteklemek için bir ısıtma plakası muhafaza edin.
  5. Koruma için sıçanın her iki gözüne de merhem ekleyin.
  6. Cerrahi bölgeyi tıraş edin ve % 10 povidon-iyot ve ardından% 70 izopropil alkol ile üç uygulama ile dezenfekte edin.

3. Sağ taraf orta serebral arter tıkanma

NOT: MCAO, daha önce16,22,23olarak tanımlandığı gibi, McGarry ve ark.24ve Uluç ve ark.25 tarafından açıklanan enstrümanların kullanımı ile değiştirilmiş bir tekniklegerçekleştirilir.

  1. Boynun ventral orta hattındaki deriyi ve yüzeysel fasyayı cerrahi cımbız ve kavisli bıçaklarla makasla parçalara ayrıştırın.
  2. ICA, harici karotis arter (ECA) ve ortak şahdamardan (CCA) oluşan kas üçgenini tanımlayın.
  3. Damar cerrahisi için doğru CCA ve ICA'yı mikroforceps ile vagus sinirinden dikkatlice ayırın.
  4. Doğru CCA ve ICA'yı açığa çıkar. CCA'dan ICA'ya gelen kan akışını mikro klipsler veya damar cerrahisi için özel turnikeler kullanarak engelleyin. Vasküler cerrahi için mikros makas kullanarak ICA üzerinde bir kesi (yaklaşık 1 mm) yapın.
  5. McA 26'yı tıkamak için, sağ CCA'nın çatallanma noktasından Willis çemberine hafif bir dirence ulaşana kadar yaklaşık 18,5-19 mm uzaklıkta, doğrudan ICA'dan bir monofilament kateter(4-0naylon) yerleştirin.
  6. CCA'nın çatallanmasının üzerinde ICA'nın etrafında ligat.
  7. Sham tarafından çalıştırılan denetim grubu için, adım 3.5 ve 3.616,22yerine naylon iplik ekleme gerçekleştirin.
  8. intraperitoneal enjeksiyon ile% 0.9 sodyum klorürün 5 mL'sini uygulayın.
  9. Yarayı dikişle kapatın ve sıçanı bir iyileşme alanına götürün.
    NOT: Anestezinin bitiminden birkaç dakika sonra, sıçan uyanacak ve kafesin etrafında bağımsız olarak hareket edecektir.
  10. MCAO'dan sonra 23 saat sonra, salin (4 mL / kg)23,26% 2 Evans mavisini bir kanonül27aracılığıyla her iki ameliyat grubu için kuyruk damarına enjekte edin.
    NOT: Bu, kan-beyin geçirgenlik izleyicisi olarak kullanılır. 60 dakika boyunca dolaşmasına izin verin.

4. Enfarktüs bölgesinin belirlenmesi

  1. IZ'yi MCAO'dan sonra 24 saat olarakölçün,daha önce açıklandığı gibi9,15,18,19,26.
    NOT: Kilolarının % 20'sinden fazlasını kaybeden veya nöbet veya hemipleji gelişen sıçanlar deneyden çıkarılır.
  2. Fare kendiliğinden nefes almaya son verene kadar ilham alan gaz karışımını% 20 oksijen ve% 80 karbondioksit ile değiştirerek sıçanı ötenazi edin.
  3. Makas ve cerrahi dikiz kullanarak göğüs kafesinin altındaki karın duvarından 5-6 cm yanal kesi ile göğsü açın.
  4. Makas ve cerrahi önps ile göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca diyaframlı bir kesi gerçekleştirin.
  5. Akciğerleri dikkatlice yerinden çıkarmak, göğüs kafesini sağ ve sol taraftaki köprücük kemiğine kadar kesin28.
  6. Kalbin sol ventrikülünden 200 mL normal salin ile perfuse.
  7. Kalbin sağ kulakçıkını makasla delin veya kuluçkaya yatırın.
  8. Giyotin kullanarak kafa kesme işlemi gerçekleştirin ve beyin dokusunu toplayın.
  9. İris makası kullanarak, foramen magnum'dan her iki taraftaki arka kafatası yüzeyinin distal kenarına kesin.
  10. Koku ampullerini, ventral yüzey boyunca sinir bağlantılarını ve kafatasının dorsal yüzeyini beyinden ayırın.
  11. Beyni kafasından çıkar.
  12. .009" paslanmaz çelik, kaplamasız, tek kenarlı jilet ile 2 mm kalınlığında yatay bölümler oluşturarak 6 beyin dilimi üretin.
  13. %0,05 TTC'de 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.
  14. Beyin dokusunu mikroskop slaytlarına yerleştirin ve bu 6 beyin diliminin 1600x1600 dpi çözünürlüğe sahip optik taramasını gerçekleştirin (örneğin, ek 1'e bakın).
  15. Kanal Karıştırıcı işlevini(Görüntü > Ayarlamalar >Kanal Karıştırıcısı) kullanarak fotoğraf düzenleyicisi (örneğin, Adobe Photoshop CS2) içeren mavi bir filtre ekleyin ve görüntüyü JPEG dosya biçimi olarak kaydedin.
    NOT: Mavi filtre uygulandıktan sonra görüntü gri tonlamalı görünecektir.
  16. Kaydedilen görüntüyü ImageJ 1.37v29,30'da açın.
    NOT: Bu bilgisayar programı, siyah veya beyaz pikselleri yalıtmak ve hesaplamak için bir eşik işlevi kullanır (bkz. Şekil 1).
  17. Görüntünün 6 beyin diliminin her biri için, ana menüden "çokgen seçim" aracını kullanarak her yarımküreyi (sağ yaralı ipsilateral ve sol yaralanmamış kontralatör) ayrı bir görüntü dosyası olarak seçin ve kaydedin.
  18. Görüntü > Ayarla > Eşik'i seçerek ImageJ yazılımının ana menüsünden otomatik eşik işlevini kullanarak IZ'yi belirlemek için kesmeyi ayarlayın ve tek bir beyin kümesinin her yarımküreslerindeki piksel sayısını ölçün.
    NOT: ImageJ yazılımında bu adım için makrolar kullanılabilir (bkz. kod için Ek 2). Kesme, hangi piksellerin beyaza dönüştürüleceklerini ve grinin gölgesine bağlı olarak hangilerinin siyaha dönüştürüleceklerini belirlemek için kritik bir parametredir (örnek olarak Ek 3 ve Ek 4'e bakın). ImageJ daha sonra IZ'yi belirlemek için beyaz ve siyah pikselleri karşılaştırır. Boyama protokolü ve tarayıcı ayarlarına dayanarak, 0.220 sabit bir kesme değeri kullandık.
  19. Ipsilateral ve Kontrallateral Serebral Yarımküre Oranları (RICH) yöntemi13,23 kullanarak doku şişmesi için IZ düzeltme ölçümünü gerçekleştirin (Ek 5'tekiörneğe bakın).
    Equation 1
    NOT: Enfarktüs boyutu kontrallateral yarımkürenin bir yüzdesi olarak değerlendirilir.

5. Beyin ödeminin belirlenmesi31

NOT: BE 32 , 33 ölçümü için ImageJ1.37vkullanın.

  1. MCAO'dan sonra 24 saat ölçün. BE'nin hesaplanması için, sol ve sağ yarımküre hacmindeki verileri (birimler halinde) kullanın.
  2. 1600x1600 dpi çözünürlükte optik tarama gerçekleştirin (örneğin, Ek 1'e bakın).
  3. Beyin yarımkürelerini seçin ve yukarıda 4.17-4.19 bölümlerinde açıklandığı gibi ImageJ 1.37v ile BE'yi belirlemek için kesmeyi ayarlayın.
  4. BE alanını, aşağıdaki denklem kullanılarak RICH yöntemiyle hesaplanan etkilenmemiş kontrallateral yarımkürenin standart alanlarının yüzdesi olarak ifade edin (Ek 5'tekiörneğe bakınız)23,34.
    Equation 2
    NOT: BE kapsamı kontrallateral yarımkürenin bir yüzdesi olarak değerlendirilir.

6. BBB kesintisinin belirlenmesi

  1. MCAO'dan sonra BBB kesintisini 24 saat ölçün.
  2. Sağ ve sol yarımküreleri altı dilime bölün ve her birini bir mikrosantrifüj tüpüne koyun.
  3. Beyin dokusunun her dilimini trikloroasetik asitte homojenize edin, %50 trikloroasetik asidin 4 mL'sinde 1 g beyin dokusunun hesaplanmasına dayanarak.
  4. 20 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüj.
  5. %96 etanol ile süpernatant sıvı 1:3 seyreltin.
  6. Spektrofotometri yazılımını kullanarak, plakayı yükleyerek ve aşağıdaki parametreleri kullanarak örnek bir okuma gerçekleştirerek lüminesans spektrofotometrisi gerçekleştirin: Floresan yoğunluğu 620 nm (bant genişliği 10 nm) ve emisyon dalga boyu 680 nm (bant genişliği 10 nm)23,35 ; Mod üst; Sayı Et 25; Manuel 100; Sallanıyor 1 sn, 1 mm.
    NOT: 620 nm'lik (bant genişliği 10 nm) bir heyecan dalga boyu ve 680 nm emisyon dalga boyu (bant genişliği 10 nm) kullanın. 23,35

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Enfarktüs bölgesi ölçümü

Bağımsız örneklemli bir t-testi, kalıcı MCAO uygulanan 19 sıçanın, 16 sahte fareye kıyasla beyin enfarktüs hacminde önemli bir artış gösterdiğini göstermiştir (MCAO=% 7.49 ± 3.57 vs. Sham = %0,31 ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (bkz. Şekil 2A)). Veriler, SD'± kontrallateral yarımkürenin ortalama bir yüzdesi olarak ifade edilir.

Beyin ödemi ölçümü

Bağımsız örneklemli bir t-testi, kalıcı MCAO uygulanan 19 sıçanın, 24 saat sonra beyin ödeminin boyutunda, 16 sahte fareye kıyasla önemli bir artış gösterdiğini göstermiştir (MCAO=% 12.31 ± 8.6 vs. Sham = %0,64 ± 10,2, t(29,37) = 3,61, p = 0,01, d = 1,23 (bkz. Şekil 2B)). Veriler, SD'± kontrallateral yarımkürenin ortalama bir yüzdesi olarak ifade edilir.

Kan beyin bariyeri geçirgenliği

Bağımsız örneklemli bir t-testi, kalıcı MCAO uygulanan 19 sıçanın, 16 sham-operated sıçana kıyasla 24 saat sonra BBB arızasının boyutunda önemli bir artış gösterdiğini göstermiştir (MCAO=2235 ng/g ± 1101 vs. Sham = 94 ng/g ± 36, t(18,05) = 8,47 p < 0,01, d = 2,7 (bkz. Şekil 2C)). Veriler beyin dokusunun ng/g'sinde ölçülür ve ortalama ± SD olarak sunulur.

Grup Saat Yordam
Sham ameliyat edildi (16 sıçan) 0 MCAO'nun indüksiyonu ve sham tarafından işletilen grup için filament yerleştirilmesi
MCAO (19 sıçan)
Sham ameliyat edildi (16 sıçan) 23h Evans mavi enjeksiyonu
MCAO (19 sıçan)
Sham ameliyat edildi (16 sıçan) 24 saat IZ, BE ve BBB kesintisi ölçümleri için beyin toplama
MCAO (19 sıçan)

Tablo 1: Protokol zaman çizelgesi. MCAO'dan 23 saat sonra Evans mavisi çözelti enjekte edildi. Bir saat sonra (MCAO'dan 24 saat sonra) beyin toplama işlemi yapıldı ve IZ, BE ve BBB geçirgenliği tüm gruplarda ölçüldü.

Figure 1
Şekil 1: Sahte ve MCAO sıçanlarının temsili beyin dilimleri.
(A-B) Orijinal taranmış görüntü. (C-D) Gri tonlamalı dönüşüm. (E-G) Eşik işlevi. (G-H) Mavi filtre uygulaması. (I-J) Mavi filtre uygulamasından sonra eşik işlevi. (K-L) Beyin ödemlerini değerlendirmek için eşik fonksiyonu kullanarak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: MCAO sıçanlarının mahmuzlu sıçanlara göre histolojik sonuçları.
(A) Enfarktüs bölgesi. MCAO sonrası 19 sıçanda enfarktüs bölgesi hacmi, ameliyattan 24 saat sonra 16 sham-operated sıçana kıyasla önemli ölçüde artmıştır (*p < 0.01). (B) Beyin ödemi. MCAO sonrası 19 sıçanda beyin ödemi hacmi, ameliyattan 24 saat sonra 16 sham-operated sıçana kıyasla önemli ölçüde artmıştır (*p < 0.01). (C) Kan beyin bariyeri geçirgenliği. MCAO sonrası 19 sıçanda kan beyin bariyeri geçirgenliği, ameliyattan 24 saat sonra 16 sham tarafından işletilen sıçana kıyasla önemli ölçüde artmıştır (*p < 0.01). Değerler, SD ± kontrasepteral yarımkürenin ortalama bir yüzdesi ve bağımsız örnekler t-testine göre beyin dokusu ± SD'nin ng/g'sinde Evans mavi ekstravazasyon indeksi olarak ifade edildi. Sonuçlar istatistiksel olarak p< 0.05 ve p < 0.01 olduğunda oldukça anlamlı olarak kabul edildi. Bu rakam Kuts ve ark.23'tendeğiştirilmiştirBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek 1: Beyin dilimlerinin örnek taraması. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek 2: Otomatik eşik işlevi ve ölçüm pikselleri için ImageJ yazılımında kullanılabilecek makrolar. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek 3: Örnek otomatik eşik. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek 4: Her yarımkürede ölçülen piksel örneği. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek 5: Örnek analizi. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mevcut protokolün temel amacı, iskemik yaralanmanın üç ana parametresinin tutarlı ölçümlerini göstermekti: IZ, BE ve BBB geçirgenliği. Bu alanda daha önce yapılan çalışmalar, bu parametrelerden bir veya ikisinin aynı örnekte birlikte gerçekleştirilme olasılığını ortaya koymuştur. Bu üç parçalı yöntemin sunduğu maliyet azaltmanın yanı sıra, ameliyat edilmesi ve daha sonra ötenazi yapılması gereken hayvan sayısını sınırlayan daha arzu edilen bir biyoetik model de sağlar. Tüm histolojik tekniklerde olduğu gibi iskemik yaralanmaların dinamik olarak gözlemlenememesi ile yöntem sınırlıdır.

Görüntü analizinde dört bilgisayar programı kullanıldı: ImageJ 1.37v, Adobe Photoshop CS2, Microsoft Excel 365 ve IBM SPSS Statistics 22. ImageJ enfarktüs bölgesinin ve beyin ödeminin uzantısını ölçmek için kullanıldı. Adobe Photoshop, Evans mavisinin beyin dokusu üzerindeki etkisini sınırlamak için kullanıldı, çünkü mavi bir renk BBB bozulmasını gösteriyor. Enfarktüs bölgesini hesaplamadan önce, mavi rengi görüntüden çıkarmak gerekir, çünkü renk enfarktüs bölgesinin doğru ölçümlerine izin vermez (bkz. Şekil 1B, 1D, 1F). Veri işleme için Excel ve SPSS kullanıldı.

ImageJ bilgisayar yazılımı ile enfarktüs bölgesini değerlendirme tekniği, sağlıklı bir yarımküredeki siyah ve beyaz piksellerin enfarktüslü bir yarımküredeki piksellerle karşılaştırılmasını temel almaktadır. Enfarktüs yarımkürede, enfarktüs bölgesi TTC ile lekeli değildir; bu nedenle, Şekil 1B'de ölçülen beyaz bir bölge ile gösterilir. Programın enfarktüs bölgesini doğru hesaplaması için, pikselleri gri renklerin değişen yoğunluklarındaki tonlara dönüştürmek gerekir (bkz. Şekil 1F, 1J). Evans mavisinin neden olduğu mavi renk (bkz. Şekil 1B),enfarktüs bölgesinin değerlendirmesini etkileyebilir (bkz. Şekil 1F). Bu nedenle, ilk adım mavi bir filtre kullanarak mavi rengi kaldırmak ve ardından görüntüyü siyah beyaz bir görüntüye dönüştürmektir (bkz. Şekil 1J). Adobe Photoshop'ı kullandık, ancak RawTherapeePortable gibi diğer bilgisayar programları da bu amaç için kullanılabilir.

Daha sonra ölçüm prosedürünü standartlaştırmak için ImageJ kullanarak bir beyin setinin 6 diliminde de enfarktüs bölgesini hesaplamak için tekdüze parametreler oluşturduk. Bu gereklidir, çünkü her setteki 6 dilimin tümü aynı koşullar altında boyanmış ve taranmıştır ve birleşik bir kesme parametresi gerektirir. Kesme, grinin gölgesine bağlı olarak hangi piksellerin beyaza dönüştürüleceğini ve hangilerinin siyaha dönüştürüleceğini belirlemek için kritik bir parametredir (bkz. Şekil 1D, 1H). Bu amaçla ana menüden Eşik işlevini kullandık. Görüntü analizinin son adımı enfarktüs bölgesinin ve beyin ödeminin hesaplanmasıydı.

Enfarktüs bölgesi ölçümü histolojik boyama veya bilgisayarlı tomograf36,pozitron emisyon tomografisi ve manyetik rezonans görüntüleme23,36gibi radyolojik teknikler de dahil olmak üzere çeşitli tekniklerle yapılabilir. Laboratuvarda daha önce yapılan çalışmalar, TTC15,26 ile boyama kullanılarak enfarktüs hacminin değerlendirilmesinigöstermiştir. Bu yöntem, TTC ve nöronların mitokondriyal dehidrogenazları arasındaki kimyasal reaksiyona dayanmaktadır. Dehidrogenazlarla zengin olan sağlıklı dokular, bu lekeleme ile kırmızı ile renklendirilir. Bununla birlikte, nekrotik hücrelerde, organik bileşiklerin oksidasyonuna katılan sistemdeki hasar nedeniyle bu renk değişimigerçekleşmez 37. Daha önceki çalışmalarımızda, bu histolojik teknik ile bu alanın beyin görüntüsü taramasından elde edilen sonuçlar arasında yüksek bir korelasyon gösterdik23.

Serebral ödem ölçümleri hem in vivo hem de in vitro olarak değerlendirilebilir. Serebral ödem, hücre içi suda artışa yol açan sodyum ve kalsiyum iyon kanalları ve taşıyıcıların faaliyetlerindeki patolojik değişikliklerden kaynaklanır38,39,40,41. Alternatif olarak, hücre dışı suyu artıran BBB hasarı ile şişme meydana gelebilir. 42 Daha önceki çalışmalarda doku suyu içeriğinin hesaplanması ile takip edilen ıslak ve kuru tekniklere dayalı serebral ödem belirlenmiştir43. Bu protokolde sunduğumuz yöntemin bir avantajı, mevcut diğer tekniklere kıyasla basitliği ve doğruluğudur23,44,45.

BBB arıza tespiti için en yararlı yöntem Evans mavi enjeksiyonundan sonra lüminesans spektroskopisidir. BBB geçirgenliğinin ölçümü, albümin'e bağlanan Evans mavisinin enjeksiyonuna dayanmaktadır. Buna karşılık, albüminin moleküler kütlesi 66 kDa'dır ve Evans blue 961 Da'nın moleküler ağırlığından çok daha önemlidir. Bu nedenle, BBB geçirgenliğinin ölçümü, hasarlı BBB'den nüfuz eden ve böylece Evans mavisini aktaran albümin moleküler kütlesi tarafından tam olarak belirlenir. Yukarıda açıklanan tekniklere ek olarak, özellikle birlikte daha doğru sonuçlar veren çeşitli dekstrans ve radyoaktif moleküllerin bir kombinasyonuna dayanan başka teknikler de vardır. BBB arızasının lüminesans spektrometresi ile ölçülmek, daha doğru ama daha pahalı tekniklere kıyasla daha ucuz ve kullanımı daha kolaydır. BBB kesintisinin enfarktüs bölgesi ve beyin ödemi ölçümleri ile birlikte değerlendirilmesi için bu yöntemi kullandık. MCAO'nun indüksiyonundan önce BBB geçirgenliğinin değerlendirilmesi için Evans mavisinin enjeksiyonu, bu iki parametreyi ölçme doğruluğunu etkilemez23.

Mevcut protokol, aynı beyin örneğinde iskemik beyin hasarının en önemli üç belirleyicisini ölçmek için yeni bir teknik sunar. Bu yöntem diğer beyin yaralanmalarının modellerine de uygulanabilir. Bu protokol iskemik yaralanma patofizyolojisinin incelenmesine katkıda bulunacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko ve Fizyoloji Bölümü, Biyoloji, Ekoloji ve Tıp Fakültesi Evgenia Goncharyk, Oles Honchar, Dnipro Üniversitesi, Dnipro, Ukrayna'ya görüşmelerimize destekleri ve yararlı katkıları için teşekkür ederiz. Elde edilen veriler Ruslan Kuts'un doktora tezinin bir parçasıdır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Syringe Braun 4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution Sigma-Aldrich 500 cc Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe Braun 305620
3-0 Silk sutures Henry Schein 1007842
4-0 Nylon suture 4-00
Brain & Tissue Matrices Sigma-Aldrich 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P Sigma-Aldrich Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances Sigma-Aldrich HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale Sigma-Aldrich Rs 4,000
Dissecting scissors Sigma-Aldrich Z265969
Eppendorf pipette Sigma-Aldrich Z683884
Eppendorf tube Sigma-Aldrich EP0030119460
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland Model: Infinite 200 PRO multimode reader Optional.
Fluorescence detector Molecular Devices LLC VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument Optional.
Gauze sponges Fisher 22-362-178
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips Sigma-Aldrich
Horizon-XL Mennen Medical Ltd
Infusion cuff ABN IC-500
Micro forceps Sigma-Aldrich
Micro scissors Sigma-Aldrich
Multiset Teva Medical 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Operating forceps Sigma-Aldrich
Operating scissors Sigma-Aldrich
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes Sigma-Aldrich P5606
Purina Chow Purina 5001 Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages Techniplast 2000P Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11 Sigma-Aldrich S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows Adobe
ImageJ 1.37v NIH The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
SPSS Statistics 22 IBM
Office 365 ProPlus Microsoft - Microsoft Office Excel
Windows 10 Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich 298-96-4
50% trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 76-03-9
Ethanol 96 % Romical Flammable liquid
Evans blue 2% Sigma-Aldrich 314-13-6
Isoflurane, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
  3. Wilkins, E., et al. European cardiovascular disease statistics 2017. , (2017).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  6. Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
  7. Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
  8. Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
  9. Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
  10. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
  11. Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
  12. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  13. O'Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
  14. Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
  15. Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. , (2019).
  16. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  17. Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
  18. Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
  19. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
  20. Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology - Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
  21. Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
  22. Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  23. Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
  24. McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. , e55277 (2017).
  25. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. , e1978 (2011).
  26. Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
  27. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. , e3564 (2012).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. , e52675 (2015).
  30. Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018).
  31. Boyko, M., et al. Pyruvate's blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
  32. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  33. Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997).
  34. Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
  35. Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
  36. Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
  38. Di Napoli, M. Caplan's Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
  39. Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
  40. Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
  41. Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
  42. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
  43. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  44. Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
  45. Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).

Tags

Nörobilim Sayı 164 Kan beyin bariyeri (BBB) bozulması beyin ödemi enfarktüs bölgesi iskemik inme orta serebral arter tıkanması (MCAO) sıçan modeli
Tek Bir Kemirgen Beyin Örneklerinde İnme Sonrası Serebral Ödem, Enfarktüs Bölgesi ve Kan-Beyin Bariyeri Kırılımının Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frank, D., Gruenbaum, B. F.,More

Frank, D., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Melamed, I., Severynovska, O., Kuts, R., Semyonov, M., Brotfain, E., Zlotnik, A., Boyko, M. Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples. J. Vis. Exp. (164), e61309, doi:10.3791/61309 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter