Summary
Dit protocol wordt gebruikt bij het vaststellen en onderhouden van gnotobiotische Amerikaanse kakkerlakken (Periplaneta americana) door de eigevallen (oothecae) vóór het uitkomen te steriliseren. Deze gnotobiotische insecten bevatten hun verticaal overgedragen Blattabacterium endosymbionts maar hebben axenische darmen.
Abstract
Gnotobiotische dieren zijn een krachtig hulpmiddel voor de studie van controles op de structuur en functie van het microbioom. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de oprichting en het onderhoud van gnotobiotische Amerikaanse kakkerlakken(Periplaneta americana). Deze aanpak omvat ingebouwde steriliteitscontroles voor voortdurende kwaliteitscontrole. Gnotobiotische insecten worden hier gedefinieerd als kakkerlakken die nog steeds hun verticaal overgedragen endosymbiont(Blattabacterium)bevatten, maar andere microben missen die normaal op hun oppervlak en in hun spijsverteringskanaal verblijven. Voor dit protocol worden eigevallen (oothecae) verwijderd uit een (niet-steriele) stamkolonie en gesteriliseerd oppervlak. Eenmaal verzameld en gesteriliseerd, worden de oothecae gedurende ongeveer 4−6 weken geïncubeerd bij 30 °C op hersenhartinfusie (BHI) totdat ze uitkomen of worden verwijderd als gevolg van besmetting. Uitgebroede nimfen worden overgebracht naar een Erlenmeyer-kolf met een BHI-vloer, steriel water en steriel rattenvoer. Om ervoor te zorgen dat de nimfen geen microben huisvesten die niet in staat zijn om onder de gegeven omstandigheden op BHI te groeien, maakt een aanvullende kwaliteitscontrolemaatregel gebruik van restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP) om te testen op niet-endosymbiotische microben. Gnotobiotische nimfen die met deze aanpak worden gegenereerd, kunnen worden ingeënt met eenvoudige of complexe microbiële gemeenschappen en worden gebruikt als hulpmiddel in darmmicrobioomstudies.
Introduction
Gnotobiotische dieren zijn van onschatbare waarde gebleken voor microbioomstudies1,2,3. Kiemvrije en gedefinieerde floradieren hebben opheldering van gastheer-microbeninteracties mogelijk, waaronder immunologische reacties van gastheer, darmepitheelrijping en gastheermetabolisme1,4,5,6,7. Gnotobiotische dieren die zijn ingeënt met een vereenvoudigde gemeenschap hebben ook geholpen bij een vollediger begrip van microbe-microbe interacties in een darmgemeenschap, met name bij het ontrafelen van kruisvoeding en antagonistische relaties8,9,10,11. Het huidige voorkeursmodelsysteem voor studies in het darmmicrobioom van zoogdieren is het muriene model. Hoewel dit systeem van vitaal belang is geweest bij de hierboven beschreven ontdekkingen, is een belangrijke tekortkoming de kosten die hiermee gemoeid zijn. Gespecialiseerde apparatuur en hoogopgeleide technici zijn nodig om een gnotobiotische faciliteit op te zetten en te onderhouden. Dit, in combinatie met extra zorg die moet worden gegeven aan elk aspect van gnotobiotisch dieronderhoud, zorgt ervoor dat het gnotobiotische dier tien tot twintig keer meer kost om te fokken dan een standaard diermodel12. Vanwege de hoge kosten kunnen veel onderzoekers zich mogelijk geen gnotobiotisch murinemodel veroorloven. Bovendien, hoewel muriene modellen misschien wel de meest geaccepteerde keuze zijn voor studies die zich willen vertalen naar de menselijke gezondheid, zijn er nog steeds veel fysiologische en morfologische verschillen tussen menselijke en muisdarmen13. Het is duidelijk dat geen enkel enkel model voldoende is om het steeds groter wordende aantal vragen over de vele aspecten van het darmmicrobioom te beantwoorden.
Insectenmodellen zijn een goedkoper alternatief vanwege hun lagere kosten van onderhoud in vergelijking met zoogdiersoorten. Uitgebreid kiemvrij en gnotobiotisch onderzoek bij verschillende insectensoorten heeft geleid tot de ontwikkeling van meerdere veelgebruikte modellen. Muggen en Drosophila zijn veel voorkomende modellen voor kiemvrij werk vanwege hun relevantie voor wereldwijde ziekten en genetische tracteerbaarheid14,15. Een ander opkomend modelsysteem is dat van de honingbij (Apis mellifera), gezien het belang ervan voor bestuivings - en socialiteitsonderzoek16. Veel van deze veelgebruikte insecten missen echter de taxonomische complexiteit die wordt gezien in darmgemeenschappen van zoogdieren17, waardoor hun vermogen om interacties van hogere orde te modelleren wordt beperkt. Niet alleen is de totale diversiteit van microben gevonden in de darm van Amerikaanse kakkerlakken meer vergelijkbaar met zoogdieren, maar veel van de microben aanwezig in de kakkerlak darm behoren tot families en phyla die vaak worden gevonden in de darmmicrobiota van zoogdieren en mensen18. De achtergeklaagde van de kakkerlak is ook functioneel analoog aan de dikke darm van zoogdieren, omdat het een fermentatiekamer is vol met bacteriën om te helpen bij de extractie van voedingsstoffen19,20. Ten slotte zorgt de omnivore aard van kakkerlakken voor een verscheidenheid aan dieetregimes die niet mogelijk zouden zijn met dieetspecialisten.
Amerikaanse kakkerlakken kunnen een nuttig modelsysteem zijn voor het begrijpen van darmmicrobiële gemeenschappen in hogere organismen, maar de status van de kakkerlak als plaag maakt dit systeem ook relevant voor ongediertebestrijding21. Het benutten van fundamentele kennis van de invloed van de darmgemeenschap op de gezondheid en fysiologie van kakkerlakken helpt bij het ontwikkelen van nieuwe technieken voor ongediertebestrijding.
Het doel van deze methode is om een uitgebreide beschrijving te schetsen van de oprichting en het onderhoud van gnotobiotische Amerikaanse kakkerlakken(Periplaneta americana),maar dit protocol kan worden gebruikt om nimfen van elkeovipareuze kakkerlak te genereren. Het omvat een methode voor efficiënte, niet-invasieve verzameling van volwassen oothecae en een niet-destructieve techniek om de gnotobiotische status van de insecten22,23,24te controleren . Terwijl eerdere methoden voor het bereiken en behouden van gnotobiotische kakkerlakken ootheca-verzameling23,24,25,26,27beschrijven, wordt ootheca-rijpheid ofwel geïnterpreteerd in termen van soortspecifieke signalen (in Blattella germanica22,24,25), of niet expliciet beschreven27,28, waardoor de implementatie moeilijk wordt voor degenen die niet bekend zijn met het systeem. Omdat de hier beschreven methode natuurlijk gedropte oothecae gebruikt, is de fout om eieren voortijdig te verwijderen afwezig. Dit protocol bevat zowel cultuurafhankelijke als cultuuronafhankelijke methoden van kwaliteitscontrole, en de cultuurafhankelijke methode vereist geen opofferende insecten. Ten slotte brengt deze methode informatie uit meerdere gnotobiotische kakkerlakstudies samen om één, uitgebreid protocol te maken met alle benodigde informatie voor het bereiken en onderhouden van gnotobiotische kakkerlakken.
Protocol
1. Bereiding van materialen
- Onderhoud van voorraad kakkerlakculturen
OPMERKING: Er zijn veel manieren om deze robuuste insecten op te kweken. De specifieke kenmerken van het bieden van beschutting en water kunnen verschillen, afhankelijk van toegankelijke materialen (d.w.z. eierdozen in plaats van kartonnen buizen). Het volgende sterilisatieprotocol werkt voor elke voorraadtankopstelling.- Verspreid voldoende houtsnipperbedden in een aquarium van 37,85 L (10 gallon) om de bodem van de tank te bedekken met ongeveer 1 inch beddengoed. Bereid de behuizing voor door (plat) karton in stukken te snijden tot 2 in x 4. Plaats kartonnen stukken in kartonnen buizen (bijv. toiletpapierbuizen) en stapel buizen aan het ene uiteinde van de tank (figuur 1).
- Smeer een dunne laag vaseline op de bovenste twee centimeter van de binnenkant van de tank om te voorkomen dat insecten ontsnappen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de binnenkant van de hoeken van de tank goed bedekt. - Voeg kakkerlakken toe door (bezette) kartonnen buizen van een vorige voorraadtank over te brengen en ze te schudden om hun bewoners vrij te laten. Verplaats voor elke overdracht 100−200 kakkerlakken van gemengde leeftijd en gemengd geslacht. Voeg hondenvoer (20−30 stuks) toe, controleer de hoeveelheid hondenvoer in de tank en vul bij als het laag is.
- Zet een waterschaal op.
- Vul een kleine plastic herbruikbare voedselcontainer met dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Snijd cellulosesponzen en gaten in het deksel van de voedselcontainer tot ongeveer dezelfde grootte.
OPMERKING: De cellulosesponzen voorkomen dat kakkerlakken verdrinken in de waterschaal.
- Vul een kleine plastic herbruikbare voedselcontainer met dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Snijd cellulosesponzen en gaten in het deksel van de voedselcontainer tot ongeveer dezelfde grootte.
- Steek sponzen in gaten in het deksel en plaats het deksel op de gevulde container. Plaats de container in de tank en vul bij als deze laag is. Bedek de tank met een katoenen doek en zet deze vast met een elastiek.
- Terwijl tanks overmatige hoeveelheden frass en insectenkarkassen beginnen te accumuleren, zet je nieuwe tanks op en breng je kakkerlakken over.
OPMERKING: Tanks worden meestal om de 6 maanden overgedragen. Alle resterende kakkerlakken/eieren in ontmantelde voorraadtanks worden geëuthanaseerd door gedurende 1 uur bij -20 °C in te vriezen en de inhoud van de voorraadtank wordt vervolgens overgebracht naar een autoclaafzak en vóór verwijdering geautoclaveerd (1 uur, zwaartekrachtcyclus). Voorraadtanks worden gesteriliseerd met 2% bleekmiddel tussen gebruik.
- Desinfecteer een secundaire container.
OPMERKING: Deze container bevat geen filter, maar maakt in plaats daarvan vrije luchtuitwisseling mogelijk.- Besproei de binnenkant van zowel het deksel als de bodem met 2% bleekmiddel en laat ze 10 minuten weken. Veeg het bleekmiddel uit met een schone papieren handdoek.
- Besproei de binnenkant van het deksel en de bodem met 70% ethanol en veeg droog met een schone papieren handdoek. Vervang het deksel tot gebruik.
- Maak BHI-schuine schuine buigingen en kolven voor het incuberen van eieren en het huisvesten van nimfen.
- Bereid BHI voor volgens de instructies van de verpakking en voeg 2% agar toe. Kook de BHI-agar oplossing tot deze is opgeklaard.
- Breng voor schuine schuine iënten 5 ml aliquots over naar 18 mm x 150 mm glazen reageerbuizen en dop. Steriliseren via autoclaaf (sterilisatietijd = 20 min, vloeistofcyclus). Plaats autoclaafbuizen onder een hoek van 45° om af te koelen in schuine schuine iën. Eenmaal gestold, in de koelkast bewaren tot gebruik om uitdroging te voorkomen.
- Breng voor kolven 10 ml aliquot gekookte BHI-agar-oplossing over in erlenmeyers van 250 ml om de bodem van de kolf volledig te bedekken. Bedek de kolf met folie en steriliseer via autoclaaf (20 min, vloeistofcyclus). Laat autoclaafkolven afkoelen en in de koelkast bewaren tot gebruik om uitdroging te voorkomen.
OPMERKING: Voor deze opstelling is geen luchtfilter vereist. De folieafdekking is voldoende om gasuitwisseling mogelijk te maken en tegelijkertijd verontreiniging door de open luchtstroom te voorkomen.
- Steriliseren via autoclaaf: autoclaveerbare rattenvoer gebroken in halve maten (~ 1/2 inch stukken) in een met folie bedekt bekerglas (sterilisatietijd = 1 uur, zwaartekrachtcyclus), ddH2O in een afgedekte fles (sterilisatietijd = 20 min, vloeistofcyclus) en tang in een met folie bedekt bekerglas (sterilisatietijd = 20 min, zwaartekrachtcyclus).
OPMERKING: Vul het rattenvoerbeker niet te vol. Pellets zwellen op in de autoclaaf. - Zet een "kraamafdeling" tank op.
OPMERKING: Deze tank bevat dezelfde materialen als de voorraadtanks (kartonnen buizen, waterschalen met sponzen, hondenvoer, houtsnipperbedden; zie figuur 1) en moet leeg zijn van kakkerlakken, tenzij overgedragen voor oothecae-verzameling (zie rubriek 2). - Bevochtig een incubator door een beker vol oververzadigde natriumchloride (NaCl) oplossing te bereiden. Bereid deze oplossing door 37 g NaCl per 100 ml ddH2O toe te voegen en te roeren tot het is opgelost.
OPMERKING: Meestal bevochtigt 500 ml verzadigde zoutoplossing een incubator met kamerafmetingen van 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x B x D) gedurende ongeveer een maand voordat er meer water moet worden toegevoegd.
2. Verzameling oothecae
- Breng vrouwtjes (in elk aantal naargelang het geval voor geplande experimenten) met oothecae (figuur 2) van de voorraadtank naar de "kraamafdeling" met behulp van een tang om kartonnen buizen met gravid vrouwtjes te verplaatsen.
- Als een carboardbuis naast het gravid vrouwtje meerdere insecten bevat, schud dan eerst de buis uit in een extra plastic container met vaseline en moedig vervolgens het doelinsect aan om alleen terug in de kartonnen buis te klimmen.
- Breng vrouwtjes terug naar de voorraadtank zodra ze hun oothecae hebben laten vallen. Haal de oothecae met een tang uit het strooisel in de tank.
OPMERKING: Oothecae worden vaak binnen 24 uur na de overdracht van het vrouwtje gedropt.
3. Reiniging van oothecae
- Voeg oothecae toe aan een centrifugebuis van 5 ml met 3 ml natriumdodecylsulfaat (SDS). Vortex voor 10 s. Herhaal dit nogmaals met een centrifugebuis met verse SDS.
OPMERKING: Er mogen maximaal vijf oothecae per 3 ml SDS worden gebruikt. - Schrob met een delicate taakdoek het oppervlak van elke ootheca voorzichtig om vuil te verwijderen. Er kunnen meer SDS worden toegevoegd om te helpen bij een grondige reiniging. Plaats gereinigde oothecae in een weegboot tot het klaar is voor sterilisatie.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken, maar als u de oothecae langere tijd (dagen tot weken) in omgevingen met een lage luchtvochtigheid laat, zullen ze uitdrogen en hun levensvatbaarheid verliezen.
4. Sterilisatie en incubatie van oothecae
- Aliquot steriel water voor na sterilisatie spoelen. Vul voor elke ootheca die gesteriliseerd moet worden twee centrifugebuizen van 1,5 ml met 1 ml steriel water.
- Voeg 10 μL geconcentreerd toe (32%) perazijnzuurvoorraadoplossing tot 3,2 ml ddH2O in een centrifugebuis van 5 ml om een 0,1% oplossing voor sterilisatie te creëren. Dop en keer meerdere keren om om te mengen.
LET OP: Perazijnzuur is schadelijk bij contact met huid of longen. Verdun in een zuurkast.
OPMERKING: Dit moet op dezelfde dag gebeuren als sterilisatie. Indien van tevoren verdund, zal de oplossing snel ontbinden en daarom niet goed steriliseren. Maar liefst vijf gereinigde oothecae kunnen worden gesteriliseerd in 3,2 ml verdund zuur. - Plaats (tot vijf) gereinigde oothecae gedurende 5 minuten in de 0,1% perazijnzuuroplossing. Keer de buis meerdere keren om de 60 s.
- Gebruik in een laminaire stromingskap steriele tang om elke ootheca over te brengen naar zijn eigen centrifugebuis met aliquoted steriel spoelwater (stap 4.1). Keer meerdere keren om om te mengen. Herhaal dit gedurende een seconde spoelen en breng vervolgens elke gespoelde ootheca over naar zijn eigen BHI-schuine kant met behulp van steriele tang.
- Plaats schuine schuine iën in de gesteriliseerde secundaire container. Verplaats de container gedurende 4−5 weken in de bevochtigde incubator bij 30 °C totdat deze is uitgebroed.
OPMERKING: Schuine schuine buigingen kunnen rechtop worden gehouden door een klein reageerbuisrek of een middelgroot/klein bekerglas. - Controleer regelmatig schuine schuine streken (1−2x per week). Als schimmel- of bacteriekoloniegroei op de agar verschijnt, verwijder dan de verontreinigde schuinte. Wanneer het tijdspunt van vier weken nadert, controleert u elke dag schuine schuine punten.
OPMERKING: Eenmaal uitgebroed, kunnen nimfen tot enkele weken overleven op BHI alleen, maar zullen ze niet optimaal groeien.
5. Onderhoud van gnotobiotische nimfen
- Breng in een laminaire stroomkap aseptisch een pellet gesteriliseerde rattenvoer over in een bereide BHI-kolf (vanaf stap 1.3.3) met steriele tang. Plaats de kolf als steriliteitscontrole gedurende 24 uur in de secundaire container in een incubator van 30 °C en gebruik deze niet als er groei verschijnt.
- Voeg nimfen toe aan de BHI-kolf met steriele voedselkorrel. Schud ze uit hun BHI-schuine kant en laat ze in een laminaire stromingskap in de kolf vallen.
OPMERKING: De nimfen hebben geen tractie op de glazen wanden van de reageerbuis. Het schudden van de buis om ze van de helling af te slaan en vervolgens de buis kantelen om ze in staat te stellen het glas in de kolf te laten glijden, is effectief. Hoewel nimfen kunnen worden overgedragen met behulp van een tang, is het risico op dodelijk letsel hoog. - Waternimfen met 300 μL steriel water eenmaal per week in een laminaire stromingskap door rechtstreeks op de BHI-vloer van de kolf te gieten.
- Als nimfuitwerpselen de BHI-vloer beginnen te bedekken, breng je over naar een nieuwe BHI-kolf en voeg je de gesteriliseerde rattensoep 24 uur van tevoren toe (om de steriliteit te verifiëren) zoals in stap 5.1.
6. Kwaliteitscontrole van steriliteit
- Verwijder één nimf uit de BHI-kolf om op te offeren voor een cultuuronafhankelijke kwaliteitscontrole van de gnotobiotische status via restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP). Om dit te doen, giet de nimf in een steriele centrifugebuis (vergelijkbaar met nimfoverdracht vanaf stap 5.1) of plaats een steriele houten applicator in de kolf en wacht tot een nimf ermee begint te klimmen en breng deze vervolgens over naar de centrifugebuis.
- Voeg 0,5 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de nimf in de centrifugebuis en homogeniseer met een steriele micropestle totdat alle grote stukken zijn afgebroken. Vortex goed.
- Extract DNA van nimf homogenaat met behulp van een bacteriële DNA extractie kit (Table of Materials) als volgt.
- Centrifugeer de gehomogeniseerde nimf gedurende 10 minuten op 5.000 x g en verwijder het supernatant. Verwarm een thermische shaker voor op 37 °C.
- Voeg 100 μL 1x Tris-EDTA toe en vortex om de pellet volledig te resuspenderen. Voeg 10 μL lysozym toe en meng, gevolgd door een incubatie van 30 minuten (niet schudden) in de voorverwarmde thermische shaker van 37 °C.
- Voeg 25 mg glasparels toe aan monsters en vortex op maximale snelheid gedurende 5 minuten. Verwarm de thermische shaker voor op 55 °C.
- Laat de kralen bezinken voordat u het supernatant overbrengt naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml met 100 μL proteïnase K-buffer en 20 μL proteïnase K. Vortex om grondig te mengen.
- Incubeer, met schudden bij 600 tpm, in een thermische shaker van 55 °C gedurende 60 minuten. Centrifugeer gedurende 2 minuten op 10.000 x g en breng supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml. Verwarm de thermische shaker voor op 65 °C. Begin met het voorverwarmen van de elutiebuffer in een hybridisatieoven van 65 °C.
- Voeg 220 μL 100% ethanol toe. Vortex op maximale snelheid gedurende 20 s. Breek elk zichtbaar neerslag door 10x op en neer te pipetten.
- Plaats een DNA-kolom in een verzamelbuis van 2 ml en breng het monster over in de kolom, inclusief eventueel gevormd neerslag. Centrifugeer gedurende 1 min op 10.000 x g, gooi filtraat uit de opvangbuis en vervang de opvangbuis.
- Voeg 500 μL bindingsbuffer toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 1 min op 10.000 x g. Gooi filtraat uit de opvangbuis en vervang de opvangbuis.
- Voeg 700 μL DNA-wasbuffer toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 1 min op 10.000 x g. Gooi filtraat uit de opvangbuis en vervang de opvangbuis. Herhaal dit voor een tweede wasstap.
- Centrifugeer de lege kolom gedurende 2 minuten om deze te drogen en breng de kolom daarna over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 50 μL voorverwarmde elutiebuffer rechtstreeks toe aan de DNA-kolommatrix en incubeer gedurende 5 minuten bij 65 °C.
- Centrifugeer op 10.000 x g gedurende 1 min tot elute. Kwantificeer het geëxtraheerde DNA in het filtraat via spectrofotometrie of fluorometrie.
- Versterken en verteren hele 16S gen. Visualiseer fragmenten met behulp van gelelektroforese.
- Gebruik 12,5 μL 2x mastermix, 0,5 μL van elke primer 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) en 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 5 ng DNA en moleculair water voor een totaal reactievolume van 25 μL.
- Voer het volgende thermocyclerprogramma uit: 94 °C gedurende 60 s; gevolgd door 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 50 °C gedurende 45 s, 68 °C gedurende 90 s; gevolgd door 68 °C gedurende 5 min.
- Zuiver het polymerasekettingreactieproduct (PCR) met behulp van een DNA-zuiveringskit(Tabel met materialen).
- Voeg 120 μL zuiverende buffer toe aan het PCR-product en de vortex om te mengen. Centrifugeer kort om druppels in het deksel te verzamelen. Steek een DNA-kolom in een opvangbuis van 2 ml, breng vloeistof over naar de voorbereide kolom en centrifugeer gedurende 1 min ≥13.000 x g.
- Gooi het filtraat weg en vervang de opvangbuis. Voeg 700 μL DNA-wasbuffer toe en centrifugeer gedurende 1 min ≥13.000 x g. Gooi het filtraat weg en vervang de opvangbuis. Herhaal dit voor een tweede wasstap.
- Centrifugeer de lege kolom gedurende 2 minuten om te drogen en breng de kolom over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 50 μL voorverwarmde elutiebuffer rechtstreeks toe aan de DNA-kolommatrix en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
- Centrifugeer op 10.000 x g gedurende 1 min tot elute. Kwantificeer het geëxtraheerde DNA in filtraat via spectrofotometrie of fluorometrie.
- Voeg 1 μg gezuiverd PCR-product toe aan 5 μL digestiebuffer, 10 eenheden RsaI en moleculair water voor een totaal reactievolume van 50 μL. Meng door op en neer te pipetten en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C.
- Scheid het verteerde product via gel-elektroforese door 20 μL verteerd DNA op een 2% agarosegel te laten lopen. Visualiseer de gel om de gnotobiotische status te bevestigen.
OPMERKING: Gnotobiotische insecten mogen alleen resulteren in banden bij 402 bp, 201 bp en een uitstrijkje van 163 tot 148 bp, gebaseerd op de 16S rDNA-sequentie van het endosymbiont, Blattabacterium. Eventuele extra banden in de gel zijn indicatief voor het besmetten van microbiële soorten.
7. Aseptische tracking van nimfgroei
- Noteer de lichaamslengte om de nimfgroei te volgen door de insecten te meten door de doorschijnende BHI-vloer van de kolf.
OPMERKING: Nimfen kunnen gedurende 15 minuten op 4 °C worden geplaatst om hun beweging te vertragen, waardoor ze gemakkelijker te meten zijn.
Representative Results
Voorraadtanks zijn opgesteld zoals afgebeeld in figuur 1. "Zwangere" vrouwtjes worden geïdentificeerd aan de hand van de ootheca die aan de achterste buik is bevestigd, zoals afgebeeld in figuur 2. Incubatie van oothecae op BHI-agar maakt gnotobiotische kwaliteitscontrole op een niet-destructieve manier mogelijk. In sommige gevallen is sterilisatie niet succesvol en verschijnt de groei rond de oothecae zoals in figuur 3B. Deze oothecae moet worden verwijderd en weggegooid. In onze handen werd een gemiddeld uitvalpercentage van 10% waargenomen voor sterilisatie (n = 51). De oothecae komt gemiddeld 34 dagen na sterilisatie uit zonder groei op het medium, zoals te zien is in figuur 3A. We hebben typische broedsnelheden van 41% (n = 46) waargenomen voor gesteriliseerde, niet-verontreinigde oothecae, met een gemiddelde van 11 nimfen per ootheca. Grotere nimfen worden overgebracht naar BHI-kolven bedekt met folie, zoals in figuur 4. De folie voorkomt besmetting en de nimfen hebben ruimte om te groeien. RFLP van de 16S rDNA van een gehomogeniseerde nimf wordt gebruikt om de gnotobiotische status te bevestigen. Er is waargenomen dat gnotobiotische nimfen langzamer groeien dan hun niet-steriele tegenhangers, zoals weergegeven in figuur 5. Figuur 6 toont resultaten van met succes gnotobiotische insecten en standaard (niet-steriele) nimfen.
Hoewel deze test nog geen besmetting heeft vastgesteld bij afwezigheid van een positief kweekresultaat, is deze stap routinematig uitgevoerd tijdens kritische experimenten om de aanwezigheid van besmette zuurstofgevoelige of kieskeurige microben uit te sluiten. Langzamere groei is waargenomen bij de gnotobiotische kakkerlakken in vergelijking met standaard / niet-steriele insecten.
Figuur 1: Kakkerlak stamcultuur opstelling.
Kartonnen buizen zijn te zien gestapeld in het uiteinde van de tank. Voedsel en water bevinden zich beide aan de voorkant van de tank. Katoenen doekhoes en elastische band zijn verwijderd voor zichtbaarheid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Een "zwangere" Amerikaanse kakkerlak.
De pijl geeft de ootheca aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Afbeeldingen van met succes gnotobiotische nimfen uitgebroed en tevergeefs gesteriliseerd oothecae op BHI-schuine schuine tjes.
Oothecae werden gesteriliseerd en geïncubeerd zoals beschreven in dit protocol. (A) Het gebrek aan microbiële groei op de BHI-helling geeft aan dat de insecten vrij zijn van cultureerbare organismen. (B) Oothecae op schuine schuine stoten die leiden tot kolonievorming moet als besmet worden weggegooid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Gnotobiotisch opfokapparaat.
Insecten worden bewaard in steriele kolven bedekt met een foliedeksel om besmetting te voorkomen. De secundaire container (groen deksel) wordt gesteriliseerd met 2% bleekmiddel gevolgd door 70% ethanol. De luchtstroom is niet beperkt in de secundaire container. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Representatieve groeisnelheidsgegevens die lichaamslengtes van gnotobiotische en niet-steriele nimfen vergelijken. Beide groepen insecten kregen een autoclaaf knaagdierdieet. Gnotobiotische insecten (hier: n = 105) worden op BHI gehouden zoals beschreven. Niet-steriele insecten (hier: n = 50) leven in kolven met autoclaaf houtsnipperbedden met kleine schotels voor water. Niet-steriele nimfen groeien gemiddeld 0,059 mm/dag, terwijl gnotobiotische nimfen groeien met 0,028 mm/dag (p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Een representatief gelbeeld van RFLP-resultaten voor kwaliteitscontrole.
Whole-16S gen amplicons werden verteerd met RsaI. DNA voor PCR werd geëxtraheerd uit nimfen gehomogeniseerd in 1x PBS. "G nimf" banen komen overeen met gnotobiotische nimfen, terwijl "conv nimf" banen overeenkomen met conventionele, niet-steriele tegenhangers. Op basis van de virtuele restrictievertering zal het endosymbiont (Blattabacterium) naar verwachting banden hebben in de maten 402 bp, 206 bp en 163 bp, met een uitstrijkje van banden tussen 163 bp en 148 bp. Een gnotobiotisch insect zou alleen het Blattabacterium banderolleerpatroon moeten vertonen. Een gemengde bacteriële gemeenschap zal naar verwachting een uitstrijkje hebben van banden met verschillende groottes, hier gelabeld "andere bacteriële 16S-fragmenten". Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Andere methoden die de generatie van gnotobiotische kakkerlakken beschrijven , beschreven ofwel de verzameling van oothecae niet of gebruikten benchmarks die specifiek waren voor andere kakkerlaksoorten om aan te geven wanneer de oothecae bij moeder23,25,26kon worden verwijderd . Oorspronkelijk werden oothecae verzameld uit het houtsnipperbedden in de voorraadtanks, wat resulteerde in zeer lage broedsnelheden (~ 10%) vergeleken met niet-gesteriliseerde oothecae (47%)29. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat onbeschadigde oothecae zich in de loop van de tijd ophopen in de voorraadkooi en er geen manier is om de leeftijd of levensvatbaarheid van ootheca te verifiëren. De toepassing van de "kraamafdeling"-aanpak maakt het mogelijk om vers gedeponeerde oothecae van bekende leeftijd te verzamelen. Dit vergemakkelijkt verder experimentele planning, omdat de onderzoeker kan anticiperen op waarschijnlijke broedtijden voor individuele oothecae. Een andere wijziging ten opzichte van de oorspronkelijke en gepubliceerde protocollen omvat de incubatie van oothecae en nimfen in half verzegelde kamers die ook een oververzadigde natriumchlorideoplossing bevatten. De aanwezigheid van de oplossing handhaaft een relatieve vochtigheid van ongeveer 75%30. Oothecae worden routinematig geïncubeerd bij 30 °C, waarvan is aangetoond dat het het aantal dagen dat nodig is voor incubatie minimaliseert en tegelijkertijd de levensvatbaarheid van de embryo's en het aantal nimfen dat per oothecawordt geproduceerd,maximaliseert. Na het uitkomen worden gnotobiotische nimfen routinematig gekweekt op de tafeltop bij laboratoriumkamertemperatuur en omgevingsomstandigheden, hoewel vochtigheidsgestuurde kamers opnieuw worden gebruikt voor kritische experimenten. Na het vaststellen van deze veranderingen in ootheca-verzameling en incubatie stegen de broedsnelheden tot ongeveer 41% (n = 51), exclusief oothecae verwijderd als gevolg van verontreiniging. Een mogelijke route naar verdere optimalisatie van de broedsnelheden kan het verlengen van de tijd tussen ootheca-verzameling en sterilisatie omvatten. De cuticula van de eicel mag bij de eerste afgifte niet volledig gelooid zijn32, en kan daarom binnen 24 uur na het vallen van de sterilisatie doorlatend zijn voor oplossingen die tijdens sterilisatie worden gebruikt.
Het sterilisatieprotocol met 0,1% perazijnzuur werd aangepast van Doll et al.25. Andere studies hebben alternatieve technieken voor het steriliseren van oothecae23,26 gedocumenteerd. Besmettingspercentages zijn gebaseerd op de niet-destructieve methode om de oothecae op een BHI-helling te incuberen. Deze aanpak is zeer voordelig omdat het een snelle identificatie en verwijdering van verontreinigd oothecae mogelijk maakt. De meeste eerdere protocollen testen op cultureerbare organismen door uitwerpselen of nimfhomogenaat op bacteriologische media te plateren en te controleren op groei22,23,25,27,28,33. In ten minste één geval werd de methode voor het testen van de gnotobiotische status niet volledig beschreven26. Behalve Clayton die een kleine plaat van steriliteit testend medium toevoegde aan het fokken van flessen24, vorige methoden22,23 huisvestte gnotobiotische insecten op bacteriologische media slechts voor korte perioden om het sterilisatieprotocol in eerste instantie te evalueren.
Voortzetting van de huisvesting van de resulterende nimfen op BHI-medium als een ingebouwde kwaliteitscontrolemaatregel maakt het mogelijk hun gnotobiotische status in semi-real-time te controleren - een techniek die in de meeste eerdere methoden niet werd gezien22,23. Dit is vooral handig voor langetermijnexperimenten waarvoor gnotobiotische nimfen moeten worden geopend. Als de BHI-vloer onder nimfen besmet lijkt met bacteriële of schimmelgroei, moet de kolf worden weggegooid. Dit type besmetting treedt meestal op bij het blootleggen van de kolven aan waternimfen, maar het kan ook ontstaan uit de uitwerpselen in het geval van onvoldoende gesteriliseerde oothecae of voedsel. Het gebruik van een laminaire stromingskap bij het water geven verbetert de verontreinigingssnelheid die wordt veroorzaakt door het blootleggen van kolven.
Aangezien niet alle besmetteorganismen aeroob kunnen groeien op BHI-medium, is een extra kweekonafhankelijke methode voor steriliteitstests vereist. Een mogelijke aanpak is microscopie27,maar deze aanpak kan arbeidsintensief zijn. Andere protocollen maken gebruik van op sequenties gebaseerde technieken om organismen te detecteren die aan kweek14,23,27,28kunnen ontsnappen . Dergelijke benaderingen zijn echter vaak duur en moeilijk te interpreteren, omdat de resultaten van sequencingbenaderingen met hoge doorvoer gemakkelijk kunnen worden beïnvloed door verontreiniging op laag niveau van reagentia34 en barcodehoppen35. In plaats daarvan is een nieuwe aanpak ontwikkeld die pcr-versterking van het 16S rRNA-gen gebruikt in combinatie met restrictiefragmentlengtepolymorfisme om zowel het endosymbiont als eventuele vervuilende darmsymbioten te visualiseren. Deze techniek omvat een interne PCR-controle, aangezien het 16S-gen van Blattabacteriumis gesequenced en het banderolleerpatroon aanwezig moet zijn bij zowel gnotobiotische als niet-sterile insecten. Aangezien het restrictiepatroon van de endosymbiont kan worden voorspeld aan de den36van het genoom, is het niet nodig om de amplicons of de beperkingsfragmenten te sequencen, tenzij identificatie van een verontreiniging gewenst is. De huidige versie van dit protocol vraagt om een nimf op te offeren voor PCR/RFLP, maar deze techniek kan ook op uitwerpselen worden gebruikt als een niet-destructieve maatregel. Het zal echter geen ingebouwde controle bevatten, omdat de uitwerpselen niet veel Blattabacteriummogen bevatten .
Een extra gemakkelijk te wijzigen maar kritische component van het fokken van gnotobiotische dieren is dieet. Hoewel BHI-agar kan dienen als een tijdelijke voedselbron voor de insecten, is gebleken dat het resulteert in aanzienlijke groeitekorten bij nimfen wanneer het voor langere tijd als enige voedselbron wordt gebruikt. Hoewel verschillende diëten zijn geprobeerd, wordt autoclaveerbare rattenvoer aanbevolen als een routinedieet voor het onderhoud van gnotobiotische insecten. Diëten die niet specifiek waren geformuleerd voor sterilisatie waren vaak moeilijk volledig steriel te maken, en veel steriele of autoclaveerbare proefdierdiëten bleken een snelle schimmelgroei te vertonen onder niet-steriele omstandigheden. Deze neiging om af te nemen onder niet-steriele omstandigheden maakte ze ongeschikt voor gebruik in experimenten die gnotobiotische en niet-gnotobiotische insecten direct vergeleken. Het aanbevolen dieet maakt het gebruik van een consistent dieet tussen gnotobiotische en standaardnimfen mogelijk, waardoor de vergelijking van kenmerken - zoals groeisnelheden - tussen de twee groepen wordt vergemakkelijkt.
Zoals anderen27hebben waargenomen, groeien de gnotobiotische nimfen langzamer dan hun niet-steriele tegenhangers. Een vergelijking tussen lichaamslengtes van gnotobiotische (n = 105) en niet-steriele nimfen (n = 50) gevoed hetzelfde, autoclaaf knaagdierdieet en bij kamertemperatuur gehouden, toont aan dat niet-steriele nimfen gemiddeld 0,059 mm/dag groeien, terwijl gnotobiotische nimfen 0,028 mm/dag groeien (p < 0,0001) (figuur 5). De aanwezigheid van darmmicrobiota in P. americana is aangetoond dat het de stofwisseling van de insectenverandert 37, en darmgemeenschappen in het algemeen worden verondersteld de opname van voedingsstoffen te beïnvloeden38,39. Deze redenen ondersteunen de waargenomen verschillen in groeisnelheid van gnotobiotische en niet-sterile nimfen.
Een mogelijke beperking van deze techniek is dat gnotobiotische nimfen mogelijk geen geslachtsrijpheid bereiken, omdat de oudste steriele cohorten meer dan 10 maanden oud zijn en alleen de zevende instar (van de 10; 11 volwassenheid) hebben bereikt, zoals benaderd door lichaamslengte40. Deze oudste cohorten volgen niet het autoclaafrattendieet, maar eten in plaats daarvan bestraalde rattenvoer, een dieet dat te veel vocht bevat om te voeden met niet-steriele cohorten zonder overmatige schimmelgroei. Niet-steriele nimfen op een niet-gesteriliseerd hondenvoerdieet bleken na 9−10 maanden volwassen te worden onder laboratoriumomstandigheden (kamertemperatuur en vochtigheid). Cohorten van gnotobiotische en niet-steriele nimfen op de gedeelde, autoclaved rat chow zijn momenteel minder dan 7 maanden oud, niet-steriele insecten worden geschat op zevende instar (gemiddeld: 16,7 mm) terwijl steriele insecten worden geschat op vijfde instar (gemiddelde: 11,2 mm). Als gevolg hiervan kunnen we tot nu toe niet controleren of onze gnotobiotische kakkerlakken zich met succes kunnen voortplanten. Gezien het gemak waarmee nieuwe gnotobiotische cohorten met behulp van deze aanpak kunnen worden vastgesteld, toont deze methode echter grote belofte, zelfs bij afwezigheid van bewezen reproductie van gnotobiotische insecten.
Concluderend, dit protocol biedt een veelzijdig hulpmiddel waarmee microbioom onderzoekers hun eigen, goedkope gnotobiotische "faciliteit" kunnen bedienen met behulp van gemeenschappelijke laboratoriummaterialen. Deze aanpak kan worden gebruikt om gnotobiotische kakkerlakken te genereren voor experimenten die de rol van de microbiota onderzoeken bij het vormgeven van gastheergedrag, immuniteit, ontwikkeling en stressreacties21,26,27. Deze gnotobiotische insecten kunnen ook worden ingeënt met synthetische of xenobiotische gemeenschappen en vervolgens worden gebruikt als proefpersonen voor darmmicrobioomstudies23,28. Verder zijn elementen van deze aanpak, waaronder het gebruik van met bacteriologische media omzoomde incubatiekamers als ingebouwde steriliteitscontrole, generaliseerbaar voor andere modelsystemen en kunnen routinematig onderhoud van gnotobiotische dieren in kleinere faciliteiten vergemakkelijken.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om openbaar te maken.
Acknowledgments
Deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer R35GM133789. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële mening van de Nationale Instituten voor Gezondheid. De auteurs willen Josey Dyer erkennen voor het volgen van sterilisatiesnelheden, broedsnelheden en groeisnelheden van de gnotobiotische kakkerlakken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X master mix | New England BioLabs | M0482 | OneTaq MasterMix |
| Autoclavable rat chow | Zeigler | NIH-31 Modified Auto | |
| Bacterial DNA extraction kit | Omega Bio-Tek | D-3350 | E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube |
| binding buffer | Omega Bio-Tek | PD099 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer) |
| brain-heart infusion (BHI) broth | Research Products International | B11000 | |
| Delicate task wipes | KimWipe | JS-KCC-34155-PK | KimWipes |
| DNA purification kit | Omega Bio-Tek | D6492 | E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution) |
| elution buffer | Omega Bio-Tek | PDR048 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| glass beads | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| Hybridization oven | UVP | 95-0330-01 | we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used |
| Laminar flow biological safety cabinet | NuAire, Inc. | NU-425-400 | Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity |
| lysozyme | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| peracetic acid stock solution (32%) | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Petroleum jelly | Vaseline | n/a | |
| proteinase K buffer | Omega Bio-Tek | PD061 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer") |
| purifying buffer | Omega Bio-Tek | PDR042 | included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer) |
| RsaI | New England BioLabs | R0167 | Includes CutSmart (digestion) buffer |
| Secondary container | n/a | n/a | a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes |
| spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | Catalog info is for NanoDrop2000 |
| thermal shaker | Eppendorf | EP5386000028 | Thermomixer R |
| Tris-EDTA | Fisher | BP1338-1 | 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
| wash buffer | Omega Bio-Tek | PDR044 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer) |
| Woodchip bedding | P.J. Murphy Forest Products | Sani-Chips |
References
- Yi, P., Li, L. The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).
- Nature Biotechnology. Laying better plans for mice. Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).
- Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents. ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).
- Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Eun, C. S., et al. Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice. Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).
- Cherbuy, C., et al. Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).
- Van Den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats. Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).
- Stecher, B., Berry, D., Loy, A. Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle. FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).
- Sugahara, H., et al. Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community. Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).
- Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).
- Mallapaty, S. Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom. Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
- Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host–Microbiota Interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).
- Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).
- Engel, P., Moran, N. A. The gut microbiota of insects - diversity in structure and function. FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).
- Tinker, K. A., Ottesen, E. A. The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts. Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).
- Zurek, L., Keddie, B. A. Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L. Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).
- Cruden, D. L., Markovetz, A. J. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).
- Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest. PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).
- Benschoter, C., Wrenn, R. Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches. Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Clayton, R. A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions. Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies. American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).
- Wada-Katsumata, A., et al. Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach. Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).
- Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate. PeerJ. 7, 6914 (2019).
- Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches. Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).
- Katoh, K., et al. Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches. Zoological Letters. 3, 3 (2017).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).
- Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids. Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).
- Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , Taylor & Francis. Philadelphia, PA. (2008).
- House, H. L. Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique. The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).
- Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses. Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).
- Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).
- Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).
- Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Muñoz-Garcia, A. The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana. PeerJ. 6, 4717 (2018).
- Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation. Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).
- Rowland, I., et al. Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components. European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).
- Gier, H. T. Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn). Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).
