Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים (Periplaneta americana)

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61316
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, University of Georgia

Summary

פרוטוקול זה משמש להקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים(Periplaneta americana)על ידי חיטוי פני השטח של ארגזי הביצים (oothecae) לפני הבקיעה. חרקים גנוטוביוטיים אלה מכילים את האנדוסימביונים של בלטבקטריום המועברים אנכית, אך יש להם מעיים גרזניים.

Abstract

בעלי חיים Gnotobiotic הם כלי רב עוצמה לחקר פקדים על מבנה מיקרוביום ותפקוד. מוצג כאן פרוטוקול להקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים(Periplaneta americana). גישה זו כוללת בדיקות סטריליות מובנות לבקרת איכות שוטפת. חרקים Gnotobiotic מוגדרים כאן כמו מקקים שעדיין מכילים אנדוסימביונט המועבר אנכית שלהם (Blattabacterium) אבל חסרים חיידקים אחרים המתגוררים בדרך כלל על פני השטח שלהם במערכת העיכול שלהם. עבור פרוטוקול זה, מקרי ביצים (oothecae) מוסרים ממושבת מלאי (לא סטרילית) ומשטח מעוקר. לאחר שנאסף ועוקר, oothecae הם דגירה ב 30 °C (60 °F) במשך כ 4-6 שבועות על עירוי המוח הלב (BHI) אגר עד שהם בוקעים או מוסרים עקב זיהום. נימפות שבקעו מועברות לבקבוק ארלמאייר המכיל רצפת BHI, מים סטריליים ומזון עכברושים סטרילי. כדי להבטיח שהנימפות אינן חיידקים דיור שאינם מסוגלים לגדול על BHI בתנאים נתון, אמצעי בקרת איכות נוסף משתמש פולימורפיזם באורך שבר הגבלה (RFLP) כדי לבדוק חיידקים לאndosymbiotic. נימפות Gnotobiotic שנוצר באמצעות גישה זו ניתן לחסן עם קהילות מיקרוביאליות פשוטות או מורכבות ומשמש ככלי במחקרים מיקרוביום במעיים.

Introduction

בעלי חיים Gnotobiotic הוכיחו להיות כלים לא יסולא בפז עבור מחקרים מיקרוביום1,2,3. בעלי חיים נטולי נבטים ומוגדרים אפשרו הבהרת אינטראקציות בין מארח למיקרואורגניזמים, כולל תגובות אימונולוגיות מארחות, התבגרות אפיתל במעיים ומטבוליזם מארח1,4,5,6,7. בעלי חיים Gnotobiotic מחוסנים עם קהילה פשוטה סייעו גם בהבנה מלאה יותר של אינטראקציות microbe-microbe בקהילה במעיים, במיוחד בפענוח האכלה צולבת ויחסים עוינים8,9,10,11. מערכת המודלים המועדפת הנוכחית למחקרים במיקרוביום המעיים של היונקים היא מודל המורין. בעוד שמערכת זו הייתה חיונית בתגליות שתוארו לעיל, חסרון מרכזי הוא העלות הכרוכה בכך. ציוד מיוחד וטכנאים מיומנים נחוצים כדי להקים ולתחזק מתקן gnotobiotic. זה, בשילוב עם טיפול נוסף שיש לתת לכל היבט של תחזוקת בעלי חיים gnotobiotic, גורם החיה gnotobiotic לעלות פי עשרה עד עשרים יותר להתרבות מאשר מודל חיה סטנדרטי12. בשל עלויות גבוהות, חוקרים רבים עשויים להיות מסוגלים להרשות לעצמם מודל מורין gnotobiotic. בנוסף, בעוד מודלים מורין עשוי להיות הבחירה המקובלת ביותר עבור מחקרים המעוניינים לתרגם לבריאות האדם, ישנם עדיין הבדלים פיזיולוגיים ומורפולוגיים רבים בין המעיים האנושי והעכבר13. ברור שאין מודל יחיד מספיק כדי לענות על מספר הולך וגדל של שאלות לגבי ההיבטים הרבים של מיקרוביום המעיים.

דגמי חרקים הם חלופה זולה יותר בשל עלות התחזוקה הנמוכה שלהם בהשוואה למינים של יונקים. מחקר נרחב ללא חיידקים וגנוטוביוטיקה במגוון מיני חרקים הוביל להתפתחותם של מודלים נפוצים רבים. יתושים ו Drosophila הם מודלים נפוצים לעבודה ללא חיידקים בשל הרלוונטיות שלהם למחלות גלובליות ומתיחהגנטית 14,15. מערכת מודלים מתפתחת נוספת היא זו של דבורת הדבש (Apis mellifera), בהתחשב בחשיבותה במחקר האבקה וחברתיות16. עם זאת, רבים של חרקים נפוצים אלה חסרים את המורכבות הטקסונומית לראות בקהילות מעי יונקים17, הגבלת יכולתם מודל אינטראקציות סדר גבוה יותר. לא רק שהמגוון הכולל של המיקרואורגניזמים המצויים במעיים של ג'וקים אמריקאים דומה יותר ליונקים, אלא שרבים מהמיקרואורגניזמים הנמצאים במעי הג'וק שייכים למשפחות ופילה המצויים בדרך כלל במיקרוביוטה של יונקים ובני אדם18. ההיסחפות של הג'וק מקבילה גם מבחינה תפקודית למעי הגס של היונקים, שכן הוא תא תסיסה עמוס בחיידקים כדי לסייע בהפקת חומרים מזינים19,20. לבסוף, האופי הכל-יכול של המקקים מאפשר מגוון של משטרי דיאטה שלא יתאפשרו עם מומחים תזונתיים.

ג'וקים אמריקאים יכולים להיות מערכת מודל שימושית להבנת קהילות מיקרוביאליות במעיים באורגניזמים גבוהים יותר, אך מעמדו של המקק כמזיק גם הופך את המערכת לרלוונטית לבקרת מזיקים21. מינוף הידע הבסיסי בהשפעת קהילת המעיים על בריאות הג'וקים והפיזיולוגיה מסייע בפיתוח טכניקות חדשות לניהול מזיקים.

מטרת שיטה זו היא להתוות תיאור מקיף של הקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים (Periplaneta americana), אך פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת נימפות של כל ג'וק אוביפר. הוא כולל שיטה לאוסף יעיל ולא פולשני של ביציות בוגרות, וטכניקה לא הרסנית לניטור מצב הגנטוביוטיקה של החרקים22,23,24. בעוד ששיטות קודמות להשגת ותחזוקה של גנוטוביוטיות מתארות את אוסף אותקה23,24,25,26,27, בגרות אוותקה מתפרשת במונחים של רמזים ספציפיים למינים (בבלטלה גרמניקה22,24,25), או לא מתואר במפורש27,28, מה שהופך את היישום קשה עבור אלה שאינםמכירים את המערכת. מאז השיטה המתוארת כאן משתמשת באופן טבעי ירד oothecae, השגיאה של הסרת ביצים בטרם עת נעדר. פרוטוקול זה מכיל הן שיטות תלויות תרבות והן שיטות בלתי תלויות בתרבות של בקרת איכות, והשיטה התלויה בתרבות אינה דורשת הקרבת חרקים. לבסוף, שיטה זו מביאה יחד מידע ממחקרי ג'וקים gnotobiotic מרובים כדי ליצור אחד, פרוטוקול מקיף עם כל המידע הדרוש להשגת ושמירה על גנוטוביוטיקה מקקים.

Protocol

1. הכנת חומרים

  1. תחזוקת תרביות ג'וקים
    הערה: ישנן דרכים רבות לגדל חרקים חזקים אלה. הפרטים על מתן מחסה ומים יכולים להיות שונים בהתאם לחומרים נגישים (כלומר, קרטוני ביצים במקום צינורות קרטון). פרוטוקול העיקור הבא יפעל עבור כל כיוונון מיכל מלאי.
    1. מורחים מספיק מצעים עץ במיכל דגים 37.85 L (10 ליטר) כדי לכסות את החלק התחתון של המיכל עם כ 1 אינץ 'של מצעים. הכן דיור על ידי חיתוך (שטוח) קרטון ל 2 ב x 4 בחתיכות. הכנס חתיכות קרטון לצינורות קרטון (למשל, צינורות נייר טואלט) וצינורות מחסנית בקצה אחד של המיכל (איור 1).
    2. למרוח שכבה דקה של ג'לי נפט על שני סנטימטרים העליונים של החלק הפנימי של המיכל כדי למנוע בריחה חרקים.
      הערה: הקפד לציפוי כראוי את החלק הפנימי של פינות המיכל.
    3. הוסף מקקים על ידי העברת (כבוש) צינורות קרטון ממיכל מלאי הקודם, לנער אותם כדי לשחרר את תושביהם. עבור כל העברה, להעביר 100-200 מעורב גיל, מעורב מין מקקים. מוסיפים מזון לכלבים (20-30 חתיכות), מנטרים את כמות המזון לכלבים במיכל וממלאים מחדש כאשר הם נמוכים.
    4. תארגן צלחת מים.
      1. מלאו מיכל מזון קטן לשימוש חוזר מפלסטיק במים מזוקקים כפולים (ddH2O). חותכים ספוגים תאית וחורים במכסה של מיכל המזון בערך באותו גודל.
        הערה: הספוגים התאיים מונעים ממקקים לטבוע בצלחת המים.
    5. הכנס ספוגים לתוך חורים במכסה ומניחים את המכסה על המיכל מלא. מניחים את המיכל במיכל וממלאים מחדש כאשר נמוך. מכסים את המיכל במטלית כותנה ומאבטחים אותו במקום עם רצועה אלסטית.
    6. כאשר טנקים מתחילים לצבור כמויות מוגזמות של פגרים ופגרי חרקים, מקים טנקים חדשים ומעבירים ג'וקים.
      הערה: טנקים מועברים בדרך כלל כל 6 חודשים. כל המקקים / הביצים הנותרים במיכלי מלאי שהוצאו משירות מורדמים על ידי הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ותכולת מיכל המלאי מועברת לאחר מכן לשקית אוטוקלאב ו autoclaved (1 שעות, מחזור הכבידה) לפני סילוק. מיכלי מניות מעוקרים עם אקונומיקה של 2% בין שימושים.
  2. לחטא מיכל משני.
    הערה: גורם מכיל זה אינו כולל מסנן, אלא מאפשר החלפת אוויר בחינם.
    1. מרססים את החלק הפנימי של המכסה והתחתון עם 2% אקונומיקה ומאפשרים להם להשרות במשך 10 דקות. מחק את האקונומיקה עם מגבת נייר נקייה.
    2. מרססים את החלק הפנימי של המכסה והתחתית עם 70% אתנול ומנגבים יבש עם מגבת נייר נקייה. החלף את המכסה עד לשימוש.
  3. הפוך BHI שיפוע ובקבוקים עבור דגירה ביצים נימפות דיור.
    1. הכן BHI על פי הוראות החבילה, הוספת 2% אגר. מרתיחים את פתרון BHI-אגר עד להבהרה.
    2. עבור slants, להעביר 5 aliquots מ"ל כדי 18 מ"מ x 150 מ"מ מבחנות זכוכית וכובע. לעקר באמצעות אוטוקלאב (זמן עיקור = 20 דקות, מחזור נוזלי). מניחים צינורות אוטומטיים בזווית של 45° כדי להתקרר לשייטים. לאחר התגבשות, יש לשמור במקרר עד לשימוש למניעת התייבשות.
    3. עבור בקבוקונים, להעביר 10 aliquots mL של פתרון מבושל BHI-אגר לתוך 250 מ"ל ארלנמייר בקבוקונים כדי לכסות לחלוטין את החלק התחתון של הבקבוק. מכסים את הבקבוק בנייר כסף וחיטוי באמצעות אוטוקלאב (20 דקות, מחזור נוזלי). אפשר צלושי autoclaved להתקרר במקרר עד לשימוש כדי למנוע התייבשות.
      הערה: אין צורך במסנן אוויר עבור התקנה זו. כיסוי הרדיד מספיק כדי לאפשר החלפת גז תוך מניעת זיהום מזרימת אוויר פתוח.
  4. לעקר באמצעות אוטוקלאב: צ'או עכברוש autoclavable שבור לתוך חצי גדלים (~ 1/2 חתיכות אינץ ') ב מכוסה רדיד אלומיניום (זמן עיקור = 1 שעות, מחזור הכבידה), ddH2O בבקבוק כתרים (זמן עיקור = 20 דקות, מחזור נוזלי), ומכריח ב מכוסה רדיד אלומיניום (זמן עיקור = 20 דקות, מחזור הכבידה).
    הערה: אין למלא יתר על הרה את צ'או החולדה. כדורי יתנפחו במובלעת האוטומטית.
  5. להקים טנק "מחלקת יולדות".
    הערה: מיכל זה מכיל את אותם חומרים כמו מיכלי המלאי (צינורות קרטון, צלחות מים עם ספוגים, מזון לכלבים, מצעים מעץ; ראו איור 1)וצריך להיות ריק ממקקים אלא אם כן הוא מועבר לאיסוף אותקי (ראו סעיף 2).
  6. לחות חממה על ידי הכנת מלאה פתרון נתרן כלורי רווי (NaCl). הכינו פתרון זה על ידי הוספת 37 גרם של NaCl לכל 100 מ"ל של ddH2O ומערבבים עד להמסה.
    הערה: בדרך כלל, 500 מ"ל של תמיסת מלח רווי בדרך כלל לחות אינקובטור עם מידות תא 51 ס"מ x 46 ס"מ x 46 ס"מ (H x W x D) במשך כחודש לפני מים נוספים יש להוסיף.

2. אוסף של ביציות

  1. העבר נקבות (בכל מספר שמתאים לניסויים מתוכננים) הנושאות ביציות(איור 2)ממיכל המלאי ל"מחלקת היולדות" באמצעות מלקחיים להזזת צינורות קרטון המכילים נקבות גראביד.
    1. אם צינור קרטון מכיל חרקים מרובים בנוסף לנקבה הכבידה, תחילה לנער את הצינור לתוך מיכל פלסטיק נוסף מוקף ג'לי נפט, ולאחר מכן לעודד את חרק היעד לטפס בחזרה לתוך צינור הקרטון לבד.
  2. העבר נקבות בחזרה למיכל המניות ברגע שהם ירדו oothecae שלהם. לאחזר את oothecae מהפסולת במיכל עם מלקחיים.
    הערה: Oothecae הם ירדו לעתים קרובות בתוך 24 שעות של הנקבה מועברת.

3. ניקוי של oothecae

  1. הוסף oothecae לצינור צנטריפוגה 5 מ"ל המכיל 3 מ"ל של נתרן דודקיל סולפט (SDS). וורטקס במשך 10 שניות. יש לחזור על הפעולה לשלב שטיפה שני עם צינור צנטריפוגה המכיל SDS טרי.
    הערה: ניתן להשתמש ב-100 מ"ל לכל 3 מ"ל של SDS.
  2. באמצעות ניגוב משימה עדין, לשפשף בעדינות את פני השטח של כל ootheca כדי להסיר את כל פסולת. ניתן להוסיף SDS נוסף כדי לסייע בניקוי יסודי. מניחים oothecae ניקה בסירת שקילה עד מוכן עיקור.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, אך השארת ה-oothecae בסביבות לחות נמוכה לפרקי זמן ממושכים (ימים עד שבועות) תגרום להם להתייבש ולאבד את הכדאיות.

4. עיקור והדגירה של oothecae

  1. מים סטריליים של אלקוט לשטיפת לאחר הסטריליזציה. עבור כל ootheca להיות מעוקר, למלא שני צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של מים סטריליים.
  2. הוסף 10 μL של מרוכז (32%) פתרון מלאי חומצה peracetic ל 3.2 מ"ל של ddH2O בצינור צנטריפוגה 5 מ"ל כדי ליצור פתרון 0.1% עבור עיקור. כובע והפך מספר פעמים כדי לערבב.
    התראה: חומצה פרמקטית מזיקה במגע עם העור או הריאות. לדלל בברדס אדים.
    הערה: יש לעשות זאת באותו יום של עיקור. אם מדולל מראש, הפתרון יתפרק במהירות ולכן לא לעקר כראוי. עד חמישה oothecae ניקה עשוי להיות מעוקר ב 3.2 מ"ל של חומצה מדוללת.
  3. מניחים (עד חמישה) oothecae ניקה בתמיסת חומצה peracetic 0.1% במשך 5 דקות. הפוך את הצינור מספר פעמים כל 60 שניות.
  4. במכסה המנוע של זרימה למינארית, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר כל אותקה לצינור צנטריפוגה משלו עם מי שטיפה סטריליים (שלב 4.1). הפוך מספר פעמים לערבב. חזור על שטיפה שנייה, ולאחר מכן להעביר כל ootheca שטף לשיפיון BHI משלו באמצעות מלקחיים סטריליים.
  5. מניחים לנטים במיכל המשני החיטוי. מעבירים את המיכל לאינקובטור הלח ב-30 מעלות צלזיוס למשך 4-5 שבועות עד לבקוע.
    הערה: Slants עשוי להיות מוחזק זקוף על ידי מתלה מבחנה קטן או מצע בינוני / קטן.
  6. יש לבדוק את ההסתבלויות באופן קבוע (1-2x בשבוע). אם צמיחת מושבה פטרייתית או חיידקית מופיעה על האגר, הסר את הנטייה המזוהמת. כאשר נקודת הזמן של ארבעה שבועות מתקרבת, לבדוק slants כל יום.
    הערה: לאחר הבקיעה, נימפות יכול לשרוד עד כמה שבועות על BHI לבד אבל לא יגדל בצורה אופטימלית.

5. תחזוקת נימפות גנוטוביות

  1. במכסה המנוע של זרימה למינארית, מעבירים בצורה לא מתאימה גלולה של צ'או עכברוש מעוקר לבקבוק BHI מוכן (משלב 1.3.3) עם מלקחיים סטריליים. כבדיקת עקרות, מניחים את הבקבוק במיכל המשני באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, ואינם משתמשים אם מופיעה צמיחה.
  2. מוסיפים נימפות לבקבוק BHI עם גלולת מזון סטרילית. לנער אותם מתוך שיפוע BHI שלהם ולתת להם ליפול לתוך הבקבוק במכסה המנוע זרימה למינארי.
    הערה: הנימפות אין מתיחה על קירות הזכוכית של המבחנה. טלטול הצינור כדי להפיל אותם מהשפה ולאחר מכן להטות את הצינור כדי לאפשר להם להחליק במורד הזכוכית לתוך הבקבוק יעיל. בעוד נימפות ניתן להעביר באמצעות מלקחיים, הסיכון לפציעה קטלנית הוא גבוה.
  3. נימפות מים עם 300 μL של מים סטריליים פעם בשבוע במכסה המנוע זרימה למינארי על ידי pipetting ישירות על הרצפה BHI של הבקבוק.
  4. כמו צואת נימפה מתחילים לכסות את הרצפה BHI, להעביר בקבוק BHI חדש, הוספת צ'או עכברוש מעוקר 24 שעות מראש (כדי לאמת עקרות) כמו בשלב 5.1.

6. בקרת איכות של סטריליות

  1. הסר נימפה אחת מבקבוק BHI כדי להקריב לבדיקת בקרת איכות שאינה תלויה בתרבות של מצב gnotobiotic באמצעות הגבלת פולימורפיזם באורך שבר (RFLP). כדי לעשות זאת, יוצקים את הנימפה לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי (בדומה להעברה נימפלית משלב 5.1) או מניחים אפליקטור עץ סטרילי לתוך הבקבוק ומחכים לנימפה כדי להתחיל לטפס עליו, ואז להעביר אותו לצינור הצנטריפוגה.
  2. מוסיפים 0.5 מ"ל של מלוחים 1x פוספט אגירה (PBS) לנימפה בצינור צנטריפוגה הומוגנית עם micropestle סטרילי עד שכל החלקים הגדולים מתפרקים. וורטקס היטב.
  3. לחלץ DNA מנימפה הומוגנט באמצעות ערכת מיצוי DNA חיידקי (שולחן החומרים) כדלקמן.
    1. צנטריפוגה נימפה הומוגנית במשך 10 דקות ב 5,000 x g ולהסיר את supernatant. מחממים שייקר תרמי ל 37 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 100 μL של 1x Tris-EDTA, ומערבולת כדי resuspend לחלוטין את גלולה. מוסיפים 10 μL של lysozyme ומערבבים, ואחריו 30 דקות (ללא טלטול) דגירה בשייקר תרמי שחומם מראש 37 מעלות צלזיוס.
    3. מוסיפים 25 מ"ג חרוזי זכוכית לדגימות, ומערבולת במהירות מרבית במשך 5 דקות. מחממים מראש את השייקר התרמי ל 55 מעלות צלזיוס.
    4. אפשר את החרוזים להתיישב לפני העברת supernatant לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל עם 100 μL של חלבון K חוצץ ו 20 μL של פרוטאינאז K. וורטקס לערבב ביסודיות.
    5. דגירה, עם טלטול ב 600 סל"ד, בשייקר תרמי 55 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 2 דקות, ולהעביר supernatant לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. מחממים מראש את השייקר התרמי ל 65 מעלות צלזיוס. התחל חימום מראש של חיץ האלוציה בתנור הכלאה של 65 מעלות צלזיוס.
    6. הוסף 220 μL של 100% אתנול. וורטקס במהירות מקסימלית למשך 20 שניות. לשבור כל משקעים גלויים על ידי pipetting למעלה ולמטה 10x.
    7. הכנס עמודת DNA לצינור איסוף של 2 מ"ל והעבר את הדגימה לעמודה, כולל כל משקע שייתכן שנוצר. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה, להשליך סינון מצינור האיסוף, ולהחליף את צינור האיסוף.
    8. הוסף 500 μL של מאגר איגוד לעמודה, וצנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה אחת. השלך סינון מצינור האיסוף והחלף את צינור האיסוף.
    9. הוסף 700 μL של מאגר לשטוף DNA לעמודה, וצנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה אחת. השלך סינון מצינור האיסוף והחלף את צינור האיסוף. יש לחזור על הפעולה לשלב שטיפה שני.
    10. צנטריפוגה עמוד ריק במשך 2 דקות כדי לייבש אותו, העברת העמודה לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל לאחר מכן. הוסף 50 μL של מאגר התרוממות רוח שחומם מראש ישירות למטריצת עמודת ה- DNA, והדגירה ב 65 °C (65 °F) במשך 5 דקות.
    11. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה כדי elute. לכמת את ה-DNA שחולצו בסינון באמצעות ספקטרופוטומיה או פלואורומטריה.
  4. להגביר ולעכל גן 16S שלם. דמיינו שברים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
    1. השתמש 12.5 μL של 2x תערובת הורים, 0.5 μL של כל פריימר 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) ו 27F (5'-AGAGTTTGATCCTCTCTCAG), 5 ng של DNA, ומים ברמה מולקולרית עבור נפח תגובה כולל של 25 μL.
    2. הפעל את תוכנית התרמוציקלר הבאה: 94 °C (60 שניות); ואחריו 35 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס עבור 30 s, 50 °C (65 °F) עבור 45 s, 68 °C (68 °F) עבור 90 s; ואחריו 68 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    3. לטהר את התגובה שרשרת פולימראז (PCR) המוצר באמצעות ערכת טיהור DNA(טבלה של חומרים).
      1. הוסף 120 μL של מאגר טיהור למוצר PCR ומערבולת לערבב. בקצרה צנטריפוגה כדי לאסוף טיפות בתוך המכסה. הכנס עמודת DNA לתוך צינור איסוף 2 מ"ל, להעביר נוזל לעמודה מוכנה צנטריפוגה ב ≥ 13,000 x g במשך דקה אחת.
      2. השלך את הסינון והחלף את צינור האיסוף. הוסף 700 μL של מאגר שטיפת DNA וצנטריפוגה ב ≥13,000 x g במשך דקה. השלך את הסינון והחלף את צינור האיסוף. יש לחזור על הפעולה לשלב שטיפה שני.
      3. צנטריפוגה העמוד הריק במשך 2 דקות לייבוש והעברת העמוד לצינור צנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל. מוסיפים 50 μL של חיץ התרוממות רוח שחומם מראש ישירות למטריצת עמוד הדנ"א, ומדגרים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
      4. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך דקה כדי elute. לכמת את ה-DNA שחולצו בסינון באמצעות ספקטרופוטומטריה או פלואורומטריה.
    4. הוסף 1 מיקרוגרם של מוצר PCR מטוהר ל 5 μL של מאגר עיכול, 10 יחידות RsaI, ומים ברמה מולקולרית עבור נפח התגובה הכולל של 50 μL. לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה דגירה ב 37 °C (60 °F) במשך 60 דקות.
    5. הפרד את המוצר מתעכל באמצעות אלקטרופורזה ג'ל על ידי הפעלת 20 μL של DNA מתעכל על 2% ג'ל agarose. דמיינו את הג'ל כדי לאשר מצב גנוטוביוטי.
      הערה: חרקים Gnotobiotic צריך רק לגרום להקות ב 402 bp, 201 bp, ומריחה מ 163 כדי 148 bp, בהתבסס על רצף 16S rDNA של אנדוסימביונט, Blattabacterium. כל להקות נוספות שנראות בג'ל מעידות על מינים מיקרוביאליים מזהמים.

7. מעקב אספטי של צמיחת נימפה

  1. רשום את אורך הגוף כדי לעקוב אחר צמיחת נימפה על ידי מדידת החרקים דרך רצפת BHI שקוף של הבקבוק.
    הערה: נימפות עשויות להיות ממוקמות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להאט את התנועה שלהם, ובכך להקל על מדידתם.

Representative Results

מיכלי מניות הוקמו כמתואר באיור 1. נקבות "בהריון" מזוהות על ידי הootheca המחוברות לבטן האחורית, כפי שמצולמו באיור 2. דגירה של oothecae על אגר BHI מאפשר בקרת איכות gnotobiotic בצורה לא הרסנית. במקרים מסוימים, הסטריליזציה אינה מצליחה, והצמיחה מופיעה סביב ה-oothecae כמו באיור 3B. oothecae אלה יש להסיר ולהשליך. בידינו נצפה שיעור כשל ממוצע של 10% לחיטוי (n = 51). oothecae בוקע בממוצע 34 ימים לאחר עיקור ללא צמיחה על המדיום, כפי שניתן לראות באיור 3A. ראינו שיעורי צוהר טיפוסיים של 41% (n = 46) עבור oothecae מעוקר, לא מזוהם, עם ממוצע של 11 נימפות לכל ootheca. נימפות גדולות יותר מועברות לבקבוקי BHI המכוסים בנייר כסף, כמו באיור 4. הרדיד מונע זיהום, ולנימפות יש מקום לגדול. RFLP של rDNA 16S מנימפה הומוגנית משמש לאישור מצב gnotobiotic. נימפות גנוטוביוטיות נצפו גדלות בקצב איטי יותר מעמיתיהן הלא סטריליים, כפי שמייצג איור 5. איור 6 מציג תוצאות מחרקים גנוטוביוטיים בהצלחה וכן מנימפות סטנדרטיות (לא סטריליות).

בעוד בדיקה זו עדיין לא זיהתה זיהום בהיעדר תוצאה תרבותית חיובית, צעד זה בוצע באופן שגרתי במהלך ניסויים קריטיים כדי לשלול את נוכחותם של מיקרואורגניזמים רגישים לחמצן או קיבה. צמיחה איטית יותר נצפתה במקקים gnotobiotic בהשוואה חרקים רגילים / לא סטריליים.

Figure 1
איור 1: הגדרת תרבות מלאי ג'וקים.
ניתן לראות צינורות קרטון מוערמים בקצה הרחוק של המיכל. מזון ומים נמצאים שניהם ליד חזית המיכל. כיסוי בד כותנה ותפס אלסטי הוסרו לנראות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ג'וק אמריקאי "בהריון".
החץ מציין את ה"אותקה". לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונות של נימפות גנוטוביוטיות בהצלחה בקעו ועוקרו ללא הצלחה oothecae על שיפונות BHI.
Oothecae היו מעוקרים ודגר כמתואר בפרוטוקול זה. (A)חוסר הצמיחה המיקרוביאלית בשיפיון BHI מצביע על כך שה חרקים נקיים מאורגניזמים זעירים. (B)Oothecae על שבלונים שתוצאתם היווצרות המושבה צריך להיות מושלך כמו מזוהם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מנגנון גידול גנוטוביוטי.
חרקים נשמרים בבקבוקים סטריליים מכוסים במכסה נייר כסף כדי למנוע זיהום. המיכל המשני (מכסה ירוק) מעוקר עם 2% אקונומיקה ואחריו 70% אתנול. זרימת האוויר אינה מוגבלת במיכל המשני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: נתוני קצב צמיחה מייצגים המשווים אורך גוף של נימפות גנוטיוטיות ולא סטריליות. שתי קבוצות החרקים קיבלו תזונה של מכרסמים אוטוקלאבים. חרקים Gnotobiotic (כאן: n = 105) נשמרים על BHI כמתואר. חרקים לא סטריליים (כאן: n = 50) חיים בבקבוקים עם מצעי עץ אוטומטיים עם מנות קטנות למים. נימפות לא סטריליות גדלות בקצב ממוצע של 0.059 מ"מ ליום, בעוד נימפות gnotobiotic לגדול ב 0.028 מ"מ ליום (p < 0.0001). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תמונת ג'ל מייצגת של תוצאות RFLP לבקרת איכות.
אמפליונים שלמים של גנים 16S התעכלו עם RsaI. DNA עבור PCR חולץ נימפות הומוגני ב 1x PBS. נתיבי "G נימפה" תואמים לנימפות גנוטוביות, בעוד נתיבי "conv nymph" תואמים לעמיתיהם הקונבנציונליים והלא סטריליים. בהתבסס על תקציר הגבלה וירטואלית, אנדוסימביונט (Blattabacterium) צפוי להיות להקות בגדלים 402 bp, 206 bp, ו 163 bp, עם מריחה של להקות בין 163 bp ו 148 bp. חרק גנוטוביוטי אמור להראות רק את תבנית הפסים של בלטבקטריום. קהילת חיידקים מעורבת צפויה להיות מריחה של להקות בגדלים שונים, שכותרתו כאן "שברי 16S חיידקיים אחרים". לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

שיטות אחרות המתארות דור של גנוביוטיות ג'וקים או לא תיארו אוסף oothecae או השתמשו אמות מידה ספציפיות למינים אחרים של ג'וקים כדי לציין מתי oothecae ניתן להסיר מן האם23,25,26. במקור, oothecae נאספו ממצעים woodchip במיכלי המלאי, וכתוצאה מכך שיעורי הצוהר נמוך מאוד (~ 10%) בהשוואה לאותקיה לא מעוקרת (47%) זה כנראה בשל העובדה כי oothecae unhatched לצבור לאורך זמן בכלוב המניות, ואין דרך לאמת את גיל ootheca או הכדאיות. יישום גישת "מחלקת היולדות" מאפשר איסוף של oothecae שהופקדו זה עתה בגיל ידוע. זה גם מקל על תכנון ניסיוני, כמו החוקר יכול לצפות זמני הבקיעה סביר עבור oothecae בודדים. שינוי נוסף מהפרוטוקולים הראשוניים והמפורסמות כולל דגירה של ביציות ונימפות בתאים אטומים למחצה המכילים גם פתרון נתרן כלורי רווי. נוכחות הפתרון שומרת על לחות יחסית של כ 75%30. Oothecae הם דגירה שגרתית ב 30 °C (60 °F), אשר הוכח למזער את מספר הימים הדרושים דגירה תוך מקסום הכדאיות של העוברים ומספר נימפות המיוצר לכל ootheca31. לאחר הבקיעה, נימפות gnotobiotic מתורבתים באופן שגרתי על הספסל בטמפרטורת חדר המעבדה ותנאי הסביבה, אם כי תאים מבוקרי לחות מנוצלים שוב לניסויים קריטיים. לאחר הקמת שינויים אלה לאוסף ootheca ודגרת, שיעורי הצוהר עלו לכ 41% (n = 51), לא כולל oothecae הוסר עקב זיהום. מסלול פוטנציאלי לאופטימיזציה נוספת של קצבי הפתח עשוי לכלול הארכת הזמן בין איסוף ootheca ועיקור. הקוטיקל של מקרה הביצה לא יכול להיות שזוף לחלוטין על שחרור ראשוני32, ולכן עשוי להיות חדיר לפתרונות המשמשים במהלך עיקור בתוך 24 שעות של ירידה.

פרוטוקול עיקור באמצעות 0.1% חומצה peracetic הותאם מ Doll et al.25. מחקרים אחרים תיעדו טכניקות חלופיות לעקר oothecae23,26. שיעורי הזיהום מבוססים על השיטה הלא הרסנית של דגירה של oothecae על שיפוע BHI. גישה זו היא יתרון מאוד כפי שהוא מאפשר זיהוי מהיר והסרה של oothecae מזוהמים. רוב הפרוטוקולים הקודמים בודקים אורגניזמים culturable על ידי ציפוי צואה או נימפה הומוגנית על מדיה בקטריולוגית ובדיקה לצמיחה22,23,25,27,28,33. במקרה אחד לפחות, השיטה לבדיקת מצב gnotobiotic לא תוארה במלואה26. מלבד קלייטון שהוסיף לוח קטן של סטריליות בדיקות בינוניות לגידול בקבוקים24, שיטותקודמות 22,23 שוכנו חרקים gnotobiotic על מדיה בקטריולוגית רק לפרקי זמן קצרים כדי להעריך בתחילה את פרוטוקול עיקור.

המשך הדיור של הנימפות המתקבלות במדיום BHI כאמצעי בקרת איכות מובנה מאפשר ניטור של מצבם הגנוביוטי בזמן אמת למחצה – טכניקה שלא נראתה ברוב השיטותהקודמות 22,23. זה שימושי במיוחד עבור ניסויים ארוכי טווח הדורשים נימפות gnotobiotic כדי לגשת. אם רצפת BHI תחת נימפות מופיע מזוהם עם צמיחה חיידקית או פטרייתית, הבקבוק צריך להיות מושלך. סוג זה של זיהום מתרחש בדרך כלל כאשר חושפים את הבקבוקים לנימפות מים, אבל זה עשוי גם לנבוע הצואה במקרה של oothecae מעוקר מספיק או מזון. השימוש במכסה המנוע של זרימה למינארית בעת השקיה משפר את קצב הזיהום הנגרם על ידי חשיפת בקבוקונים.

מכיוון שלא כל האורגניזמים המזהמים עשויים לגדול באופן אווירובידי במדיום BHI, נדרשת שיטה נוספת שאינה תלויה בתרבות של בדיקות סטריליות. גישה אפשרית אחת היא מיקרוסקופיה27, אבל גישה זו יכולה להיות עתירת עבודה. פרוטוקולים אחרים משתמשים בטכניקות מבוססות רצף כדי לזהות אורגניזמים שעלולים לברוח מתרבות14,23,27,28. עם זאת, גישות כאלה הן לעתים קרובות יקר וקשה לפרש, כמו התוצאות של גישות רצף תפוקה גבוהה יכול בקלות להיות מושפע זיהום ברמה נמוכה של ריאגנטים34 וברקוד מקפץ35. במקום זאת, פותחה גישה חדשה המשתמשת בהגברת PCR של גן 16S rRNA בשילוב עם פולימורפיזם באורך שבר הגבלה כדי לדמיין הן את האנדוסימביונט והן את כל סימביונטים המעיים המזהמים. טכניקה זו כוללת בקרת PCR פנימית, שכן הגן 16S של בלטבקטריוםכבר רצף, ואת דפוס הפסים שלה צריך להיות נוכח חרקים gnotobiotic ולא סטרילי. כמו דפוס ההגבלה של אנדוסימביונט ניתן לחזות מרצף הגנום שלה36, אין צורך לרצף את האמפליקונים או שברי ההגבלה, אלא אם כן זיהוי של כל מזהם רצוי. הגרסה הנוכחית של פרוטוקול זה קוראת להקרבת נימפה עבור PCR/RFLP, אך טכניקה זו יכולה לשמש גם על צואה כאמצעי לא הרסני. עם זאת, זה לא יכלול שליטה מובנית, כמו הצואה לא צריך להכיל הרבה Blattabacterium.

מרכיב נוסף שניתן לשינוי בקלות אך קריטי בגידול בעלי חיים גנוטוביוטיים הוא דיאטה. בעוד שאגר BHI יכול לשמש כמקור מזון זמני לחרקים, נמצא כי הוא גורם לגירעונות צמיחה משמעותיים בקרב נימפות כאשר הוא משמש כמקור המזון היחיד לתקופות ממושכות. בעוד דיאטות מגוונות כבר ניסו, אוכל עכברוש autoclavable מומלץ כת דיאטה שגרתית לשמירה על חרקים gnotobiotic. דיאטות שלא נוסחו במיוחד לעיקור היו לעתים קרובות קשות לעיבוד סטרילי לחלוטין, ות דיאטות רבות של בעלי חיים במעבדה סטרילית או אוטו-שירות נמצאו להפגין צמיחה פטרייתית מהירה בתנאים לא סטריליים. נטייה זו להשפיל בתנאים לא סטריליים הפך אותם לא מתאימים לשימוש בניסויים ישירות השוואת חרקים gnotobiotic ו nongnotobiotic. הדיאטה המומלצת מאפשרת שימוש בתזונה עקבית בין נימפות גנוטוביות לסטנדרטיות, ומאפשרת השוואה של מאפיינים – כגון שיעורי צמיחה – בין שתי הקבוצות.

כפי שאחרים הבחינו27, נימפות gnotobiotic לגדול לאט יותר מאשר עמיתיהם שאינם סטריליים. השוואה בין אורכי הגוף של gnotobiotic (n = 105) ונימפות לא סטריליות (n = 50) האכילו אותו, דיאטת מכרסמים autoclaved ונשמר בטמפרטורת החדר מגלה כי נימפות לא סטריליות לגדול בממוצע 0.059 מ"מ ליום, בעוד נימפות gnotobiotic לגדול 0.028 מ"מ ליום (p < 0.0001) (איור 5). נוכחות של microbiota במעיים P. americana הוכח לשנות את קצב חילוף החומרים של החרקים37, וקהילות המעיים בכלל נחשבים להשפיע על ספיגת התזונה38,39. סיבות אלה תומכות בהבדלים שנצפו בקצב הצמיחה של נימפות גנוטוביות ולא סטריליות.

מגבלה אפשרית לטכניקה זו היא כי נימפות gnotobiotic לא יכול להגיע לבגרות מינית, כמו קבוצות סטריליות העתיקה ביותר הם יותר מ 10 חודשים והגיעו רק כוכב השביעי (מתוך 10; 11 להיות בגרות) כפי משוער על ידי אורך הגוף40. אלה קבוצות הוותיקים אינם על דיאטה חולדה autoclaved אבל במקום לאכול אוכל עכברוש מוקרן, דיאטה המכילה יותר מדי לחות להאכיל קבוצות לא סטריליות ללא צמיחת עובש מוגזמת. נימפות לא סטריליות על דיאטה מזון לכלבים לא מעוקרים נמצאו להגיע לבגרות לאחר 9-10 חודשים בתנאי מעבדה (טמפרטורת החדר ולחות). קבוצות של נימפות gnotobiotic ולא סטרילי על משותף, autoclaved צ'או חולדה הם כיום פחות מ 7 חודשים, חרקים לא סטריליים מוערך להיות כוכב שביעי (ממוצע: 16.7 מ"מ) בעוד חרקים סטריליים מוערך להיות כוכב חמישי (ממוצע: 11.2 מ"מ). כתוצאה מכך, איננו יכולים, נכון לעכשיו, לאמת אם המקקים הגנטוביוטיים שלנו יכולים להתרבות בהצלחה. עם זאת, בהתחשב בקלות שבה ניתן להקים קבוצות gnotobiotic חדשות באמצעות גישה זו, שיטה זו מראה הבטחה גדולה גם בהיעדר רבייה מוכחת של חרקים gnotobiotic.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק כלי רב-תכליתי המאפשר לחוקרי מיקרוביום להפעיל "מתקן" גנוטוביוטי משלהם בעלות נמוכה באמצעות חומרי מעבדה נפוצים. גישה זו עשויה לשמש ליצירת מקקים gnotobiotic לניסויים בוחנים את התפקיד של microbiota בעיצוב התנהגות המארח, חסינות, פיתוח, ותגובות מתח21,26,27. חרקים gnotobiotic אלה עשויים גם להיות מחוסנים עם קהילות סינתטיות או xenobiotic ולאחר מכן משמש כנושאים למחקרים מיקרוביום במעיים23,28. יתר על כן, אלמנטים של גישה זו, כולל שימוש בתאי דגירה מרופדים במדיה בקטריולוגית כבדיקת סטריליות מובנית, ניתנים להכללה למערכות מודל אחרות ויכולים להקל על תחזוקה שגרתית של בעלי חיים גנוטיוטיים במתקנים בקנה מידה קטן יותר.

Disclosures

המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

פרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס R35GM133789. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את התפיסה הרשמית של המכונים הלאומיים לבריאות. המחברים רוצים להכיר ג'וסי דייר למעקב אחר שיעורי עיקור, קצבי הצוהר, ושיעורי הצמיחה של מקקים gnotobiotic.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2X master mix New England BioLabs M0482 OneTaq MasterMix
Autoclavable rat chow Zeigler NIH-31 Modified Auto
Bacterial DNA extraction kit Omega Bio-Tek D-3350 E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube
binding buffer Omega Bio-Tek PD099 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer)
brain-heart infusion (BHI) broth Research Products International B11000
Delicate task wipes KimWipe JS-KCC-34155-PK KimWipes
DNA purification kit Omega Bio-Tek D6492 E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution)
elution buffer Omega Bio-Tek PDR048 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
glass beads Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
Hybridization oven UVP 95-0330-01 we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used
Laminar flow biological safety cabinet NuAire, Inc. NU-425-400 Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity
lysozyme Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
peracetic acid stock solution (32%) Sigma-Aldrich 269336
Petroleum jelly Vaseline n/a
proteinase K buffer Omega Bio-Tek PD061 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer")
purifying buffer Omega Bio-Tek PDR042 included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer)
RsaI New England BioLabs R0167 Includes CutSmart (digestion) buffer
Secondary container n/a n/a a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes
spectrophotometer ThermoFisher ND-2000 Catalog info is for NanoDrop2000
thermal shaker Eppendorf EP5386000028 Thermomixer R
Tris-EDTA Fisher BP1338-1 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8
wash buffer Omega Bio-Tek PDR044 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer)
Woodchip bedding P.J. Murphy Forest Products Sani-Chips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yi, P., Li, L. The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).
  2. Nature Biotechnology. Laying better plans for mice. Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).
  3. Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents. ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).
  4. Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).
  5. Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
  6. Eun, C. S., et al. Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice. Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).
  7. Cherbuy, C., et al. Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).
  8. Van Den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats. Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).
  9. Stecher, B., Berry, D., Loy, A. Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle. FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).
  10. Sugahara, H., et al. Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community. Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).
  11. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).
  12. Mallapaty, S. Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom. Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).
  13. Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  14. Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
  15. Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host–Microbiota Interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).
  16. Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).
  17. Engel, P., Moran, N. A. The gut microbiota of insects - diversity in structure and function. FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).
  18. Tinker, K. A., Ottesen, E. A. The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts. Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).
  19. Zurek, L., Keddie, B. A. Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L. Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).
  20. Cruden, D. L., Markovetz, A. J. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).
  21. Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest. PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).
  22. Benschoter, C., Wrenn, R. Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches. Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).
  23. Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
  24. Clayton, R. A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions. Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).
  25. Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies. American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).
  26. Wada-Katsumata, A., et al. Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach. Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).
  27. Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate. PeerJ. 7, 6914 (2019).
  28. Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches. Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).
  29. Katoh, K., et al. Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches. Zoological Letters. 3, 3 (2017).
  30. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).
  31. Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids. Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).
  32. Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , Taylor & Francis. Philadelphia, PA. (2008).
  33. House, H. L. Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique. The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).
  34. Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses. Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).
  35. Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).
  36. Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).
  37. Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Muñoz-Garcia, A. The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana. PeerJ. 6, 4717 (2018).
  38. Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation. Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).
  39. Rowland, I., et al. Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components. European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).
  40. Gier, H. T. Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn). Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).

Tags

ביולוגיה גיליון 171 גנוטוביוטיקה ללא חיידקים ג'וק פריפלנטה אמריקנה חיטוי אותקאי
הקמה ותחזוקה של מקקים אמריקאים גנוטוביוטיים (<em>Periplaneta americana</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen,… More

Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen, E. A. Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana). J. Vis. Exp. (171), e61316, doi:10.3791/61316 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter