Summary
Este protocolo describe una novedosa técnica de medir los tres parámetros más importantes de la lesión cerebral isquémica en el mismo conjunto de muestras cerebrales de roedores. El uso de una sola muestra cerebral es altamente ventajoso en términos de costos éticos y económicos.
Abstract
Una de las causas más comunes de morbilidad y mortalidad en todo el mundo es el accidente cerebrovascular isquémico. Históricamente, un modelo animal utilizado para estimular el accidente cerebrovascular isquémico implica oclusión arterial cerebral media (MCAO). La zona infarta, el edema cerebral y la descomposición de la barrera hematoencefálica (BBB) se miden como parámetros que reflejan el alcance de la lesión cerebral después del MCAO. Una limitación significativa a este método es que estas mediciones se obtienen normalmente en diferentes muestras de cerebro de rata, lo que conduce a cargas éticas y financieras debido al gran número de ratas que necesitan ser eutanasiadas para un tamaño de muestra adecuado. Aquí presentamos un método para evaluar con precisión las lesiones cerebrales después de MCAO midiendo la zona infarta, el edema cerebral y la permeabilidad bbb en el mismo conjunto de cerebros de ratas. Esta novedosa técnica proporciona una manera más eficiente de evaluar la fisiopatología del accidente cerebrovascular.
Introduction
Una de las causas más comunes de morbilidad y mortalidad en todo el mundo es el accidente cerebrovascular. A nivel mundial, el accidente cerebrovascular isquémico representa el 68% de todos los casos de accidente cerebrovascular, mientras que en los Estados Unidos el accidente cerebrovascular isquémico representa el 87% de los casos de accidente cerebrovascular1,2. Se estima que la carga económica del ictus alcanza los 34.000 millones de dólares en los Estados Unidos2.000 millones de dólares y los 45.000 millones de euros en la Unión Europea3. Los modelos animales de ictus son necesarios para estudiar su fisiopatología, desarrollar nuevos métodos de evaluación y proponer nuevas opciones terapéuticas4.
El accidente cerebrovascular isquémico ocurre con oclusión de una arteria cerebral importante, generalmente la arteria cerebral media o una de sus ramas5. Así, los modelos de accidente cerebrovascular isquémico han implicado históricamente oclusión arterial cerebral media (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Después de MCAO, las lesiones neurológicas se evalúan con mayor frecuencia midiendo la zona infarta (IZ) utilizando un método de tinción de cloruro de 2,3,5 tripfeniltrazolium (TTC)13,edema cerebral (BE) usando14, 15,16,y la permeabilidad de la barrera hemisférica de la barrera hemisférica de la sangre (BBB) mediante una técnica de espectrometría utilizando las manchas azules evans17,18,19.
El método tradicional MCAO utiliza conjuntos separados de cerebros para cada una de las tres mediciones cerebrales. Para un gran tamaño de muestra, esto resulta en un número significativo de animales eutanasiados, con consideraciones éticas y financieras añadidas. Un método alternativo para aliviar estos costos implicaría mediciones de los tres parámetros en un solo conjunto de cerebros de roedores post-MCAO.
Se han realizado intentos anteriores para medir combinaciones de parámetros en la misma muestra cerebral. Se han descrito métodos de tinción inmunofluorescentes simultáneas20, así como otros análisis moleculares y bioquímicos21 después de la tinción de TTC en la misma muestra cerebral. Hemos calculado previamente los volúmenes del hemisferio cerebral para evaluar el edema cerebral y hemos realizado manchas de TTC para calcular la zona infarta en el mismo cerebro establecido15.
En el protocolo actual, presentamos una técnica de MCAO modificada que mide la lesión cerebral isquémica a través de la determinación de la permeabilidad iz, BE y BBB en el mismo conjunto de cerebros de roedores. Iz se mide mediante tinción TTC, BE se determina calculando el volumen hemisférico, y la permeabilidad BBB se obtiene mediante métodos de espectrometría19. En este protocolo, utilizamos un modelo MCAO modificado, basado en la inserción directa y fijación del catéter monofilamento en la arteria carótida interna (ICA) y el bloqueo adicional del flujo sanguíneo a la arteria cerebral media (MCA)22. Este método modificado muestra una disminución de la tasa de mortalidad y morbilidad en comparación con el método tradicional MCAO16,22.
Este nuevo enfoque proporciona un modelo financieramente sólido y ético para medir lesiones neurológicas después de MCAO. Esta evaluación de los principales parámetros de la lesión cerebral isquémica ayudará a investigar exhaustivamente su fisiopatología.
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Protocol
Los siguientes procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Declaración de Helsinki y Tokio y las Directrices para el uso de animales experimentales de la Comunidad Europea. Los experimentos también fueron aprobados por el Comité de Cuidado animal de la Universidad Ben-Gurion del Negev.
1. Preparación de ratas para el procedimiento experimental
- Seleccione ratas macho sprague-dawley adultas sin patología excesiva, cada una con un peso de entre 300 y 350 g.
- Mantenga todas las ratas a temperatura ambiente a 22 °C, con 12 horas de ciclos claros y oscuros antes del experimento.
- Asegúrese de que los alimentos y el agua estén disponibles ad libitum.
- Realice todos los procedimientos entre las 6:00 a.m. y las 2:00 p.m.
2. Preparación de ratas para cirugía
- Anestesiar las ratas durante 30 min con isoflurano (4% para inducción y 2% para mantenimiento) y 24% oxígeno (1,5 L/min).
- Pruebe el nivel de anestesia en las ratas asegurándose de que no tengan un reflejo de abstinencia del pedal.
- Inserte el catéter del calibre 24 en la vena de la cola.
NOTA: El calentamiento de la cola para vasodilatación no se realiza.- Coloque las ratas sobre la mesa en posición supina. Utilice cinta médica para colocar las cuatro extremidades de las ratas.
- Coloque la sonda para medir la temperatura en el recto de la rata antes de la cirugía.
- Durante el procedimiento, mantenga una placa de calentamiento para soportar una temperatura corporal del núcleo de 37 °C.
- Agregue ungüento en ambos ojos de la rata para protegerse.
- Afeitar el área quirúrgica y desinfectar con tres aplicaciones de 10% povidone-yodo seguido de 70% alcohol isopropílico.
3. Oclusión de la arteria cerebral media derecha
NOTA: MCAO se realiza mediante una técnica modificada, como se describió anteriormente16,22,23, con el uso de instrumentos descritos por McGarry et al.24 y Uluç et al.25.
- Disecciona la piel y la fascia superficial en la línea media ventral del cuello con pinzas quirúrgicas y tijeras con cuchillas curvas.
- Identificar el triángulo muscular, formado por el ICA, la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida común (CCA).
- Separe cuidadosamente el CCA y el ICA correctos del nervio vago con microaplicaps para la cirugía vascular.
- Exponga el CCA y el ICA correctos. Bloquee el flujo sanguíneo que proviene de la CCA al ICA utilizando micro-clips o torniquetes especiales para cirugía vascular. Haga una incisión (aproximadamente 1 mm) en el ICA usando microscisores para cirugía vascular.
- Inserte un catéter monofilamento (nylon 4-0) directamente a través del ICA, aproximadamente 18,5-19 mm desde el punto de bifurcación de la CCA derecha en el círculo de Willis hasta alcanzar una resistencia leve, para ocultar el MCA26.
- Ligar alrededor del ICA por encima de la bifurcación de CCA.
- Para el grupo de control operado por sham, realice una inserción de hilo de nylon en lugar de los pasos 3.5 y 3.616,22.
- Administrar 5 ml de cloruro de sodio al 0,9% mediante inyección intraperitoneal.
- Cierre la herida por sutura y lleve a la rata a un área de recuperación.
NOTA: Unos minutos después del final de la anestesia, la rata se despertará y se moverá independientemente alrededor de la jaula. - A las 23 h después de MCAO, inyectar 2% Evans azul en solución salina (4 mL/kg)23,26 en la vena trasera para ambos grupos operados a través de una cánula27.
NOTA: Esto se utiliza como un trazador de permeabilidad cerebro-sangre. Dejar circular durante 60 minutos.
4. Determinación de la zona infarta
- Medir IZ a las 24 h después de MCAO como se describió anteriormente9,15,18,19,26.
NOTA: Las ratas que perdieron más del 20% de su peso o desarrollaron convulsiones o hemiplejia están excluidas del experimento. - Eutanasia a la rata reemplazando la mezcla de gas inspirada por un 20% de oxígeno y un 80% de dióxido de carbono hasta que la rata deje de respirar espontáneamente.
- Abra el pecho con una incisión lateral de 5-6 cm a través de la pared abdominal debajo de la caja torácica con tijeras y fórceps quirúrgicos.
- Realice una incisión diafragmática a lo largo de toda la longitud de la caja torácica con tijeras y fórceps quirúrgicos.
- Desplazar cuidadosamente los pulmones, cortar a través de la caja torácica hasta la clavícula en los lados derecho e izquierdo28.
- Perfuso con 200 ml de solución salina normal a través del ventrículo izquierdo del corazón.
- Pinchazo o incienso el atrio derecho del corazón con tijeras.
- Realiza la decapitación usando una guillotina y recoge tejido cerebral.
- Usando tijeras de iris, corta desde el antenombre hasta el borde distal de la superficie posterior del cráneo en ambos lados.
- Separa las bombillas olfativas, las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral y la superficie dorsal del cráneo del cerebro.
- Extraiga el cerebro de la cabeza.
- Produzca 6 rebanadas cerebrales creando secciones horizontales de 2 mm de espesor con una hoja de afeitar de .009", sin recubrimiento y de un solo borde.
- Incubar durante 30 min a 37 °C en 0.05% TTC.
- Coloque el tejido cerebral en las diapositivas del microscopio y realice la exploración óptica de estas 6 rebanadas cerebrales con una resolución de 1600x1600 dpi (ver Suplemento 1 por ejemplo).
- Añada un filtro azul con un editor de fotos (por ejemplo, Adobe Photoshop CS2) utilizando la función Mezclador de canales(Imagen > Ajustes > Mezclador de canales)y guarde la imagen como formato de archivo JPEG.
NOTA: Después de aplicar el filtro azul, la imagen aparecerá en escala de grises. - Abra la imagen guardada en ImageJ 1.37v29,30.
NOTA: Este programa informático utiliza una función de umbral para aislar y calcular los píxeles que son en blanco o negro (consulte la figura 1). - Para cada uno de los 6 sectores cerebrales de la imagen, seleccione y guarde cada hemisferio (ipsilateral lesionado derecho e contralateral izquierdo sin lesiones) como un archivo de imagen independiente utilizando la herramienta "selección de polígonos" del menú principal.
- Establezca el límite para determinar IZ mediante una función de umbral automático en el menú principal del software ImageJ seleccionando Imagen > Ajustar > Umbraly mida el número de píxeles en cada hemisferio de un solo conjunto cerebral.
NOTA: Las macros se pueden utilizar para este paso en el software ImageJ (consulte suplemento 2 para el código). El corte es un parámetro crítico para determinar qué píxeles convertir al blanco y qué convertir al negro dependiendo del tono de gris (consulte Suplemento 3 y Suplemento 4 como ejemplos). A continuación, ImageJ compara píxeles blancos y negros para determinar IZ. Basándonos en el protocolo de tinción y la configuración del escáner, usamos un valor de corte constante de 0,220. - Realizar la medición de la corrección de IZ para la hinchazón del tejido utilizando las relaciones de los hemisferios cerebrales ipsilaterales y contralaterales (RICH) método13,23 (ver ejemplo en suplemento 5).
NOTA: El tamaño infarto se evalúa como un porcentaje del hemisferio contralateral.
5. Determinación del edema cerebral31
NOTA: Utilice ImageJ 1.37v para la medición de BE32,33.
- Mida BE 24 h después de MCAO. Para el cálculo de BE, utilice los datos del volumen del hemisferio izquierdo y derecho (en unidades).
- Realice el escaneo óptico con una resolución de 1600x1600 ppp (consulte suplemento 1, por ejemplo).
- Seleccione los hemisferios cerebrales y establezca el corte para determinar BE con ImageJ 1.37v, como se describió anteriormente en las secciones 4.17-4.19.
- Exprese el área BE como porcentaje de las áreas estándar del hemisferio contralateral no afectado, calculada por el método RICH utilizando la siguiente ecuación (véase el ejemplo en Suplemento 5)23,34.
NOTA: La extensión de BE se evalúa como un porcentaje del hemisferio contralateral.
6. Determinación de la interrupción del BBB
- Mida la interrupción de BBB 24 h después de MCAO.
- Divida los hemisferios derecho e izquierdo en seis rebanadas y coloque cada uno en un tubo de microcentrífuga.
- Homogeneizar cada rebanada del tejido cerebral en ácido tricloroacético, basado en el cálculo de 1 g de tejido cerebral en 4 ml de ácido tricloroacético al 50%.
- Centrífuga a 10.000 x g durante 20 min.
- Diluir líquido sobrenadante 1:3 con 96% etanol.
- Realice espectrofotometría de luminiscencia utilizando software de espectrofotometría, instalando la placa y realizando una lectura de muestra utilizando los siguientes parámetros: Longitud de onda de excitación de intensidad de fluorescencia de 620 nm (ancho de banda 10 nm) y una longitud de onda de emisión de 680 nm (ancho de banda 10 nm)23,35 ; Mod superior; Número Carne 25; Manual 100; Agitar 1 s, 1 mm.
NOTA: Utilice una longitud de onda de excitación de 620 nm (ancho de banda 10 nm) y una longitud de onda de emisión de 680 nm (ancho de banda 10 nm). 23,35
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Representative Results
Medición de zona infarto
Una prueba t de muestra independiente indicó que 19 ratas que se sometieron a MCAO permanente demostraron un aumento significativo en el volumen de infartos cerebrales en comparación con las 16 ratas operadas por sham (MCAO=7.49% ± 3.57 contra. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (véase la Figura 2A)). Los datos se expresan como un porcentaje medio del hemisferio contralateral ± SD.
Medición del edema cerebral
Una prueba t de muestra independiente indicó que 19 ratas que se sometieron a MCAO permanente demostraron un aumento significativo en la extensión del edema cerebral después de 24 h en comparación con las 16 ratas operadas por sham (MCAO=12.31% ± 8.6 vs. Sham = 0,64% ± 10,2, t(29,37) = 3,61, p = 0,01, d = 1,23 (véase la Figura 2B)). Los datos se expresan como un porcentaje medio del hemisferio contralateral ± SD.
Permeabilidad de la barrera hematoencefálica
Una prueba t de muestra independiente indicó que 19 ratas que se sometieron a MCAO permanente demostraron un aumento significativo en el grado de descomposición del BBB después de 24 h en comparación con las 16 ratas operadas por sham (MCAO=2235 ng/g ± 1101 vs. Sham = 94 ng/g ± 36, t(18.05) = 8.47 p < 0.01, d = 2.7 (véase la Figura 2C)). Los datos se miden en ng/g de tejido cerebral y se presentan como media ± SD.
| Grupo | Hora | Procedimientos |
| Sham operado (16 ratas) | 0 | Inducción de MCAO e inserción de filamento para grupo operado por sham |
| MCAO (19 ratas) | ||
| Sham operado (16 ratas) | 23h | Inyección de evans azul |
| MCAO (19 ratas) | ||
| Sham operado (16 ratas) | 24h | Colección cerebral para mediciones de la interrupción de IZ, BE y BBB |
| MCAO (19 ratas) |
Tabla 1: Cronología del protocolo. A las 23 h después de MCAO, se inyectó la solución azul evans. Una hora más tarde (24 h después de MCAO), se realizó la recolección de cerebros, e IZ, BE y BBB permeabilidad se midieron en todos los grupos.
Figura 1: Rebanadas cerebrales representativas de ratas MCAO y operadas por una farsa.
(A-B) Imagen escaneada original. (C-D) Transformación a escala de grises. (E-G) Función de umbral. (G-H) Aplicación de un filtro azul. (I-J) Función de umbral después de la aplicación de filtro azul. (K-L) Uso de la función de umbral para evaluar el edema cerebral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados histológicos de ratas MCAO en comparación con ratas operadas por la farsa.
(A) Zona de infarto. El volumen de la zona infarto en 19 ratas después de mcao se incrementó significativamente en comparación con las 16 ratas operadas por sham 24 h después de la cirugía (*p < 0.01). B) Edema cerebral. El volumen de edema cerebral en 19 ratas después del MCAO se incrementó significativamente en comparación con las 16 ratas operadas por sham 24 h después de la cirugía (*p < 0.01). (C) Permeabilidad de la barrera hematoencefálica. La permeabilidad de la barrera hematoencefálica en 19 ratas después del MCAO se incrementó significativamente en comparación con las 16 ratas operadas por sham 24 h después de la cirugía (*p < 0.01). Los valores se expresaron como un porcentaje medio del hemisferio contralateral ± SD y significan el índice de extravasación azul evans en ng/g de tejido cerebral ± SD según muestras independientes t-test. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando p< 0.05, y muy significativos cuando p < 0.01. Esta cifra ha sido modificada de Kuts et al.23Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplemento 1: Ejemplo de escaneo de rebanadas cerebrales. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Suplemento 2: Macros que se pueden utilizar en el software ImageJ para la función de umbral automático y medir píxeles. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Suplemento 3: Ejemplo de umbral automático. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Suplemento 4: Ejemplo de píxeles medidos en cada hemisferio. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Suplemento 5: Análisis de muestras. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
El objetivo principal del presente protocolo era demostrar mediciones consistentes de tres parámetros principales de lesión isquémica: IZ, BE y BBB permeabilidad. Estudios previos en este campo han demostrado la posibilidad de realizar uno o dos de estos parámetros juntos en la misma muestra. Además de la reducción de costes que ofrece este método de tres partes, también proporciona un modelo bioético más deseable que limita el número de animales que deben ser operados y posteriormente eutanasiados. Al igual que en todas las técnicas histológicas, el método está limitado por la incapacidad de observar lesiones isquémicas dinámicamente.
En el análisis de imágenes se utilizaron cuatro programas informáticos: ImageJ 1.37v, Adobe Photoshop CS2, Microsoft Excel 365 e IBM SPSS Statistics 22. ImageJ se utilizó para medir la extensión de la zona infarta y el edema cerebral. Adobe Photoshop se utilizó para limitar el efecto de Evans azul en el tejido cerebral, ya que un color azul indica descomposición BBB. Antes de calcular la zona infarta, es necesario eliminar el color azul de la imagen, ya que el color no permite mediciones precisas de la zona infarta (consulte la Figura 1B, 1D, 1F). Excel y SPSS se utilizaron para el procesamiento de datos.
La técnica para evaluar una zona infarta con software informático ImageJ se basa en una comparación de píxeles en blanco y negro en un hemisferio sano a píxeles en un hemisferio infarto. En el hemisferio infarto, la zona infarta no está manchada con TTC; por lo tanto, se indica mediante una región blanca en la Figura 1B que se mide. Para que el programa calcule correctamente la zona infarta, es necesario convertir los píxeles en tonos de intensidades variables de colores grises (consulte la Figura 1F, 1J). El color azul, causado por Evans blue (véase la Figura 1B),puede afectar a la evaluación de la zona infarta (véase la Figura 1F). Por lo tanto, el primer paso es eliminar el color azul usando un filtro azul y luego convertir la imagen en una imagen en blanco y negro (consulte la Figura 1J). Utilizamos Adobe Photoshop, pero otros programas informáticos también se pueden utilizar para este propósito, como RawTherapeePortable.
A continuación, establecimos parámetros uniformes para calcular la zona infarta en las 6 rebanadas de un conjunto cerebral utilizando ImageJ con el fin de estandarizar el procedimiento de medición. Esto es necesario porque los 6 sectores de cada conjunto fueron manchados y escaneados en las mismas condiciones y requieren un parámetro de corte unificado. El corte es un parámetro crítico para determinar qué píxeles convertir a blanco y qué convertir en negro dependiendo del tono de gris (consulte la Figura 1D, 1H). Utilizamos la función Umbral del menú principal para este propósito. El último paso en el análisis de imágenes fue el cálculo de la zona infarta y el edema cerebral.
La medición de la zona infarta puede realizarse mediante diversas técnicas, incluyendo tinción histológica o técnicas radiológicas como un tomograma computado36,tomografía por emisión de positrones e imágenes de resonancia magnética23,36. Estudios previos en el laboratorio han demostrado la evaluación del volumen infarto utilizando tinción con TTC15,26. Este método se basa en una reacción química entre TTC y deshidrogenasas mitocondriales de las neuronas. Los tejidos sanos, ricos en deshidrogenasas, están coloreados de rojo con esta tinción. Sin embargo, en las células necróticas, este cambio de color no se produce debido al daño en el sistema que participa en la oxidación de compuestos orgánicos37. En nuestros estudios anteriores, demostramos una alta correlación entre esta técnica histológica y resulta de la exploración de imágenes cerebrales de esta área23.
Las mediciones del edema cerebral se pueden evaluar tanto in vivo como in vitro. El edema cerebral es el resultado de cambios patológicos en las actividades de los canales de iones de sodio y calcio y transportadores que conducen a un aumento del agua intracelular38,39,40,41. Alternativamente, la hinchazón puede ocurrir por daño de BBB que aumenta el agua extracelular. 42 En estudios anteriores, el edema cerebral se determinó en base a técnicas húmedas y secas seguidas del cálculo del contenido de agua tisular43. Una ventaja del método que presentamos en este protocolo es su simplicidad y precisión en comparación con otras técnicas existentes23,44,45.
El método más útil para la detección de averías BBB es la espectroscopia de luminiscencia después de la inyección azul de Evans. La medición de la permeabilidad BBB se basa en la inyección de evans azul, que se une a la albúmina. A su vez, la masa molecular de albúmina es de 66 kDa y mucho más significativa que el peso molecular de Evans azul 961 Da. Por lo tanto, la medición de la permeabilidad BBB está determinada precisamente por la masa molecular de albúmina que penetra a través del BBB dañado, transfiriendo así el azul Evans. Además de las técnicas descritas anteriormente, existen otras técnicas, en particular las basadas en una combinación de diversas moléculas dextrans y radiactivas, que en conjunto dan resultados más precisos. La medición de la descomposición BBB por espectrometría de luminiscencia es más barata y fácil de usar, en comparación con técnicas más precisas pero más costosas. Utilizamos este método para las evaluaciones de la interrupción de BBB junto con mediciones de zona infarta y edema cerebral. Inyección de Evans azul para la evaluación de la permeabilidad BBB antes de la inducción de MCAO no afecta a la precisión de medir estos dos parámetros23.
El protocolo actual presenta una técnica novedosa para medir los tres determinantes más importantes de la lesión cerebral isquémica en la misma muestra cerebral. Este método también se puede aplicar a modelos de otras lesiones cerebrales. Este protocolo contribuirá al estudio de la fisiopatología de lesiones isquémicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko y Evgenia Goncharyk del Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Ecología y Medicina, Oles Honchar, Universidad Dnipro, Dnipro, Ucrania por su apoyo y contribuciones útiles a nuestros debates. Los datos obtenidos forman parte de la tesis doctoral de Ruslan Kuts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
| 27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
| 3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
| Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
| Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
| Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
| Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
| Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
| ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Office 365 ProPlus | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
| Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
| Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |
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