Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Etablering og vedligeholdelse af gnotobiotiske amerikanske kakerlakker (Periplaneta americana)

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61316
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology, University of Georgia

Summary

Denne protokol anvendes til at etablere og vedligeholde gnotobiotiske amerikanske kakerlakker (Periplaneta americana) ved overfladesterilisering af ægkasserne (oothecae) før udklækning. Disse gnotobiotiske insekter indeholder deres lodret overførte Blattabacterium endosymbionts, men har økse indvolde.

Abstract

Gnotobiotiske dyr er et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af kontroller af mikrobiomstruktur og -funktion. Præsenteret her er en protokol til etablering og vedligeholdelse af gnotobiotiske amerikanske kakerlakker (Periplaneta americana). Denne tilgang omfatter indbygget sterilitet kontrol for løbende kvalitetskontrol. Gnotobiotiske insekter defineres her som kakerlakker, der stadig indeholder deres lodret overførte endosymbiont (Blattabacterium), men mangler andre mikrober, der normalt bor på deres overflade og i deres fordøjelseskanal. Til denne protokol fjernes ægkasser (oothecae) fra en (nonsterile) stamkoloni og overfladesteriliseret. Når oothecae er indsamlet og steriliseret, inkuberes den ved 30 °C i ca. 4−6 uger på hjernehjerteinfusion (BHI) agar, indtil de klækkes eller fjernes på grund af forurening. Udklækkede nymfer overføres til en Erlenmeyer kolbe, der indeholder et BHI-gulv, sterilt vand og steril rottemad. For at sikre, at nymferne ikke er boliger mikrober, der ikke er i stand til at vokse på BHI i de givne betingelser, en ekstra kvalitetskontrol foranstaltning bruger begrænsning fragment-længde polymorfi (RFLP) til at teste for nonendosymbiotic mikrober. Gnotobiotiske nymfer genereret ved hjælp af denne tilgang kan podes med enkle eller komplekse mikrobielle samfund og bruges som et værktøj i tarmmikrobiomestudier.

Introduction

Gnotobiotiske dyr har vist sig at være uvurderlige værktøjer til mikrobiomundersøgelser1,2,3. Kimfrie og definerede floradyr har gjort det muligt at belyse værtsmikrobeinteraktioner, herunder værtsimmunologiske reaktioner, tarmepitelemodning og værtsmetabolisme1,4,5,6,7. Gnotobiotiske dyr podet med en forenklet samfund har også bistået i en mere komplet forståelse af mikrobe-mikrobe interaktioner i en tarm samfund, specielt i optrevling cross-fodring og antagonistiske relationer8,9,10,11. Det nuværende foretrukne modelsystem til undersøgelser af pattedyrs tarmmikrobiomet er murinmodellen. Selv om dette system har været afgørende i de opdagelser, der er skitseret ovenfor, er en vigtig mangel omkostningerne. Specialiseret udstyr og højtuddannede teknikere er nødvendige for at etablere og vedligeholde et gnotobiotisk anlæg. Dette, i kombination med ekstra omhu, der skal gives til alle aspekter af gnotobiotisk dyrevedligeholdelse, får et gnotobiotisk dyr til at koste ti til tyve gange mere at opdrætte end en standarddyrmodel12. På grund af høje omkostninger, mange forskere kan være i stand til at give en gnotobiotisk murine model. Derudover, mens murinmodeller kan være det mest accepterede valg til undersøgelser, der ønsker at oversætte til menneskers sundhed, er der stadig mange fysiologiske og morfologiske forskelle mellem menneske- og museinde13. Det er klart ingen enestående model er nok til at besvare det stadigt stigende antal spørgsmål om de mange aspekter af tarmen mikrobiom.

Insektmodeller er et billigere alternativ på grund af deres lavere vedligeholdelsesomkostninger sammenlignet med pattedyrarter. Omfattende kimfri og gnotobiotisk forskning i en række insektarter har ført til udvikling af flere almindeligt anvendte modeller. Myg og Drosophila er almindelige modeller for kimfrit arbejde på grund af deres relevans for globale sygdomme og genetisk trækkraft14,15. Et andet spirende modelsystem er honningbien (Apis mellifera) i betragtning af dens betydning for bestøvning og socialitetsforskning16. Men mange af disse almindeligt anvendte insekter mangler den taksonomiske kompleksitet ses i pattedyr tarm samfund17, begrænse deres evne til at modellere højere orden interaktioner. Ikke alene er den samlede mangfoldighed af mikrober, der findes i tarmen af amerikanske kakerlakker, mere ligner pattedyr, men mange af de mikrober, der er til stede i kakerlak tarmen, tilhører familier og phyla, der almindeligvis findes i tarmmikrobiotaen hos pattedyr og mennesker18. Bagguden af kakerlakken er også funktionelt analog med tyktarmen af pattedyr, da det er et fermenteringskammer tæt pakket med bakterier for at hjælpe med udvinding af næringsstoffer19,20. Endelig giver kakerlakkernes altomfattende natur mulighed for en mangfoldighed af kostregimer, der ikke ville være mulige med diætspecialister.

Amerikanske kakerlakker kan være et nyttigt modelsystem til forståelse af tarmmikrobibielle samfund i højere organismer, men kakerlakkens status som skadedyr gør også dette system relevant for skadedyrsbekæmpelse21. Udnyttelse af grundlæggende viden om tarmsamfundets indflydelse på kakerlaksundhed og fysiologi hjælper med at udvikle nye teknikker til skadedyrsbekæmpelse.

Målet med denne metode er at skitsere en omfattende beskrivelse af etablering og vedligeholdelse af gnotobiotiske amerikanske kakerlakker (Periplaneta americana), men denne protokol kan bruges til at generere nymfer af enhver oviparous kakerlak. Det omfatter en metode til effektiv, ikke-invasiv samling af modne oothecae, og en ikke-destruktiv teknik til at overvåge gnotobiotiske tilstand afinsekterne 22,23,24. Mens tidligere metoder til at opnå og vedligeholde gnotobiotiske kakerlakker beskriver ootheca-samling23,24,25,26,27, fortolkes ootheca-modenhed enten i artsspecifikke signaler (i Blattella germanica22,24,25) eller ikke udtrykkeligt beskrevet27,28, hvilket gør implementering vanskelig for dem, der ikke er bekendt med systemet. Da den her beskrevne metode bruger naturligt tabt oothecae, er fejlen ved at fjerne æg for tidligt fraværende. Denne protokol indeholder både kulturafhængige og kultur-uafhængige metoder til kvalitetskontrol, og den kulturafhængige metode kræver ikke at ofre insekter. Endelig samler denne metode oplysninger fra flere gnotobiotiske kakerlakundersøgelser for at skabe en, omfattende protokol med alle nødvendige oplysninger til at opnå og opretholde gnotobiotiske kakerlakker.

Protocol

1. Fremstilling af materialer

  1. Vedligeholdelse af lagerkakerlakkulturer
    BEMÆRK: Der er mange måder at opdrætte disse robuste insekter på. Detaljerne om at give husly og vand kan være forskellige afhængigt af tilgængelige materialer (dvs. ægkartoner i stedet for paprør). Følgende steriliseringsprotokol fungerer for enhver lagertankopsætning.
    1. Spred nok træflis strøelse i en 37,85 L (10 gallon) akvarium til at dække bunden af tanken med ca 1 tomme af strøelse. Forbered huset ved at skære (fladt) pap til 2 i x 4 i stykker. Sæt papstykker i paprør (f.eks. toiletpapirrør) og stakrør i den ene ende af tanken(figur 1).
    2. Smør et tyndt lag vaseline på de øverste to inches af indersiden af tanken for at forhindre insekt undslippe.
      BEMÆRK: Sørg for at belægge indersiden af tankens hjørner korrekt.
    3. Tilsæt kakerlakker ved at overføre (besatte) paprør fra en tidligere lagertank og ryste dem for at frigive deres indbyggere. For hver overførsel skal du flytte 100-200 blandede, blandede sex kakerlakker. Tilsæt hundemad (20-30 stykker), overvåg mængden af hundemad i tanken og genopfyld, når den er lav.
    4. Sæt en vandret op.
      1. Fyld en lille plast genanvendelig fødevarebeholder med dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Skær cellulose svampe og huller i låget af fødevarebeholderen til omtrent samme størrelse.
        BEMÆRK: Cellulosesvampene forhindrer kakerlakker i at drukne i vandretten.
    5. Sæt svampe i huller i låget og læg låget på den fyldte beholder. Placer beholderen i tanken og påfyld den, når den er lav. Dæk tanken med bomuldsklud og fastgør den på plads med et elastikbånd.
    6. Da tanke begynder at akkumulere store mængder frass og insektkroppe, skal du oprette nye tanke og overføre kakerlakker.
      BEMÆRK: Tanke overføres typisk hver 6. måned. Eventuelle resterende kakerlakker/æg i nedlagte lagertanke aflives ved frysning ved -20 °C i 1 time, og indholdet af lagertanken overføres derefter til en autoklavepose og autoklaveret (1 h, tyngdekraftscyklus) inden bortskaffelsen. Lagertanke steriliseres med 2% blegemiddel mellem anvendelser.
  2. Desinficere en sekundær beholder.
    BEMÆRK: Denne beholder indeholder ikke et filter, men tillader i stedet fri luftudveksling.
    1. Spray indersiden af både låget og bunden med 2% blegemiddel og lad dem suge i 10 minutter. Tør blegemidlet ud med et rent køkkenrulle.
    2. Spray indersiden af låget og bunden med 70% ethanol og tør tør med et rent køkkenrulle. Udskift låget, indtil det bruges.
  3. Lav BHI skråninger og kolber til inkubation af æg og boliger nymfer.
    1. Forbered BHI i henhold til pakkeinstruktioner, tilsæt 2% agar. Kog BHI-agar opløsningen, indtil den er afklaret.
    2. For skråninger overføres 5 mL aliquots til 18 mm x 150 mm glas reagensglas og hætte. Sterilisere via autoklave (steriliseringstid = 20 min. flydende cyklus). Placer autoklaverede rør i en 45° vinkel for at køle af i skråninger. Når størknet, opbevares i køleskab, indtil brug for at forhindre udtørring.
    3. For kolber overføres 10 ml aliquots kogt BHI-agaropløsning til 250 mL Erlenmeyer kolber for helt at dække bunden af kolben. Kolben dækkes med folie og steriliseres via autoklave (20 min. flydende cyklus). Lad autoklaverede kolber køle af og køle, indtil de bruges, for at forhindre udtørring.
      BEMÆRK: Der kræves ikke luftfilter til denne opsætning. Foliedækslet er tilstrækkeligt til at muliggøre gasudveksling, samtidig med at forureningen forhindres i at flyde i fri luft.
  4. Sterilisere via autoklave: autoclavable rotte chow opdelt i halv-størrelser (~ 1/2 tommer stykker) i en folie-dækket bægerglas (sterilisering tid = 1 h, tyngdekraft cyklus), ddH2O i en udjævnet flaske (sterilisering tid = 20 min, flydende cyklus), og pincet i en folie-dækket bægerglas (sterilisering tid = 20 min, tyngdekraft cyklus).
    BEMÆRK: Rotten må ikke fyldes for meget. Pellets vil svulme op i autoklaven.
  5. Opret en "fødeafdeling" tank.
    BEMÆRK: Denne tank indeholder de samme materialer som lagertankene (paprør, vandretter med svampe, hundemad, træflisstrøelse; se figur 1) og bør være tomme for kakerlakker, medmindre de overføres til oothecae-samling (se afsnit 2).
  6. Befugt en inkubator ved at forberede et bægerglas fyldt med overmættet natriumchlorid (NaCl) opløsning. Forbered denne opløsning ved at tilsætte 37 g NaCl pr. 100 ml ddH2O og omrøre, indtil den er opløst.
    BEMÆRK: Typisk fugter 500 ml mL mÆttet saltopløsning en inkubator med kammerdimensioner 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x W x D) i ca. en måned, før der skal tilsættes mere vand.

2. Indsamling af oothecae

  1. Hundyr overføres (i det antal, der er relevant for planlagte forsøg), og som transporterer oothecae (figur 2) fra lagertanken til "fødeafdelingen" ved hjælp af pincet til at flytte paprør, der indeholder gravide hunner.
    1. Hvis et karboardrør indeholder flere insekter ud over den gravide kvinde, skal du først ryste røret ud i en ekstra plastbeholder, der er ringet med vaseline, og derefter tilskynde målinsektet til at klatre tilbage i paprøret alene.
  2. Overfør hunner tilbage til lagertanken, når de har tabt deres oothecae. Hent oothecae fra kuldet i tanken med pincet.
    BEMÆRK: Oothecae er ofte faldet inden for 24 timer efter den kvindelige overføres.

3. Rengøring af oothecae

  1. Der tilsættes oothecae til et 5 mL centrifugerør, der indeholder 3 mL natrium dodecyl sulfat (SDS). Vortex i 10 s. Gentag for et andet vasketrin med et centrifugerør, der indeholder frisk SDS.
    BEMÆRK: Der kan anvendes op til fem mængder pr. 3 mL SDS.
  2. Brug en delikat opgave tørre, forsigtigt skrubbe overfladen af hver ootheca at fjerne snavs. Der kan tilføjes mere SDS for at hjælpe med grundig rengøring. Placer renset oothecae i en vejebåd, indtil den er klar til sterilisering.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her, men hvis oothecae efterlades i miljøer med lav luftfugtighed i længere tid (dage til uger), vil de blive dehydreret og miste levedygtigheden.

4. Sterilisering og inkubation af oothecae

  1. Aliquot sterilt vand til efter sterilisering skylles. For hver ootheca, der skal steriliseres, fyldes to 1,5 mL centrifugerør med 1 mL sterilt vand.
  2. Der tilsættes 10 μL koncentreret (32 %) peracetsyrebestandopløsning til 3,2 ml ddH2O i et 5 ml centrifugerør for at skabe en 0,1% opløsning til sterilisering. Cap og invertere flere gange for at blande.
    ADVARSEL: Perdikesyre er skadelig i kontakt med hud eller lunger. Fortyndes i en røghætte.
    BEMÆRK: Dette skal gøres samme dag som sterilisering. Hvis den fortyndes på forhånd, nedbrydes opløsningen hurtigt og steriliseres derfor ikke korrekt. Så mange som fem rensede oothecae kan steriliseres i 3,2 mL fortyndet syre.
  3. Der anbringes (op til fem) renset oothecae i 0,1% peracetsyreopløsningen i 5 min. Vend røret flere gange hver 60 s.
  4. I en laminar flow hætte, bruge sterile pincet til at overføre hver ootheca til sin egen centrifuge rør med aliquoted sterilt skyllevand (trin 4.1). Inverter flere gange for at blande. Gentag for en anden skylning, derefter overføre hver skyllet ootheca til sin egen BHI skrå ved hjælp af sterile pincet.
  5. Placer skråninger i den steriliserede sekundære beholder. Beholderen flyttes ind i den befugtede inkubator ved 30 °C i 4-5 uger, indtil den udklækkes.
    BEMÆRK: Skråninger kan holdes oprejst af et lille reagensglasstativ eller et medium/lille bægerglas.
  6. Kontroller skråninger regelmæssigt (1−2x om ugen). Hvis svampe- eller bakteriekolonivækst vises på agaren, skal du fjerne den forurenede skrå. Når tidspunktet på fire uger nærmer sig, skal du kontrollere skråninger hver dag.
    BEMÆRK: Når udklækket, nymfer kan overleve i op til flere uger på BHI alene, men vil ikke vokse optimalt.

5. Vedligeholdelse af gnotobiotiske nymfer

  1. I en laminar flow hætte, aseptisk overføre en pellet af steriliseret rotte chow til en forberedt BHI kolbe (fra trin 1.3.3) med sterile pincet. Som sterilitetskontrol anbringes kolben i den sekundære beholder i en 30 °C inkubator i 24 timer, og kolben må ikke anvendes, hvis der opstår vækst.
  2. Tilsæt nymfer til BHI kolben med steril mad pellet. Ryst dem ud af deres BHI skrå og lad dem falde i kolben i en laminar flow hætte.
    BEMÆRK: Nymferne har ikke trækkraft på reagensglassets glasvægge. Ryste røret til at banke dem ud af skrå og derefter tippe røret, så de kan glide ned glasset ind i kolben er effektiv. Mens nymfer kan overføres ved hjælp af pincet, er risikoen for dødelig skade høj.
  3. Vandnymfer med 300 μL sterilt vand en gang om ugen i en laminar flow hætte ved pipetter direkte på BHI gulvet i kolben.
  4. Som nymfe afføring begynder at dække BHI gulvet, overføre til en ny BHI kolbe, tilføje steriliseret rotte chow 24 timer i forvejen (for at kontrollere sterilitet) som i trin 5.1.

6. Kvalitetskontrol af sterilitet

  1. Fjern en nymfe fra BHI kolben for at ofre for en kultur-uafhængig kvalitetskontrol af gnotobiotisk status via begrænsning fragment-længde polymorfi (RFLP). For at gøre dette skal du hælde nymfen i et sterilt centrifugerør (svarende til nymphal overførsel fra trin 5.1) eller placere en steril træapplikator i kolben og vente på, at en nymfe begynder at klatre det og derefter overføre det til centrifugerøret.
  2. Der tilsættes 0,5 mL 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) til nymfen i centrifugerøret og homogeniseres med en steril mikropestle, indtil alle store stykker er brudt op. Vortex godt.
  3. Ekstrakt DNA fra nymfe homogenat ved hjælp af en bakteriel DNA ekstraktion kit (Tabel over materialer) som følger.
    1. Centrifuge den homogeniserede nymfe i 10 min ved 5.000 x g og fjern supernatanten. Forvarm en termisk shaker til 37 °C.
    2. Tilsæt 100 μL af 1x Tris-EDTA, og vortex til helt at genbruge pellet. Der tilsættes 10 μL lysozym og blandes efterfulgt af en 30 min (ingen rysten) inkubation i den forvarmede 37 °C termiske shaker.
    3. Tilsæt 25 mg glasperler til prøver, og vortex ved maksimal hastighed i 5 min. Forvarm den termiske shaker til 55 °C.
    4. Lad perlerne afregne, før supernatanten overføres til et nyt 1,5 mL centrifugerør med 100 μL proteinase K buffer og 20 μL proteinase K. Vortex blandes grundigt.
    5. Inkuber ved 600 omdrejninger i minuttet i en termisk shaker på 55 °C i 60 min. Centrifuge ved 10.000 x g i 2 min, og overfør supernatant til et nyt 1,5 mL centrifugerør. Forvarm den termiske shaker til 65 °C. Begynd at forvarme elueringsbufferen i en 65 °C hybridiseringsovn.
    6. Der tilsættes 220 μL 100% ethanol. Vortex ved maksimal hastighed i 20 s. Opbryd eventuelle synlige bundfald ved pipetter op og ned 10x.
    7. Indsæt en DNA-kolonne i et 2 mL opsamlingsrør, og overfør prøven til kolonnen, herunder eventuelle udfældningsfald, der måtte være dannet. Centrifuger ved 10.000 x g i 1 min., kassér filtrat fra opsamlingsrøret, og udskift opsamlingsrøret.
    8. Der tilsættes 500 μL bindingsbuffer til kolonnen og centrifuge ved 10.000 x g i 1 min. Kassér filtrat fra opsamlingsrøret, og udskift opsamlingsrøret.
    9. Der tilsættes 700 μL DNA-vaskebuffer til kolonnen og centrifuge ved 10.000 x g i 1 min. Kassér filtrat fra opsamlingsrøret, og udskift opsamlingsrøret. Gentag for et andet vasketrin.
    10. Centrifuge tom kolonne i 2 minutter for at tørre den og overfører kolonnen til et nyt 1,5 mL centrifugerør bagefter. Der tilsættes 50 μL forvarmet udrensningsbuffer direkte til DNA-kolonnematrixen, og der inkuberes ved 65 °C i 5 min.
    11. Centrifuge ved 10.000 x g i 1 min. for at elute. Kvantificere det udvundne DNA i filtratet via spektrofotometri eller fluorometri.
  4. Forstærk og fordøje hele 16S gen. Visualiser fragmenter ved hjælp af gel elektroforese.
    1. Brug 12,5 μL 2x master mix, 0,5 μL af hver primer 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) og 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 5 ng DNA og molekylært vand til et samlet reaktionsvolumen på 25 μL.
    2. Kør følgende termocykelprogram: 94 °C i 60 s; efterfulgt af 35 cyklusser på 94 °C for 30 s, 50 °C for 45 s, 68 °C for 90 s efterfulgt af 68 °C i 5 min.
    3. Purificer polymerasekædereaktionsproduktet (PCR) ved hjælp af et DNA-rensesæt (Tabel over materialer).
      1. Der tilsættes 120 μL rensebuffer til PCR-produktet og vortex for at blande. Kort centrifuge til at indsamle dråber inde i låget. Sæt en DNA-kolonne i et 2 mL opsamlingsrør, overfør væske til den forberedte søjle og centrifuge ved ≥13.000 x g i 1 min.
      2. Kassere filtrat og erstatte indsamling røret. Der tilsættes 700 μL DNA-vaskebuffer og centrifuge ved ≥13.000 x g i 1 min. Kassere filtrat og erstatte indsamling røret. Gentag for et andet vasketrin.
      3. Den tomme kolonne centrifuges i 2 minutter for at tørre og overføre kolonnen til et nyt centrifugerør på 1,5 mL. Der tilsættes 50 μL forvarmet udrensningsbuffer direkte til DNA-kolonnematrixen, og der inkuberes ved stuetemperatur i 2 min.
      4. Centrifuge ved 10.000 x g i 1 min. for at elute. Kvantificere det udvundne DNA i filtrat via spektrofotometri eller fluorometri.
    4. Der tilsættes 1 μg renset PCR-produkt til 5 μL fordøjelsesbuffer, 10 enheder RsaI og molekylært vand for et samlet reaktionsvolumen på 50 μL. Blandes ved pipettering op og ned og inkuberes ved 37 °C i 60 min.
    5. Det fordøjede produkt adskilles via gelelektroforese ved at køre 20 μL fordøjet DNA på en 2% agarosegel. Visualiser gelen for at bekræfte gnotobiotisk status.
      BEMÆRK: Gnotobiotiske insekter bør kun resultere i bånd ved 402 bp, 201 bp og en smøre fra 163 til 148 bp, baseret på 16S rDNA-sekvensen af endosymbiont, Blattabacterium. Eventuelle ekstra bånd, der ses i gelen, er tegn på kontaminering af mikrobielle arter.

7. Aseptisk sporing af nymphal vækst

  1. Registrer kropslængden for at spore nymphalvækst ved at måle insekterne gennem kolbens gennemskinnelige BHI-gulv.
    BEMÆRK: Nymfer kan anbringes ved 4 °C i 15 minutter for at bremse deres bevægelse, hvilket gør dem lettere at måle.

Representative Results

Lagertanke er opstillet som vist i figur 1. "Gravide" hunner identificeres af ootheca fastgjort til den bageste mave, som afbilledet i figur 2. Inkubation af oothecae på BHI agar giver mulighed for gnotobiotisk kvalitetskontrol på en ikke-destruktiv måde. I nogle tilfælde er sterilisering mislykket, og der forekommer vækst omkring oothecae som i figur 3B. Disse oothecae bør fjernes og kasseres. I vores hænder blev der observeret en gennemsnitlig 10% fejlrate for sterilisering (n = 51). Oothecae luge i gennemsnit 34 dage efter sterilisering uden vækst på mediet, som det ses i figur 3A. Vi har observeret typiske lugehastigheder på 41% (n = 46) for steriliseret, ikke-forurenet oothecae, med et gennemsnit på 11 nymfer pr. Ootheca. Større nymfer overføres til BHI-kolber dækket af folie, som i figur 4. Folien forhindrer forurening, og nymferne har plads til at vokse. RFLP af 16S rDNA fra en homogeniseret nymfe bruges til at bekræfte gnotobiotisk status. Gnotobiotiske nymfer er blevet observeret at vokse langsommere end deres ikke-sterile modstykker, som repræsenteret figur 5. Figur 6 viser resultater fra succesfulde gnotobiotiske insekter såvel som standard (nonsterile) nymfer.

Selv om denne test endnu ikke har identificeret kontaminering i mangel af et positivt kulturresultat, er dette trin blevet udført rutinemæssigt under kritiske forsøg for at udelukke tilstedeværelsen af forurenende iltfølsomme eller kræsne mikrober. Langsommere vækst er observeret i de gnotobiotiske kakerlakker sammenlignet med standard / nonsterile insekter.

Figure 1
Figur 1: Opsætning af kakerlaklagerkultur.
Paprør kan ses stablet i den fjerneste ende af tanken. Mad og vand er begge nær forsiden af tanken. Bomuldskludbetræk og elastikbånd er blevet fjernet for synlighed. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: En "gravid" amerikansk kakerlak.
Pilen angiver ootheca. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Billeder af med succes gnotobiotiske nymfer udklækket og uden held steriliseret oothecae på BHI skråninger.
Oothecae blev steriliseret og inkuberet som beskrevet i denne protokol. (A) Manglen på mikrobiel vækst på BHI-skråningen indikerer, at insekterne er fri for kulforurenende organismer. (B) Oothecae på skråninger, der resulterer i kolonidannelse, bør kasseres som kontamineret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Gnotobiotiske opdrætsapparater.
Insekter opbevares i sterile kolber dækket af et folielåg for at forhindre forurening. Den sekundære beholder (grønt låg) steriliseres med 2% blegemiddel efterfulgt af 70% ethanol. Luftstrømmen er ikke begrænset i den sekundære beholder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative vækstratedata, der sammenligner kropslængder af gnotobiotiske og nonsterile nymfer. Begge grupper af insekter blev fodret autoklaveret gnaver kost. Gnotobiotiske insekter (her: n = 105) opbevares på BHI som beskrevet. Nonsterile insekter (her: n = 50) lever i kolber med autoklaveret træflis strøelse med små retter til vand. Nonsterile nymfer vokser en gennemsnitlig hastighed på 0,059 mm/dag, mens gnotobiotiske nymfer vokser med 0,028 mm/dag (p < 0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Et repræsentativt gelbillede af RFLP-resultater til kvalitetskontrol.
Hele 16S gen ampliconer blev fordøjet med RsaI. DNA til PCR blev udvundet af nymfer homogeniseret i 1x PBS. "G nymfe" baner svarer til gnotobiotiske nymfer, mens "conv nymfe" baner svarer til konventionelle, nonsterile kolleger. Baseret på virtuelle begrænsning fordøje, endosymbiont (Blattabacterium) forventes at have bånd på størrelserne 402 bp, 206 bp, og 163 bp, med en smøre af bånd mellem 163 bp og 148 bp. Et gnotobiotisk insekt bør kun vise Blattabacterium banding mønster. En blandet bakteriel samfund forventes at have en smøre af bands med forskellige størrelser, mærket her "andre bakterielle 16S fragmenter". Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Andre metoder, der beskriver generering af gnotobiotiske kakerlakker, beskrev enten ikke oothecae-samling eller brugte benchmarks, der er specifikke for andre kakerlakarter, for at angive, hvornår oothecae kunne fjernes fra moderen23,25,26. Oprindeligt blev der indsamlet oothecae fra træflisstrøelse i lagertankene, hvilket resulterede i meget lave lugehastigheder (~10%) sammenlignet med ikke-industrialiserede oothecae (47%)29. Dette skyldes sandsynligvis, at unhatched oothecae ophobes over tid i lagerburet, og der er ingen måde at kontrollere ootheca alder eller levedygtighed. Gennemførelsen af "barselsafdelingen" gør det muligt at indsamle nyindlagte produkter af kendt alder. Dette yderligere letter eksperimentel planlægning, som forskeren kan forudse sandsynlige luge gange for de enkelte oothecae. En anden ændring fra indledende og offentliggjorte protokoller omfatter inkubation af oothecae og nymfer i halvlukkede kamre, der også indeholder en overmættet natriumchloridopløsning. Tilstedeværelsen af opløsningen opretholder en relativ luftfugtighed på ca. 75%30. Oothecae inkuberes rutinemæssigt ved 30 °C, hvilket har vist sig at minimere det antal dage, der kræves til inkubation, samtidig med at embryonernes levedygtighed og antallet af nymfer, der produceres pr. ootheca31,maksimeres. Efter udklækning dyrkes gnotobiotiske nymfer rutinemæssigt på bordpladen ved laboratorierumstemperatur og omgivende forhold, selvom fugtighedskontrollerede kamre igen bruges til kritiske eksperimenter. Efter at disse ændringer var blevet foretaget i forbindelse med indsamling og inkubation af ootheca, steg lugehastigheden til ca. 41% (n = 51), ekskl. En mulig vej til yderligere optimering af lugehastigheder kan omfatte forlængelse af tiden mellem ootheca-indsamling og sterilisering. Æggetuiets kutikula må ikke være fuldt garvet ved den første udslip32og kan derfor være gennemtrængelig for opløsninger, der anvendes under sterilisering inden for 24 timer efter sætningen.

Steriliseringsprotokollen med 0,1% pereddikesyre blev tilpasset fra Doll et al.25. Andre undersøgelser har dokumenteret alternative teknikker til sterilisering af oothecae23,26. Kontamineringshastighederne er baseret på den ikke-destruktive metode til inkubation af oothecae på en BHI-skråning. Denne fremgangsmåde er yderst fordelagtig, da den giver mulighed for hurtig identifikation og fjernelse af forurenet oothecae. De fleste tidligere protokoller test for kulturable organismer ved plating afføring eller nymfe homogenat på bakteriologiske medier og kontrol for vækst22,23,25,27,28,33. I mindst ét tilfælde var metoden til test af gnotobiotisk status ikke fuldt ud beskrevet26. Undtagen Clayton, der tilføjede en lille plade af sterilitetstestmedium til opdræt af flasker24, tidligere metoder22,23 husede gnotobiotiske insekter på bakteriologiske medier kun i korte perioder for i første omgang at evaluere steriliseringsprotokollen.

Fortsat hus af de resulterende nymfer på BHI medium som en indbygget kvalitetskontrol foranstaltning gør det muligt at overvåge deres gnotobiotiske status i semi-real-time-en teknik, der ikke ses i de fleste tidligere metoder22,23. Dette er især nyttigt til langsigtede eksperimenter, der kræver gnotobiotiske nymfer, der skal tilgås. Hvis BHI-gulvet under nymfer forekommer forurenet med bakteriel eller svampevækst, skal kolben kasseres. Denne type forurening opstår typisk ved udspørning af kolberne til vandnymfer, men det kan også opstå fra afføring i tilfælde af utilstrækkeligt steriliseret oothecae eller mad. Brugen af en laminar flow hætte, når vanding forbedrer forureningshastigheden forårsaget af udsløring af kolber.

Da ikke alle kontaminerende organismer kan vokse aerobt på BHI-mediet, kræves der en yderligere kulturafhængig metode til sterilitetstest. En potentiel tilgang er mikroskopi27, men denne tilgang kan være arbejdskrævende. Andre protokoller anvender sekvensbaserede teknikker til at detektere organismer , der kan undslippe kultur14,23,27,28. Sådanne tilgange er imidlertid ofte dyre og svære at fortolke, da resultaterne af højgennemstrømningssekvenseringsmetoder let kan påvirkes af lavniveauforurening af reagenser34 og stregkodehopping35. I stedet er der udviklet en ny tilgang, der bruger PCR-forstærkning af 16S rRNA-genet i kombination med begrænsningsfragmentlængdepolymorfi til at visualisere både endosymbionten og eventuelle forurenende tarmsymposbionter. Denne teknik omfatter en intern PCR-kontrol, da Blattabacteriums16S-gen er blevet sekventeret, og dets båndmønster skal være til stede i både gnotobiotiske og nonsterile insekter. Da endosymbiontens begrænsningsmønster kan forudsiges ud fra dets genomsekvens36, er der ingen grund til at sekvensere ampliconerne eller begrænsningsfragmenterne, medmindre der ønskes identifikation af forurenende stoffer. Den nuværende version af denne protokol opfordrer til en nymfe, der skal ofres for PCR / RFLP, men denne teknik kan også bruges på afføring som en ikke-destruktiv foranstaltning. Det vil dog ikke omfatte en indbygget kontrol, da afføringen ikke bør indeholde meget Blattabacterium.

En yderligere let modificerbar, men kritisk komponent i opdræt af gnotobiotiske dyr er kost. Mens BHI agar kan tjene som en midlertidig fødekilde for insekterne, har det vist sig, at det resulterer i betydelige vækstunderskud blandt nymfer, når de anvendes som den eneste fødekilde i længere perioder. Mens forskellige kostvaner er blevet prøvet, anbefales autokraperbar rotte chow som en rutinemæssig kost til vedligeholdelse af gnotobiotiske insekter. Kostvaner, der ikke specifikt er formuleret til sterilisering, var ofte vanskelige at gøre fuldt sterile, og mange sterile eller autokrabbare laboratoriedyrdiæter viste sig at udvise hurtig svampevækst under ikke-sterile forhold. Denne tendens til nedbrydning under ikke-erhvervsmæssige forhold gjorde dem uegnede til brug i forsøg, der direkte sammenlignede gnotobiotiske og ikke-agnotobiotiske insekter. Den anbefalede kost giver mulighed for brug af en konsekvent kost mellem gnotobiotiske og standard nymfer, hvilket letter sammenligningen af egenskaber - såsom vækstrater - mellem de to grupper.

Som andre har observeret27, vokser de gnotobiotiske nymfer langsommere end deres nonsterile modstykker. En sammenligning mellem kropslængder af gnotobiotiske (n = 105) og nonsterile nymfer (n = 50) fodret med det samme, autoklaveret gnaver kost og holdes ved stuetemperatur afslører, at nonsterile nymfer vokser i gennemsnit 0,059 mm/dag, mens gnotobiotiske nymfer vokser 0,028 mm/ dag (p < 0,0001) (Figur 5). Tilstedeværelsen af tarmmikrobiota i P. americana har vist sig at ændre insekternes stofskifte37, og tarmsamfund generelt menes at påvirke næringsstofabsorptionen38,39. Disse grunde understøtter de observerede forskelle i vækstraten for gnotobiotiske og nonsterile nymfer.

En mulig begrænsning af denne teknik er, at gnotobiotiske nymfer muligvis ikke når seksuel modenhed, da de ældste sterile kohorter er mere end 10 måneder gamle og kun har nået den syvende instar (ud af 10; 11 er voksenalderen) som tilnærmet af kropslængde40. Disse ældste kohorter er ikke på autoklaveret rotte kost, men i stedet spise bestrålet rotte chow, en kost, der indeholder for meget fugt til at fodre til nonsterile kohorter uden overdreven skimmelvækst. Nonsterile nymfer på en nonsterilized hundemad kost blev fundet at nå voksenalderen efter 9−10 måneder under laboratorieforhold (stuetemperatur og fugtighed). Kohorter af gnotobiotiske og nonsterile nymfer på den fælles, autoklaverede rotte chow er i øjeblikket mindre end 7 måneder gamle, nonsterile insekter anslås at være syvende instar (gennemsnit: 16,7 mm), mens sterile insekter skønnes at være femte instar (gennemsnit: 11,2 mm). Som følge heraf kan vi endnu ikke kontrollere, om vores gnotobiotiske kakerlakker med succes kan reproducere. Men i betragtning af den lethed, hvormed nye gnotobiotiske kohorter kan etableres ved hjælp af denne tilgang, viser denne metode store løfter selv i mangel af dokumenteret reproduktion af gnotobiotiske insekter.

Afslutningsvis giver denne protokol et alsidigt værktøj, der gør det muligt for mikrobiomforskere at drive deres egen, billige gnotobiotiske "facilitet" ved hjælp af almindelige laboratoriematerialer. Denne tilgang kan bruges til at generere gnotobiotiske kakerlakker til eksperimenter, der undersøger mikrobiotas rolle i udformningen af værtsadfærd, immunitet, udvikling ogstressresponser 21,26,27. Disse gnotobiotiske insekter kan også podes med enten syntetiske eller xenobiotiske samfund og efterfølgende anvendes som forsøgspersoner for tarmmikrobiomeundersøgelser23,28. Desuden kan elementer af denne tilgang, herunder anvendelse af bakteriologiske medieforede inkubationskamre som indbygget sterilitetskontrol, generaliseres til andre modelsystemer og kan lette rutinemæssig vedligeholdelse af gnotobiotiske dyr i mindre anlæg.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences fra National Institutes of Health under tildelingsnummer R35GM133789. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis det officielle synspunkt fra National Institutes of Health. Forfatterne vil gerne anerkende Josey Dyer for sporing af steriliseringsrater, lugehastigheder og vækstrater for de gnotobiotiske kakerlakker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2X master mix New England BioLabs M0482 OneTaq MasterMix
Autoclavable rat chow Zeigler NIH-31 Modified Auto
Bacterial DNA extraction kit Omega Bio-Tek D-3350 E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube
binding buffer Omega Bio-Tek PD099 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer)
brain-heart infusion (BHI) broth Research Products International B11000
Delicate task wipes KimWipe JS-KCC-34155-PK KimWipes
DNA purification kit Omega Bio-Tek D6492 E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution)
elution buffer Omega Bio-Tek PDR048 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
glass beads Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
Hybridization oven UVP 95-0330-01 we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used
Laminar flow biological safety cabinet NuAire, Inc. NU-425-400 Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity
lysozyme Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
peracetic acid stock solution (32%) Sigma-Aldrich 269336
Petroleum jelly Vaseline n/a
proteinase K buffer Omega Bio-Tek PD061 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer")
purifying buffer Omega Bio-Tek PDR042 included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer)
RsaI New England BioLabs R0167 Includes CutSmart (digestion) buffer
Secondary container n/a n/a a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes
spectrophotometer ThermoFisher ND-2000 Catalog info is for NanoDrop2000
thermal shaker Eppendorf EP5386000028 Thermomixer R
Tris-EDTA Fisher BP1338-1 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8
wash buffer Omega Bio-Tek PDR044 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer)
Woodchip bedding P.J. Murphy Forest Products Sani-Chips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yi, P., Li, L. The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).
  2. Nature Biotechnology. Laying better plans for mice. Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).
  3. Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents. ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).
  4. Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).
  5. Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
  6. Eun, C. S., et al. Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice. Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).
  7. Cherbuy, C., et al. Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).
  8. Van Den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats. Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).
  9. Stecher, B., Berry, D., Loy, A. Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle. FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).
  10. Sugahara, H., et al. Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community. Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).
  11. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).
  12. Mallapaty, S. Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom. Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).
  13. Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  14. Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
  15. Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host–Microbiota Interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).
  16. Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).
  17. Engel, P., Moran, N. A. The gut microbiota of insects - diversity in structure and function. FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).
  18. Tinker, K. A., Ottesen, E. A. The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts. Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).
  19. Zurek, L., Keddie, B. A. Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L. Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).
  20. Cruden, D. L., Markovetz, A. J. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).
  21. Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest. PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).
  22. Benschoter, C., Wrenn, R. Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches. Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).
  23. Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
  24. Clayton, R. A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions. Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).
  25. Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies. American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).
  26. Wada-Katsumata, A., et al. Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach. Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).
  27. Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate. PeerJ. 7, 6914 (2019).
  28. Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches. Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).
  29. Katoh, K., et al. Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches. Zoological Letters. 3, 3 (2017).
  30. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).
  31. Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids. Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).
  32. Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , Taylor & Francis. Philadelphia, PA. (2008).
  33. House, H. L. Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique. The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).
  34. Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses. Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).
  35. Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).
  36. Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).
  37. Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Muñoz-Garcia, A. The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana. PeerJ. 6, 4717 (2018).
  38. Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation. Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).
  39. Rowland, I., et al. Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components. European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).
  40. Gier, H. T. Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn). Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).

Tags

Biologi gnotobiotisk kim-fri kakerlak periplaneta americana sterilisere oothecae
Etablering og vedligeholdelse af gnotobiotiske amerikanske kakerlakker (<em>Periplaneta americana</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen,… More

Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen, E. A. Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana). J. Vis. Exp. (171), e61316, doi:10.3791/61316 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter