Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Etablering og vedlikehold av Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61316
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, University of Georgia

Summary

Denne protokollen brukes til å etablere og vedlikeholde gnotobiotiske amerikanske (Periplaneta americana) ved overflatesterilisering av eggkassene (oothecae) før klekking. Disse gnotobiotiske insekter inneholder sine vertikalt overførte Blattabacterium endosymbionts, men har akseniske tarmer.

Abstract

Gnotobiotiske dyr er et kraftig verktøy for studiet av kontroller på mikrobiomestruktur og funksjon. Presentert her er en protokoll for etablering og vedlikehold av gnotobiotiske amerikanske (Periplaneta americana). Denne tilnærmingen inkluderer innebygde sterilitetskontroller for kontinuerlig kvalitetskontroll. Gnotobiotiske insekter er her definert som som fortsatt inneholder deres vertikalt overførte endosymbiont (Blattabacterium), men mangler andre mikrober som normalt ligger på overflaten og i fordøyelseskanalen. For denne protokollen fjernes eggkasser (oothecae) fra en (ikke-steril) lagerkoloni og overflatesterilisert. Når den er samlet og sterilisert, inkuberes oothecaen ved 30 °C i ca. 4-6 uker på hjernehjerteinfusjon (BHI) agar til de klekkes eller fjernes på grunn av forurensning. Klekkede nymfer overføres til en Erlenmeyer-kolbe som inneholder et BHI-gulv, sterilt vann og steril rottemat. For å sikre at nymfene ikke huser mikrober som ikke er i stand til å vokse på BHI under de gitte forholdene, bruker et ekstra kvalitetskontrolltiltak begrensning fragmentlengde polymorfisme (RFLP) for å teste for ikke-dosymbiotiske mikrober. Gnotobiotiske nymfer generert ved hjelp av denne tilnærmingen kan inokuleres med enkle eller komplekse mikrobielle samfunn og brukes som et verktøy i tarmmikrobiomestudier.

Introduction

Gnotobiotiske dyr har vist seg å være uvurderlige verktøy for mikrobiomestudier1,2,3. Bakteriefrie og definerte floradyr har tillatt belysning av vertsmikrobeinteraksjoner, inkludert vertsimmunologiske responser, tarmepiteriemodning og vertsmetabolisme1,4,5,6,7. Gnotobiotiske dyr inokulert med et forenklet samfunn har også bistått i en mer fullstendig forståelse av mikrobe-mikrobe interaksjoner i et tarmsamfunn, spesielt i unraveling kryssfôring og antagonistiske forhold8,9,10,11. Det nåværende foretrukne modellsystemet for studier i pattedyret tarmmikrobiom er murinmodellen. Selv om dette systemet har vært avgjørende i funnene som er skissert ovenfor, er en viktig mangel kostnadene som er involvert. Spesialisert utstyr og høyt utdannede teknikere er nødvendige for å etablere og vedlikeholde et gnotobiotisk anlegg. Dette, i kombinasjon med ekstra forsiktighet som må gis til alle aspekter av gnotobiotisk dyrevedlikehold, fører til at et gnotobiotisk dyr koster ti til tjue ganger mer å avle enn en standard dyremodell12. På grunn av høye kostnader kan mange forskere ikke ha råd til en gnotobiotisk murinmodell. I tillegg, mens murine modeller kan være det mest aksepterte valget for studier som ønsker å oversette til menneskers helse, er det fortsatt mange fysiologiske og morfologiske forskjeller mellom menneske- og muse tarm13. Det er klart at ingen entallsmodell er nok til å svare på det stadig økende antallet spørsmål om de mange aspektene ved tarmmikrobiomet.

Insektmodeller er et billigere alternativ på grunn av deres lavere vedlikeholdskostnader i forhold til pattedyrarter. Omfattende bakteriefri og gnotobiotisk forskning i en rekke insektarter har ført til utvikling av flere ofte brukte modeller. Mygg og Drosophila er vanlige modeller for bakteriefritt arbeid på grunn av deres relevans for globale sykdommer og genetisk tractability14,15. Et annet fremvoksende modellsystem er honningbien (Apis mellifera), gitt sin betydning i pollinering og sosialitetsforskning16. Imidlertid mangler mange av disse ofte brukte insekter den taksonomiske kompleksiteten sett i pattedyr tarmsamfunn17, og begrenser deres evne til å modellere høyere ordens interaksjoner. Ikke bare er det totale mangfoldet av mikrober som finnes i tarmen til amerikanske mer lik pattedyr, men mange av mikroberene som er tilstede i tarmen tilhører familier og phyla som ofte finnes i tarmmikrobiota av pattedyr og mennesker18. Bakenden av er også funksjonelt analog med tykktarmen av pattedyr, da det er et gjæringskammer tett pakket med bakterier for å hjelpe til med utvinning av næringsstoffer19,20. Til slutt gir altomfattende natur et mangfold av diettregimer som ikke ville være mulig med kostholdsspesialister.

Amerikanske kan være et nyttig modellsystem for å forstå tarmmikrobielle samfunn i høyere organismer, men status som gjør også dette systemet relevant for skadedyrskontroll21. Utnytte grunnleggende kunnskap om tarmsamfunnets innflytelse på helse og fysiologi bidrar til å utvikle nye teknikker for skadedyrshåndtering.

Målet med denne metoden er å skissere en omfattende beskrivelse av etablering og vedlikehold av gnotobiotiske amerikanske (Periplaneta americana), men denne protokollen kan brukes til å generere nymfer av enhver oviparøs. Det inkluderer en metode for effektiv, ikke-invasiv samling av moden oothecae, og en ikke-ødeleggende teknikk for å overvåke gnotobiotisk status for insekter22,23,24. Mens tidligere metoder for å oppnå og vedlikeholde gnotobiotiske beskriver ootheca samling23,24,25,26,27, ootheca modenhet er enten tolket i form av artsspesifikke signaler (i Blattella germanica22,24,25), eller ikke eksplisitt beskrevet27,28, noe som gjør implementering vanskelig for de ukjente med systemet. Siden metoden beskrevet her bruker naturlig droppet oothecae, er feilen ved å fjerne egg for tidlig fraværende. Denne protokollen inneholder både kulturavhengige og kulturuavhengige metoder for kvalitetskontroll, og den kulturavhengige metoden krever ikke å ofre insekter. Til slutt samler denne metoden informasjon fra flere gnotobiotiske kakerlakkstudier for å lage en omfattende protokoll med all nødvendig informasjon for å oppnå og vedlikeholde gnotobiotiske.

Protocol

1. Fremstilling av materialer

  1. Vedlikehold av lager kulturer
    MERK: Det er mange måter å bake disse robuste insekter. Spesifikasjonene for å gi ly og vann kan være forskjellige avhengig av tilgjengelige materialer (dvs. eggkartonger i stedet for papprør). Følgende steriliseringsprotokoll vil fungere for ethvert lagertankoppsett.
    1. Spred nok woodchip sengetøy i en 37.85 L (10 gallon) fisketank for å dekke bunnen av tanken med ca 1 tomme sengetøy. Forbered huset ved å kutte (flatt) papp til 2 i x 4 i stykker. Sett pappstykker inn i papprør (f.eks. toalettpapirrør) og stablerør i den ene enden av tanken (figur 1).
    2. Smør et tynt lag med petroleumjell på toppen to tommer av tankens indre for å forhindre insektflukt.
      MERK: Sørg for å belegge innsiden av hjørnene på tanken på riktig måte.
    3. Legg ved å overføre (okkuperte) papprør fra en tidligere lagertank, rist dem for å frigjøre sine innbyggere. For hver overføring, flytt 100-200 blandet alder, blandet sex. Tilsett hundemat (20-30 stykker), overvåk mengden hundemat i tanken og fyll på når den er lav.
    4. Sett opp en vannfat.
      1. Fyll en liten plast gjenbrukbar matbeholder med dobbeltdestillert vann (ddH2O). Klipp cellulose svamper og hull i lokket på matbeholderen til omtrent samme størrelse.
        MERK: Cellulosesvampene hindrer i å drukne i vannfatet.
    5. Sett svamper inn i hullene i lokket og legg lokket på den fylte beholderen. Plasser beholderen i tanken og fyll på når den er lav. Dekk tanken med bomullsklut og fest den på plass med et elastisk bånd.
    6. Når tanker begynner å samle store mengder frass og insektkropper, sett opp nye tanker og overfør.
      MERK: Tanker overføres vanligvis hver sjette måned. Eventuelle gjenværende / egg i utrangerte lagertanker avlives ved frysing ved -20 °C i 1 time, og innholdet i lagertanken overføres deretter til en autoklavpose og autoklaveres (1 t, tyngdekraftssyklus) før avhending. Lagertanker steriliseres med 2% blekemiddel mellom bruk.
  2. Desinfiser en sekundær beholder.
    MERK: Denne beholderen inkluderer ikke et filter, men tillater i stedet fri luftutveksling.
    1. Spray innsiden av både lokket og bunnen med 2% blekemiddel og la dem suge i 10 minutter. Tørk ut blekemiddelet med et rent papirhåndkle.
    2. Spray innsiden av lokket og bunnen med 70% etanol og tørk tørt med et rent papirhåndkle. Sett på lokket igjen til bruk.
  3. Lag BHI skråblikk og kolber for inkubering av egg og bolignymfer.
    1. Forbered BHI i henhold til pakkeinstruksjoner, og legg til 2% agar. Kok BHI-agarløsningen til den er avklart.
    2. For skråninger, overfør 5 ml aliquots til 18 mm x 150 mm glass reagensrør og hette. Steriliser via autoklav (steriliseringstid = 20 min, væskesyklus). Plasser autoklavede rør i en 45° vinkel for å avkjøles i skråninger. Når den er størknet, må den oppbevares til bruk for å unngå uttørking.
    3. For kolber, overfør 10 ml aliquots av kokt BHI-agaroppløsning til 250 ml Erlenmeyer-kolber for å dekke bunnen av kolben helt. Dekk kolben med folie og steriliser via autoklav (20 min, flytende syklus). La autoklavede kolber avkjøles og kjøles ned til bruk for å unngå uttørking.
      MERK: Det er ikke nødvendig med luftfilter for dette oppsettet. Foliedekselet er tilstrekkelig til å tillate gassutveksling samtidig som forurensningen hindrer forurensning fra friluftsstrømmen.
  4. Steriliser via autoklav: autoklaverbar rotte chow brutt i halve størrelser (~ 1/2 tommers stykker) i et foliedekket beger (steriliseringstid = 1 t, tyngdekraftssyklus), ddH2O i en kappet flaske (steriliseringstid = 20 min, flytende syklus) og tang i et foliedekket beger (steriliseringstid = 20 min, tyngdekraftsyklus).
    MERK: Ikke fyll rotte chow begeret for mye. Pellets vil svulme i autoklaven.
  5. Sett opp en "barselavdeling" tank.
    MERK: Denne tanken inneholder de samme materialene som lagertankene (papprør, vannretter med svamper, hundemat, trechip-sengetøy, se figur 1) og bør være tom for med mindre de overføres til oothecae-kolleksjon (se avsnitt 2).
  6. Fukt en inkubator ved å forberede et beger fullt av overmettet natriumklorid (NaCl) løsning. Forbered denne løsningen ved å tilsette 37 g NaCl per 100 ml ddH2O og rør til den er oppløst.
    MERK: Vanligvis fukter 500 ml mettet saltoppløsning vanligvis en inkubator med kammerdimensjoner 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x B x D) i omtrent en måned før mer vann må tilsettes.

2. Innsamling av oothecae

  1. Overfør kvinner (i et hvilket som helst tall etter behov for planlagte eksperimenter) som bærer oothecae (figur 2) fra lagertanken til "barselavdelingen" ved å bruke tang til å flytte papprør som inneholder gravide kvinner.
    1. Hvis et kartavlerør inneholder flere insekter i tillegg til gravid-kvinnen, må du først riste ut røret i en ekstra plastbeholder ringet med petroleumjell, og deretter oppmuntre målinsektet til å klatre tilbake i papprøret alene.
  2. Overfør kvinner tilbake til lagertanken når de har droppet oothecae. Hent oothecae fra søppelet i tanken med tang.
    MERK: Oothecae blir ofte droppet innen 24 timer etter at kvinnen ble overført.

3. Rengjøring av oothecae

  1. Tilsett oothecae til et 5 ml sentrifugerør som inneholder 3 ml natriumdodecylsulfat (SDS). Virvel i 10 s. Gjenta for et nytt vasketrinn med et sentrifugerør som inneholder fersk SDS.
    MERK: Opptil fem oothecae kan brukes per 3 ml SDS.
  2. Bruk en delikat oppgaveserviett, skrubb forsiktig overflaten av hver ootheca for å fjerne rusk. Mer SDS kan legges til for å hjelpe til med grundig rengjøring. Plasser rengjort oothecae i en veiebåt til den er klar til sterilisering.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her, men hvis du lar oothecae være i omgivelser med lav luftfuktighet i lengre perioder (dager til uker), vil de bli dehydrert og miste levedyktighet.

4. Sterilisering og inkubasjon av oothecae

  1. Aliquot sterilt vann for ettersterilisering skylling. For hver ootheca som skal steriliseres, fyll to 1,5 ml sentrifugerør med 1 ml sterilt vann.
  2. Tilsett 10 μL konsentrert (32 %) peracetic acid lagerløsning til 3,2 ml ddH2O i et 5 ml sentrifugerør for å skape en 0,1% løsning for sterilisering. Hette og inverter flere ganger for å blande.
    FORSIKTIG: Peratisk syre er skadelig i kontakt med hud eller lunger. Fortynn i en avtrekkshette.
    MERK: Dette må gjøres samme dag som sterilisering. Hvis fortynnet på forhånd, vil løsningen raskt dekomponere og derfor ikke steriliseres riktig. Så mange som fem rensede oothecae kan steriliseres i 3,2 ml fortynnet syre.
  3. Plasser (opptil fem) rengjort oothecae i 0,1% peracetic acid løsning i 5 min. Snu røret flere ganger hver 60.
  4. I en laminær strømningshette, bruk sterile tang for å overføre hver ootheca til sitt eget sentrifugerør med aliquoted sterilt skyllevann (trinn 4.1). Inverter flere ganger for å blande. Gjenta for en ny skylling, og overfør deretter hver skyllet ootheca til sin egen BHI skråstilling ved hjelp av sterile tang.
  5. Plasser skråninger i den steriliserte sekundærbeholderen. Flytt beholderen inn i den fuktede inkubatoren ved 30 °C i 4-5 uker til den er klekket ut.
    MERK: Skråninger kan holdes oppreist av et lite reagensglassstativ eller et middels/lite beger.
  6. Kontroller skråstillingene regelmessig (1−2x per uke). Hvis sopp eller bakteriell kolonivekst vises på agaren, fjern den forurensede skråningen. Når tidspunktet på fire uker nærmer seg, kontrollerer du skråblikk hver dag.
    MERK: Når de er klekket ut, kan nymfer overleve i opptil flere uker på BHI alene, men vil ikke vokse optimalt.

5. Vedlikehold av gnotobiotiske nymfer

  1. I en laminær strømningshette overføres aseptisk en pellets av sterilisert rotte chow til en tilberedt BHI-kolbe (fra trinn 1.3.3) med sterile tang. Som en sterilitetskontroll, plasser kolben i sekundærbeholderen i en 30 °C inkubator i 24 timer, og ikke bruk den hvis veksten oppstår.
  2. Tilsett nymfer i BHI-kolben med steril matpellet. Rist dem ut av BHI-skråningen og la dem falle inn i kolben i en laminær strømningshette.
    MERK: Nymfene har ikke trekkraft på glassveggene i reagensglasset. Risting av røret for å slå dem av skråningen og deretter tippe røret slik at de kan gli ned glasset i kolben er effektivt. Mens nymfer kan overføres ved hjelp av tang, er risikoen for dødelig skade høy.
  3. Vannnymfer med 300 μL sterilt vann en gang i uken i en laminær strømningshette ved å pipetter direkte på BHI-gulvet i kolben.
  4. Når nymfe avføring begynner å dekke BHI gulvet, overføre til en ny BHI kolbe, legge sterilisert rotte chow 24 h på forhånd (for å verifisere sterilitet) som i trinn 5.1.

6. Kvalitetskontroll av sterilitet

  1. Fjern en nymfe fra BHI-kolben for å ofre for en kulturuavhengig kvalitetskontroll av gnotobiotisk status via begrensning fragmentlengde polymorfisme (RFLP). For å gjøre dette, hell nymfen i et sterilt sentrifugerør (ligner nymphal overføring fra trinn 5.1) eller legg en steril treapplikator i kolben og vent på at en nymfe begynner å klatre den, og overfør den deretter til sentrifugerøret.
  2. Tilsett 0,5 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) til nymfen i sentrifugerøret og homogeniser med en steril mikropestol til alle store stykker er brutt opp. Virvel godt.
  3. Trekk ut DNA fra nymfe homogenat ved hjelp av et bakterielt DNA-ekstraksjonssett (Tabell over materialer) som følger.
    1. Sentrifuger den homogeniserte nymfen i 10 min ved 5000 x g og fjern supernatanten. Forvarm en termisk shaker til 37 °C.
    2. Tilsett 100 μL 1x Tris-EDTA, og virvel for å resuspendere pelletsen fullstendig. Tilsett 10 μL lysozym og bland, etterfulgt av en 30 min (ingen risting) inkubasjon i den forvarmede 37 °C termiske shakeren.
    3. Tilsett 25 mg glassperler til prøver, og virvel med maksimal hastighet i 5 min. Forvarm den termiske shakeren til 55 °C.
    4. La perlene slå seg ned før du overfører supernatanten til et nytt 1,5 ml sentrifugerør med 100 μL proteinase K-buffer og 20 μL proteinase K. Vortex for å blande grundig.
    5. Inkuber, med risting ved 600 o/min, i en 55 °C termisk shaker i 60 min. Sentrifuge ved 10.000 x g i 2 min, og overfør supernatant til et nytt 1,5 ml sentrifugerør. Forvarm den termiske shakeren til 65 °C. Begynn å forvarme elutionbufferen i en 65 °C hybridiseringsovn.
    6. Tilsett 220 μL 100% etanol. Virvel med maksimal hastighet i 20 s. Bryt opp ethvert synlig bunnfall ved å pipettere opp og ned 10x.
    7. Sett inn en DNA-kolonne i et 2 ml oppsamlingsrør, og overfør prøven til kolonnen, inkludert eventuelle bunnfall som kan ha dannet seg. Sentrifuge ved 10.000 x g i 1 min, kast filtrat fra oppsamlingsrøret og bytt ut oppsamlingsrøret.
    8. Tilsett 500 μL bindingsbuffer i kolonnen, og sentrifuger ved 10 000 x g i 1 min. Kast filtratet fra oppsamlingsrøret og skift ut oppsamlingsrøret.
    9. Tilsett 700 μL DNA-vaskebuffer i kolonnen, og sentrifuger ved 10.000 x g i 1 min. Kast filtratet fra oppsamlingsrøret og skift ut oppsamlingsrøret. Gjenta for et nytt vasketrinn.
    10. Sentrifuger tom søyle i 2 min for å tørke den, og oversenv kolonnen til et nytt 1,5 ml sentrifugerør etterpå. Tilsett 50 μL forvarmet eliksjonsbuffer direkte til DNA-kolonnematrisen, og inkuber ved 65 °C i 5 minutter.
    11. Sentrifuge på 10.000 x g i 1 min å elute. Kvantifisere det ekstraherte DNA-et i filtratet via spektrofotometri eller fluorometri.
  4. Forsterk og fordøye hele 16S-genet. Visualiser fragmenter ved hjelp av gelelektroforese.
    1. Bruk 12,5 μL 2x master mix, 0,5 μL av hver primer 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) og 27F (5'-AGAGTTTCCGATTGGCTCAG), 5 ng DNA og molekylært vann for et totalt reaksjonsvolum på 25 μL.
    2. Kjør følgende termosyklerprogram: 94 °C i 60 s; etterfulgt av 35 sykluser på 94 °C i 30 s, 50 °C i 45 s, 68 °C i 90 s; etterfulgt av 68 °C i 5 minutter.
    3. Rens polymerasekjedereaksjonsproduktet (PCR) ved hjelp av et DNA-rensesett (Materialtabell).
      1. Tilsett 120 μL rensebuffer til PCR-produktet og virvelen som skal blandes. Sentrifuge kort for å samle dråper inne i lokket. Sett inn en DNA-kolonne i et 2 ml oppsamlingsrør, overfør væske til den forberedte kolonnen og sentrifuger ved ≥ 13 000 x g i 1 min.
      2. Kast filtratet og sett inn oppsamlingsrøret igjen. Tilsett 700 μL DNA-vaskebuffer og sentrifuge ved ≥ 13 000 x g i 1 min. Kast filtratet og sett inn oppsamlingsrøret igjen. Gjenta for et nytt vasketrinn.
      3. Sentrifuger den tomme kolonnen i 2 min for å tørke og overføre kolonnen til et nytt 1,5 ml sentrifugerør. Tilsett 50 μL forvarmet eliksjonsbuffer direkte til DNA-kolonnematrisen, og inkuber ved romtemperatur i 2 min.
      4. Sentrifuge på 10.000 x g i 1 min å elute. Kvantifisere det ekstraherte DNA-et i filtrat via spektrofotometri eller fluorometri.
    4. Tilsett 1 μg renset PCR-produkt til 5 μL fordøyelsesbuffer, 10 enheter RsaI og molekylært vann for et totalt reaksjonsvolum på 50 μL. Bland ved pipettering opp og ned og inkuber ved 37 °C i 60 minutter.
    5. Skill det fordøyde produktet via gelelektroforese ved å kjøre 20 μL fordøyd DNA på en 2% agarose gel. Visualiser gelen for å bekrefte gnotobiotisk status.
      MERK: Gnotobiotiske insekter bør bare resultere i bånd ved 402 bp, 201 bp og et smør fra 163 til 148 bp, basert på 16S rDNA-sekvensen av endosymbiont, Blattabacterium. Eventuelle ekstra bånd sett i gelen indikerer forurensende mikrobielle arter.

7. Aseptisk sporing av nymphal vekst

  1. Registrer kroppslengden for å spore nymphal vekst ved å måle insekter gjennom det gjennomsiktige BHI-gulvet i kolben.
    MERK: Nymfer kan plasseres ved 4 °C i 15 minutter for å bremse bevegelsen, og dermed gjøre dem enklere å måle.

Representative Results

Lagertanker er definert som avbildet i figur 1. "Gravide" kvinner identifiseres av ootheca festet til bakre mage, som avbildet i figur 2. Inkubasjon av oothecae på BHI agar gir mulighet for gnotobiotisk kvalitetskontroll på en ikke-ødeleggende måte. I noen tilfeller er sterilisering mislykket, og veksten vises rundt oothecae som i figur 3B. Disse oothecae bør fjernes og kastes. I våre hender ble det observert en gjennomsnittlig sviktrate på 10% for sterilisering (n = 51). Oothecae luker i gjennomsnitt 34 dager etter sterilisering uten vekst på mediet, som vist i figur 3A. Vi har observert typiske lukehastigheter på 41% (n = 46) for sterilisert, ikke-aminert oothecae, med et gjennomsnitt på 11 nymfer per ootheca. Større nymfer overføres til BHI-kolber dekket med folie, som i figur 4. Folien forhindrer forurensning, og nymfene har plass til å vokse. RFLP av 16S rDNA fra en homogenisert nymfe brukes til å bekrefte gnotobiotisk status. Gnotobiotiske nymfer har blitt observert å vokse i en langsommere hastighet enn deres ikke-sterile kolleger, som representert figur 5. Figur 6 viser resultater fra vellykket gnotobiotiske insekter samt standard (ikke-steroide) nymfer.

Selv om denne testen ennå ikke har identifisert forurensning i fravær av et positivt kulturresultat, har dette trinnet blitt utført rutinemessig under kritiske eksperimenter for å utelukke tilstedeværelsen av forurensende oksygenfølsomme eller begeistrede mikrober. Langsommere vekst har blitt observert i gnotobiotiske sammenlignet med standard / ikke-steroide insekter.

Figure 1
Figur 1: Cockroach lagerkulturoppsett.
Papprør kan sees stablet i den andre enden av tanken. Mat og vann er begge nær forsiden av tanken. Bomullsklutdeksel og elastisk bånd er fjernet for synlighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: En gravid amerikansk.
Pilen indikerer oothecaen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bilder av vellykket gnotobiotiske nymfer klekket ut og uten hell sterilisert oothecae på BHI-skråninger.
Oothecae ble sterilisert og inkubert som beskrevet i denne protokollen. (A) Mangelen på mikrobiell vekst på BHI-skråningen indikerer at insekter er fri for dyrkbare organismer. (B) Oothecae på skråninger som resulterer i kolonidannelse bør kastes som forurenset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Gnotobiotisk oppdrettsapparat.
Insekter holdes i sterile kolber dekket med folielokk for å forhindre forurensning. Den sekundære beholderen (grønt lokk) steriliseres med 2% blekemiddel etterfulgt av 70% etanol. Luftstrømmen er ikke begrenset i sekundærbeholderen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative vekstratedata som sammenligner kroppslengder på gnotobiotiske og ikke-steroide nymfer. Begge gruppene av insekter ble matet autoklavert gnager diett. Gnotobiotiske insekter (her: n = 105) holdes på BHI som beskrevet. Nonsterile insekter (her: n = 50) lever i kolber med autoklavert woodchip sengetøy med små retter for vann. Nonsterile nymfer vokser en gjennomsnittlig hastighet på 0,059 mm / dag, mens gnotobiotiske nymfer vokser på 0,028 mm / dag (p < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Et representativt gelbilde av RFLP-resultater for kvalitetskontroll.
Hele 16S genamplikoner ble fordøyd med RsaI. DNA for PCR ble hentet fra nymfer homogenisert i 1x PBS. "G nymfe" baner tilsvarer gnotobiotiske nymfer, mens "conv nymph" -baner tilsvarer konvensjonelle, ikke-steroide kolleger. Basert på virtuell begrensningssammendrag forventes endosymbiont (Blattabacterium) å ha bånd i størrelsene 402 bp, 206 bp og 163 bp, med et smør av bånd mellom 163 bp og 148 bp. Et gnotobiotisk insekt bør bare vise Blattabacterium-bandingmønsteret. Et blandet bakteriesamfunn forventes å ha et smør av bånd med varierende størrelse, merket her "andre bakterielle 16S-fragmenter". Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Andre metoder som beskriver generering av gnotobiotiske beskrev enten ikke oothecae-samlingen eller brukte benchmarks som er spesifikke for andre kakerlakkarter for å indikere når oothecae kunne fjernes fra moren23,25,26. Opprinnelig ble oothecae samlet inn fra woodchip sengetøy i lagertankene, noe som resulterte i svært lave lukehastigheter (~ 10%) sammenlignet med ikke-steroid oothecae (47 %)29. Dette skyldes sannsynligvis det faktum at unhatched oothecae akkumuleres over tid i lagerburet, og det er ingen måte å verifisere ootheca alder eller levedyktighet. Implementering av "barselavdelingen" -tilnærmingen tillater innsamling av nyavsatt oothecae av kjent alder. Dette letter videre eksperimentell planlegging, da forskeren kan forutse sannsynlige luketider for individuell oothecae. En annen modifikasjon fra innledende og publiserte protokoller inkluderer inkubasjon av oothecae og nymfer i halvforseglede kamre som også inneholder en overmettet natriumkloridoppløsning. Tilstedeværelsen av løsningen opprettholder en relativ fuktighet på ca. 75%30. Oothecae inkuberes rutinemessig ved 30 °C, noe som har vist seg å minimere antall dager som kreves for inkubasjon, samtidig som embryoenes levedyktighet og antall nymfer produseres per ootheca31. Etter klekking dyrkes gnotobiotiske nymfer rutinemessig på benken ved laboratorietemperatur og omgivelsesforhold, selv om fuktighetskontrollerte kamre igjen brukes til kritiske eksperimenter. Etter etablering av disse endringene i ootheca innsamling og inkubasjon økte lukehastighetene til ca. 41% (n = 51), ikke inkludert oothecae fjernet på grunn av forurensning. En potensiell vei til ytterligere optimalisering av lukehastigheter kan omfatte å forlenge tiden mellom ootheca-innsamling og sterilisering. Kutikylen i eggkassen kan ikke være fullt solbrun ved første utgivelse32, og kan derfor være gjennomtrengelig for løsninger som brukes under sterilisering innen 24 timer etter å ha blitt droppet.

Steriliseringsprotokollen ved hjelp av 0,1% peratisk syre ble tilpasset fra Doll et al.25. Andre studier har dokumentert alternative teknikker for sterilisering av oothecae23,26. Forurensningsrater er basert på den ikke-ødeleggende metoden for å inkubere oothecae på en BHI-skråning. Denne tilnærmingen er svært fordelaktig, da den gir mulighet for rask identifisering og fjerning av forurenset oothecae. De fleste tidligere protokoller tester for dyrkbare organismer ved å plating avføring eller nymfe homogenat på bakteriologiske medier og se etter vekst22,23,25,27,28,33. I minst ett tilfelle ble metoden for testing av gnotobiotisk status ikke fullstendig beskrevet26. Bortsett fra Clayton som la til en liten plate med sterilitetstesting middels til oppdrettsflasker24, tidligere metoder22,23 huset gnotobiotiske insekter på bakteriologiske medier bare i korte perioder for å først evaluere steriliseringsprotokollen.

Fortsatt hus av de resulterende nymfer på BHI medium som et innebygd kvalitetskontrolltiltak gjør at deres gnotobiotiske status kan overvåkes i semi-sanntid - en teknikk som ikke er sett i de fleste tidligere metoder22,23. Dette er spesielt nyttig for langsiktige eksperimenter som krever gnotobiotiske nymfer for å få tilgang til. Hvis BHI-gulvet under nymfer virker forurenset med bakteriell eller soppvekst, bør kolben kastes. Denne typen forurensning oppstår vanligvis når du avdekker kolber til vannnymfer, men det kan også oppstå fra avføringen ved utilstrekkelig sterilisert oothecae eller mat. Bruken av en laminær strømningshette ved vanning forbedrer forurensningshastigheten forårsaket av å avdekke kolber.

Siden ikke alle forurensende organismer kan vokse aerobt på BHI-medium, er det nødvendig med en ekstra kulturuavhengig sterilitetsmetode. En potensiell tilnærming er mikroskopi27, men denne tilnærmingen kan være arbeidskrevende. Andre protokoller bruker sekvensbaserte teknikker til å oppdage organismer som kan unnslippe kultur14,23,27,28. Imidlertid er slike tilnærminger ofte dyre og vanskelige å tolke, da resultatene av høygjennomstrømningssekvenseringsmetoder lett kan påvirkes av lavnivåforurensning av reagenser34 og strekkodehopping35. I stedet er det utviklet en ny tilnærming som bruker PCR-forsterkning av 16S rRNA-genet i kombinasjon med begrensning av fragmentlengdepolymorfisme for å visualisere både endosymbiont og eventuelle forurensende tarmsympmioner. Denne teknikken inkluderer en intern PCR-kontroll, siden Blattabacteriums16S-gen har blitt sekvensert, og båndmønsteret skal være til stede i både gnotobiotiske og ikke-steroide insekter. Siden endosymbionts begrensningsmønster kan forutsies fra sin genomsekvens36, er det ikke nødvendig å sekvensere amfikanene eller begrensningsfragmentene, med mindre identifisering av forurensning er ønsket. Den nåværende versjonen av denne protokollen krever at en nymfe ofres for PCR / RFLP, men denne teknikken kan også brukes på avføring som et ikke-ødeleggende tiltak. Det vil imidlertid ikke inkludere en innebygd kontroll, da avføringen ikke skal inneholde mye Blattabacterium.

En ekstra lett modifiserbar, men kritisk komponent for oppdrett av gnotobiotiske dyr er kosthold. Mens BHI agar kan tjene som en midlertidig matkilde for insekter, har det blitt funnet at det resulterer i betydelige vekstunderskudd blant nymfer når den brukes som eneste matkilde i lengre perioder. Mens ulike dietter har blitt prøvd, anbefales autoklaverbar rotte chow som et rutinemessig kosthold for vedlikehold av gnotobiotiske insekter. Dietter som ikke er spesielt formulert for sterilisering, var ofte vanskelige å gjengi helt sterile, og mange sterile eller autoklaverbare laboratoriedyr dietter ble funnet å vise rask soppvekst under ikke-sterile forhold. Denne tendensen til å forringe under ikke-steroide forhold gjorde dem uegnet til bruk i eksperimenter som direkte sammenlignet gnotobiotiske og nongnotobiotiske insekter. Det anbefalte kostholdet tillater bruk av et konsistent kosthold mellom gnotobiotiske og standard nymfer, noe som letter sammenligning av egenskaper - for eksempel vekstrater - mellom de to gruppene.

Som andre har observert27, vokser de gnotobiotiske nymfene langsommere enn deres ikke-steroide kolleger. En sammenligning mellom kroppslengder av gnotobiotisk (n = 105) og ikke-steroide nymfer (n = 50) matet det samme, autoklavert gnagerdiett og holdt ved romtemperatur avslører at ikke-steroide nymfer vokser i gjennomsnitt 0,059 mm/dag, mens gnotobiotiske nymfer vokser 0,028 mm/dag (p < 0,0001) (Figur 5). Tilstedeværelsen av tarmmikrobiota i P. americana har vist seg å endre insektenes metabolske rate37, og tarmsamfunn generelt antas å påvirke næringsopptaket38,39. Disse årsakene støtter de observerte forskjellene i vekstraten av gnotobiotiske og ikke-steroide nymfer.

En mulig begrensning i denne teknikken er at gnotobiotiske nymfer kanskje ikke når seksuell modenhet, da de eldste sterile kohortene er mer enn 10 måneder gamle og bare har nådd den syvende instar (av 10; 11 er voksen alder) så omtrentlig etter kroppslengde40. Disse eldste kohortene er ikke på autoklaved rotte diett, men i stedet spise bestrålet rotte chow, en diett som inneholder for mye fuktighet til å mate til ikke-steroide kohorter uten overdreven muggvekst. Ikke-steroide nymfer på et ikke-steroid hundematdiett ble funnet å nå voksen alder etter 9-10 måneder under laboratorieforhold (romtemperatur og fuktighet). Kohorter av gnotobiotiske og ikke-sterile nymfer på de delte, autoklavede rotte chow er for tiden mindre enn 7 måneder gamle, ikke-sterile insekter anslås å være syvende instar (gjennomsnitt: 16,7 mm) mens sterile insekter anslås å være femte instar (gjennomsnitt: 11,2 mm). Som et resultat kan vi ennå ikke bekrefte om våre gnotobiotiske kan reprodusere. Men gitt den enkle som nye gnotobiotiske kohorter kan etableres ved hjelp av denne tilnærmingen, viser denne metoden stort løfte selv i fravær av bevist reproduksjon av gnotobiotiske insekter.

Til slutt gir denne protokollen et allsidig verktøy som gjør det mulig for mikrobiomeforskere å drive sitt eget, rimelige gnotobiotiske "anlegg" ved hjelp av vanlige laboratoriematerialer. Denne tilnærmingen kan brukes til å generere gnotobiotiske for eksperimenter som undersøker mikrobiotaens rolle i å forme vertsadferd, immunitet, utvikling ogstressresponser 21,26,27. Disse gnotobiotiske insekter kan også inokuleres med enten syntetiske eller xenobiotiske samfunn og senere brukes som forsøkspersoner for tarmmikrobiomestudier23,28. Videre er elementer av denne tilnærmingen, inkludert bruk av bakteriologiske medieforede inkubasjonskamre som en innebygd sterilitetskontroll, generaliserbare for andre modellsystemer og kan lette rutinemessig vedlikehold av gnotobiotiske dyr i mindre anlegg.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under tildelingsnummer R35GM133789. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis det offisielle synet på National Institutes of Health. Forfatterne ønsker å anerkjenne Josey Dyer for sporing av steriliseringshastigheter, lukehastigheter og vekstrater for de gnotobiotiske.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2X master mix New England BioLabs M0482 OneTaq MasterMix
Autoclavable rat chow Zeigler NIH-31 Modified Auto
Bacterial DNA extraction kit Omega Bio-Tek D-3350 E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube
binding buffer Omega Bio-Tek PD099 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer)
brain-heart infusion (BHI) broth Research Products International B11000
Delicate task wipes KimWipe JS-KCC-34155-PK KimWipes
DNA purification kit Omega Bio-Tek D6492 E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution)
elution buffer Omega Bio-Tek PDR048 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
glass beads Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
Hybridization oven UVP 95-0330-01 we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used
Laminar flow biological safety cabinet NuAire, Inc. NU-425-400 Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity
lysozyme Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
peracetic acid stock solution (32%) Sigma-Aldrich 269336
Petroleum jelly Vaseline n/a
proteinase K buffer Omega Bio-Tek PD061 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer")
purifying buffer Omega Bio-Tek PDR042 included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer)
RsaI New England BioLabs R0167 Includes CutSmart (digestion) buffer
Secondary container n/a n/a a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes
spectrophotometer ThermoFisher ND-2000 Catalog info is for NanoDrop2000
thermal shaker Eppendorf EP5386000028 Thermomixer R
Tris-EDTA Fisher BP1338-1 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8
wash buffer Omega Bio-Tek PDR044 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer)
Woodchip bedding P.J. Murphy Forest Products Sani-Chips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yi, P., Li, L. The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).
  2. Nature Biotechnology. Laying better plans for mice. Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).
  3. Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents. ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).
  4. Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).
  5. Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
  6. Eun, C. S., et al. Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice. Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).
  7. Cherbuy, C., et al. Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).
  8. Van Den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats. Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).
  9. Stecher, B., Berry, D., Loy, A. Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle. FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).
  10. Sugahara, H., et al. Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community. Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).
  11. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).
  12. Mallapaty, S. Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom. Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).
  13. Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  14. Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
  15. Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host–Microbiota Interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).
  16. Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).
  17. Engel, P., Moran, N. A. The gut microbiota of insects - diversity in structure and function. FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).
  18. Tinker, K. A., Ottesen, E. A. The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts. Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).
  19. Zurek, L., Keddie, B. A. Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L. Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).
  20. Cruden, D. L., Markovetz, A. J. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).
  21. Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest. PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).
  22. Benschoter, C., Wrenn, R. Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches. Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).
  23. Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
  24. Clayton, R. A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions. Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).
  25. Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies. American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).
  26. Wada-Katsumata, A., et al. Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach. Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).
  27. Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate. PeerJ. 7, 6914 (2019).
  28. Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches. Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).
  29. Katoh, K., et al. Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches. Zoological Letters. 3, 3 (2017).
  30. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).
  31. Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids. Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).
  32. Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , Taylor & Francis. Philadelphia, PA. (2008).
  33. House, H. L. Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique. The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).
  34. Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses. Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).
  35. Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).
  36. Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).
  37. Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Muñoz-Garcia, A. The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana. PeerJ. 6, 4717 (2018).
  38. Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation. Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).
  39. Rowland, I., et al. Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components. European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).
  40. Gier, H. T. Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn). Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).

Tags

Biologi Utgave 171 gnotobiotisk bakteriefri, periplaneta americana sterilisere oothecae
Etablering og vedlikehold av Gnotobiotic American Cockroaches (<em>Periplaneta americana</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen,… More

Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen, E. A. Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana). J. Vis. Exp. (171), e61316, doi:10.3791/61316 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter