Summary
이 프로토콜은 부화 전에 계란 케이스(oothecae)를 살균하는 표면을 통해 그노토바이오틱 미국바퀴벌레(페리플라네나 아메리카나)를설치하고 유지하는 데 사용됩니다. 이 뇨토바이오틱 곤충은 수직으로 전염된 Blattabacterium 내시빅바이오엔트를 함유하고 있지만 도끼 내장이 있습니다.
Abstract
Gnotobiotic 동물은 미생물군유전체 구조와 기능에 대한 제어 연구를 위한 강력한 도구입니다. 여기에 제시 된 gnotobiotic 미국 바퀴벌레의 설립 및 유지 보수를위한 프로토콜입니다(페리 플라토나 아메리카나). 이 접근 방식에는 지속적인 품질 관리에 대한 불임 검사가 내장되어 있습니다. 뇨토바이오틱 곤충은 수직으로 전염된내시빅비언트(Blattabacterium)를여전히 함유하고 있지만 일반적으로 표면과 소화관에 상주하는 다른 미생물이 부족한 바퀴벌레로 정의됩니다. 이 프로토콜의 경우, 계란 케이스(oothecae)는 (비멸균) 스톡 콜로니와 표면 살균에서 제거됩니다. 일단 수집및 살균되면, 오스테카는 부화하거나 오염으로 인해 제거 될 때까지 뇌 심장 주입 (BHI) 한천에 약 4-6 주 동안 30 °C에서 배양됩니다. 부화 된 님프는 BHI 바닥, 멸균 물 및 멸균 쥐 사료가 들어있는 Erlenmeyer 플라스크로 옮겨져 있습니다. 님프가 주어진 조건에서 BHI에서 성장할 수 없는 미생물을 수용하지 않도록 하기 위해, 추가 품질 관리 측정은 비엔도시모틱 미생물을 테스트하기 위해 제한 단편 길이 다형성(RFLP)을 사용합니다. 이 접근법을 사용하여 생성된 Gnotobiotic 님프는 간단하거나 복잡한 미생물 공동체로 접종될 수 있으며 장내 미생물군유전체 연구의 도구로 사용될 수 있습니다.
Introduction
Gnotobiotic 동물은 미생물군유전체 연구1,2,3에귀중한 도구로 입증되었습니다. 세균이 없고 정의된 식물동물은 숙주 면역학적 반응, 장 상피 성숙, 숙주 대사1,4,5,6,7을포함한 숙주 세균 상호작용의 용해를허용했다. 단순화된 공동체로 접종된 Gnotobiotic 동물은 특히 교차 수유 및 적대관계를 해명하는 창자 커뮤니티에서 미생물 상호 작용에 대한 보다 완전한 이해를 도왔습니다8,9,10,11. 포유류 장 내 미생물군유전체연구를 위한 현재 바람직한 모델 시스템은 뮤린 모델이다. 이 시스템은 위에서 설명한 발견에서 매우 중요했지만, 주요 단점은 관련된 비용입니다. 전문 장비와 고도로 훈련된 기술자는 gnotobiotic 시설을 설치하고 유지 관리해야 합니다. 이것은, gnotobiotic 동물 유지 의 모든 양상에 주어져야 하는 추가 주의와 함께, 표준 동물모델(12)보다번식하기 위하여 10-20 배 더 많은 비용을 요하는 gnotobiotic 동물을 일으키는 원인이 됩니다. 높은 비용으로 인해, 많은 연구자들은 gnotobiotic 뮤린 모델을 감당할 수 없을 수 있습니다. 또한, 뮤린 모델은 인간의 건강을 번역하고자하는 연구에 가장 널리 허용 된 선택이 될 수 있지만, 여전히 인간과 마우스 내장 사이의 많은 생리적 및 형태적 차이가 있다13. 분명히 어떤 단수 모델은 창 자 microbiome의 많은 양상에 관하여 질문의 계속 증가하는 수를 대답하기에 충분하지 않습니다.
곤충 모델은 포유류 종에 비해 유지 보수 비용이 낮기 때문에 더 저렴한 대안입니다. 다양한 곤충 종에서 광범위한 세균이 없고 귀생생연구는 여러 가지 일반적으로 사용되는 모델의 개발을 주도하고 있다. 모기와 드로소필라는 글로벌 질병과 유전적 학력14,15에대한 관련성 때문에 세균없는 작업을위한 일반적인 모델입니다. 또 다른 신흥 모델 시스템은 수분 및 사회성 연구의 중요성을 감안할 때 꿀벌(아피스 멜라이프라)의것입니다16. 그러나, 이러한 일반적으로 사용되는 곤충의 대부분은 포유류 창자 지역 사회에서 볼 수있는 분류학적 복잡성이 부족17,더 높은 순서 상호 작용을 모델링하는 능력을 제한. 뿐만 아니라 포유류와 더 유사한 미국 바퀴벌레의 창자에서 발견 되는 미생물의 총 다양성, 하지만 바퀴벌레 창 자에 존재 하는 미생물의 많은 일반적으로 포유류와 인간의 창 자 미생물에서 발견 되는 가족과 필라에 속한다 18. 바퀴벌레의 힌드구트는 또한 영양분19,20의추출을 돕기 위해 박테리아로 조밀하게 포장 된 발효 챔버이기 때문에 포유류의대장과기능적으로 유사합니다. 마지막으로, 바퀴벌레의 잡식성 특성은 식이 전문가와 함께 가능하지 않을 다이어트 정권의 다양성을 허용합니다.
미국 바퀴벌레는 높은 유기체에서 창자 미생물 지역 사회를 이해하는 데 유용한 모델 시스템이 될 수 있지만, 해충으로 바퀴벌레의 상태는 또한 해충 방제(21)에대한 관련이있는시스템을 만든다. 바퀴벌레 건강과 생리학에 대한 장 공동체의 영향에 대한 근본적인 지식을 활용하여 해충 관리를위한 새로운 기술을 개발하는 데 도움을 주었습니다.
이 방법의 목표는 그노토바이오틱 미국 바퀴벌레(페리 플라토나 아메리카나)의설립 및 유지 보수에 대한 포괄적 인 설명을 설명하는 것이지만,이 프로토콜은 어떤 oviparous 바퀴벌레의 님프를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 성숙한 oothecae의 효율적이고 비침습적 수집을 위한 방법 및 곤충의 노토바이오틱 상태를 모니터링하는 비파괴 적 기술을포함(22,23,24). 노토바이오틱 바퀴벌레를 달성하고 유지하는 이전 방법은 ootheca 컬렉션23,24,25,26,27을설명하는 반면, ootheca 성숙도는 종별단서(블라텔라 게르마니카22,24,25)의관점에서 해석되거나 명시적으로 설명되지 않는27,28,시스템에 익숙하지 않은 사람들을 위해 구현이 어렵다. 여기에 설명된 방법은 자연적으로 떨어뜨린 oothecae를 사용하기 때문에 계란을 조기에 제거하는 오류는 없습니다. 이 프로토콜은 문화권에 종속되고 문화권독립적인 품질 관리 방법을 모두 포함하고 있으며, 문화권 에 의존하는 방법은 곤충을 희생할 필요가 없습니다. 마지막으로,이 방법은 달성하고 gnotobiotic 바퀴벌레를 유지하기위한 모든 필요한 정보와 하나, 포괄적 인 프로토콜을 만들기 위해 여러 gnotobiotic 바퀴벌레 연구에서 정보를 함께 제공합니다.
Protocol
1. 재료 의 준비
- 재고 바퀴벌레 문화의 유지 보수
참고 : 이러한 강력한 곤충을 양육하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 대피소와 물을 제공하는 세부 사항은 접근 가능한 재료 (즉, 골판지 튜브 대신 계란 상자)에 따라 다를 수 있습니다. 다음 멸균 프로토콜은 모든 스톡 탱크 설정에 대해 작동합니다.- 37.85 L (10 갤런) 어조에 충분한 우드 칩 침구를 펼쳐 약 1 인치의 침구로 탱크의 바닥을 덮습니다. 조각에 x 4에 2로 (플랫) 골판지를 절단하여 하우징을 준비합니다. 골판지 튜브(예: 화장지 튜브)에 골판지 조각을 삽입하고 탱크의 한쪽 끝에 튜브를 쌓습니다(도1).
- 곤충 탈출을 방지하기 위해 탱크 내부의 상단 2 인치에 석유 젤리의 얇은 층을 얼룩.
참고: 탱크 모서리 안쪽을 제대로 코팅하십시오. - 이전 스톡 탱크에서 골판지 튜브를 옮기고 주민을 풀어주며 바퀴벌레를 넣습니다. 각 전송에 대해, 이동 100-200 혼합 연령, 혼합 섹스 바퀴벌레. 개 사료 (20-30 개)를 추가하고 탱크에서 개 사료의 양을 모니터링하고 낮을 때 리필하십시오.
- 물 접시를 설정합니다.
- 작은 플라스틱 재사용 가능한 식품 용기를 이중 증류수(ddH2O)로 채웁니다. 셀룰로오스 스폰지와 식품 용기 뚜껑의 구멍을 거의 동일한 크기로 자른다.
참고: 셀룰로오스 스폰지는 바퀴벌레가 물 접시에 익사하는 것을 방지합니다.
- 작은 플라스틱 재사용 가능한 식품 용기를 이중 증류수(ddH2O)로 채웁니다. 셀룰로오스 스폰지와 식품 용기 뚜껑의 구멍을 거의 동일한 크기로 자른다.
- 뚜껑의 구멍에 스폰지를 삽입하고 채워진 용기에 뚜껑을 놓습니다. 용기를 탱크에 넣고 낮을 때 리필합니다. 면 천으로 탱크를 덮고 탄성 밴드로 제자리에 고정하십시오.
- 탱크가 과도한 양의 frass와 곤충 시체를 축적하기 시작하면 새로운 탱크를 설치하고 바퀴벌레를 옮기게됩니다.
참고: 탱크는 일반적으로 6개월마다 전송됩니다. 폐기된 스톡 탱크에 남아 있는 모든 바퀴벌레/계란은 -20°C에서 1h로 동결하여 안락사되고, 스톡 탱크의 내용물들은 폐기 전에 오토클레이브 백과 오토클레이브(1h, 중력 주기)로 옮겨져 있습니다. 스톡 탱크는 사용 사이에 2 %의 표백제로 살균됩니다.
- 보조 컨테이너를 소독합니다.
참고: 이 컨테이너에는 필터가 포함되어 있지 않지만 대신 무료 공기 교환을 허용합니다.- 뚜껑과 바닥 의 안쪽을 2 % 표백제로 스프레이하고 10 분 동안 담가 두십시오. 깨끗한 종이 타월로 표백제닦아냅니다.
- 뚜껑 안쪽과 바닥에 70%에탄올을 뿌린 후 깨끗한 종이 타월로 닦아냅니다. 사용이 될 때까지 뚜껑을 교체하십시오.
- 계란과 주택 님프를 배양BHI 경사와 플라스크를 확인합니다.
- 패키지 지침에 따라 BHI를 준비하여 2%의 한천을 추가합니다. BHI-agar 용액을 명확히 할 때까지 끓입니다.
- 경사의 경우 5mL 알리코를 18mm x 150mm 유리 테스트 튜브 및 캡으로 옮기습니다. 오토클레이브를 통해 살균(멸균 시간 = 20분, 액체 사이클). 자동 식튜브를 45° 각도로 배치하여 경사로 식힙니다. 일단 고화되면, 건조를 방지하기 위해 사용할 때까지 냉장.
- 플라스크의 경우 삶은 BHI-agar 용액10mL 알리쿼트를 250mL 에렌마이어 플라스크로 전송하여 플라스크 바닥을 완전히 덮습니다. 플라스크를 호일로 덮고 오토클레이브(20분, 액체 주기)를 통해 살균합니다. 자동 플라스크가 건조를 방지하기 위해 사용할 때까지 냉각하고 냉장 보관할 수 있도록 합니다.
참고: 이 설정에는 공기 필터가 필요하지 않습니다. 호일 커버는 오염이 대기 흐름에서 발생하는 것을 방지하면서 가스 교환을 허용하기에 충분합니다.
- 오토클레이브를 통해 살균: 호일 덮인 비커(살균 시간 = 1h, 중력 주기)에서 반크기(~1/2인치 조각)로 부서진 자동 암쥐 차우, 뚜껑에 담긴 ddH2O(멸균 시간 = 20분, 액체 사이클), 포일 덮인 비커(살균 시간 = 20분, 액체 주기), 포일 덮인 비커(살균 시간 = 20분, 액체 주기) 및 포일 덮인 비커(살균 시간 = 20분, 비커)의 포셉(멸균 시간 = 20분)
참고 : 쥐 차우 비커를 과도하게 채우지 마십시오. 펠릿은 오토클레이브에서 팽창할 것입니다. - "출산 병동" 탱크를 설치합니다.
참고 :이 탱크는 스톡 탱크 (골판지 튜브, 스폰지, 개 사료, 우드 칩 침구가있는 물 접시, 그림 1참조)와 동일한 재료를 포함하고 있으며 oothecae 컬렉션으로 전송되지 않는 한 바퀴벌레가 비어 있어야합니다 (섹션 2 참조). - 과포화 나트륨 염화나트륨(NaCl) 용액으로 가득 찬 비커를 준비하여 인큐베이터를 가습합니다. ddH2O의 100mL당 37g의 NaCl을 추가하고 용해 될 때까지 저어서이 솔루션을 준비하십시오.
참고: 일반적으로 포화 염용액 500mL는 일반적으로 챔버 치수 51cm x 46cm x 46cm(H x W x D)로 인큐베이터를 가습한 후 약 한 달 동안 더 많은 물을 첨가해야 합니다.
2. 오테카에 컬렉션
- 스모크 탱크에서 "출산 병동"으로 오테카(그림2)를운반하는 여성을 이송하여 중력여성을 포함하는 골판지 튜브를 이동시합니다.
- 카보드 튜브에 중력 여성 이외에 여러 곤충이 포함되어 있는 경우 먼저 튜브를 석유 젤리로 고리로 울리는 추가 플라스틱 용기에 넣고 대상 곤충이 골판지 튜브로 다시 올라가도록 장려합니다.
- 암컷을 스톡 탱크로 옮기면 오테카에 떨어뜨리면 다시 스톡 탱크로 옮깁니다. 집게로 탱크의 쓰레기에서 오테카를 검색합니다.
참고 : 오테카에는 종종 전송되는 여성의 24 시간 이내에 삭제됩니다.
3. 오테카에 청소
- 도데딜 황산나트륨(SDS)의 3mL를 함유한 5mL 원심분리기 튜브에 oothecae를 추가합니다. 10 초 용 소용돌이. 신선한 SDS가 들어있는 원심분리기 튜브로 두 번째 세척 단계를 반복하십시오.
참고: SDS 3mL당 최대 5개의 오테카에사용할 수 있습니다. - 섬세한 작업 닦아, 부드럽게 파편을 제거하기 위해 각 ootheca의 표면을 문질러. 철저한 청소를 돕기 위해 더 많은 SDS가 추가될 수 있습니다. 세척된 오스테카를 계량 보트에 놓고 멸균이 준비될 때까지 청소하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있지만, 습도가 낮은 환경에서 장시간(며칠에서 몇 주) 동안 오테카를 방치하면 탈수되고 생존력을 잃게 됩니다.
4. 옴테카의 살균 및 인큐베이션
- 살균 후 헹구기 위한 알리쿼트 멸균 물. 모든 ootheca를 살균하려면 멸균 수의 1mL로 두 개의 1.5mL 원심분리기 튜브를 채웁니다.
- 농축 된 10 μL 추가 (32%) 멸혈산 재고 용액은 5mL 원심분리기 튜브에서 ddH 2 O의3.2mL로 용액하여 멸균을 위한 0.1% 용액을 생성한다. 뚜껑을 두어 여러 번 반전하여 혼합합니다.
주의: 과자산은 피부 나 폐와 접촉하는 데 유해합니다. 연기 후드에 희석.
참고: 이 작업은 살균과 같은 날 수행해야 합니다. 사전에 희석되면 용액이 신속하게 분해되어 제대로 살균되지 않습니다. 5개의 세척된 oothecae는 희석산의 3.2mL에서 살균될 수 있다. - 5 분 동안 0.1 % peracetic 산 용액에 코테카 (최대 5)를 청소하십시오. 튜브를 60s마다 여러 번 반전시면 됩니다.
- 라미나르 플로우 후드에서 멸균 포셉을 사용하여 각 ootheca를 알리인용 멸균 헹구기 물(4.1단계)으로 자체 원심분리기 튜브로 이송합니다. 혼합하려면 여러 번 반전하십시오. 두 번째 헹구기를 반복한 다음 헹구는 각 ootheca를 멸균 집게를 사용하여 자체 BHI 경사로 옮깁니다.
- 멸균 된 보조 용기에 경사를 놓습니다. 부화 될 때까지 4-5 주 동안 30 °C에서 가습 된 인큐베이터로 용기를 이동합니다.
참고: 경사는 작은 시험관 랙 또는 중간/소형 비커에 의해 똑바로 유지될 수 있습니다. - 정기적으로 경사를 확인하십시오 (주당 1-2 배). 곰팡이 또는 세균성 식민지 성장이 한천에 나타나면 오염 된 경사를 제거하십시오. 4주 간의 타임포인트가 다가오면 매일 경사를 확인합니다.
참고 : 일단 부화되면, 님프는 BHI혼자에서 최대 몇 주 동안 살아남을 수 있지만 최적으로 성장하지 는 않습니다.
5. 그노토바이오틱 님프의 유지 보수
- 라미나르 플로우 후드에서 멸균 된 쥐 차우의 펠릿을 멸균 집게로 준비 된 BHI 플라스크 (1.3.3 단계에서)로 무균적으로 전달합니다. 멸균 검사로서 플라스크를 24시간 동안 30°C 인큐베이터에 넣고, 성장이 나타나면 사용하지 않는다.
- 멸균 식품 펠릿으로 BHI 플라스크에 님프를 추가합니다. BHI 경사에서 그들을 흔들어 그들이 라미나르 흐름 후드에 플라스크에 빠지게.
참고 : 님프는 테스트 튜브의 유리 벽에 견인이 없습니다. 튜브를 흔들어 경사에서 그들을 노크 한 다음 플라스크에 유리아래로 밀어 수 있도록 튜브를 팁 효과가 있습니다. 님프는 집게를 사용하여 옮길 수 있지만 치명적인 부상의 위험이 높습니다. - 플라스크의 BHI 바닥에 직접 파이프를 하여 라미나르 흐름 후드에서 일주일에 한 번 300 μL의 멸균 수를 가진 물 님프.
- nymph 대변이 BHI 바닥을 커버하기 시작하면 새로운 BHI 플라스크로 옮기고, 5.1 단계에서와 같이 살균 된 쥐 차우 24 h를 사전에 추가합니다 (멸균을 확인하기 위해).
6. 멸균의 품질 관리
- 제한 단편 길이 다형성(RFLP)을 통해 gnotobiotic 상태의 배양 독립적 품질 관리 검사를 위해 BHI 플라스크에서 하나의 nymph를 제거합니다. 이렇게하려면, 멸균 원심분리기 튜브에 님프를 부어 (단계 에서 님프 전달과 유사 5.1) 플라스크에 멸균 나무 어플리케이터를 배치하고 님프가 등반을 시작하기를 기다린 다음 원심분리튜브로 전송합니다.
- 원심분리기 튜브의 님프에 1x 인산염 완충식식염식염수(PBS)의 0.5mL를 추가하고 모든 큰 조각이 파손될 때까지 멸균 마이크로페일로 균질화합니다. 소용돌이 잘.
- 세균 DNA 추출키트(재료표)를이용하여 님프 균질화로부터 DNA를 추출합니다.
- 원심분리기는 5,000 x g에서 10분 동안 균질화된 님프를 원심분리하고 상체를 제거합니다. 열 셰이커를 37°C로 예열합니다.
- 1x Tris-EDTA의 100 μL을 추가하고 소용돌이를 추가하여 펠릿을 완전히 다시 보펜합니다. 리소지메10μL을 넣고 섞은 다음, 예열된 37°C 열 셰이커에서 30분(흔들림 없음) 인큐베이션을 넣습니다.
- 25 mg의 유리 구슬을 샘플에 넣고 최대 속도로 5분 동안 소용돌이를 추가합니다. 열 셰이커를 55°C로 예열합니다.
- 비드가 100μL의 단백질제 K 버퍼와 20 μL의 단백질제 K. 소용돌이가 완전히 섞인 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 체전하기 전에 정착하도록 허용하십시오.
- 600 rpm에서 흔들리는 인큐베이션은 60 분 동안 55 °C 열 셰이커로 흔들어줍니다. 원심분리기는 10,000 x g에서 2분 동안, 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 상류체를 전송합니다. 열 셰이커를 65°C로 예열합니다. 65°C 혼성화 오븐에서 용출 버퍼를 예열하기 시작합니다.
- 100% 에탄올의 220 μL을 추가합니다. 20 초 최대 속도로 소용돌이. 10배 위아래로 피펫팅하여 눈에 보이는 침전을 분해합니다.
- DNA 컬럼을 2mL 수집 튜브에 삽입하고, 형성되었을 수 있는 침전을 포함하여 샘플을 컬럼으로 옮기다. 원심분리기는 1분 동안 10,000 x g의 원심분리기를 1분 동안, 수집 튜브에서 여과물을 버리고 수집 튜브를 교체합니다.
- 열에 바인딩 버퍼 500 μL을 추가하고 원심분리기를 1분 동안 10,000 x g로 추가합니다. 수집 튜브에서 여과물을 버리고 수집 튜브를 교체합니다.
- DNA 세척 버퍼 700μL을 컬럼에 넣고 원심분리기를 1분 동안 10,000 x g에 추가합니다. 수집 튜브에서 여과물을 버리고 수집 튜브를 교체합니다. 두 번째 세척 단계를 위해 반복합니다.
- 원심분리기 빈 기둥은 2분 동안 빈 열을 건조하고, 그 후 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 컬럼을 전송합니다. DNA 컬럼 매트릭스에 직접 예열된 용출 버퍼 50 μL을 추가하고 65°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 원심분리기 10,000 x g에서 1분 동안 엘ute. 분광광법 또는 불소법을 통해 여과에서 추출된 DNA를 정량화한다.
- 전체 16S 유전자를 증폭하고 소화합니다. 젤 전기 전광을 사용하여 조각을 시각화합니다.
- 2배 마스터 믹스의 12.5 μL, 각 프라이머 1492R의 0.5 μL(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) 및 27F(5'-AGAGTGATCCTGGCTCAGG), DNA 5ng 및 분자등급 물을 사용하여 총 반응부 25μL을 사용하십시오.
- 다음 열순환기 프로그램 실행: 60s에 대한 94°C; 30s용 94°C의 35사이클, 45s용 50°C, 90s용 68°C; 그 다음에는 68°C가 5분 동안.
- DNA 정제키트(재료표)를사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR) 제품을 정화합니다.
- PCR 제품 및 소용돌이에 120 μL의 정화 버퍼를 추가하여 혼합합니다. 뚜껑 안쪽에 물방울을 모으기 위해 간략하게 원심분리기. DNA 컬럼을 2mL 수집 튜브에 삽입하고, 1분 동안 ≥13,000 x g에서 준비된 컬럼및 원심분리기로 액체를 전달한다.
- 여과를 버리고 수집 튜브를 교체합니다. DNA 세척 버퍼 와 원심분리기 700 μL을 ≥13,000 x g에서 1분 간 추가합니다. 여과를 버리고 수집 튜브를 교체합니다. 두 번째 세척 단계를 위해 반복합니다.
- 빈 열을 2분 동안 원심분리하여 컬럼을 건조시키고 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮김합니다. DNA 컬럼 매트릭스에 직접 예열된 용출 버퍼 50 μL을 추가하고 실온에서 2분 동안 배양합니다.
- 원심분리기 10,000 x g에서 1분 동안 엘ute. 분광광법 또는 불소법을 통해 필로테산에서 추출된 DNA를 정량화한다.
- 소화 완충제 5μL, 10단위 RsaI, 분자등급 물에 1μg을 추가하여 총 반응량 50 μL. 혼합하여 37°C에서 37°C로 배양하고 60분 동안 배양한다.
- 2% 아가로즈 젤에 소화된 DNA의 20 μL을 실행하여 젤 전기전경을 통해 소화된 제품을 분리합니다. 젤을 시각화하여 유노바이오틱 상태를 확인합니다.
참고: 노토바이오틱 곤충은 내시빅비엔트, 블랫타박테리움의16S rDNA 서열을 기준으로 402bp, 201bp, 163~148bp의 대역만 발생한다. 젤에서 볼 수있는 여분의 밴드는 미생물 종을 오염시키는 것을 나타냅니다.
7. 님팔 성장의 무균 추적
- 플라스크의 반투명 BHI 바닥을 통해 곤충을 측정하여 몸의 성장을 추적하기 위해 몸 길이를 기록합니다.
참고: 님프는 움직임을 느리게 하기 위해 15분 동안 4°C에 배치되어 측정하기가 더 쉬워집니다.
Representative Results
스톡 탱크는 그림 1에묘사된 대로 설정됩니다. "임신"여성은 그림 2에서그림과 같이 후방 복부에 부착 된 ootheca에 의해 식별됩니다. BHI 한천에 스오토케를 배양하면 비파괴적 방식으로 노토바이오틱 품질 관리를 할 수 있습니다. 경우에 따라 살균이 실패하고 도 3B에서와같이 스누테카 주위에 성장이 나타납니다. 이러한 오테카는 제거하고 폐기해야합니다. 우리의 손에는 멸균(n =51)에 대해 평균 고장률이 10%나 관찰되었다. 피규어 3A에서볼 수 있듯이, 오스테카는 매체에 성장하지 않고 살균 후 평균 34일의 해치. 우리는 멸균, 오염되지 않은 oothecae에 대한 41 %(n = 46)의 전형적인 해치 비율을 관찰했으며, 오스테카 당 평균 11 개의 nymphs를 관찰했습니다. 더 큰 님프는 도 4에서와같이 호일로 덮인 BHI 플라스크로 전송됩니다. 호일은 오염을 방지하고, 님프는 성장할 여지가 있다. 균질화된 nymph로부터의 16S rDNA의 RFLP는 유토바이오틱 상태를 확인하는 데 사용된다. Gnotobiotic 님프는 그림 5를나타내는 바와 같이 비멸성 상대보다 느린 속도로 성장하는 것으로 관찰되었습니다. 그림 6은 성공적으로 gnotobiotic 곤충뿐만 아니라 표준 (살균되지 않은) 님프의 결과를 표시합니다.
이 시험은 긍정적인 배양 결과의 부재에 있는 오염을 아직 확인하지 않은 동안, 이 단계는 산소에 민감한 또는 까다로운 미생물을 오염의 존재를 배제하기 위하여 중요한 실험 도중 일상적으로 수행되었습니다. 표준/비멸 곤충에 비해 노토바이오틱 바퀴벌레에서 느린 성장이 관찰되고 있다.
그림 1: 바퀴벌레 스톡 컬쳐 설정.
골판지 튜브는 탱크의 맨 끝에 쌓여 볼 수 있습니다. 음식과 물은 모두 탱크 의 전면 근처에 있습니다. 면 천 커버와 신축성 있는 밴드가 제거되어 가시성을 확보할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: "임신한" 미국 바퀴벌레.
화살표는 오테카를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성공적으로 노토바이오틱 님프의 이미지는 BHI 경사에 부화하고 성공적으로 살균 된 oothecae의 이미지입니다.
오테카는 이 프로토콜에 설명된 대로 살균되고 배양되었다. (A)BHI 경사에 미생물 성장의 부족은 곤충이 컬터유기체가 없다는 것을 나타낸다. (B)식민지 형성을 초래하는 경사에 오테카에 오염된 것으로 버려야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 노토바이오틱 사육 장치.
곤충은 오염을 방지하기 위해 호일 뚜껑으로 덮인 멸균 플라스크에 보관됩니다. 이차 용기(녹색 뚜껑)는 표백제 2%로 살균되고 70%의 에탄올이 있습니다. 보조 컨테이너에서는 공기 흐름이 제한되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 유노토바이오틱 및 비멸균 님프의 신체 길이를 비교하는 대표적인 성장률 데이터. 곤충의 두 그룹은 오토클레이브 설치류 다이어트를 공급했다. 그노토바이오틱 곤충(여기: n =105)은 설명된 바와 같이 BHI에 보관된다. 비살균 곤충 (여기 : n = 50)은 물을위한 작은 요리와 자동 나무 칩 침구플라스크에 살고있습니다. 비멸 균 님프는 0.059 mm/일의 평균 속도 성장, gnotobiotic nymphs 에서 성장 하는 동안 0.028 mm/일 (p < 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 품질 관리를 위한 RFLP 결과의 대표적인 젤 이미지.
전체 16S 유전자 앰플리톤은 RsaI로 소화되었다. PCR에 대한 DNA는 1x PBS에서 균질화된 님프로부터 추출되었다. "G nymph" 차선은 그놈바이오틱 님프에 해당하며, "conv nymph" 차선은 기존의 비멸균 차선과 일치합니다. 가상 제한 다이제스트에 기초하여,내시빅바이오트(Blattabacterium)는163bp에서 148bp 사이의 대역 얼룩이 있는 402bp, 206bp 및 163bp 크기의 대역을 가질 것으로 예상된다. 노토바이오틱 곤충은 블라타박테리움 밴딩 패턴만 보여줘야 합니다. 혼합 세균 성 지역 사회는 다양한 크기와 밴드의 얼룩이있을 것으로 예상된다, 여기에 표시 "다른 세균 성 16S 조각". 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
gnotobiotic 바퀴벌레의 생성을 설명하는 다른 방법은 oothecae 수집을 설명하지 않았거나 oothecae가 어머니에서 제거 될 수있는 시기를 나타내기 위해 다른 바퀴벌레 종에 특정 벤치 마크를 사용하지 않았다23,25,26. 원래, oothecae는 주식 탱크의 우드 칩 침구에서 수집되었다, 매우 낮은 해치 비율의 결과 (~10%) 비살균된 오스테카(47%)와 비교하면29. 이것은 해치지 않은 oothecae가 재고 케이지에 시간이 지남에 따라 축적되어 있으며 ootheca 시대 나 생존 가능성을 확인할 방법이 없기 때문일 것입니다. "출산 병동"접근 방식을 구현하면 알려진 연령의 갓 기탁 된 오테카를 수집 할 수 있습니다. 이것은 또한 실험 계획을 용이하게, 연구원은 개별 oothecae에 대 한 가능성이 해치 시간을 예상할 수 있습니다. 초기 및 게시된 프로토콜의 또 다른 수정에는 과포화 염화나트륨 용액을 포함하는 반밀봉 챔버에서 oothecae 및 nymphs의 배큐베이션이 포함됩니다. 용액의 존재는 약 75%30의상대 습도를 유지한다. Oothecae는 30°C에서 일상적으로 배양되어 배아의 생존가능성과 ootheca31당생성된 님프 수를 최대화하면서 배양에 필요한 일수를 최소화하는 것으로 나타났다. 부화 후, 귀안 생체 내림질은 실험실 실온 및 주변 조건에서 벤치탑에서 일상적으로 배양되지만 습도 제어 챔버는 중요한 실험에 다시 활용됩니다. ootheca 수집 및 배양에 이러한 변경의 설립 후, 해치 속도는 약 41 %로 증가 (n = 51), 오염으로 인해 제거 oothecae를 포함하지. 해치 속도를 추가로 최적화하는 잠재적 경로에는 ootheca 수집과 살균 사이의 시간을 연장하는 것이 포함될 수 있습니다. 계란 케이스의 큐티클은 초기 방출32에서완전히 무두질되지 않을 수 있으며, 따라서 삭제되는 24 시간 이내에 살균 중에 사용되는 용액에 투과성이 있을 수 있습니다.
0.1% peracetic산을 이용한 멸균 프로토콜은 인형등으로부터적용하였다. 다른 연구는 oothecae 살균을위한 대체 기술을 문서화23,26. 오염률은 BHI 경사에 침투하는 비파괴적 방법을 기반으로 합니다. 이 방법은 오염 된 oothecae의 빠른 식별 및 제거를 허용하기 때문에 매우 유리합니다. 대부분의 이전 프로토콜은 세균계에 대변 또는 님프균주를 도금하고 성장22,23,25,27,28,33을검사하여 배율 성 유기체에 대한 테스트. 적어도 하나의 경우, gnotobiotic 상태를 테스트하는 방법은 완전히 설명되지 않았다26. 클레이튼을 제외하고 는 병24,이전 방법22,23 개의 사육 유방 곤충을 박테리아 배지에 처음 평가하기 위해 단기간에만 멸균 시험 매체를 추가하였다.
내장 품질 관리 조치로 BHI 매체에 생성 된 님프의 지속적인 하우징은 반 실시간으로 그들의 gnotobiotic 상태를 모니터링 할 수 있습니다 - 대부분의 이전 방법에서 볼 수없는 기술22,23. 이것은 gnotobiotic 님프에 접근해야 하는 장기 실험에 특히 유용합니다. 님프 의 밑에 BHI 바닥이 세균성 또는 곰팡이 성장으로 오염된 것처럼 보이는 경우에, 플라스크는 버려야 합니다. 오염의 이 모형은 일반적으로 물 님프에 플라스크를 밝힐 때 생깁니다, 그러나 또한 불충분하게 살균한 oothecae 또는 음식의 경우에 대변에서 생길 수 있습니다. 라미나르 플로우 후드를 사용하면 플라스크를 발견하여 발생하는 오염속도가 향상됩니다.
모든 오염 유기체가 BHI 배지에서 공기로 성장할 수 있는 것은 아니기 때문에, 추가배양문화 독립적인 멸균 시험 방법이 요구된다. 한 가지 잠재적인 접근법은 현미경검사법 27이지만이방법은 노동 집약적 일 수 있습니다. 다른 프로토콜은 기시계 기술을 사용하여문화권(14,23,27,28)을탈출할 수 있는 유기체를 검출한다. 그러나, 이러한 접근 방식은 종종 비싸고 해석하기 어렵다, 높은 처리량 시퀀싱 접근의 결과는 쉽게시약34및 바코드호핑35의낮은 수준의 오염에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에. 대신, 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭을 제한 단편 길이 다형성과 결합하여 내시빅바이오런트와 오염시키는 장 심비온을 모두 시각화하는 새로운 접근법이 개발되었다. 이 기술은 Blattabacterium의16S 유전자가 서열되었기 때문에 내부 PCR 제어를 포함하고, 그것의 밴딩 패턴은 gnotobiotic및 비멸 곤충 둘 다에 존재해야 합니다. 내시비온의 제한 패턴은 게놈서열(36)으로부터예측할 수 있기 때문에, 오염물질의 식별이 바람직하지 않는 한 앰플리콘 또는 제한 단편을 시퀀스할 필요가 없다. 이 프로토콜의 현재 버전은 PCR/RFLP를 위해 nymph를 희생할 것을 요구하지만,이 기술은 또한 비파괴 측정으로 대변에 사용될 수 있습니다. 그러나 대변에는 많은 Blattabacterium을포함해서는 안되기 때문에 내장 된 제어를 포함하지 않습니다.
추가 쉽게 수정 하지만 gnotobiotic 동물을 양육의 중요 한 구성 요소는 다이어트. BHI 한청은 곤충의 임시 식량 원천이 될 수 있지만, 장기간 유일한 식량 원천으로 사용될 때 님프들 사이에서 상당한 성장 적자를 초래하는 것으로 나타났습니다. 다양한 식단을 시도했지만, 자동 식 쥐 차우는 뇨영양 곤충의 유지 보수를위한 일상적인 식단으로 권장됩니다. 살균을 위해 특별히 제조되지 않은 식단은 종종 완전히 멸균되기 어려웠으며, 많은 멸균 또는 자동 분해 가능한 실험실 동물 식단은 비멸 조건에서 급속한 곰팡이 성장을 나타내는 것으로 나타났습니다. 비멸 조건하에서 저하되는 이 경향은 그노토바이오틱과 농생물 곤충을 직접 비교하는 실험에 사용하기에 적합하지 않게 했습니다. 권장된 식단은 뇨귀생술과 표준 님프 사이의 일관된 식단을 사용하여 두 그룹 간의 성장률과 같은 특성 비교를 용이하게 합니다.
다른 사람들이 관찰 한 대로27,gnotobiotic nymphs 그들의 비 살균 대응 보다 더 느리게 성장. 노토바이오틱(n=105)과 비멸성 님프(n =50)의 체길이를 비교하여 동일한, 오토클레이브 설치류 식단을 동일하게 공급하고 실온에서 보관한 결과, 비멸성 님프가 평균 0.059mm/일, gnotobiotic nymphs는 0.028mm/day(p.0)< 0.010mm)로 증가합니다. P. 아메리카나에서 장내 미생물의 존재는 곤충의대사율(37)을변경하는 것으로 나타났으며, 일반적으로 장 내 공동체는 영양 분흡수에 영향을 미치는 것으로 생각된다38,39. 이러한 이유는 뇨뇨및 비멸성 님프의 성장률에 있는 관찰된 다름을 지원합니다.
이 기술에 대한 가능한 제한은 가장 오래된 멸균 코호트가 10 개월 이상이며 신체 길이40에의해 근사된 것처럼 일곱 번째 인스타 (10 명 중 11 명, 성인기)에 도달했기 때문에 gnotobiotic 님프가 성기에 도달하지 못할 수 있다는 것입니다. 이 가장 오래된 코호트는 오토클레이브 쥐 식단이 아니라 과도한 곰팡이 성장없이 비멸균 코호트에게 공급하기에 너무 많은 수분을 함유한 식단인 조사된 쥐 차우를 먹습니다. 살균되지 않은 개 사료 식단에 대한 살균되지 않은 님프는 실험실 조건 (실온 및 습도)에서 9-10 개월 후에 성인기에 도달하는 것으로 나타났습니다. 공유된 오토클레이브 랫초에 있는 노토바이오틱 및 비멸균 님프의 코호트는 현재 생후 7개월 미만이며, 무살균 곤충은 7번째 인스타(평균: 16.7mm)로 추정되며 멸균 곤충은 5번째 인스타(평균: 11.2mm)로 추정된다. 그 결과, 우리는 아직까지 우리의 노토바이오틱 바퀴벌레가 성공적으로 재현할 수 있는지 여부를 확인할 수 없습니다. 그러나, 새로운 gnotobiotic 코호트가 이 접근법을 사용하여 확립될 수 있는 용이성을 감안할 때, 이 방법은 노토바이오틱 곤충의 입증된 번식이 없는 경우에도 큰 약속을 보여줍니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 미생물군유전체 연구원이 일반적인 실험실 재료를 사용하여 저비용 노토바이오틱 "시설"을 작동할 수 있는 다목적 도구를 제공합니다. 이러한 접근법은 숙주 행동, 면역, 발달 및 스트레스 반응21,26,27을형성하는 미생물의 역할을 검사하는 실험을 위한 노토바이오틱 바퀴벌레를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 뇨유생물곤충은 합성 또는 제노바이오틱 커뮤니티와 함께 접종할 수 있으며, 이후 장내 미생물군유전체 연구23,28의과목으로 사용될 수 있다. 또한, 내장된 멸균 검사로서 세균성 미디어 안감 배양챔버의 사용을 포함한 이러한 접근법의 요소는 다른 모델 시스템에 일반화가능하며 소규모 시설에서 뇨생물 동물의 일상적인 유지관리를 용이하게 할 수 있다.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 간행물은 수상 번호 R35GM133789의 밑에 건강의 국가 학회의 일반 의학 과학의 국가 학회에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 저자는 살균 속도 추적에 대 한 조시 다이어를 인정 하 고 싶습니다., 해치 속도, 그리고 gnotobiotic 바퀴벌레의 성장 속도.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X master mix | New England BioLabs | M0482 | OneTaq MasterMix |
| Autoclavable rat chow | Zeigler | NIH-31 Modified Auto | |
| Bacterial DNA extraction kit | Omega Bio-Tek | D-3350 | E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube |
| binding buffer | Omega Bio-Tek | PD099 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer) |
| brain-heart infusion (BHI) broth | Research Products International | B11000 | |
| Delicate task wipes | KimWipe | JS-KCC-34155-PK | KimWipes |
| DNA purification kit | Omega Bio-Tek | D6492 | E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution) |
| elution buffer | Omega Bio-Tek | PDR048 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| glass beads | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| Hybridization oven | UVP | 95-0330-01 | we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used |
| Laminar flow biological safety cabinet | NuAire, Inc. | NU-425-400 | Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity |
| lysozyme | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| peracetic acid stock solution (32%) | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Petroleum jelly | Vaseline | n/a | |
| proteinase K buffer | Omega Bio-Tek | PD061 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer") |
| purifying buffer | Omega Bio-Tek | PDR042 | included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer) |
| RsaI | New England BioLabs | R0167 | Includes CutSmart (digestion) buffer |
| Secondary container | n/a | n/a | a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes |
| spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | Catalog info is for NanoDrop2000 |
| thermal shaker | Eppendorf | EP5386000028 | Thermomixer R |
| Tris-EDTA | Fisher | BP1338-1 | 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
| wash buffer | Omega Bio-Tek | PDR044 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer) |
| Woodchip bedding | P.J. Murphy Forest Products | Sani-Chips |
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