Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Etablering och underhåll av Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61316
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, University of Georgia

Summary

Detta protokoll används för att upprätta och upprätthålla gnotobiotiska amerikanska kackerlackor (Periplaneta americana) genom att ytsterilisera äggfallen (oothecae) före kläckning. Dessa gnotobiotiska insekter innehåller sina vertikalt överförda Blattabacterium endosymbionts men har yxniska tarmar.

Abstract

Gnotobiotiska djur är ett kraftfullt verktyg för studier av kontroller på mikrobiomstruktur och funktion. Presenteras här är ett protokoll för etablering och underhåll av gnotobiotiska amerikanska kackerlackor (Periplaneta americana). Detta tillvägagångssätt omfattar inbyggda sterilitetskontroller för kontinuerlig kvalitetskontroll. Gnotobiotiska insekter definieras här som kackerlackor som fortfarande innehåller deras vertikalt överförda endosymbiont (Blattabacterium) men saknar andra mikrober som normalt bor på deras yta och i matsmältningssystemet. För detta protokoll avlägsnas äggfall (oothecae) från en (icke-steril) lagerkoloni och ytan steriliserad. När oothecae har samlats in och steriliserats den vid 30 °C i cirka 4−6 veckor på hjärnhjärtats infusion (BHI) agar tills de kläcks eller avlägsnas på grund av förorening. Kläckta nymfer överförs till en Erlenmeyerkolv som innehåller ett BHI-golv, sterilt vatten och steril råttmat. För att säkerställa att nymferna inte innehåller mikrober som inte kan växa på BHI under de givna förhållandena använder en ytterligare kvalitetskontrollåtgärd begränsningsfragmentlängd polymorfism (RFLP) för att testa för icke-dosymbiotiska mikrober. Gnotobiotiska nymfer som genereras med detta tillvägagångssätt kan vaccineras med enkla eller komplexa mikrobiella samhällen och användas som ett verktyg i tarmfloran studier.

Introduction

Gnotobiotiska djur har visat sig vara ovärderliga verktyg för mikrobiomstudier1,2,3. Bakteriefria och definierade flora djur har tillåtit klargörande av värd-mikrob interaktioner, inklusive värd immunologiska svar, tarm epitelial mognad och värdmetabolism1,4,5,6,7. Gnotobiotiska djur inokulerade med ett förenklat samhälle har också hjälpt till med en mer fullständig förståelse av mikrob-mikrobinteraktioner i ett tarmsamhälle, särskilt för att riva upp korsmatning och antagonistiskarelationer 8,9,10,11. Det nuvarande föredragna modellsystemet för studier i däggdjursmagsmikrobiomet är murinmodellen. Även om detta system har varit avgörande i de upptäckter som beskrivs ovan, är en viktig brist kostnaden. Specialiserad utrustning och högutbildade tekniker är nödvändiga för att etablera och underhålla en gnotobiotisk anläggning. Detta, i kombination med extra omsorg som måste ges till varje aspekt av gnotobiotiskt djurunderhåll, gör att ett gnotobiotiskt djur kostar tio till tjugo gånger mer att odla än en vanlig djurmodell12. På grund av höga kostnader kan många forskare inte ha råd med en gnotobiotisk murinmodell. Dessutom, medan murinmodeller kan vara det mest accepterade valet för studier som vill översättas till människors hälsa, finns det fortfarande många fysiologiska och morfologiska skillnader mellan mänskliga och mus tarmar13. Uppenbarligen räcker det inte med någon ovanlig modell för att svara på det ständigt ökande antalet frågor om de många aspekterna av tarmfloran.

Insektsmodeller är ett billigare alternativ på grund av deras lägre underhållskostnad i jämförelse med däggdjursarter. Omfattande bakteriefri och gnotobiotisk forskning i en mängd olika insektsarter har lett till utveckling av flera vanliga modeller. Myggor och Drosophila är vanliga modeller för bakteriefritt arbete på grund av deras relevans för globala sjukdomar och genetisk tractability14,15. Ett annat framväxande modellsystem är honungsbiet (Apis mellifera), med tanke på dess betydelse i pollinerings- och socialitetsforskning16. Många av dessa vanliga insekter saknar dock den taxonomiska komplexiteten som ses i däggdjurs gut communities17, vilket begränsar deras förmåga att modellera högre ordningsinteraktioner. Inte bara är den totala mångfalden av mikrober som finns i tarmen av amerikanska kackerlackor mer lik däggdjur, men många av mikroberna som finns i kackerlacksmagen tillhör familjer och phyla som ofta finns i tarmfloran hos däggdjur och människor18. Kackerlackans bakben är också funktionellt analogt med tjocktarmen hos däggdjur, eftersom det är en jäsningskammare tätt packad med bakterier för att hjälpa till vidextraktion av näringsämnen 19,20. Slutligen tillåter kackerlackornas allätande natur en mångfald av dietregimer som inte skulle vara möjliga med kostspecialister.

Amerikanska kackerlackor kan vara ett användbart modellsystem för att förstå tarmmikrobiella samhällen i högre organismer, men kackerlackans status som skadedjur gör också detta system relevant för skadedjursbekämpning21. Genom att utnyttja grundläggande kunskaper om tarmsamhällets påverkan på kackerlackans hälsa och fysiologi hjälper man till att utveckla nya tekniker för skadedjursbekämpning.

Målet med denna metod är att beskriva en omfattande beskrivning av etablering och underhåll av gnotobiotiska amerikanska kackerlackor (Periplaneta americana), men detta protokoll kan användas för att generera nymfer av någon oviparous kackerlacka. Den innehåller en metod för effektiv, icke-invasiv samling av mogen oothecae och en icke-förstörande teknik för att övervaka gnotobiotisk status hosinsekterna 22,23,24. Medan tidigare metoder för att uppnå och upprätthålla gnotobiotiska kackerlackor beskriver ootheca samling23,24,25,26,27, ootheca mognad tolkas antingen i termer av artspecifika ledtrådar (i Blattella germanica22,24,25), eller inte uttryckligen beskrivs27,28, vilket gör genomförandet svårt för dem som inte är bekanta med systemet. Eftersom metoden som beskrivs här använder naturligt tappade oothecae, är felet att ta bort ägg i förtid frånvarande. Detta protokoll innehåller både kulturberoende och kulturoberoende metoder för kvalitetskontroll, och den kulturberoende metoden kräver inte att man offrar insekter. Slutligen sammanför denna metod information från flera gnotobiotiska kackerlacksstudier för att skapa ett omfattande protokoll med all nödvändig information för att uppnå och upprätthålla gnotobiotiska kackerlackor.

Protocol

1. Beredning av material

  1. Underhåll av lager kackerlacka kulturer
    OBS: Det finns många sätt att föda upp dessa robusta insekter. Detaljerna om att tillhandahålla skydd och vatten kan vara olika beroende på tillgängliga material (dvs. äggkartonger istället för kartongrör). Följande steriliseringsprotokoll fungerar för alla lagertankinställningar.
    1. Sprid tillräckligt med flissängkläder i en fisktank på 37,85 L (10 gallon) för att täcka tankens botten med cirka 1 tum sängkläder. Förbered höljet genom att skära (platt) kartong till 2 i x 4 stycken. Sätt in kartongbitar i kartongrör (t.ex. toalettpappersrör) och stapelrör i ena änden av tanken (figur 1).
    2. Smeta ett tunt lager petroleumgel på tankens övre två tum för att förhindra insektsflykt.
      OBS: Var noga med att täcka insidan av tankens hörn ordentligt.
    3. Tillsätt kackerlackor genom att överföra (ockuperade) kartongrör från en tidigare lagertank och skaka dem för att släppa sina invånare. För varje överföring, flytta 100−200 blandade, blandade kackerlackor. Tillsätt hundmat (20−30 stycken), övervaka mängden hundmat i tanken och fyll på när den är låg.
    4. Sätt upp en vattenrätt.
      1. Fyll en liten återanvändbar matbehållare i plast med dubbeldestillerat vatten (ddH2O). Skär cellulosasvampar och hål i locket på matbehållaren till ungefär samma storlek.
        OBS: Cellulossvamparna förhindrar kackerlackor från att drunkna i vattenformen.
    5. Sätt in svampar i hål i locket och placera locket på den fyllda behållaren. Placera behållaren i tanken och fyll på när den är låg. Täck tanken med bomullsduk och fäst den på plats med ett elastiskt band.
    6. När tankar börjar ackumulera överdrivna mängder frass och insektskroppar, sätt upp nya tankar och överför kackerlackor.
      OBS: Tankar överförs vanligtvis var 6: e månad. Eventuella återstående kackerlackor/ägg i nedlagda lagertankar avlivas genom frysning vid -20 °C i 1 timme och innehållet i lagertanken överförs sedan till en autoklavpåse och autoklaveras (1 h, gravitationscykeln) före bortskaffandet. Lagertankar steriliseras med 2% blekmedel mellan användningarna.
  2. Desinficera en sekundär behållare.
    OBS: Denna behållare innehåller inte ett filter, utan tillåter istället fri luftväxling.
    1. Spraya insidan av både locket och botten med 2% blekmedel och låt dem suga i 10 minuter. Torka ut blekmedlet med en ren pappershandduk.
    2. Spraya insidan av locket och botten med 70% etanol och torka torrt med en ren pappershandduk. Sätt tillbaka locket tills det används.
  3. Gör BHI slants och flaskor för inkubation av ägg och inhysa nymfer.
    1. Förbered BHI enligt förpackningsinstruktioner och tillsätt 2% agar. Koka BHI-agar-lösningen tills den är klarlagd.
    2. För slants, överför 5 ml alikvoter till 18 mm x 150 mm glas provrör och lock. Sterilisera via autoklav (steriliseringstid = 20 min, vätskecykel). Placera autoklaverade rör i 45° vinkel för att svalna i slants. När den är stelnad, kyl tills den används för att förhindra torkning.
    3. För flaskor, överför 10 ml alikvoter av kokt BHI-agarlösning till 250 ml Erlenmeyer-flaskor för att helt täcka botten av kolven. Täck kolven med folie och sterilisera via autoklav (20 min, vätskecykel). Låt autoklavkolvar svalna och kyla tills de används för att förhindra torkning.
      OBS: Inget luftfilter krävs för den här installationen. Foliehöljet är tillräckligt för att möjliggöra gasutbyte samtidigt som kontaminering förhindras från utomhusflöde.
  4. Sterilisera via autoklav: autoklaverbar råttmats som är uppdelad i halvstorlekar (~ 1/2 tums bitar) i en folietäckt bägare (steriliseringstid = 1 h, gravitationscykel), ddH2O i en täckt flaska (steriliseringstid = 20 min, vätskecykel) och tång i en folietäckt bägare (steriliseringstid = 20 min, gravitationscykel).
    OBS: Överfyll inte rått chow bägare. Pellets kommer att svälla i autoklaven.
  5. Sätt upp en "förlossningsavdelning" tank.
    OBS: Denna tank innehåller samma material som lagertankarna (kartongrör, vattenfat med svampar, hundmat, flissängkläder; se figur 1) och bör vara tom på kackerlackor om de inte överförs för oothecae-insamling (se avsnitt 2).
  6. Fukta en inkubator genom att förbereda en bägare full av övermättad natriumkloridlösning (NaCl). Förbered denna lösning genom att tillsätta 37 g NaCl per 100 ml ddH2O och omrör omröra tills den är upplöst.
    OBS: Vanligtvis fuktar 500 ml mättad saltlösning vanligtvis en inkubator med kammarens dimensioner 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x W x D) i ungefär en månad innan mer vatten måste tillsättas.

2. Insamling av oothecae

  1. Överför honor (i valfritt antal som är lämpligt för planerade experiment) som transporterar oothecae (figur 2) från lagertanken till "förlossningsavdelningen" genom att använda tång för att flytta kartongrör som innehåller gravida honor.
    1. Om ett carboardrör innehåller flera insekter förutom gravidkvinnan, skaka först ut röret i en extra plastbehållare ringad med petroleumgel och uppmuntra sedan målinsekten att klättra tillbaka in i kartongröret ensam.
  2. Överför kvinnor tillbaka till lagertanken när de har tappat sin oothecae. Hämta oothecae från kullen i tanken med tång.
    OBS: Odeka tappas ofta inom 24 timmar efter att honan överförts.

3. Rengöring av oothecae

  1. Tillsätt oothecae till ett 5 ml centrifugeringsrör som innehåller 3 ml natriumdcylsulfat (SDS). Virvel i 10 s. Upprepa för ett andra tvättsteg med ett centrifugrör som innehåller färsk SDS.
    OBS: Upp till fem oothecae kan användas per 3 ml SDS.
  2. Använd en delikat uppgiftsservett och skrubba försiktigt ytan på varje ootheca för att ta bort skräp. Mer SDS kan läggas till för att hjälpa till med noggrann rengöring. Placera rengjord oothecae i en vägningsbåt tills den är klar för sterilisering.
    OBS: Protokollet kan pausas här, men att lämna oothecae i miljöer med låg luftfuktighet under längre tidsperioder (dagar till veckor) kommer att orsaka att de torkar ut och förlorar livskraft.

4. Sterilisering och inkubation av oothecae

  1. Alikvotsterilt vatten för sköljning efter sterilisering. Fyll två 1,5 ml centrifugeringsrör med 1 ml sterilt vatten för varje ootheca som ska steriliseras.
  2. Tillsätt 10 μL koncentrerat (32 %) peracetic syra stamlösning till 3,2 ml ddH2O i ett 5 mL centrifugeringsrör för att skapa en 0,1% lösning för sterilisering. Keps och invertera flera gånger för att blanda.
    VARNING: Peracetika är skadligt vid kontakt med hud eller lungor. Späd i en rökhuva.
    OBS: Detta måste göras samma dag som sterilisering. Om lösningen späds ut i förväg bryts den snabbt ned och steriliseras därför inte ordentligt. Så många som fem rengjorda oothecae kan steriliseras i 3,2 ml utspädd syra.
  3. Placera (upp till fem) rengjord oothecae i 0,1% peracetic acid lösning i 5 min. Vänd röret flera gånger var 60:e sekund.
  4. Använd sterila tångar i en laminär flödeshuv för att överföra varje ootheca till sitt eget centrifugeringsrör med alikvoterat sterilt sköljvatten (steg 4.1). Vänd flera gånger för att blanda. Upprepa för en andra sköljning och överför sedan varje sköljd ootheca till sin egen BHI-vinkling med sterila tångar.
  5. Placera snedämnen i den steriliserade sekundärbehållaren. Flytta behållaren till den fuktade inkubatorn vid 30 °C i 4−5 veckor tills den kläckts.
    OBS: Snedställningar kan hållas upprätt av ett litet provrörsställ eller en medelstor/liten bägare.
  6. Kontrollera snedanskigerna regelbundet (1−2x per vecka). Om svamp- eller bakteriekolonitillväxt uppträder på agaren, ta bort den förorenade vinklingen. När den fyra veckor långa tidpunkten närmar sig kontrollerar du sneda ämnen varje dag.
    OBS: När nymferna har kläckts kan de överleva i upp till flera veckor enbart på BHI men kommer inte att växa optimalt.

5. Underhåll av gnotobiotiska nymfer

  1. Överför aseptiskt en pellet av steriliserad råtta chow till en beredd BHI-kolv (från steg 1.3.3) med sterila tångar i en laminär flödeshuv. Som en sterilitetskontroll, placera kolven i den sekundära behållaren i en inkubator på 30 °C i 24 timmar och använd inte om tillväxten uppträder.
  2. Tillsätt nymfer till BHI-kolven med steril matpellets. Skaka dem ur deras BHI-vinkling och låt dem falla ner i kolven i en laminär flödeshuv.
    OBS: Nymferna har inte dragkraft på provrörets glasväggar. Att skaka röret för att slå av dem från lutningen och sedan tippa röret så att de kan glida ner i glaset i kolven är effektivt. Medan nymfer kan överföras med tång, är risken för dödlig skada hög.
  3. Vattennymfer med 300 μL sterilt vatten en gång i veckan i en laminär flödeshuv genom att leda direkt på kolvens BHI-golv.
  4. När nymfavföring börjar täcka BHI-golvet, överför till en ny BHI-kolv och tillsätt den steriliserade rått chow 24 h i förväg (för att verifiera sterilitet) som i steg 5.1.

6. Kvalitetskontroll av sterilitet

  1. Ta bort en nymf från BHI-kolven för att offra för en kulturoberoende kvalitetskontroll av gnotobiotisk status via restriktionsfragmentlängdspolymorfism (RFLP). För att göra detta, häll nymfen i ett sterilt centrifugerör (liknar nymföverföring från steg 5.1) eller placera en steril träapplikator i kolven och vänta på att en nymf börjar klättra den och överför den sedan till centrifugröret.
  2. Tillsätt 0,5 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till nymfen i centrifugröret och homogenisera med en steril mikropestel tills alla stora bitar är uppbrutna. Vortex bra.
  3. Extrahera DNA från nymf homogenisera med hjälp av ett bakteriellt DNA-extraktionskit (Table of Materials) enligt följande.
    1. Centrifug den homogeniserade nymfen i 10 min vid 5 000 x g och ta bort supernaten. Förvärm en termisk skakapparat till 37 °C.
    2. Tillsätt 100 μL 1x Tris-EDTA och virvel för att helt återanvända pelleten. Tillsätt 10 μL lysozyme och blanda, följt av en inkubation på 30 min (ingen skakning) i den förvärmda termiska skakapparaten på 37 °C.
    3. Tillsätt 25 mg glaspärlor till proverna och virvel i maximal hastighet i 5 minuter. Förvärm termisk skakapparat till 55 °C.
    4. Låt pärlorna sätta sig innan de överför supernaten till ett nytt 1,5 mL centrifugeringsrör med 100 μL proteinas K-buffert och 20 μL proteinas K. Vortex att blandas noggrant.
    5. Inkubera, med skakningar vid 600 varv/min, i en termisk skakapparat på 55 °C i 60 minuter. Centrifug vid 10 000 x g i 2 min och överför supernatant till ett nytt 1,5 mL centrifugerör. Förvärm termisk skakapparat till 65 °C. Börja förvärma elueringsbufferten i en hybridiseringsugn på 65 °C.
    6. Tillsätt 220 μL 100% etanol. Virvel med maximal hastighet i 20 s. Bryt upp alla synliga fällningar genom att leda upp och ner 10x.
    7. Sätt in en DNA-kolonn i ett uppsamlingsrör på 2 ml och överför provet till kolonnen, inklusive eventuella fällningar som kan ha bildats. Centrifug vid 10 000 x g i 1 minut, kassera filtratet från uppsamlingsröret och byt ut uppsamlingsröret.
    8. Tillsätt 500 μL bindningsbuffert till kolonnen och centrifug vid 10 000 x g i 1 minut. Kassera filtratet från uppsamlingsröret och byt ut uppsamlingsröret.
    9. Tillsätt 700 μL DNA-tvättbuffert till kolonnen och centrifug vid 10 000 x g i 1 minut. Kassera filtratet från uppsamlingsröret och byt ut uppsamlingsröret. Upprepa för ett andra tvättsteg.
    10. Centrifug tom kolonn i 2 min för att torka den, överföra kolonnen till ett nytt 1,5 mL centrifugeringsrör efteråt. Tillsätt 50 μL förvärmd elueringsbuffert direkt i DNA-kolumnmatrisen och inkubera vid 65 °C i 5 minuter.
    11. Centrifugera vid 10 000 x g i 1 minut för att eluera. Kvantifiera det extraherade DNA:t i filtratet via spektrofotometri eller fluorometri.
  4. Förstärk och smälta hela 16S genen. Visualisera fragment med hjälp av gelelektrofores.
    1. Använd 12,5 μL 2x master mix, 0,5 μL av varje primer 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) och 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 5 ng DNA och molekylärt vatten för en total reaktionsvolym på 25 μL.
    2. Kör följande termocyklistprogram: 94 °C för 60 s; följt av 35 cykler på 94 °C för 30 s, 50 °C för 45 s, 68 °C för 90 s, följt av 68 °C i 5 min.
    3. Rena produkten för polymeraskedjereaktion (PCR) med hjälp av ett DNA-reningskit(Materialförteckning).
      1. Tillsätt 120 μL reningbuffert till PCR-produkten och virveln som ska blandas. Kort centrifug för att samla droppar inuti locket. Sätt in en DNA-kolonn i ett uppsamlingsrör på 2 ml, överför vätska till den beredda kolonnen och centrifugen vid ≥13 000 x g i 1 minut.
      2. Kassera filtratet och byt ut uppsamlingsröret. Tillsätt 700 μL DNA-tvättbuffert och centrifugera vid ≥ 13 000 x g i 1 minut. Kassera filtratet och byt ut uppsamlingsröret. Upprepa för ett andra tvättsteg.
      3. Centrifugera den tomma kolonnen i 2 minuter för att torka och överföra kolonnen till ett nytt 1,5 ml centrifugeringsrör. Tillsätt 50 μL förvärmd elueringsbuffert direkt i DNA-kolumnmatrisen och inkubera vid rumstemperatur i 2 minuter.
      4. Centrifugera vid 10 000 x g i 1 minut för att eluera. Kvantifiera det extraherade DNA:t i filtrat via spektrofotometri eller fluorometri.
    4. Tillsätt 1 μg renad PCR-produkt till 5 μL rötbuffert, 10 enheter RsaI och molekylvatten för en total reaktionsvolym på 50 μL. Blanda genom att leda upp och ner och inkubera vid 37 °C i 60 min.
    5. Separera den smälta produkten via gelelektrofores genom att köra 20 μL smält DNA på en 2% agarosgel. Visualisera gelén för att bekräfta gnotobiotisk status.
      OBS: Gnotobiotiska insekter bör endast resultera i band på 402 bp, 201 bp och ett utstryk från 163 till 148 bp, baserat på 16S rDNA-sekvensen av endosymbionten, Blattabacterium. Eventuella extra band som ses i gelén tyder på att de förorenar mikrobiella arter.

7. Aseptisk spårning av nymphal tillväxt

  1. Registrera kroppslängden för att spåra nymphal tillväxt genom att mäta insekterna genom kolvens genomskinliga BHI-golv.
    OBS: Nymfer kan placeras vid 4 °C i 15 minuter för att bromsa deras rörelse, vilket gör dem lättare att mäta.

Representative Results

Lagertankar sätts upp enligt figur 1. "Gravida" kvinnor identifieras av ootheca fäst vid den bakre buken, som bilden i figur 2. Inkubation av oothecae på BHI-agar möjliggör gnotobiotisk kvalitetskontroll på ett icke-förstörande sätt. I vissa fall misslyckas sterilisering, och tillväxt förekommer runt oothecae som i figur 3B. Dessa oothecae bör avlägsnas och kasseras. I våra händer observerades en genomsnittlig felfrekvens på 10% för sterilisering (n = 51). Oothecae kläcker i genomsnitt 34 dagar efter sterilisering utan tillväxt på mediet, vilket ses i figur 3A. Vi har observerat typiska kläckningshastigheter på 41% (n = 46) för steriliserade, icke-förorenade oothecae, med ett genomsnitt på 11 nymfer per ootheca. Större nymfer överförs till BHI-flaskor täckta med folie, som i figur 4. Folien förhindrar förorening, och nymferna har utrymme att växa. RFLP av 16S rDNA från en homogeniserad nymf används för att bekräfta gnotobiotiska status. Gnotobiotiska nymfer har observerats växa långsammare än deras icke-sterila motsvarigheter, som representerade figur 5. Figur 6 visar resultat från framgångsrikt gnotobiotiska insekter samt standard (nonsterile) nymfer.

Även om detta test ännu inte har identifierat kontaminering i avsaknad av ett positivt kulturresultat, har detta steg utförts rutinmässigt under kritiska experiment för att utesluta förekomsten av förorenande syrekänsliga eller kräsna mikrober. Långsammare tillväxt har observerats i de gnotobiotiska kackerlackorna jämfört med vanliga / icke-sterila insekter.

Figure 1
Bild 1: Kackerlacka lagerkultur setup.
Kartongrör kan ses staplade i tankens bortre ände. Mat och vatten är båda nära tankens framsida. Tygskydd i bomull och elastiskt band har tagits bort för synlighet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: En "gravid" amerikansk kackerlacka.
Pilen anger ootheca. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Bilder av framgångsrikt gnotobiotiska nymfer kläckta och utan framgång steriliserade oothecae på BHI slants.
Odeka steriliserades och inkuberades enligt beskrivningen i detta protokoll. A)Bristen på mikrobiell tillväxt på BHI-vinklingen tyder på att insekterna är fria från odlingsbara organismer. B)Odeka på snedämnen som leder till kolonibildning bör kasseras som kontaminerade. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Gnotobiotisk uppfödningsapparat.
Insekter hålls i sterila flaskor täckta med ett folielock för att förhindra förorening. Den sekundära behållaren (grönt lock) steriliseras med 2% blekmedel följt av 70% etanol. Luftflödet är inte begränsat i den sekundära behållaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Representativa tillväxthastighetsdata som jämför kroppslängder av gnotobiotiska och icke-sterila nymfer. Båda grupperna av insekter matades autoklaverad gnagare diet. Gnotobiotiska insekter (här: n = 105) hålls på BHI enligt beskrivningen. Icke-sterila insekter (här: n = 50) lever i flaskor med autoklaverat flissängkläder med små rätter för vatten. Nonsterile nymfer växer en genomsnittlig hastighet på 0.059 mm/dag, medan gnotobiotiska nymfer växer på 0.028 mm/dag (p < 0.0001). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: En representativ gelbild av RFLP-resultat för kvalitetskontroll.
Hela-16S gen amplicons smältes med RsaI. DNA för PCR extraherades från nymfer homogeniserade i 1x PBS. "G nymf" körfält motsvarar gnotobiotiska nymfer, medan "conv nymph" körfält motsvarar konventionella, nonsterile motsvarigheter. Baserat på virtuell begränsningssammandrag förväntas endosymbionten (Blattabacterium) ha band i storlekarna 402 bp, 206 bp och 163 bp, med ett utstryk av band mellan 163 bp och 148 bp. En gnotobiotisk insekt bör bara visa Blattabacterium banding mönster. Ett blandat bakteriesamhälle förväntas ha ett utstryk av band med olika storlekar, märkt här "andra bakteriella 16S-fragment". Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Andra metoder som beskriver generering av gnotobiotiska kackerlackor beskrev antingen inte oothecae-samlingen eller använde riktmärken som är specifika för andra kackerlacksarter för att ange när oothecae kunde avlägsnas frånmodern 23,25,26. Ursprungligen samlades oothecae från flissängkläderna i lagertankarna, vilket resulterade i mycket låga kläckningshastigheter (~ 10%) jämfört med icke-steriliserad oothecae (47%)29. Detta beror sannolikt på det faktum att unhatched oothecae ackumuleras över tiden i lagerburen, och det finns inget sätt att verifiera ootheca ålder eller livskraft. Genomförandet av "moderskapsavdelningen" gör det möjligt att samla in nyligen deponerade oothecae av känd ålder. Detta underlättar ytterligare experimentell planering, eftersom forskaren kan förutse sannolika kläckningstider för enskilda oothecae. En annan modifiering från de första och publicerade protokollen omfattar inkubation av oothecae och nymfer i halvtätade kamrar som också innehåller en övermättad natriumkloridlösning. Närvaron av lösningen upprätthåller en relativ fuktighet på cirka 75%30. Odeka är rutinmässigt inkuberade vid 30 °C, vilket har visat sig minimera antalet dagar som krävs för inkubation samtidigt som embryonas livskraft och antalet nymfer som produceras per ootheca31 maximeras. Efter kläckning odlas gnotobiotiska nymfer rutinmässigt på bänkskivan vid laboratorierumstemperatur och omgivningsförhållanden, även om fuktkontrollerade kammare återigen används för kritiska experiment. Efter etablering av dessa förändringar i ootheca insamling och inkubation ökade kläckningshastigheterna till cirka 41% (n = 51), exklusive oothecae bort på grund av förorening. En potentiell väg till ytterligare optimering av kläckningshastigheter kan inkludera att förlänga tiden mellan ootheca-insamling och sterilisering. Äggets nagelband får inte vara helt garvat vid förstafrisättningen 32, och kan därför vara genomsläppligt för lösningar som används under sterilisering inom 24 timmar efter att ha tappats.

Sterilisering protokollet med 0,1% peracetic syra anpassades från Docka et al.25. Andra studier har dokumenterat alternativa tekniker för sterilisering av oothecae23,26. Kontamineringshastigheterna baseras på den icke-förstörande metoden att inkubera oothecae på en BHI-vinkling. Detta tillvägagångssätt är mycket fördelaktigt eftersom det möjliggör snabb identifiering och avlägsnande av förorenade oothecae. De flesta tidigare protokolltest för odlingsbara organismer genom plätering av avföring eller nymf homogenat på bakteriologiska medier och kontroll förtillväxt 22,23,25,27,28,33. I minst ett fall beskrevs inte metoden för att testa gnotobiotiska status fullt ut26. Förutom Clayton som lade till en liten platta av sterilitetstestmedel tilluppfödningsflaskor 24, tidigaremetoder 22,23 inrymde gnotobiotiska insekter på bakteriologiska medier endast under korta tidsperioder för att initialt utvärdera steriliseringsprotokollet.

Fortsatt hölje av de resulterande nymferna på BHI-medium som en inbyggd kvalitetskontrollåtgärd gör att deras gnotobiotiska status kan övervakas i halv realtid - en teknik som inte setts i de flesta tidigare metoder22,23. Detta är särskilt användbart för långsiktiga experiment som kräver att gnotobiotiska nymfer nås. Om BHI-golvet under nymfer verkar förorenat med bakteriell eller svamptillväxt, ska kolven kasseras. Denna typ av förorening uppstår vanligtvis när kolvarna avtäcks för att vattna nymfer, men det kan också uppstå från avföringen vid otillräckligt steriliserad oothecae eller mat. Användningen av en laminär flödeshuv vid vattning förbättrar föroreningshastigheten som orsakas av avtäckt av flaskor.

Eftersom inte alla förorenande organismer kan växa aerobiskt på BHI-medium krävs ytterligare en kulturoberoende sterilitetstestmetod. Ett potentiellt tillvägagångssätt är mikroskopi27, men detta tillvägagångssätt kan vara arbetsintensivt. Andra protokoll använder sekvensbaserade tekniker för att upptäcka organismer som kan undkomma kultur14,23,27,28. Sådana tillvägagångssätt är dock ofta dyra och svåra att tolka, eftersom resultaten av sekvenseringsmetoder med hög genomströmning lätt kan påverkas av lågnivåförorening av reagenser34 och streckkodshoppning35. Istället har ett nytt tillvägagångssätt utvecklats som använder PCR-förstärkning av 16S rRNA-genen i kombination med restriktionsfragmentlängdspolymorfism för att visualisera både endosymbionten och eventuella förorenande tarm symbionter. Denna teknik inkluderar en intern PCR kontroll, eftersom Blattabacteriums16S gen har sekvenserats, och dess banding mönster bör vara närvarande i både gnotobiotiska och nonsterile insekter. Eftersom endosymbiontens begränsningsmönster kan förutsägas från dess genomsekvens36, finns det inget behov av att sekvensera ampliconerna eller begränsningsfragmenten, såvida inte identifiering av något främmande medel önskas. Den nuvarande versionen av detta protokoll kräver att en nymf offras för PCR / RFLP, men denna teknik kan också användas på avföring som en icke-förstörande åtgärd. Det kommer dock inte att innehålla en inbyggd kontroll, eftersom avföringen inte bör innehålla mycket Blattabacterium.

En ytterligare lätt modifierbar men kritisk komponent i uppfödning av gnotobiotiska djur är kost. Medan BHI agar kan fungera som en tillfällig livsmedelskälla för insekterna, har det visat sig att det resulterar i betydande tillväxtunderskott bland nymfer när de används som den enda livsmedelskällan under längre perioder. Medan olika dieter har provats, rekommenderas autoklaverbar rått chow som en rutindiet för underhåll av gnotobiotiska insekter. Dieter som inte specifikt formulerats för sterilisering var ofta svåra att göra helt sterila, och många sterila eller autoklaverbara laboratoriedjurdieter konstaterades uppvisa snabb svamptillväxt under icke-sterila förhållanden. Denna tendens att bryta ned under ickesterila förhållanden gjorde dem olämpliga för användning i experiment som direkt jämförde gnotobiotiska och nongnotobiotiska insekter. Den rekommenderade kosten möjliggör användning av en konsekvent diet mellan gnotobiotiska och vanliga nymfer, vilket underlättar jämförelse av egenskaper - såsom tillväxthastigheter - mellan de två grupperna.

Som andra harobserverat 27, växer de gnotobiotiska nymferna långsammare än deras icke-sterila motsvarigheter. En jämförelse mellan kroppslängder av gnotobiotiska (n = 105) och icke-sterila nymfer (n = 50) matade samma, autoklaverad gnagare diet och hålls vid rumstemperatur avslöjar att icke-sterila nymfer växer i genomsnitt 0,059 mm/ dag, medan gnotobiotiska nymfer växer 0,028 mm / dag (p < 0,0001) (Figur 5). Förekomsten av tarmmikrobiota i P. americana har visat sig förändra insekternas ämnesomsättning37, och tarmsamhällen i allmänhet tros påverka näringsabsorption38,39. Dessa skäl stöder de observerade skillnaderna i tillväxttakt för gnotobiotiska och nonsterile nymfer.

En möjlig begränsning av denna teknik är att gnotobiotiska nymfer inte kan nå sexuell mognad, eftersom de äldsta sterila kohorterna är mer än 10 månader gamla och har nått endast den sjunde instjärnan (av 10; 11 är vuxen ålder) som approximeras av kroppslängd40. Dessa äldsta kohorter finns inte på den autoklaverade råttdieten utan äter istället bestrålad råttmat, en diet som innehåller för mycket fukt för att mata till icke-sterila kohorter utan överdriven mögeltillväxt. Nonsterile nymfer på en nonsterilized hundmatdiet befanns nå vuxen ålder efter 9−10 månader under laboratorieförhållanden (rumstemperatur och fuktighet). Kohorter av gnotobiotiska och icke-sterila nymfer på den delade, autoklaverade rått chow är för närvarande mindre än 7 månader gamla, icke-sterila insekter uppskattas vara sjunde instar (genomsnitt: 16,7 mm) medan sterila insekter uppskattas vara femte instar (genomsnitt: 11,2 mm). Som ett resultat kan vi ännu inte verifiera om våra gnotobiotiska kackerlackor framgångsrikt kan reproducera. Men med tanke på hur lätt nya gnotobiotiska kohorter kan etableras med detta tillvägagångssätt, visar denna metod stort löfte även i avsaknad av bevisad reproduktion av gnotobiotiska insekter.

Sammanfattningsvis ger detta protokoll ett mångsidigt verktyg som gör det möjligt för mikrobiomforskare att driva sin egen, billiga gnotobiotiska "anläggning" med hjälp av vanliga laboratoriematerial. Detta tillvägagångssätt kan användas för att generera gnotobiotiska kackerlackor för experiment som undersöker mikrobiotans roll i utformningen av värdbeteende, immunitet, utveckling och stresssvar21,26,27. Dessa gnotobiotiska insekter kan också inokuleras med antingen syntetiska eller xenobiotiska samhällen och därefter användas som försökspersoner för tarmfloranstudier23,28. Vidare är delar av detta tillvägagångssätt, inklusive användning av bakteriologiska mediefodrade inkubationskammare som en inbyggd sterilitetskontroll, generaliserbara för andra modellsystem och kan underlätta rutinmässigt underhåll av gnotobiotiska djur i mindre anläggningar.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under tilldelningsnummer R35GM133789. Innehållet är enbart upphovsmännens ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella uppfattning. Författarna skulle vilja erkänna Josey Dyer för att spåra steriliseringshastigheter, kläckningshastigheter och tillväxthastigheter för de gnotobiotiska kackerlackorna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2X master mix New England BioLabs M0482 OneTaq MasterMix
Autoclavable rat chow Zeigler NIH-31 Modified Auto
Bacterial DNA extraction kit Omega Bio-Tek D-3350 E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube
binding buffer Omega Bio-Tek PD099 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer)
brain-heart infusion (BHI) broth Research Products International B11000
Delicate task wipes KimWipe JS-KCC-34155-PK KimWipes
DNA purification kit Omega Bio-Tek D6492 E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution)
elution buffer Omega Bio-Tek PDR048 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
glass beads Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
Hybridization oven UVP 95-0330-01 we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used
Laminar flow biological safety cabinet NuAire, Inc. NU-425-400 Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity
lysozyme Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
peracetic acid stock solution (32%) Sigma-Aldrich 269336
Petroleum jelly Vaseline n/a
proteinase K buffer Omega Bio-Tek PD061 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer")
purifying buffer Omega Bio-Tek PDR042 included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer)
RsaI New England BioLabs R0167 Includes CutSmart (digestion) buffer
Secondary container n/a n/a a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes
spectrophotometer ThermoFisher ND-2000 Catalog info is for NanoDrop2000
thermal shaker Eppendorf EP5386000028 Thermomixer R
Tris-EDTA Fisher BP1338-1 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8
wash buffer Omega Bio-Tek PDR044 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer)
Woodchip bedding P.J. Murphy Forest Products Sani-Chips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yi, P., Li, L. The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).
  2. Nature Biotechnology. Laying better plans for mice. Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).
  3. Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents. ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).
  4. Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).
  5. Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
  6. Eun, C. S., et al. Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice. Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).
  7. Cherbuy, C., et al. Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).
  8. Van Den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats. Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).
  9. Stecher, B., Berry, D., Loy, A. Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle. FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).
  10. Sugahara, H., et al. Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community. Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).
  11. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).
  12. Mallapaty, S. Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom. Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).
  13. Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  14. Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
  15. Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host–Microbiota Interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).
  16. Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).
  17. Engel, P., Moran, N. A. The gut microbiota of insects - diversity in structure and function. FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).
  18. Tinker, K. A., Ottesen, E. A. The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts. Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).
  19. Zurek, L., Keddie, B. A. Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L. Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).
  20. Cruden, D. L., Markovetz, A. J. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).
  21. Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest. PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).
  22. Benschoter, C., Wrenn, R. Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches. Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).
  23. Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
  24. Clayton, R. A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions. Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).
  25. Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies. American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).
  26. Wada-Katsumata, A., et al. Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach. Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).
  27. Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate. PeerJ. 7, 6914 (2019).
  28. Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches. Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).
  29. Katoh, K., et al. Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches. Zoological Letters. 3, 3 (2017).
  30. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).
  31. Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids. Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).
  32. Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , Taylor & Francis. Philadelphia, PA. (2008).
  33. House, H. L. Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique. The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).
  34. Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses. Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).
  35. Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).
  36. Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).
  37. Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Muñoz-Garcia, A. The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana. PeerJ. 6, 4717 (2018).
  38. Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation. Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).
  39. Rowland, I., et al. Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components. European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).
  40. Gier, H. T. Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn). Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).

Tags

Biologi Utgåva 171 gnotobiotisk bakteriefri kackerlacka periplaneta americana sterilisera oothecae
Etablering och underhåll av Gnotobiotic American Cockroaches (<em>Periplaneta americana</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen,… More

Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen, E. A. Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana). J. Vis. Exp. (171), e61316, doi:10.3791/61316 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter