Summary
Ce protocole est utilisé dans l’établissement et le maintien des blattes américaines gnotobiotiques (Periplaneta americana) en stérilisant en surface les caisses d’œufs (oothèques) avant l’éclosion. Ces insectes gotobiotiques contiennent leurs endosymbiontes de Blattabacterium transmis verticalement mais ont des intestins axeniques.
Abstract
Les animaux gnotobiotiques sont un outil puissant pour l’étude des contrôles sur la structure et la fonction du microbiome. Présenté ici est un protocole pour l’établissement et le maintien des cafards américains ginotopotiques (Periplaneta americana). Cette approche comprend des contrôles de stérilité intégrés pour un contrôle continu de la qualité. Les insectes gnotobiotiques sont définis ici comme des cafards qui contiennent encore leur endosymbiote transmis verticalement (Blattabacterium) mais manquent d’autres microbes qui résident normalement à leur surface et dans leur tube digestif. Pour ce protocole, les caisses d’œufs (oothèques) sont retirées d’une colonie (non stérile) et stérilisées en surface. Une fois recueillis et stérilisés, les oothèques sont incubées à 30 °C pendant environ 4 à 6 semaines sur gélose à perfusion de cœur cérébral (IHB) jusqu’à ce qu’elles éclosent ou soient éliminées en raison de la contamination. Les nymphes écloses sont transférées dans une fiole d’Erlenmeyer contenant un plancher BHI, de l’eau stérile et de la nourriture stérile pour rats. Pour s’assurer que les nymphes ne logent pas de microbes qui sont incapables de se développer sur BHI dans les conditions données, une mesure de contrôle de la qualité supplémentaire utilise le polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) pour tester les microbes nonendosymbiotiques. Les nymphes gnotobiotiques générées à l’aide de cette approche peuvent être inoculées avec des communautés microbiennes simples ou complexes et utilisées comme outil dans les études du microbiome intestinal.
Introduction
Les animaux gnotobiotiques se sont révélés être des outils précieux pour les études du microbiome1,2,3. Les animaux à flore définie et sans germes ont permis d’élucider les interactions hôte-microbe, y compris les réponses immunologiques de l’hôte, la maturation épithéliale intestinale et le métabolisme de l’hôte1,4,5,6,7. Les animaux gnotobiotiques inoculés avec une communauté simplifiée ont également aidé à une compréhension plus complète des interactions microbe-microbe dans une communauté intestinale, en particulier dans le démêlage des relations d’alimentation croisée et antagonistes8,9,10,11. Le système modèle actuellement préféré pour les études dans le microbiome intestinal des mammifères est le modèle murin. Bien que ce système ait été vital dans les découvertes décrites ci-dessus, une lacune clé est le coût impliqué. De l’équipement spécialisé et des techniciens hautement qualifiés sont nécessaires pour établir et entretenir une installation génotobiotique. Ceci, combiné à un soin supplémentaire qui doit être accordé à tous les aspects de l’entretien des animaux génotopotiques, fait qu’un animal gnotobiotique coûte dix à vingt fois plus cher à se reproduire qu’un modèle animal standard12. En raison des coûts élevés, de nombreux chercheurs peuvent être incapables de se permettre un modèle murin gotobiotique. En outre, bien que les modèles murins puissent être le choix le plus largement accepté pour les études qui cherchent à se traduire par la santé humaine, il existe encore de nombreuses différences physiologiques et morphologiques entre les intestins humains et murins13. Il est clair qu’aucun modèle unique n’est suffisant pour répondre au nombre sans cesse croissant de questions concernant les nombreux aspects du microbiome intestinal.
Les modèles d’insectes sont une alternative moins chère en raison de leur coût d’entretien inférieur à celui des espèces de mammifères. Des recherches approfondies sur l’utilisation de plantes exemptes de germes et de génotobiotiques sur diverses espèces d’insectes ont mené à l’élaboration de multiples modèles couramment utilisés. Les moustiques et les drosophiles sont des modèles courants de travail sans germes en raison de leur pertinence pour les maladies mondiales et de la tractabilité génétique14,15. Un autre système modèle émergent est celui de l’abeille mellifère (Apis mellifera), compte tenu de son importance dans la recherche sur la pollinisation et la socialité16. Cependant, beaucoup de ces insectes couramment utilisés n’ont pas la complexité taxonomique observée dans les communautés intestinales de mammifères17, ce qui limite leur capacité à modéliser les interactions d’ordre supérieur. Non seulement la diversité totale des microbes trouvés dans l’intestin des cafards américains ressemble davantage aux mammifères, mais de nombreux microbes présents dans l’intestin des cafards appartiennent à des familles et à des embranchements que l’on trouve couramment dans le microbiote intestinal des mammifères et des humains18. L’intestin postérieur du cafard est également fonctionnellement analogue au gros intestin des mammifères, car il s’agit d’une chambre de fermentation densément remplie de bactéries pour aider à l’extraction des nutriments19,20. Enfin, la nature omnivore des cafards permet une diversité de régimes alimentaires qui ne seraient pas possibles avec les spécialistes de l’alimentation.
Les blattes américaines peuvent être un système modèle utile pour comprendre les communautés microbiennes intestinales dans les organismes supérieurs, mais le statut de la blatte en tant que ravageur rend également ce système pertinent pour la lutte antiparasitaire21. Tirer parti des connaissances fondamentales de l’influence de la communauté intestinale sur la santé et la physiologie des blattes aide à développer de nouvelles techniques de lutte antiparasitaire.
Le but de cette méthode est de décrire une description complète de l’établissement et du maintien des blattes américaines gnotobiotiques (Periplaneta americana), mais ce protocole pourrait être utilisé pour générer des nymphes de n’importe quel cafard ovipare. Il comprend une méthode de collecte efficace et non invasive d’oothèques matures, et une technique non destructive pour surveiller l’état génotobiotique des insectes22,23,24. Alors que les méthodes précédentes d’obtention et de maintien des cafards gnotobiotiques décrivent la collection d’oothèques23,24, 25,26,27,la maturité de l’oothèque est soit interprétée en termes de signaux spécifiques à l’espèce (dans Blattella germanica22,24,25), soit non explicitement décrite27,28, ce qui rend la mise en œuvre difficile pour ceux qui ne connaissent pas le système. Étant donné que la méthode décrite ici utilise des oothèques naturellement abandonnées, l’erreur de retirer les œufs prématurément est absente. Ce protocole contient à la fois des méthodes de contrôle de la qualité dépendantes de la culture et indépendantes de la culture, et la méthode dépendante de la culture ne nécessite pas de sacrifier les insectes. Enfin, cette méthode rassemble des informations provenant de plusieurs études sur les blattes génotobiotiques pour créer un protocole complet avec toutes les informations nécessaires pour atteindre et maintenir les blattes gnotobiotiques.
Protocol
1. Préparation du matériel
- Maintien des cultures de blattes de stock
REMARQUE: Il existe de nombreuses façons d’élever ces insectes robustes. Les détails sur la fourniture d’un abri et de l’eau peuvent être différents selon les matériaux accessibles (c.-à-d. des boîtes d’œufs au lieu de tubes en carton). Le protocole de stérilisation suivant fonctionnera pour toute configuration de réservoir de stock.- Étalez suffisamment de litière de copeaux de bois dans un réservoir de poisson de 37,85 L (10 gallons) pour couvrir le fond du réservoir d’environ 1 pouce de litière. Préparez le boîtier en coupant le carton (plat) à 2 en x 4 en morceaux. Insérez des morceaux de carton dans des tubes en carton (p. ex. des tubes de papier hygiénique) et des tubes d’empilement à une extrémité du réservoir(figure 1).
- Étalez une fine couche de vaseline sur les deux pouces supérieurs de l’intérieur du réservoir pour empêcher les insectes de s’échapper.
REMARQUE: Assurez-vous de bien enduire l’intérieur des coins du réservoir. - Ajoutez des cafards en transférant des tubes en carton (occupés) d’un réservoir de stock précédent, en les secouant pour libérer leurs habitants. Pour chaque transfert, déplacez 100 à 200 cafards mixtes d’âge mixte. Ajoutez de la nourriture pour chiens (20 à 30 pièces), surveillez la quantité de nourriture pour chiens dans le réservoir et remplissez-la lorsqu’elle est basse.
- Arrosez un plat d’eau.
- Remplissez un petit contenant alimentaire réutilisable en plastique avec de l’eau doublement distillée (ddH2O). Couper les éponges de cellulose et les trous dans le couvercle du contenant alimentaire à peu près de la même taille.
REMARQUE: Les éponges de cellulose empêchent les cafards de se noyer dans le plat d’eau.
- Remplissez un petit contenant alimentaire réutilisable en plastique avec de l’eau doublement distillée (ddH2O). Couper les éponges de cellulose et les trous dans le couvercle du contenant alimentaire à peu près de la même taille.
- Insérez des éponges dans des trous dans le couvercle et placez le couvercle sur le récipient rempli. Placez le récipient dans le réservoir et remplissez-le lorsqu’il est bas. Couvrez le réservoir avec un chiffon de coton et fixez-le en place avec une bande élastique.
- Alors que les réservoirs commencent à accumuler des quantités excessives de carcasses d’insectes et d’insectes, configurez de nouveaux réservoirs et transférez les cafards.
REMARQUE: Les réservoirs sont généralement transférés tous les 6 mois. Tous les cafards / œufs restants dans les réservoirs de stock déclassés sont euthanasiés par congélation à -20 ° C pendant 1 h et le contenu du réservoir de stock est ensuite transféré dans un sac autoclave et autoclavé (1 h, cycle gravitaire) avant l’élimination. Les réservoirs de stock sont stérilisés avec 2% d’eau de Javel entre les utilisations.
- Désinfecter un contenant secondaire.
REMARQUE: Ce conteneur ne comprend pas de filtre, mais permet plutôt un échange d’air libre.- Vaporisez l’intérieur du couvercle et du fond avec 2% d’eau de Javel et laissez-les tremper pendant 10 min. Essuyez l’eau de Javel avec une serviette en papier propre.
- Vaporisez l’intérieur du couvercle et du fond avec 70% d’éthanol et essuyez-les avec une serviette en papier propre. Remplacez le couvercle (l’un) jusqu’à son utilisation.
- Faites des inclinaisons et des flacons BHI pour incuber les œufs et loger les nymphes.
- Préparez BHI selon les instructions de l’emballage, en ajoutant 2% de gélose. Faire bouillir la solution de BHI-agar jusqu’à clarification.
- Pour les inclinaisons, transférer des aliquotes de 5 mL dans des tubes à essai et un bouchon en verre de 18 mm x 150 mm. Stériliser par autoclave (temps de stérilisation = 20 min, cycle liquide). Placez les tubes autoclavés à un angle de 45 ° pour refroidir en inclinaisons. Une fois solidifié, réfrigérer jusqu’à utilisation pour éviter le dessèchement.
- Pour les fioles, transférer 10 mL de aliquotes de solution de BHI-agar bouillie dans des fioles d’Erlenmeyer de 250 mL pour recouvrir complètement le fond de la fiole. Recouvrir le ballon de papier d’aluminium et stériliser par autoclave (20 min, cycle liquide). Laisser refroidir et réfrigérer les fioles autoclavées jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour éviter le dessèchement.
REMARQUE : aucun filtre à air n’est requis pour cette configuration. Le couvercle de la feuille est suffisant pour permettre l’échange de gaz tout en empêchant la contamination par le flux d’air libre.
- Stériliser via autoclave: chow de rat autoclavable cassé en demi-tailles (~ 1/2 pouce morceaux) dans un bécher recouvert de papier d’aluminium (temps de stérilisation = 1 h, cycle de gravité), ddH2O dans une bouteille coiffée (temps de stérilisation = 20 min, cycle liquide), et pince dans un bécher recouvert de papier d’aluminium (temps de stérilisation = 20 min, cycle de gravité).
REMARQUE: Ne pas trop remplir le bécher rat chow. Les granulés vont gonfler dans l’autoclave. - Mettre en place un réservoir « maternité ».
REMARQUE: Ce réservoir contient les mêmes matériaux que les réservoirs de stock (tubes en carton, vaisselle d’eau avec éponges, nourriture pour chiens, literie en copeaux de bois; voir figure 1)et doit être vide de cafards à moins qu’ils ne soient transférés pour la collecte des oothèques (voir la section 2). - Humidifier un incubateur en préparant un bécher rempli de solution de chlorure de sodium sursaturé (NaCl). Préparer cette solution en ajoutant 37 g de NaCl par100 mL de ddH2 O et en agitant jusqu’à dissolution.
REMARQUE: Typiquement, 500 mL de solution saline saturée humidifie typiquement un incubateur avec des dimensions de chambre 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x L x D) pendant environ un mois avant que plus d’eau doit être ajoutée.
2. Collecte des oothèques
- Transférer les femelles (en nombre quelconque, selon le cas pour les expériences planifiées) transportant des oothèques(figure 2)du réservoir d’origine à la « maternité » en utilisant des pinces pour déplacer les tubes en carton qui contiennent des femelles gravides.
- Si un tube de carboard contient plusieurs insectes en plus de la femelle gravide, secouez d’abord le tube dans un récipient en plastique supplémentaire entouré de vaseline, puis encouragez l’insecte cible à remonter seul dans le tube en carton.
- Transférer les femelles dans le réservoir d’élevage une fois qu’elles ont laissé tomber leur oothèque. Récupérez les oothèques de la litière dans le réservoir avec une pince.
REMARQUE: Les oothèques sont souvent abandonnées dans les 24 h suivant le transfert de la femelle.
3. Nettoyage des oothèques
- Ajouter l’oothèque à un tube à centrifuger de 5 mL contenant 3 mL de dodécyl sulfate de sodium (FDS). Vortex pour 10 s. Répétez l’opération pour une deuxième étape de lavage avec un tube à centrifuger contenant une FDS fraîche.
NOTA : Jusqu’à cinq oothèques peuvent être utilisées par 3 mL de FDS. - À l’aide d’une lingette délicate, frottez doucement la surface de chaque oothèque pour enlever les débris. D’autres FDS peuvent être ajoutées pour faciliter le nettoyage en profondeur. Placez les oothèques nettoyées dans un bateau de pesage jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être stérilisées.
REMARQUE: Le protocole peut être suspendu ici, mais laisser les oothèques dans des environnements à faible humidité pendant de longues périodes de temps (jours à semaines) les déshydratera et leur viabilité.
4. Stérilisation et incubation des oothèques
- Aliquote eau stérile pour le rinçage post-stérilisation. Pour chaque oothèque à stériliser, remplissez deux tubes à centrifuger de 1,5 mL avec 1 mL d’eau stérile.
- Ajouter 10 μL de concentré (32 %) solution mère d’acide peracétique à 3,2 mL deddH2Odans un tube centrifuge de 5 mL pour créer une solution à 0,1% pour la stérilisation. Coiffez et inversez plusieurs fois pour mélanger.
ATTENTION: L’acide peracétique est nocif au contact de la peau ou des poumons. Diluer dans une hotte.
REMARQUE: Cela doit être fait le même jour que la stérilisation. Si elle est diluée à l’avance, la solution se décomposera rapidement et ne stérilisera donc pas correctement. Jusqu’à cinq oothèques nettoyées peuvent être stérilisées dans 3,2 mL d’acide dilué. - Placez (jusqu’à cinq) les oothèques nettoyées dans la solution d’acide peracétique à 0,1% pendant 5 min. Inverser le tube plusieurs fois tous les 60 s.
- Dans une hotte à flux laminaire, utilisez une pince stérile pour transférer chaque oothèque dans son propre tube de centrifugation avec de l’eau de rinçage stérile aliquoted (étape 4.1). Inverser plusieurs fois pour mélanger. Répétez pour un deuxième rinçage, puis transférez chaque oothèque rincée sur sa propre inclinaison BHI à l’aide d’une pince stérile.
- Placez les inclinaisons dans le récipient secondaire stérilisé. Déplacer le récipient dans l’incubateur humidifié à 30 °C pendant 4 à 5 semaines jusqu’à ce qu’il éclose.
REMARQUE: Les inclinaisons peuvent être maintenues verticales par un petit support de tube à essai ou un bécher moyen / petit. - Vérifiez les inclinaisons régulièrement (1 à 2x par semaine). Si la croissance de colonies fongiques ou bactériennes apparaît sur la gélose, retirez l’inclinaison contaminée. Lorsque le point de temps de quatre semaines approche, vérifiez les inclinaisons tous les jours.
REMARQUE: Une fois écloses, les nymphes peuvent survivre jusqu’à plusieurs semaines sur BHI seul, mais ne pousseront pas de manière optimale.
5. Entretien des nymphes gotobiotiques
- Dans une hotte à flux laminaire, transférer aseptiquement une pastille de chow de rat stérilisé dans une fiole BHI préparée (à partir de l’étape 1.3.3) avec une pince stérile. À titre de contrôle de stérilité, placez le ballon dans le récipient secondaire dans un incubateur à 30 °C pendant 24 h et ne pas l’utiliser si la croissance apparaît.
- Ajouter des nymphes au ballon BHI avec des granulés de nourriture stériles. Secouez-les de leur inclinaison BHI et laissez-les tomber dans le ballon dans une hotte à flux laminaire.
REMARQUE: Les nymphes n’ont pas de traction sur les parois vitrées du tube à essai. Secouer le tube pour les faire tomber de l’inclinaison, puis faire basculer le tube pour leur permettre de glisser le verre dans le ballon est efficace. Bien que les nymphes puissent être transférées à l’aide d’une pince, le risque de blessures mortelles est élevé. - Nymphes d’eau avec 300 μL d’eau stérile une fois par semaine dans une hotte à flux laminaire en pipetant directement sur le plancher BHI du ballon.
- Lorsque les excréments de nymphes commencent à recouvrir le plancher du BHI, transférer dans une nouvelle fiole du BHI, en ajoutant le rat stérilisé chow 24 h à l’avance (pour vérifier la stérilité) comme à l’étape 5.1.
6. Contrôle de la qualité de la stérilité
- Retirer une nymphe du ballon BHI pour la sacrifier pour un contrôle de la qualité indépendant de la culture de l’état génotobiotique via le polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP). Pour ce faire, versez la nymphe dans un tube de centrifugation stérile (similaire au transfert nymphal de l’étape 5.1) ou placez un applicateur en bois stérile dans le ballon et attendez qu’une nymphe commence à l’escalader, puis transférez-la dans le tube de centrifugation.
- Ajouter 0,5 mL de 1x phosphate tamponné salin (PBS) à la nymphe dans le tube de centrifugation et homogénéiser avec un micropestle stérile jusqu’à ce que tous les gros morceaux soient brisés. Vortex bien.
- Extraire l’ADN de l’homogénat de nymphe à l’aide d’un kitd’extraction d’ADNbactérien (Table des matériaux) comme suit.
- Centrifuger la nymphe homogénéisée pendant 10 min à 5 000 x g et retirer le surnageant. Préchauffer un vibreur thermique à 37 °C.
- Ajouter 100 μL de 1x Tris-EDTA et vortex pour ressusciter complètement la pastille. Ajouter 10 μL de lysozyme et mélanger, suivi d’une incubation de 30 min (sans secousses) dans le thermosamateur préchauffé à 37 °C.
- Ajouter 25 mg de perles de verre aux échantillons et vortex à la vitesse maximale pendant 5 min. Préchauffer le vibreur thermique à 55 °C.
- Laisser les billes se déposer avant de transférer le surnageant dans un nouveau tube centrifuge de 1,5 mL avec 100 μL de tampon protéinase K et 20 μL de protéinase K. Vortex pour bien mélanger.
- Incuber, en secouant à 600 tr/min, dans un thermoscousse à 55 °C pendant 60 min. Centrifuger à 10 000 x g pendant 2 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 mL. Préchauffer le vibreur thermique à 65 °C. Commencez à préchauffer le tampon d’élution dans un four d’hybridation à 65 °C.
- Ajouter 220 μL d’éthanol à 100 %. Vortex à vitesse maximale pendant 20 s. Décomposer tout précipité visible en pipetant de haut en bas 10x.
- Insérez une colonne d’ADN dans un tube de collecte de 2 mL et transférez l’échantillon dans la colonne, y compris tout précipité qui pourrait s’être formé. Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min, jeter le filtrat du tube de collecte et remplacer le tube de collecte.
- Ajouter 500 μL de tampon de liaison à la colonne et centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min. Jetez le filtrat du tube de collecte et remplacez le tube de collecte.
- Ajouter 700 μL de tampon de lavage d’ADN à la colonne et centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min. Jetez le filtrat du tube de collecte et remplacez le tube de collecte. Répétez l’opération pour une deuxième étape de lavage.
- Centrifuger la colonne vide pendant 2 min pour la sécher, en transférant la colonne dans un nouveau tube centrifuge de 1,5 mL par la suite. Ajouter 50 μL de tampon d’élution préchauffé directement dans la matrice de la colonne d’ADN et incuber à 65 °C pendant 5 min.
- Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min à éluer. Quantifier l’ADN extrait dans le filtrat par spectrophotométrie ou fluorométrie.
- Amplifier et digérer le gène 16S entier. Visualisez les fragments à l’aide de l’électrophorèse sur gel.
- Utilisez 12,5 μL de mélange principal 2x, 0,5 μL de chaque amorce 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) et 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 5 ng d’ADN et de l’eau de qualité moléculaire pour un volume de réaction total de 25 μL.
- Exécuter le programme de thermocycleur suivant: 94 °C pendant 60 s; suivi de 35 cycles de 94 °C pour 30 s, 50 °C pour 45 s, 68 °C pour 90 s; suivi de 68 °C pendant 5 min.
- Purifier le produit de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) à l’aide d’un kit de purificationde l’ADN (Table des matériaux).
- Ajouter 120 μL de tampon purifiant au produit PCR et vortex à mélanger. Centrifuger brièvement pour recueillir les gouttelettes à l’intérieur du couvercle. Insérer une colonne d’ADN dans un tube de collecte de 2 mL, transférer le liquide dans la colonne préparée et centrifuger à ≥13 000 x g pendant 1 min.
- Jetez le filtrat et remplacez le tube de collecte. Ajouter 700 μL de tampon de lavage d’ADN et centrifuger à ≥13 000 x g pendant 1 min. Jetez le filtrat et remplacez le tube de collecte. Répétez l’opération pour une deuxième étape de lavage.
- Centrifuger la colonne vide pendant 2 min pour sécher et transférer la colonne dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 mL. Ajouter 50 μL de tampon d’élution préchauffé directement dans la matrice de la colonne d’ADN et incuber à température ambiante pendant 2 min.
- Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min à éluer. Quantifier l’ADN extrait dans le filtrat par spectrophotométrie ou fluorométrie.
- Ajouter 1 μg de produit PCR purifié à 5 μL de tampon de digestion, 10 unités RsaI et de l’eau de qualité moléculaire pour un volume de réaction total de 50 μL. Mélanger par pipetage de haut en bas et incuber à 37 °C pendant 60 min.
- Séparer le produit digéré par électrophorèse sur gel en faisant fonctionner 20 μL d’ADN digéré sur un gel d’agarose à 2 %. Visualisez le gel pour confirmer l’état génotobiotique.
REMARQUE: Les insectes gnotobiotiques ne devraient donner que des bandes à 402 pb, 201 pb et un frottis de 163 à 148 pb, basé sur la séquence d’ADNr 16S de l’endosymbiote, Blattabacterium. Toutes les bandes supplémentaires observées dans le gel indiquent la contamination des espèces microbiennes.
7. Suivi aseptique de la croissance nymphale
- Enregistrer la longueur du corps pour suivre la croissance nymphale en mesurant les insectes à travers le plancher translucide de BHI du ballon.
REMARQUE: Les nymphes peuvent être placées à 4 °C pendant 15 min pour ralentir leur mouvement, les rendant ainsi plus faciles à mesurer.
Representative Results
Les réservoirs de stock sont configurés comme illustré à la figure 1. Les femelles « gravides » sont identifiées par l’oothèque fixée à l’abdomen postérieur, comme illustré à la figure 2. L’incubation des oothèques sur la gélose BHI permet un contrôle de la qualité génotobiotique d’une manière non destructive. Dans certains cas, la stérilisation est infructueuse et la croissance apparaît autour de l’oothèque comme à la figure 3B. Ces oothèques doivent être enlevées et jetées. Dans nos mains, un taux d’échec moyen de 10% a été observé pour la stérilisation (n = 51). Les oothèques éclosent en moyenne 34 jours après la stérilisation sans croissance sur le milieu, comme le voit la figure 3A. Nous avons observé des taux d’éclosion typiques de 41 % (n = 46) pour les oothèques stérilisées et non contaminées, avec une moyenne de 11 nymphes par oothèque. Les nymphes plus grosses sont transférées dans des fioles BHI recouvertes de papier d’aluminium, comme à la figure 4. La feuille empêche la contamination et les nymphes ont de la place pour se développer. Rflp du rDNA 16S d’une nymphe homogénéisée est employé pour confirmer le statut gnotobiotic. On a observé que les nymphes génotobiotiques se développaient à un rythme plus lent que leurs homologues non stériles, comme le représente la figure 5. La figure 6 montre les résultats d’insectes génotobiotiques ainsi que de nymphes standard (non astériles).
Bien que ce test n’ait pas encore identifié de contamination en l’absence d’un résultat de culture positif, cette étape a été effectuée régulièrement lors d’expériences critiques pour exclure la présence de microbes contaminants sensibles à l’oxygène ou méfiants. Une croissance plus lente a été observée chez les cafards gotobiotiques par rapport aux insectes standard / non astiles.
Figure 1 : Configuration de la culture de stock de blattes.
Des tubes en carton peuvent être vus empilés à l’extrémité du réservoir. La nourriture et l’eau sont toutes deux près de l’avant du réservoir. Le couvercle en tissu de coton et la bande élastique ont été enlevés pour la visibilité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Un cafard américain « enceinte ».
La flèche indique l’oothèque. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Ill. 3 : Images de nymphes génotobiotiques ayant réussi à éclore et à stériliser sans succès des oothèques sur des pentes BHI.
Des oothèques ont été stérilisées et incubées comme décrit dans ce protocole. (A) L’absence de croissance microbienne sur l’inclinaison BHI indique que les insectes sont exempts d’organismes cultivables. (B) Les oothèques sur les pentes qui entraînent la formation de colonies doivent être rejetées comme contaminées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Appareil d’élevage gotobiotique.
Les insectes sont conservés dans des flacons stériles recouverts d’un couvercle en papier d’aluminium pour éviter toute contamination. Le récipient secondaire (couvercle vert) est stérilisé avec 2% d’eau de Javel suivie de 70% d’éthanol. Le débit d’air n’est pas limité dans le conteneur secondaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Données représentatives sur le taux de croissance comparant la longueur du corps des nymphes génotobiotiques et non gnotoiles. Les deux groupes d’insectes ont été alimentés le régime autoclavé de rongeur. Les insectes gnotobiotiques (ici: n = 105) sont conservés sur BHI comme décrit. Les insectes non astérieux (ici: n = 50) vivent dans des flacons avec une literie en copeaux de bois autoclavés avec de petits plats pour l’eau. Les nymphes nonsteriles développent un taux moyen de 0,059 mm/jour, tandis que les nymphes génotobiotiques grandissent à 0,028 mm/jour (p < 0,0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6 : Image de gel représentative des résultats du RFLP pour le contrôle de la qualité.
Des amplicons de gène de Whole-16S ont été digérés avec RsaI. L’ADN pour l’ACP a été extrait des nymphes homogénéisées dans 1x PBS. Les voies « nymphes G » correspondent aux nymphes gnotobiotiques, tandis que les voies « nymphes conv » correspondent à des homologues conventionnelles non astériles. D’après le digest de restriction virtuelle, l’endosymbiote (Blattabacterium) devrait avoir des bandes aux tailles 402 pb, 206 pb et 163 pb, avec un frottis de bandes entre 163 pb et 148 pb. Un insecte génotobiotique ne doit montrer que le motif de bande de Blattabacterium. On s’attend à ce qu’une communauté bactérienne mixte ait un frottis de bandes de tailles variables, étiquetées ici « autres fragments bactériens 16S ». Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
D’autres méthodes décrivant la génération de blattes gotobiotiques ne décrivaient pas la collection d’oothèques ou utilisaient des repères spécifiques à d’autres espèces de blattes pour indiquer quand les oothèques pouvaient être retirées de la mère23,25,26. À l’origine, les oothèques ont été recueillies dans la litière de copeaux de bois dans les réservoirs d’origine, ce qui a entraîné de très faibles taux d’éclosion (~ 10 %) par rapport aux oothèques non téliilisées (47 %)29. Cela est probablement dû au fait que les oothèques non hachées s’accumulent au fil du temps dans la cage d’élevage et qu’il n’y a aucun moyen de vérifier l’âge ou la viabilité de l’oothèque. La mise en œuvre de l’approche « maternité » permet de collecte d’oothèques fraîchement déposées d’âge connu. Cela facilite davantage la planification expérimentale, car le chercheur peut prévoir les temps d’éclosion probables pour les oothèques individuelles. Une autre modification des protocoles initiaux et publiés comprend l’incubation d’oothèques et de nymphes dans des chambres semi-scellées contenant également une solution de chlorure de sodium sursaturée. La présence de la solution maintient une humidité relative d’environ 75%30. Les oothèques sont systématiquement incubées à 30 °C, ce qui a été démontré pour minimiser le nombre de jours requis pour l’incubation tout en maximisant la viabilité des embryons et le nombre de nymphes produites par oothèque31. Après l’éclosion, les nymphes gotobiotiques sont régulièrement cultivées sur la paillasse à la température ambiante et dans des conditions ambiantes de laboratoire, bien que des chambres à humidité contrôlée soient à nouveau utilisées pour des expériences critiques. Après l’établissement de ces changements dans la collecte et l’incubation de l’oothèque, les taux d’éclosion ont augmenté à environ 41 % (n = 51), sans compter les oothèques enlevées en raison de la contamination. Une solution possible pour optimiser davantage les taux d’éclosion pourrait comprendre la prolongation du délai entre la collecte de l’oothèque et la stérilisation. La cuticule du boîtier de l’œuf ne peut pas être entièrement tannée lors de la libération initiale32,et peut donc être perméable aux solutions utilisées lors de la stérilisation dans les 24 h suivant la chute.
Le protocole de stérilisation utilisant 0,1% d’acide peracétique a été adapté de Doll et al.25. D’autres études ont documenté des techniques alternatives pour stériliser lesoothèques 23,26. Les taux de contamination sont basés sur la méthode non destructive d’incubation de l’oothèque sur une inclinaison BHI. Cette approche est très avantageuse car elle permet d’identifier et d’éliminer rapidement les oothèques contaminées. La plupart des protocoles précédents testent les organismes cultivables en plaquant des matières fécales ou des nymphes homogénat sur des milieux bactériologiques et en vérifiant la croissance22,23,25,27,28,33. Dans au moins un cas, la méthode d’essai de l’état génotobiotique n’a pas été entièrement décrite26. Sauf Clayton qui a ajouté une petite dalle de milieu d’essai de stérilité aux bouteilles d’élevage24,les méthodes précédentes22,23 ont hébergé des insectes génotobiotiques sur des milieux bactériologiques uniquement pendant de courtes périodes de temps pour évaluer initialement le protocole de stérilisation.
Le maintien du logement des nymphes résultantes sur le milieu BHI en tant que mesure intégrée de contrôle de la qualité permet de surveiller leur état génotobiotique en temps semi-réel , une technique qui n’a pas été vue dans la plupart des méthodes précédentes22,23. Ceci est particulièrement utile pour les expériences à long terme qui nécessitent l’accès aux nymphes génotobiotiques. Si le plancher du BHI sous les nymphes semble contaminé par une croissance bactérienne ou fongique, le ballon doit être jeté. Ce type de contamination se produit généralement lors de la découverte des fioles aux nymphes d’eau, mais il peut également provenir des matières fécales dans le cas d’oothèques ou d’aliments insuffisamment stérilisés. L’utilisation d’une hotte à flux laminaire lors de l’arrosage améliore le taux de contamination causé par la découverte des fioles.
Étant donné que tous les organismes contaminants ne peuvent pas se développer aérobiement sur le milieu BHI, une méthode supplémentaire d’essai de stérilité indépendante de la culture est requise. Une approche potentielle est la microscopie27, mais cette approche peut être laborieuse. D’autres protocoles utilisent des techniques basées sur la séquence pour détecter les organismes susceptibles d’échapper à la culture14,23,27,28. Cependant, de telles approches sont souvent coûteuses et difficiles à interpréter, car les résultats des approches de séquençage à haut débit peuvent facilement être impactés par une contamination de faible niveau des réactifs34 et un saut de code-barres35. Au lieu de cela, une nouvelle approche a été développée qui utilise l’amplification par PCR du gène de l’ARNr 16S en combinaison avec un polymorphisme de longueur de fragment de restriction pour visualiser à la fois l’endosymbion et tout symbiote intestinal contaminant. Cette technique inclut un contrôle interne d’ACP, puisque Blattabacterium' le gène 16S de s a été séquencé, et son modèle de bande devrait être présent dans les insectes génotobiotiques et non stériles. Comme le schéma de restriction de l’endosymbionte peut être prédit à partir de sa séquence génomique36,il n’est pas nécessaire de séquencer les amplicons ou les fragments de restriction, sauf si l’identification d’un contaminant est souhaitée. La version actuelle de ce protocole appelle à sacrifier une nymphe pour PCR/RFLP, mais cette technique pourrait également être employée sur des matières fécales comme mesure non destructive. Cependant, il n’inclura pas de contrôle intégré, car les matières fécales ne devraient pas contenir beaucoup de Blattabacterium.
Un autre composant facilement modifiable mais critique de l’élevage des animaux génotobiotiques est le régime alimentaire. Bien que la gélose BHI puisse servir de source de nourriture temporaire pour les insectes, il a été constaté qu’elle entraîne des déficits de croissance substantiels chez les nymphes lorsqu’elle est utilisée comme seule source de nourriture pendant de longues périodes. Alors que divers régimes ont été essayés, le chow autoclavable de rat est recommandé comme régime de routine pour le maintien des insectes génobiotiques. Les régimes qui n’étaient pas spécifiquement formulés pour la stérilisation étaient souvent difficiles à rendre complètement stériles, et de nombreux régimes d’animaux de laboratoire stériles ou autoclavables présentaient une croissance fongique rapide dans des conditions non stériles. Cette tendance à se dégrader dans des conditions non stériles les rendait impropres à une utilisation dans des expériences comparant directement des insectes génotobiotiques et non génobiotiques. Le régime recommandé permet l’utilisation d’un régime alimentaire cohérent entre les nymphes génotobiotiques et standard, facilitant la comparaison des caractéristiques, telles que les taux de croissance, entre les deux groupes.
Comme d’autres l’ont observé27,les nymphes génotobiotiques se développent plus lentement que leurs homologues non astiles. Une comparaison entre les longueurs corporelles des nymphes génotobiotiques (n = 105) et non ténéles (n = 50) nourries au même régime autoclavé de rongeurs et maintenues à température ambiante révèle que les nymphes non tonirtiques poussent en moyenne à 0,059 mm/jour, tandis que les nymphes génotobiotiques poussent à 0,028 mm/jour (p < 0,0001) (Figure 5). Il a été démontré que la présence du microbiote intestinal chez P. americana modifie le taux métabolique des insectes37,et on pense que les communautés intestinales en général affectent l’absorption des nutriments38,39. Ces raisons soutiennent les différences observées dans le taux de croissance des nymphes génotobiotiques et nonsteriles.
Une limitation possible de cette technique est que les nymphes génotobiotiques peuvent ne pas atteindre la maturité sexuelle, car les cohortes stériles les plus anciennes ont plus de 10 mois et n’ont atteint que le septième stade (sur 10; 11 étant l’âge adulte) tel qu’approché par la longueur du corps40. Ces cohortes les plus âgées ne sont pas sur le régime de rat autoclavé mais mangent plutôt chow irradié de rat, un régime qui contient trop d’humidité pour nourrir des cohortes nonsteriles sans croissance excessive de moisissure. On a constaté que les nymphes non isolées suivant un régime alimentaire non astérilisé pour chiens atteignaient l’âge adulte après 9 à 10 mois dans des conditions de laboratoire (température ambiante et humidité). Les cohortes de nymphes génotobiotiques et non stériles sur le chow de rat autoclavé partagé ont actuellement moins de 7 mois, les insectes non stériles sont estimés au septième stade (moyenne : 16,7 mm) tandis que les insectes stériles sont estimés au cinquième stade (moyenne : 11,2 mm). En conséquence, nous ne pouvons pas encore vérifier si nos cafards génotobiotiques peuvent se reproduire avec succès. Cependant, étant donné la facilité avec laquelle de nouvelles cohortes de génotobiotiques peuvent être établies à l’aide de cette approche, cette méthode est très prometteuse même en l’absence de reproduction prouvée d’insectes génotobiotiques.
En conclusion, ce protocole fournit un outil polyvalent qui permet aux chercheurs en microbiome d’exploiter leur propre « installation » génotobiotique à faible coût en utilisant des matériaux de laboratoire courants. Cette approche peut être utilisée pour générer des cafards génotobiotiques pour des expériences examinant le rôle du microbiote dans la formation du comportement de l’hôte, de l’immunité, du développement et des réponses au stress21,26,27. Ces insectes génotobiotiques peuvent également être inoculés avec des communautés synthétiques ou xénobiotiques et ensuite utilisés comme sujets pour des études sur le microbiome intestinal23,28. De plus, les éléments de cette approche, y compris l’utilisation de chambres d’incubation bactériologiques doublées de milieux comme vérification de stérilité intégrée, sont généralisables à d’autres systèmes modèles et peuvent faciliter l’entretien courant des animaux génotobiotiques dans des installations à plus petite échelle.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Cette publication a été soutenue par le National Institute of General Medical Sciences des National Institutes of Health sous le numéro de prix R35GM133789. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle des National Institutes of Health. Les auteurs aimeraient remercier Josey Dyer pour avoir suivi les taux de stérilisation, les taux d’éclosion et les taux de croissance des blattes génotobiotiques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X master mix | New England BioLabs | M0482 | OneTaq MasterMix |
| Autoclavable rat chow | Zeigler | NIH-31 Modified Auto | |
| Bacterial DNA extraction kit | Omega Bio-Tek | D-3350 | E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube |
| binding buffer | Omega Bio-Tek | PD099 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer) |
| brain-heart infusion (BHI) broth | Research Products International | B11000 | |
| Delicate task wipes | KimWipe | JS-KCC-34155-PK | KimWipes |
| DNA purification kit | Omega Bio-Tek | D6492 | E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution) |
| elution buffer | Omega Bio-Tek | PDR048 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| glass beads | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| Hybridization oven | UVP | 95-0330-01 | we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used |
| Laminar flow biological safety cabinet | NuAire, Inc. | NU-425-400 | Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity |
| lysozyme | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| peracetic acid stock solution (32%) | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Petroleum jelly | Vaseline | n/a | |
| proteinase K buffer | Omega Bio-Tek | PD061 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer") |
| purifying buffer | Omega Bio-Tek | PDR042 | included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer) |
| RsaI | New England BioLabs | R0167 | Includes CutSmart (digestion) buffer |
| Secondary container | n/a | n/a | a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes |
| spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | Catalog info is for NanoDrop2000 |
| thermal shaker | Eppendorf | EP5386000028 | Thermomixer R |
| Tris-EDTA | Fisher | BP1338-1 | 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
| wash buffer | Omega Bio-Tek | PDR044 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer) |
| Woodchip bedding | P.J. Murphy Forest Products | Sani-Chips |
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