Summary
Dit protocol beschrijft een nieuwe techniek om de drie belangrijkste parameters van ischemisch hersenletsel te meten op dezelfde set knaagdierhersenmonsters. Het gebruik van slechts één hersenmonster is zeer voordelig in termen van ethische en economische kosten.
Abstract
Een van de meest voorkomende oorzaken van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd is ischemische beroerte. Historisch gezien omvat een diermodel dat wordt gebruikt om ischemische beroerte te stimuleren midden-cerebrale slagader occlusie (MCAO). Infarctzone, hersenoedeem en afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB) worden gemeten als parameters die de omvang van hersenletsel na MCAO weerspiegelen. Een belangrijke beperking van deze methode is dat deze metingen normaal gesproken worden verkregen in verschillende monsters van rattenhersenen, wat leidt tot ethische en financiële lasten vanwege het grote aantal ratten dat moet worden geëuthanaseerd voor een geschikte steekproefgrootte. Hier presenteren we een methode om hersenletsel na MCAO nauwkeurig te beoordelen door infarctzone, hersenoedeem en BBB-permeabiliteit in dezelfde set rattenhersenen te meten. Deze nieuwe techniek biedt een efficiëntere manier om de pathofysiologie van beroerte te evalueren.
Introduction
Een van de meest voorkomende oorzaken van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd is beroerte. Wereldwijd vertegenwoordigt ischemische beroerte 68% van alle beroertegevallen, terwijl in de Verenigde Staten ischemische beroerte 87% van de beroertegevallenvertegenwoordigt 1,2. Geschat wordt dat de economische last van beroerte in de Verenigde Staten2 en 45 miljard EUR in de Europese Unie3bedraagt . Diermodellen van beroerte zijn nodig om de pathofysiologie te bestuderen, nieuwe methoden voor evaluatie te ontwikkelen en nieuwe therapeutische opties voor te stellen4.
Ischemische beroerte treedt op met occlusie van een belangrijke hersenslagader, meestal de middelste hersenslagader of een van de takken5. Zo hebben modellen van ischemische beroerte van oudsher betrekking gehad op midden-cerebrale slagader occlusie (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. In navolging van MCAO, neurologisch letsel wordt meestal beoordeeld door infarctzone (IZ) te meten met behulp van een 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuringsmethode13, hersenoedeem (BE) met behulp van of het berekenen van hemisferische volumes14,15,16, en bloed hersenbarrière (BBB) permeabiliteit door middel van een spectrometrie techniek met behulp van Evans blauwe kleuring17,18,19.
De traditionele MCAO-methode maakt gebruik van afzonderlijke sets hersenen voor elk van de drie hersenmetingen. Voor een grote steekproefgrootte resulteert dit in een aanzienlijk aantal geëuthanaseerde dieren, met extra ethische en financiële overwegingen. Een alternatieve methode om deze kosten te verlichten zou metingen van alle drie parameters in één set post-MCAO knaagdierhersenen omvatten.
Eerdere pogingen zijn gedaan om combinaties van parameters in hetzelfde hersenmonster te meten. Gelijktijdige immunofluorescente kleuringsmethoden20 evenals andere moleculaire en biochemische analyses21 zijn beschreven na TTC-kleuring in hetzelfde hersenmonster. We hebben eerder de volumes van de hersenhelft berekend om hersenoedeem te beoordelen en TTC-vlekken uitgevoerd om de infarctzone in dezelfde hersenset15te berekenen.
In dit protocol presenteren we een aangepaste MCAO-techniek die ischemisch hersenletsel meet door de permeabiliteit van IZ, BE en BBB in dezelfde set knaagdierhersenen te bepalen. IZ wordt gemeten door TTC-kleuring, BE wordt bepaald door het hemisferische volume te berekenen en BBB-permeabiliteit wordt verkregen door spectrometriemethoden19. In dit protocol gebruikten we een aangepast MCAO-model, gebaseerd op directe invoeging en fixatie van de monofilamentkatheter in de interne halsslagader (ICA) en verdere blokkering van de bloedtoevoer naar de middelste hersenslagader (MCA)22. Deze gewijzigde methode vertoont een verlaagd sterftecijfer en morbiditeit in vergelijking met de traditionele MCAO-methode16,22.
Deze nieuwe aanpak biedt een financieel verantwoord en ethisch model voor het meten van neurologisch letsel na MCAO. Deze beoordeling van de belangrijkste parameters van ischemisch hersenletsel zal helpen om de pathofysiologie uitgebreid te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de aanbevelingen van de Verklaring van Helsinki en Tokio en de richtsnoeren voor het gebruik van proefdieren van de Europese Gemeenschap. De experimenten werden ook goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Ben-Gurion University of the Negev.
1. Ratten voorbereiden op de experimentele procedure
- Selecteer volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten zonder openlijke pathologie, elk met een gewicht tussen 300 en 350 g.
- Houd alle ratten op kamertemperatuur op 22 °C, met 12 uur lichte en donkere cycli voor het experiment.
- Zorg ervoor dat voedsel en water ad libitum beschikbaar zijn.
- Voer alle procedures uit tussen 6:00 a.m. en 14:00 uur.m.
2. Ratten voorbereiden op een operatie
- Verdoof de ratten gedurende 30 minuten met isofluraan (4% voor inductie en 2% voor onderhoud) en 24% zuurstof (1,5 L/min).
- Test het anesthesieniveau bij de ratten door ervoor te zorgen dat ze geen pedaalontwenningsreflex hebben.
- Steek de 24-gauge katheter in de staartader.
OPMERKING: Staartverwarming voor vasodilatatie wordt niet uitgevoerd.- Leg de ratten in een liggende positie op tafel. Gebruik medische tape om alle vier de ledematen van de ratten aan te brengen.
- Plaats de sonde voor temperatuurmeting in het rectum van de rat vóór de operatie.
- Houd tijdens de procedure een verwarmingsplaat aan om een kernlichaamstemperatuur van 37 °C te ondersteunen.
- Voeg zalf toe in de ogen van de rat voor bescherming.
- Scheer het operatiegebied en desinfecteer met drie toepassingen van 10% povidonjodium gevolgd door 70% isopropylalcohol.
3. Rechterzijde midden hersenslagader occlusie
OPMERKING: MCAO wordt uitgevoerd met een gewijzigde techniek, zoals eerder beschreven16,22,23, met het gebruik van instrumenten beschreven door McGarry et al.24 en Uluç et al.25.
- Ontleed de huid en oppervlakkige fascia aan de ventrale middellijn van de nek met een chirurgisch pincet en een schaar met gebogen messen.
- Identificeer de spierdriehoek, bestaande uit de ICA, uitwendige halsslagader (ERK) en gemeenschappelijke halsslagader (CCA).
- Scheid voorzichtig de juiste CCA en ICA van de nervus vagus met microforceps voor vasculaire chirurgie.
- Ontmasker de juiste CCA en de ICA. Blokkeer de bloedstroom van de CCA naar de ICA met behulp van microclips of speciale tourniquets voor vasculaire chirurgie. Maak een incisie (ongeveer 1 mm) op de ICA met behulp van microscissors voor vasculaire chirurgie.
- Plaats een monofilamentkatheter (4-0 nylon) rechtstreeks door de ICA, ongeveer 18,5-19 mm van het bifurcatiepunt van de rechter CCA in de cirkel van Willis tot het bereiken van een milde weerstand, om de MCA26af te sluiten.
- Ligate rond ICA boven de splitsing van CCA.
- Voer voor de schijngestuurde controlegroep een invoeging van nylondraad uit in plaats van de stappen 3.5 en 3.616,22.
- Dien 5 ml 0,9% natriumchloride toe door intraperitoneale injectie.
- Sluit de wond met hechting en breng de rat naar een herstelgebied.
OPMERKING: Een paar minuten na het einde van de anesthesie wordt de rat wakker en beweegt hij zich onafhankelijk rond de kooi. - Na 23 uur na MCAO 2% Evans blauw injecteren in zoutoplossing (4 ml/kg)23,26 in de staartader voor beide geopereerde groepen via een canule27.
OPMERKING: Dit wordt gebruikt als een bloed-hersendoorlatendheid tracer. Laat 60 minuten circuleren.
4. Bepaling van het infarctgebied
- Maatregel IZ om 24 uur na MCAO zoals eerder beschreven9,15,18,19,26.
OPMERKING: Ratten die meer dan 20% van hun gewicht verloren of aanvallen of hemiplegie ontwikkelden, zijn uitgesloten van het experiment. - Euthanaseer de rat door het geïnspireerde gasmengsel te vervangen door 20% zuurstof en 80% kooldioxide totdat de rat spontaan stopt met ademen.
- Open de borstkas met een zijincisie van 5-6 cm door de buikwand onder de ribbenkast met behulp van een schaar en chirurgische tang.
- Voer een diafragmatische incisie uit over de gehele lengte van de ribbenkast met een schaar en chirurgische tang.
- Voorzichtig verplaatsen van de longen, snijd door de ribbenkast tot aan het sleutelbeen aan de rechter- en linkerkant28.
- Perfuse met 200 ml normale zoutoplossing door de linkerventrikel van het hart.
- Prik of inciseer het rechter atrium van het hart met een schaar.
- Voer onthoofding uit met behulp van een guillotine en verzamel hersenweefsel.
- Snijd met behulp van een irisschaar van het foramen magnum naar de distale rand van het achterste schedeloppervlak aan beide zijden.
- Scheid de reukbollen, nerveuze verbindingen langs het ventrale oppervlak en het dorsale oppervlak van de schedel van de hersenen.
- Haal de hersenen uit het hoofd.
- Produceer 6 hersenschijfjes door 2 mm dikke horizontale secties te maken met een .009" roestvrij staal, ongecoat scheermesje met één rand.
- Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C in 0,05% TTC.
- Plaats het hersenweefsel op de microscoopdia's en voer optische scans uit van deze 6 hersensegmenten met een resolutie van 1600x1600 dpi (zie bijvoorbeeld Supplement 1).
- Voeg een blauw filter toe met een foto-editor (bijv. Adobe Photoshop CS2) met behulp van de functie Kanaalmixer (Afbeelding > Aanpassingen > Kanaalmixer) en sla de afbeelding op als JPEG-bestandsindeling.
OPMERKING: Nadat u het blauwe filter hebt aangebracht, wordt de afbeelding grijs weergegeven. - Open de opgeslagen afbeelding in ImageJ 1.37v29,30.
OPMERKING: Dit computerprogramma gebruikt een drempelfunctie om de pixels zwart of wit te isoleren en te berekenen (zie figuur 1). - Voor elk van de 6 hersensegmenten van de afbeelding selecteert en slaat u elke hersenhelft (rechts gewond ipsilateraal en links ongedeerd contralateral) op als een afzonderlijk afbeeldingsbestand met behulp van het gereedschap "polygoonselectie" in het hoofdmenu.
- Stel de cut-off in voor het bepalen van de IZ met behulp van een automatische drempelfunctie in het hoofdmenu van de ImageJ-software door Afbeelding > Aanpassen > Drempelwaardete selecteren en het aantal pixels in elke hersenhelft van één hersenset te meten.
OPMERKING: Macro's kunnen voor deze stap worden gebruikt in ImageJ-software (zie Supplement 2 voor de code). De cut-off is een kritieke parameter om te bepalen welke pixels naar wit moeten worden geconverteerd en welke naar zwart moeten worden geconverteerd, afhankelijk van de grijstint (zie Supplement 3 en Supplement 4 als voorbeelden). ImageJ vergelijkt vervolgens witte en zwarte pixels om IZ te bepalen. Op basis van het kleuringsprotocol en de scannerinstellingen gebruikten we een constante afkapwaarde van 0,220. - Voer metingen uit van IZ-correctie voor weefselzwelling met behulp van de verhoudingen van ipsilaterale en contralaterale hersenhelften (RICH) methode13,23 (zie voorbeeld in supplement 5).
OPMERKING: De grootte van het infarct wordt beoordeeld als een percentage van de contralaterale hemisfeer.
5. Bepaling van hersenoedeem31
OPMERKING: Gebruik ImageJ 1.37v voor het meten van BE32,33.
- Meet BE 24 uur na MCAO. Gebruik voor de berekening van BE de gegevens van het volume van de linker- en rechterhersenhelft (in eenheden).
- Voer optische scans uit met een resolutie van 1600x1600 dpi (zie bijvoorbeeld Supplement 1).
- Selecteer hersenhelften en stel de cut-off in voor het bepalen van BE met ImageJ 1.37v, zoals hierboven beschreven in de paragrafen 4.17-4.19.
- Druk het BE-gebied uit als een percentage van de standaardgebieden van de niet-aangetaste contralaterale hemisfeer, berekend door de RICH-methode met behulp van de volgende vergelijking (zie voorbeeld in supplement 5)23,34.
OPMERKING: De omvang van BE wordt beoordeeld als een percentage van de contralaterale hemisfeer.
6. Bepaling BBB-storing
- Maatregel BBB-storing 24 uur na MCAO.
- Verdeel de rechter- en linkerhersenhelft in zes plakjes en doe ze allemaal in een microcentrifugebuis.
- Homogeniseer elk deel van het hersenweefsel in trichloorazijnzuur, gebaseerd op de berekening van 1 g hersenweefsel in 4 ml van 50% trichloorazijnzuur.
- Centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 20 min.
- Verdun supernatant vloeistof 1:3 met 96% ethanol.
- Voer luminescentiespectrofotometrie uit met behulp van spectrofotometriesoftware, installeer de plaat en voer een monstermeting uit met behulp van de volgende parameters: fluorescentie-intensiteit excitatiegolflengte van 620 nm (bandbreedte 10 nm) en een emissiegolflengte van 680 nm (bandbreedte 10 nm)23,35 ; Mod bovenkant; Nummer Vlees 25; Handleiding 100; Schudden 1 sec, 1 mm.
OPMERKING: Gebruik een excitatiegolflengte van 620 nm (bandbreedte 10 nm) en een emissiegolflengte van 680 nm (bandbreedte 10 nm). 23,35 jaar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Infarctzonemeting
Een onafhankelijke t-test gaf aan dat 19 ratten die permanente MCAO ondergingen een significante toename van het infarctvolume van de hersenen vertoonden in vergelijking met de 16 schijnratten (MCAO = 7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (zie figuur 2A)). De gegevens worden uitgedrukt als een gemiddeld percentage van de contralaterale hemisfeer ± SD.
Hersenoedeemmeting
Een t-test met onafhankelijk monster wees uit dat 19 ratten die permanente MCAO ondergingen een significante toename van de omvang van hersenoedeem na 24 uur vertoonden in vergelijking met de 16 schijnratten (MCAO = 12,31% ± 8,6 vs. Sham = 0,64% ± 10,2, t(29,37) = 3,61, p = 0,01, d = 1,23 (zie figuur 2B)). De gegevens worden uitgedrukt als een gemiddeld percentage van de contralaterale hemisfeer ± SD.
Doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière
Uit een t-test met onafhankelijk monster bleek dat 19 ratten die een permanente MCAO ondergingen, een significante toename van de omvang van de BBB-afbraak na 24 uur vertoonden in vergelijking met de 16 schijnratten (MCAO=2235 ng/g ± 1101 vs. Sham = 94 ng/g ± 36, t(18,05) = 8,47 p < 0,01, d = 2,7 (zie figuur 2C)). De gegevens worden gemeten in ng/g hersenweefsel en gepresenteerd als gemiddelde ± SD.
| Groep | Tijd | Procedures |
| Sham geopereerd (16 ratten) | 0 | Inductie van MCAO en inbrengen van filament voor schijnwerkgroep |
| MCAO (19 ratten) | ||
| Sham geopereerd (16 ratten) | 23u | Injectie van Evans blauw |
| MCAO (19 ratten) | ||
| Sham geopereerd (16 ratten) | 24u | Herseninzameling voor metingen van verstoring IZ, BE en BBB |
| MCAO (19 ratten) |
Tabel 1: Tijdlijn van het protocol. Om 23 uur na MCAO werd de Evans blauwe oplossing geïnjecteerd. Een uur later (24 uur na MCAO) werd hersenverzameling uitgevoerd en werden IZ, BE en BBB permeabiliteit in alle groepen gemeten.
Figuur 1: Representatieve hersenschijfjes van schijn- en MCAO-ratten.
(A-B) Originele gescande afbeelding. (C-D) Transformatie naar grijswaarden. (E-G) Drempelfunctie. (G-H) Toepassing van een blauw filter. (I-J) Drempelfunctie na blauwe filtertoepassing. (K-L) Het gebruik van drempelfunctie om hersenoedeem te beoordelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Histologische uitkomsten van MCAO-ratten in vergelijking met schijnratten.
(A) Infarctzone. Het volume van de infarctzone bij 19 ratten na MCAO was aanzienlijk verhoogd in vergelijking met de 16 schijnratten 24 uur na de operatie (*p < 0,01). (B) Hersenoedeem. Het oedeemvolume in de hersenen bij 19 ratten na MCAO was significant verhoogd in vergelijking met de 16 schijnratten 24 uur na de operatie (*p < 0,01). (C) Doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière. De doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière bij 19 ratten na MCAO was significant verhoogd in vergelijking met de 16 schijnratten 24 uur na de operatie (*p < 0,01). Waarden werden uitgedrukt als een gemiddeld percentage van de contralaterale hemisfeer ± SD en gemiddelde Evans blauwe extravasatie-index in ng/g hersenweefsel ± SD volgens onafhankelijke monsters t-test. De resultaten werden statistisch significant geacht bij p< 0,05 en zeer significant bij p < 0,01. Deze figuur is gewijzigd van Kuts et al.23Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Supplement 1: Voorbeeldscan van hersensegmenten. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvulling 2: Macro's die kunnen worden gebruikt in ImageJ-software voor de automatische drempelfunctie en het meten van pixels. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvulling 3: Voorbeeld automatische drempelwaarde. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Supplement 4: Voorbeeld van gemeten pixels op elke hemisfeer. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvulling 5: Voorbeeldanalyse. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het belangrijkste doel van dit protocol was om consistente metingen van drie belangrijke parameters van ischemische schade aan te tonen: IZ, BE en BBB permeabiliteit. Eerdere studies op dit gebied hebben de mogelijkheid aangetoond om een of twee van deze parameters samen in dezelfde steekproef uit te voeren. Naast de kostenreductie die deze driedelige methode biedt, biedt het ook een wenselijker bio-ettisch model dat het aantal dieren beperkt dat moet worden geopereerd en vervolgens geëuthanaseerd. Zoals in alle histologische technieken wordt de methode beperkt door het onvermogen om ischemische verwondingen dynamisch te observeren.
Vier computerprogramma's werden gebruikt in de beeldanalyse: ImageJ 1.37v, Adobe Photoshop CS2, Microsoft Excel 365 en IBM SPSS Statistics 22. ImageJ werd gebruikt om de uitbreiding van de infarctzone en hersenoedeem te meten. Adobe Photoshop werd gebruikt om het effect van Evans blauw op hersenweefsel te beperken, omdat een blauwe kleur wijst op BBB-afbraak. Alvorens de infarctzone te berekenen, is het noodzakelijk om de blauwe kleur uit de afbeelding te verwijderen, omdat de kleur geen nauwkeurige metingen van de infarctzone mogelijk maakt (zie figuur 1B, 1D, 1F). Excel en SPSS werden gebruikt voor gegevensverwerking.
De techniek voor het beoordelen van een infarctzone met ImageJ-computersoftware is gebaseerd op een vergelijking van zwart-witte pixels in een gezonde hemisfeer met pixels in een infarct halfrond. In het infarct halfrond is de infarctzone niet bevlekt met TTC; daarom wordt het aangegeven door een wit gebied in figuur 1B dat wordt gemeten. Om de infarctzone correct te berekenen, is het noodzakelijk om de pixels om te zetten in tinten met verschillende intensiteiten van grijze kleuren (zie figuur 1F, 1J). De blauwe kleur, die wordt veroorzaakt door Evans blauw (zie figuur 1B), kan van invloed zijn op de beoordeling van de infarctzone (zie figuur 1F). Daarom is de eerste stap het verwijderen van de blauwe kleur met behulp van een blauw filter en vervolgens de afbeelding converteren naar een zwart-witafbeelding (zie figuur 1J). We hebben Adobe Photoshop gebruikt, maar ook andere computerprogramma's kunnen hiervoor worden gebruikt, zoals RawTherapeePortable.
Vervolgens hebben we uniforme parameters vastgesteld voor het berekenen van de infarctzone in alle 6 segmenten van één hersenset met behulp van ImageJ om de meetprocedure te standaardiseren. Dit is nodig omdat alle 6 segmenten van elke set onder dezelfde omstandigheden zijn gekleurd en gescand en een uniforme afkapparameter vereisen. De cut-off is een kritieke parameter om te bepalen welke pixels naar wit moeten worden geconverteerd en welke naar zwart moeten worden geconverteerd, afhankelijk van de grijstint (zie figuur 1D, 1H). Hiervoor hebben we de threshold-functie uit het hoofdmenu gebruikt. De laatste stap in de beeldanalyse was de berekening van de infarctzone en hersenoedeem.
De infarctzonemeting kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende technieken, waaronder histologische kleuring of radiologische technieken zoals een berekende tomograaf36, positronemissietomografie en magnetische resonantiebeeldvorming23,36. Eerdere studies in het lab hebben de beoordeling van het infarctvolume aangetoond met behulp van kleuring met TTC15,26. Deze methode is gebaseerd op een chemische reactie tussen TTC en mitochondriale dehydrogenases van neuronen. De gezonde weefsels, rijk aan dehydrogenases, zijn gekleurd met rood met deze kleuring. In necrotische cellen treedt deze kleurverandering echter niet op als gevolg van schade in het systeem die deelneemt aan de oxidatie van organische verbindingen37. In onze eerdere studies toonden we een hoge correlatie aan tussen deze histologische techniek en de resultaten van het scannen van hersenbeelden van dit gebied23.
Metingen van hersenoedeem kunnen zowel in vivo als in vitro worden beoordeeld. Cerebraal oedeem is het gevolg van pathologische veranderingen in de activiteiten van natrium - en calciumionenkanalen en transporteurs die leiden tot een toename van intracellulair water38,39,40,41. Als alternatief kan zwelling optreden door BBB-schade die extracellulair water verhoogt. In eerdere studies werd hersenoedeem bepaald op basis van natte en droge technieken, gevolgd door de berekening van het gehalte aan weefselwater43. Een voordeel van de methode die we in dit protocol presenteren, is de eenvoud en nauwkeurigheid ervan in vergelijking met andere bestaande technieken23,44,45.
De meest nuttige methode voor BBB-afbraakdetectie is luminescentiespectroscopie na evans blauwe injectie. De meting van de permeabiliteit van BBB is gebaseerd op de injectie van Evans blue, die zich bindt aan albumine. Op zijn beurt is de moleculaire massa van albumine 66 kDa en veel belangrijker dan het molecuulgewicht van Evans blue 961 Da. Zo wordt de meting van de BBB-permeabiliteit precies bepaald door de moleculaire massa van albumine die door de beschadigde BBB dringt, waardoor het Evans-blauw wordt overgedragen. Naast de hierboven beschreven technieken zijn er nog andere technieken, met name technieken die gebaseerd zijn op een combinatie van verschillende dextrans- en radioactieve moleculen, die samen nauwkeurigere resultaten opleveren. Het meten van BBB-afbraak door luminescentiespectrometrie is goedkoper en gemakkelijker te gebruiken, in vergelijking met nauwkeurigere maar duurdere technieken. We gebruikten deze methode voor de evaluaties van BBB-verstoring samen met metingen van infarctzone en hersenoedeem. Injectie van Evans blue voor de beoordeling van de permeabiliteit van BBB vóór inductie van MCAO heeft geen invloed op de nauwkeurigheid van het meten van deze twee parameters23.
Het huidige protocol presenteert een nieuwe techniek voor het meten van de drie belangrijkste determinanten van ischemisch hersenletsel op hetzelfde hersenmonster. Deze methode kan ook worden toegepast op modellen van ander hersenletsel. Dit protocol zal bijdragen aan de studie van de pathofysiologie van ischemisch letsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko en Evgenia Goncharyk van de afdeling Fysiologie, Faculteit Biologie, Ecologie en Geneeskunde, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Oekraïne voor hun steun en nuttige bijdragen aan onze discussies. De verkregen gegevens maken deel uit van het proefschrift van Ruslan Kuts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
| 27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
| 3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
| Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
| Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
| Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
| Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
| Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
| ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Office 365 ProPlus | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
| Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
| Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |
References
- Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
- Wilkins, E., et al. European cardiovascular disease statistics 2017. , (2017).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
- Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
- Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
- Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- O'Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
- Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
- Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. , (2019).
- Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
- Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
- Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
- Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology - Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
- Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
- Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
- Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
- McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. , e55277 (2017).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. , e1978 (2011).
- Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
- Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. , e3564 (2012).
- Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. , e52675 (2015).
- Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018).
- Boyko, M., et al. Pyruvate's blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997).
- Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
- Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
- Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
- Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
- Di Napoli, M. Caplan's Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
- Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
- Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
- Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
- Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
- Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).
