Summary
Este protocolo é usado no estabelecimento e manutenção de baratas americanas gnotobióticas(Periplaneta americana)por superfície esterilizando as caixas de ovos (oothecae) antes da eclosão. Estes insetos gnotobióticos contêm seus endosímbiontos blattabacterium transmitidos verticalmente, mas têm tripas axenicas.
Abstract
Os animais gnotobióticos são uma ferramenta poderosa para o estudo de controles sobre estrutura e função de microbioma. Apresentado aqui é um protocolo para o estabelecimento e manutenção de baratas gnotobióticas americanas (Periplaneta americana). Esta abordagem inclui verificações de esterilidade incorporadas para controle de qualidade contínuo. Os insetos gnotobióticos são definidos aqui como baratas que ainda contêm seu endossímbionte transmitido verticalmente (Blattabacterium), mas não possuem outros micróbios que normalmente residem em sua superfície e em seu trato digestivo. Para este protocolo, os casos de ovos (oothecae) são removidos de uma colônia de estoque (não estéril) e superfície esterilizada. Uma vez coletada e esterilizada, a oothecae é incubada a 30 °C por aproximadamente 4-6 semanas em ágar de infusão cérebro-coração (BHI) até que eles eclodam ou são removidos devido à contaminação. Ninfas escotadas são transferidas para um frasco de Erlenmeyer contendo um piso BHI, água estéril e alimentos de rato estéreis. Para garantir que as ninfas não estejam abrigando micróbios que não são capazes de crescer em BHI nas condições dadas, uma medida adicional de controle de qualidade usa o polimorfismo de comprimento de fragmento (RFLP) para testar micróbios não-simbióticos. As ninfas gnotobióticas geradas usando essa abordagem podem ser inoculadas com comunidades microbianas simples ou complexas e usadas como ferramenta em estudos de microbioma intestinal.
Introduction
Animais gnotobióticos provaram ser ferramentas inestimáveis para estudos de microbioma1,2,3. Animais sem germes e de flora definida permitiram a elucidação de interações hospedeira-micróbios, incluindo respostas imunológicas hospedeiras, maturação epitelial intestinal e metabolismo hospedeiro1,4,5,6,7. Animais gnotobióticos inoculados com uma comunidade simplificada também têm auxiliado em uma compreensão mais completa das interações micróbios-micróbios em uma comunidade intestinal, especificamente na desvendação de relações transversais e antagônicas8,9,10,11. O atual sistema modelo preferido para estudos no microbioma intestinal dos mamíferos é o modelo murino. Embora este sistema tenha sido vital nas descobertas acima descritas, uma deficiência fundamental é o custo envolvido. Equipamentos especializados e técnicos altamente treinados são necessários para estabelecer e manter uma instalação gnotobiótica. Isso, em combinação com cuidados extras que devem ser dados a todos os aspectos da manutenção animal gnotobiótica, faz com que o animal gnotobiótico custe de dez a vinte vezes mais para procriar do que um modelo animal padrão12. Devido aos altos custos, muitos pesquisadores podem não conseguir pagar um modelo gnotobiótico de murina. Além disso, embora os modelos murine possam ser a escolha mais amplamente aceita para estudos que buscam traduzir para a saúde humana, ainda existem muitas diferenças fisiológicas e morfológicas entre as entranhas humanas e do camundongo13. Claramente nenhum modelo singular é suficiente para responder ao número cada vez maior de perguntas sobre os muitos aspectos do microbioma intestinal.
Os modelos de insetos são uma alternativa mais barata devido ao seu menor custo de manutenção em comparação com as espécies de mamíferos. Extensa pesquisa sem germes e gnotobióticas em uma variedade de espécies de insetos levou ao desenvolvimento de múltiplos modelos comumente usados. Mosquitos e Drosophila são modelos comuns para o trabalho sem germes devido à sua relevância para doenças globais e tratos genéticos14,15. Outro sistema de modelo emergente é o da abelha-,dada a sua importância na pesquisa de polinização e socialidade16. No entanto, muitos desses insetos comumente usados não têm a complexidade taxonômica vista nas comunidades intestinais de mamíferos17,limitando sua capacidade de modelar interações de ordem mais alta. Não só a diversidade total de micróbios encontrados no intestino de baratas americanas é mais semelhante aos mamíferos, mas muitos dos micróbios presentes no intestino das baratas pertencem a famílias e filos que são comumente encontrados na microbiota intestinal de mamíferos e humanos18. O hindgut da barata também é funcionalmente análogo ao intestino grosso dos mamíferos, pois é uma câmara de fermentação densamente embalada com bactérias para auxiliar na extração de nutrientes19,20. Finalmente, a natureza onívora das baratas permite uma diversidade de regimes alimentares que não seria possível com especialistas dietéticos.
As baratas americanas podem ser um sistema modelo útil para a compreensão das comunidades microbianas intestinais em organismos superiores, mas o status da barata como praga também torna esse sistema relevante para o controle de pragas21. Aproveitar o conhecimento fundamental da influência da comunidade intestinal na saúde das baratas e na fisiologia auxilia no desenvolvimento de novas técnicas para o manejo de pragas.
O objetivo deste método é traçar uma descrição abrangente do estabelecimento e manutenção de baratas gnotobióticas americanas(Periplaneta americana),mas este protocolo poderia ser usado para gerar ninfas de qualquer barata oviparada. Inclui um método para uma coleta eficiente e não invasiva de oothecae maduro, e uma técnica não destrutiva para monitorar o estado gnotobiótico dos insetos22,23,24. Enquanto métodos anteriores de alcançar e manter baratas gnotobióticas descrevem a coleção ootheca23,24,25,26,27, a maturidade ootheca é interpretada em termos de pistas específicas de espécies (em Blattella germanica22,24,25), ou não explicitamente descrita27,28, dificultando a implementação para aqueles que não estão familiarizados com o sistema. Uma vez que o método descrito aqui usa oothecae naturalmente descartado, o erro de remover ovos prematuramente está ausente. Este protocolo contém métodos de controle de qualidade dependentes da cultura e independentes da cultura, e o método dependente da cultura não requer sacrificar insetos. Finalmente, este método reúne informações de múltiplos estudos de baratas gnotobióticas para criar um protocolo abrangente e abrangente com todas as informações necessárias para alcançar e manter baratas gnotobióticas.
Protocol
1. Preparação de materiais
- Manutenção de culturas de baratas de estoque
NOTA: Há muitas maneiras de criar esses insetos robustos. As especificidades sobre o fornecimento de abrigo e água podem ser diferentes dependendo de materiais acessíveis (ou seja, caixas de ovos em vez de tubos de papelão). O seguinte protocolo de esterilização funcionará para qualquer configuração do tanque de estoque.- Espalhe roupas de cama suficientes em um aquário de 37,85 L (10 galões) para cobrir o fundo do tanque com aproximadamente 1 polegada de roupa de cama. Prepare a carcaça cortando (plana) papelão a 2 em x 4 em pedaços. Insira pedaços de papelão em tubos de papelão (por exemplo, tubos de papel higiênico) e empilhe tubos em uma extremidade do tanque(Figura 1).
- Esfregue uma fina camada de geleia de petróleo nas duas polegadas superiores do interior do tanque para evitar a fuga de insetos.
NOTA: Certifique-se de revestir corretamente o interior dos cantos do tanque. - Adicione baratas transferindo tubos de papelão (ocupados) de um tanque de estoque anterior, sacudindo-os para liberar seus habitantes. Para cada transferência, mova 100-200 baratas de idade mista e sexo misto. Adicione comida de cachorro (20-30 peças), monitore a quantidade de ração para cães no tanque e refil quando estiver baixo.
- Montar um prato de água.
- Encha um pequeno recipiente de alimentos reutilizáveis plásticos com água duplamente destilada (ddH2O). Corte esponjas de celulose e furos na tampa do recipiente de alimentos para aproximadamente o mesmo tamanho.
NOTA: As esponjas de celulose evitam que as baratas se afoguem no prato de água.
- Encha um pequeno recipiente de alimentos reutilizáveis plásticos com água duplamente destilada (ddH2O). Corte esponjas de celulose e furos na tampa do recipiente de alimentos para aproximadamente o mesmo tamanho.
- Insira esponjas em orifícios na tampa e coloque a tampa no recipiente cheio. Coloque o recipiente no tanque e recarreque quando estiver baixo. Cubra o tanque com pano de algodão e fixe-o no lugar com uma faixa elástica.
- À medida que os tanques começam a acumular quantidades excessivas de carcaças de frass e insetos, configurar novos tanques e transferir baratas.
NOTA: Os tanques são normalmente transferidos a cada 6 meses. Quaisquer baratas/ovos remanescentes em tanques de estoque desativados são eutanizados congelando a -20 °C por 1 h e o conteúdo do tanque de estoque é então transferido para um saco de autoclave e autoclaved (1 h, ciclo de gravidade) antes do descarte. Os tanques de estoque são esterilizados com 2% de alvejante entre os usos.
- Desinfete um recipiente secundário.
NOTA: Este recipiente não inclui um filtro, mas permite a troca de ar livre.- Pulverize o interior da tampa e a parte inferior com 2% de alvejante e deixe-os de molho por 10 minutos. Limpe o alvejante com uma toalha de papel limpa.
- Pulverize o interior da tampa e o fundo com 70% de etanol e limpe com uma toalha de papel limpa. Substitua a tampa até usar.
- Faça inclinações e frascos bhi para incubar ovos e ninfas de habitação.
- Prepare o BHI de acordo com as instruções do pacote, adicionando 2% de ágar. Ferva a solução BHI-ágar até esclarecer.
- Para inclinações, transfira 5 mL para tubos de teste de vidro de 18 mm x 150 mm e tampa. Esterilizar via autoclave (tempo de esterilização = 20 min, ciclo líquido). Coloque tubos autoclavados em um ângulo de 45° para esfriar em inclinações. Uma vez solidificado, leve à geladeira até evitar a secagem.
- Para frascos, transfira 10 mL de solução BHI-ágar cozida em frascos de 250 mL Erlenmeyer para cobrir completamente o fundo do frasco. Cubra o frasco com papel alumínio e esterilize via autoclave (ciclo líquido de 20 minutos). Deixe os frascos autoclavados esfriarem e refrigerarem até que usem para evitar a secagem.
NOTA: Não é necessário filtro de ar para esta configuração. A tampa da folha é suficiente para permitir a troca de gás, evitando a contaminação do fluxo de ar livre.
- Esterilizar via autoclave: chow de rato autoclavável quebrado em meias-tamanhos (~1/2 polegadas) em um béquer coberto de papel alumínio (tempo de esterilização = 1 h, ciclo de gravidade), ddH2O em uma garrafa tampada (tempo de esterilização = 20 min, ciclo líquido) e fórceps em um béquer coberto de papel alumínio (tempo de esterilização = 20 min, ciclo gravitacional).
NOTA: Não encheque demais o béquer de comida de rato. Pelotas vão inchar na autoclave. - Montar um tanque de "maternidade".
NOTA: Este tanque contém os mesmos materiais que os tanques de estoque (tubos de papelão, pratos de água com esponjas, ração para cães, roupa de cama de cavanha; ver Figura 1) e deve estar vazio de baratas a menos que seja transferido para a coleta de oothecae (ver seção 2). - Umidificar uma incubadora preparando um béquer cheio de solução de cloreto de sódio supersaturado (NaCl). Prepare esta solução adicionando 37 g de NaCl por 100 mL de ddH2O e mexendo até dissolver.
NOTA: Normalmente, 500 mL de solução de sal saturado tipicamente umidifica uma incubadora com dimensões de câmara de 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x W x D) por aproximadamente um mês antes de mais água ser adicionada.
2. Coleção de oothecae
- Transfira as fêmeas (em qualquer número conforme apropriado para experimentos planejados) carregando oothecae(Figura 2) do tanque de estoque para a "maternidade" usando fórceps para mover tubos de papelão que contenham fêmeas gravidas.
- Se um tubo de carrossel contém vários insetos, além da fêmea gravid, primeiro retire o tubo em um recipiente de plástico adicional anelado com geleia de petróleo, e depois encoraje o inseto alvo a subir de volta para o tubo de papelão sozinho.
- Transfira as fêmeas de volta para o tanque de estoque assim que caírem o oothecae. Recupere o oothecae da ninhada no tanque com fórceps.
NOTA: Oothecae são muitas vezes descartados dentro de 24 horas da fêmea ser transferida.
3. Limpeza de oothecae
- Adicione oothecae a um tubo centrífuga de 5 mL contendo 3 mL de sulfato de dodecyl de sódio (SDS). Vórtice para 10 s. Repita para um segundo passo de lavagem com um tubo de centrífuga contendo SDS fresco.
NOTA: Até cinco oothecae pode ser usado por 3 mL de SDS. - Usando uma limpeza de tarefa delicada, esfregue suavemente a superfície de cada ootheca para remover quaisquer detritos. Mais SDS podem ser adicionados para auxiliar na limpeza completa. Coloque oothecae limpo em um barco de pesagem até estar pronto para esterilização.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, mas deixar o oothecae em ambientes de baixa umidade por longos períodos de tempo (dias a semanas) fará com que eles desidratem e percam a viabilidade.
4. Esterilização e incubação de oothecae
- Água estéril aliquot para enxágüe pós-esterilização. Para cada ootheca a ser esterilizada, encha dois tubos de centrífuga de 1,5 mL com 1 mL de água estéril.
- Adicionar 10 μL de concentrado (32%) solução de estoque de ácido peracético para 3,2 mL de ddH2O em um tubo de centrífuga de 5 mL para criar uma solução de 0,1% para esterilização. Cap e inverta várias vezes para misturar.
ATENÇÃO: O ácido peracético é prejudicial no contato com a pele ou pulmões. Diluir em um capô de fumaça.
NOTA: Isso deve ser feito no mesmo dia da esterilização. Se diluída com antecedência, a solução se decomporáirá rapidamente e, portanto, não esterilizará adequadamente. Até cinco oothecae limpos podem ser esterilizados em 3,2 mL de ácido diluído. - Coloque (até cinco) oothecae limpo na solução de ácido peracético de 0,1% por 5 min. Inverta o tubo várias vezes a cada 60 s.
- Em uma capa de fluxo laminar, use fórceps estéreis para transferir cada ootheca para seu próprio tubo de centrífuga com água de lavagem estéril aliquoted (passo 4.1). Inverta várias vezes para misturar. Repita por uma segunda lavagem, depois transfira cada ootheca enxaguada para sua própria inclinação BHI usando fórceps estéreis.
- Coloque inclinações no recipiente secundário esterilizado. Mova o recipiente para a incubadora umidificada a 30 °C durante 4-5 semanas até chocar.
NOTA: As inclinações podem ser mantidas eretas por um pequeno rack de tubo de ensaio ou por um béquer médio/pequeno. - Verifique as inclinações regularmente (1−2x por semana). Se o crescimento de colônias fúngicas ou bacterianas aparecer no ágar, remova a inclinação contaminada. Quando o ponto de tempo de quatro semanas se aproxima, verifique as inclinações todos os dias.
NOTA: Uma vez eclodidas, as ninfas podem sobreviver por até várias semanas apenas no BHI, mas não crescerão de forma ideal.
5. Manutenção de ninfas gnóbiticas
- Em uma capa de fluxo laminar, transfile aseticamente uma pelota de chow de rato esterilizado para um frasco BHI preparado (a partir da etapa 1.3.3) com fórceps estéreis. Como verificação de esterilidade, coloque o frasco no recipiente secundário em uma incubadora de 30 °C por 24 h e não use se o crescimento aparecer.
- Adicione ninfas ao frasco BHI com pelotas de alimentos estéreis. Afaste-os da inclinação bhi e deixe-os cair no frasco em um capô de fluxo laminar.
NOTA: As ninfas não têm tração nas paredes de vidro do tubo de ensaio. Sacudir o tubo para derrubá-los da inclinação e, em seguida, derrubar o tubo para permitir que eles deslizem o vidro para o frasco é eficaz. Enquanto as ninfas podem ser transferidas usando fórceps, o risco de ferimentos fatais é alto. - Ninfas de água com 300 μL de água estéril uma vez por semana em uma coifa de fluxo laminar, tubulando diretamente no piso BHI do frasco.
- À medida que as fezes de ninfa começam a cobrir o piso bhi, transfira para um novo frasco BHI, adicionando a comida de rato esterilizada com 24 horas de antecedência (para verificar a esterilidade) como na etapa 5.1.
6. Controle de qualidade da esterilidade
- Remova uma ninfa do frasco BHI para sacrificar por uma verificação de controle de qualidade independente da cultura do status gnotobiótico através do polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP). Para isso, despeje a ninfa em um tubo de centrífuga estéril (semelhante à transferência ninfa da etapa 5.1) ou coloque um aplicador de madeira estéril no frasco e espere uma ninfa começar a escalar e, em seguida, transfira-a para o tubo centrífuga.
- Adicione 0,5 mL de salina tamponada de fosfato de 1x (PBS) à ninfa no tubo centrífuga e homogeneize com uma micropestle estéril até que todas as peças grandes sejam quebradas. Vórtice bem.
- Extrair DNA da ninfa homogeneizar usando um kit de extração de DNA bacteriano(Tabela de Materiais)da seguinte forma.
- Centrifugar a ninfa homogeneizada por 10 min a 5.000 x g e remover o supernaspe. Pré-aqueça um agitador térmico a 37 °C.
- Adicione 100 μL de 1x Tris-EDTA e vórtice para resuspensar completamente a pelota. Adicione 10 μL de lise e misture, seguido de uma incubação de 30 minutos (sem agitação) no agitador térmico pré-aquecido de 37 °C.
- Adicione 25 mg de contas de vidro às amostras e vórtice em velocidade máxima por 5 minutos. Pré-aqueça o agitador térmico a 55 °C.
- Deixe as contas se instalarem antes de transferir o supernasciente para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL com 100 μL de tampão proteinase K e 20 μL de proteinase K. Vórtice para misturar completamente.
- Incubar, com agitação a 600 rpm, em um agitador térmico de 55 °C por 60 min. Centrifugar a 10.000 x g por 2 min, e transferir supernadante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL. Pré-aqueça o agitador térmico a 65 °C. Comece a pré-aquecimento do tampão de eluição em um forno de hibridização de 65 °C.
- Adicione 220 μL de 100% de etanol. Vórtice em velocidade máxima para 20 s. Quebre qualquer precipitado visível por tubulação para cima e para baixo 10x.
- Insira uma coluna de DNA em um tubo de coleta de 2 mL e transfira a amostra para a coluna, incluindo qualquer precipitado que possa ter se formado. Centrifugar a 10.000 x g por 1 min, descartar filtrar do tubo de coleta e substituir o tubo de coleta.
- Adicione 500 μL de tampão de ligação à coluna e centrífuga a 10.000 x g por 1 min. Descarte o filtrado do tubo de coleta e substitua o tubo de coleta.
- Adicione 700 μL de tampão de lavagem de DNA à coluna e centrífuga a 10.000 x g por 1 min. Descarte o filtrado do tubo de coleta e substitua o tubo de coleta. Repita para um segundo passo de lavagem.
- Centrifugar coluna vazia por 2 minutos para secá-la, transferindo a coluna para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL depois. Adicione 50 μL de tampão de elução pré-aquecido diretamente à matriz da coluna de DNA e incubar a 65 °C por 5 min.
- Centrifugar a 10.000 x g por 1 min a elute. Quantifique o DNA extraído no filtrado via espectrofotometria ou fluorometria.
- Amplificar e digerir todo o gene 16S. Visualize fragmentos usando eletroforese em gel.
- Use 12,5 μL de mix mestre de 2x, 0,5 μL de cada primer 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT) e 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 5 ng de DNA e água de grau molecular para um volume total de reação de 25 μL.
- Execute o seguinte programa termociclador: 94 °C para 60 s; seguido por 35 ciclos de 94 °C para 30 s, 50 °C para 45 s, 68 °C para 90 s; seguido por 68 °C para 5 min.
- Purifique o produto de reação em cadeia de polimerase (PCR) utilizando um kit de purificação de DNA(Tabela de Materiais).
- Adicione 120 μL de tampão purificador ao produto PCR e vórtice para misturar. Centrifugar brevemente para coletar gotículas dentro da tampa. Insira uma coluna de DNA em um tubo de coleta de 2 mL, transfira líquido para a coluna preparada e centrífuga a ≥13.000 x g por 1 min.
- Descarte o filtrado e substitua o tubo de coleta. Adicione 700 μL de tampão de lavagem de DNA e centrífuga a ≥13.000 x g por 1 min. Descarte o filtrado e substitua o tubo de coleta. Repita para um segundo passo de lavagem.
- Centrifugar a coluna vazia por 2 minutos para secar e transferir a coluna para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicione 50 μL de tampão de elução pré-aquecido diretamente à matriz da coluna de DNA e incubar à temperatura ambiente por 2 minutos.
- Centrifugar a 10.000 x g por 1 min a elute. Quantifique o DNA extraído em filtrado via espectrofotometria ou fluorometria.
- Adicione 1 μg de produto PCR purificado a 5 μL de tampão de digestão, 10 unidades RsaI e água de grau molecular para um volume total de reação de 50 μL. Misture por tubulação para cima e para baixo e incubar a 37 °C por 60 min.
- Separe o produto digerido via eletroforese de gel executando 20 μL de DNA digerido em um gel de 2% de agarose. Visualize o gel para confirmar o estado gnóbito.
NOTA: Os insetos gnotobióticos só devem resultar em bandas de 402 bp, 201 bp, e uma mancha de 163 a 148 bp, com base na sequência 16S rDNA do endossímbionte, Blattabacterium. Quaisquer bandas extras vistas no gel são indicativas de contaminar espécies microbianas.
7. Rastreamento asséptico do crescimento ninfa
- Regissuça o comprimento do corpo para acompanhar o crescimento ninfa, medindo os insetos através do piso BHI translúcido do frasco.
NOTA: As ninfas podem ser colocadas a 4 °C por 15 minutos para retardar seu movimento, tornando-as mais fáceis de medir.
Representative Results
Os tanques de estoque são configurados como descritos na Figura 1. As fêmeas "grávidas" são identificadas pela ootheca presa ao abdômen posterior, conforme retratado na Figura 2. A incubação de oothecae no ágar BHI permite o controle de qualidade gnotobiótico de forma não destrutiva. Em alguns casos, a esterilização não é bem sucedida, e o crescimento aparece em torno da oothecae como na Figura 3B. Estes oothecae devem ser removidos e descartados. Em nossas mãos, observou-se uma taxa média de falha de 10% para esterilização (n = 51). O oothecae eclode uma média de 34 dias após a esterilização sem crescimento no meio, como visto na Figura 3A. Observamos taxas típicas de escotilha de 41% (n = 46) para oothecas esterilizadas e não contaminadas, com uma média de 11 ninfas por ootheca. Ninfas maiores são transferidas para frascos BHI cobertos com papel alumínio, como na Figura 4. A folha previne a contaminação, e as ninfas têm espaço para crescer. RFLP do rDNA 16S de uma ninfa homogeneizada é usado para confirmar o estado gnotobiótico. As ninfas gnotobióticas têm sido observadas para crescer em uma taxa mais lenta do que suas contrapartes não estéreis, como representado Figura 5. A Figura 6 exibe resultados de insetos gnotobióticos com sucesso, bem como ninfas padrão (não osteril).
Embora este teste ainda não tenha identificado contaminação na ausência de um resultado positivo da cultura, esta etapa tem sido realizada rotineiramente durante experimentos críticos para descartar a presença de micróbios sensíveis ao oxigênio ou exigentes. O crescimento mais lento tem sido observado nas baratas gnotobióticas quando comparado com insetos padrão/não-estérquico.
Figura 1: Configuração da cultura de ações de baratas.
Tubos de papelão podem ser vistos empilhados na extremidade do tanque. Comida e água estão perto da frente do tanque. Capa de pano de algodão e banda elástica foram removidas para visibilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Uma barata americana "grávida".
A seta indica a ootheca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens de ninfas gnotobióticas com sucesso eclodiram e esterilizaram oothecae sem sucesso em inclinações bhi.
Oothecae foram esterilizados e incubados conforme descrito neste protocolo. AFalta de crescimento microbiano na inclinação do BHI indica que os insetos estão livres de organismos culturais. (B) Oothecae sobre inclinações que resultam na formação de colônias devem ser descartados como contaminados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Aparelho de criação gnotobiótico.
Os insetos são mantidos em frascos estéreis cobertos com uma tampa de papel alumínio para evitar contaminação. O recipiente secundário (tampa verde) é esterilizado com 2% de alvejante seguido de 70% de etanol. O fluxo de ar não é restrito no recipiente secundário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Dados representativos da taxa de crescimento comparando os comprimentos corporais das ninfas gnóbiticas e não assterianas. Ambos os grupos de insetos foram alimentados com dieta autoclaved roedor. Os insetos gnotobióticos (aqui: n = 105) são mantidos em BHI como descrito. Insetos não-estéres (aqui: n = 50) vivem em frascos com cama de cavanha autoclavada com pequenos pratos para água. As ninfas não-estrúrquicas crescem uma taxa média de 0,059 mm/dia, enquanto as ninfas gnotobióticas crescem a 0,028 mm/dia (p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Uma imagem de gel representativa dos resultados rflp para controle de qualidade.
Amplicons genéticos de 16S inteiros foram digeridos com RsaI. O DNA para PCR foi extraído de ninfas homogeneizadas em 1x PBS. As faixas de "G ninfa" correspondem a ninfas gnotobióticas, enquanto as faixas de "ninfa conv" correspondem a contrapartes convencionais e não-tésteres. Com base no digestor de restrição virtual, espera-se que o endossímbionte (Blattabacterium) tenha bandas nos tamanhos de 402 bp, 206 bp e 163 bp, com uma mancha de bandas entre 163 bp e 148 bp. Um inseto gnotobiótico deve mostrar apenas o padrão de banda blattabacterium. Espera-se que uma comunidade bacteriana mista tenha uma mancha de bandas com tamanhos variados, rotuladas aqui como "outros fragmentos bacterianos 16S". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Outros métodos que descrevem a geração de baratas gnotobióticas não descreveram a coleta de oothecae ou usaram referências específicas para outras espécies de baratas para indicar quando a oothecae poderia ser removida da mãe23,25,26. Originalmente, oothecae foram coletados da cama de cavacos de madeira nos tanques de estoque, resultando em taxas de escotilha muito baixas (~10%) em comparação com oothecae não esterilizado (47%)29. Isso é provável devido ao fato de que oothecae não-esqueca se acumula ao longo do tempo na gaiola de estoque, e não há nenhuma maneira de verificar a idade ou viabilidade da ootheca. A implantação da abordagem "maternidade" permite a coleta de oothecae recém-depositado de idade conhecida. Isso facilita ainda mais o planejamento experimental, já que o pesquisador pode antecipar tempos prováveis de eclosão para oothecae individual. Outra modificação dos protocolos iniciais e publicados inclui a incubação de oothecae e ninfas em câmaras semi-seladas também contendo uma solução de cloreto de sódio supersaturado. A presença da solução mantém uma umidade relativa de aproximadamente 75%30. Oothecae são rotineiramente incubados a 30 °C, o que tem sido mostrado para minimizar o número de dias necessários para a incubação, ao mesmo tempo em que maximiza a viabilidade dos embriões e o número de ninfas produzidas por ootheca31. Após a eclosão, as ninfas gnóbiticas são rotineiramente cultivadas no banco a temperatura ambiente de laboratório e condições ambientais, embora as câmaras controladas pela umidade sejam novamente utilizadas para experimentos críticos. Após o estabelecimento dessas alterações na coleta e incubação da ootheca, as taxas de escotilha aumentaram para aproximadamente 41% (n = 51), sem incluir a oothecae removida devido à contaminação. Uma rota potencial para maior otimização das taxas de escotilha pode incluir a ampliação do tempo entre a coleta de ootheca e a esterilização. A cutícula da caixa do ovo pode não ser totalmente bronzeada na versão inicial32, e, portanto, pode ser permeável para soluções utilizadas durante a esterilização dentro de 24 horas após a queda.
O protocolo de esterilização utilizando ácido peracético de 0,1% foi adaptado de Doll et al.25. Outros estudos documentaram técnicas alternativas para esterilizar oothecae23,26. As taxas de contaminação baseiam-se no método não destrutivo de incubação da oothecae em uma inclinação bhi. Esta abordagem é altamente vantajosa, pois permite a identificação rápida e a remoção de oothecae contaminado. A maioria dos protocolos anteriores testa organismos culturaláveis, emplacando fezes ou homogeneizando ninfa em mídia bacteriológica e verificando o crescimento22,23,25,27,28,33. Em pelo menos um caso, o método para testar o estado gnotobiótico não foi totalmente descrito26. Exceto Clayton, que adicionou uma pequena laje de teste de esterilidade de garrafas médias para a criação24, métodos anteriores22,23 insetos gnóbitos alojados em mídia bacteriológica apenas por curtos períodos de tempo para avaliar inicialmente o protocolo de esterilização.
A habitação contínua das ninfas resultantes no meio BHI como medida de controle de qualidade incorporada permite que seu status gnotobiótico seja monitorado em tempo semirreal — uma técnica não vista na maioria dos métodos anteriores22,23. Isso é especialmente útil para experimentos de longo prazo que requerem acesso a ninfas gnotobióticas. Se o piso BHI sob ninfas aparecer contaminado com crescimento bacteriano ou fúngico, o frasco deve ser descartado. Esse tipo de contaminação normalmente ocorre ao descobrir os frascos em ninfas de água, mas também pode surgir das fezes no caso de oothecae ou alimentos insuficientemente esterilizados. O uso de uma coifa de fluxo laminar ao regar melhora a taxa de contaminação causada pela descoberta de frascos.
Como nem todos os organismos contaminantes podem crescer aerobicamente no meio BHI, é necessário um método adicional independente de cultura de teste de esterilidade. Uma abordagem potencial é a microscopia27,mas essa abordagem pode ser intensiva em mão-de-obra. Outros protocolos utilizam técnicas baseadas em sequências para detectar organismos que podem escapar da cultura14,23,27,28. No entanto, tais abordagens são muitas vezes caras e difíceis de interpretar, pois os resultados de abordagens de sequenciamento de alto rendimento podem ser facilmente impactados pela contaminação de baixo nível dos reagentes34 e do código de barraspulando 35. Em vez disso, foi desenvolvida uma nova abordagem que usa amplificação PCR do gene 16S rRNA em combinação com o polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição para visualizar tanto o endossímbionte quanto qualquer siríionto intestinal contaminante. Esta técnica inclui um controle interno de PCR, uma vez que o gene 16S de Blattabacteriumfoi sequenciado, e seu padrão de banda deve estar presente tanto em insetos gnóbitos quanto não téris. Como o padrão de restrição do endossímbionte pode ser previsto a partir de sua sequência de genoma36,não há necessidade de sequenciar os amplicons ou os fragmentos de restrição, a menos que a identificação de qualquer contaminante seja desejada. A versão atual deste protocolo exige que uma ninfa seja sacrificada para PCR/RFLP, mas essa técnica também poderia ser usada em fezes como medida não destrutiva. No entanto, não incluirá um controle embutido, pois as fezes não devem conter muito Blattabacterium.
Um componente facilmente modificável, mas crítico, da criação de animais gnóbitos é a dieta. Embora o ágar bhi possa servir como uma fonte temporária de alimento para os insetos, descobriu-se que resulta em déficits de crescimento substanciais entre as ninfas quando usado como a única fonte de alimento por longos períodos. Embora dietas diversas tenham sido testadas, a comida de rato autoclavável é recomendada como uma dieta de rotina para a manutenção de insetos gnóbitos. Dietas não especificamente formuladas para esterilização eram muitas vezes difíceis de tornar totalmente estéreis, e muitas dietas animais de laboratório estéreis ou autoclaváveis foram encontradas para exibir um rápido crescimento fúngico em condições não estéreis. Essa tendência de degradação sob condições não estérias tornou-os inadequados para uso em experimentos que comparavam diretamente insetos gnóbitos e nãognóbitos. A dieta recomendada permite o uso de uma dieta consistente entre ninfas gnotobióticas e padrão, facilitando a comparação de características — como taxas de crescimento — entre os dois grupos.
Como outros observaram27,as ninfas gnotobióticas crescem mais lentamente do que suas contrapartes não-ostúris. Uma comparação entre os comprimentos do corpo de gnotobióticas (n = 105) e ninfas nãosterianas (n = 50) alimentou o mesmo, a dieta autoclaved roedor e mantida à temperatura ambiente revela que as ninfas não-orínias crescem em média 0,059 mm/dia, enquanto as ninfas gnotobióticas crescem 0,028 mm/dia (p < 0,0001)(Figura 5). A presença de microbiota intestinal em P. americana tem sido demonstrada para alterar a taxa metabólica dos insetos37, e as comunidades intestinais em geral são pensadas para afetar a absorção de nutrientes38,39. Essas razões suportam as diferenças observadas na taxa de crescimento das ninfas gnóbiticas e não asséiles.
Uma possível limitação a essa técnica é que as ninfas gnotobióticas podem não atingir a maturidade sexual, pois as coortes estéreis mais antigas têm mais de 10 meses e atingiram apenas a sétima estrela (de 10; 11 na idade adulta) como aproximadas pelo comprimento corporal40. Essas coortes mais antigas não estão na dieta autoclaved de ratos, mas, em vez disso, comem comida de rato irradiada, uma dieta que contém muita umidade para alimentar coortes não-estérias sem crescimento excessivo de moldes. Ninfas não-árteis em uma dieta alimentar de cães não esterilizadas foram encontradas para atingir a idade adulta após 9-10 meses em condições laboratoriais (temperatura ambiente e umidade). Coortes de ninfas gnóbóticas e não-ostúiles na comida de rato compartilhada e autoclavada têm atualmente menos de 7 meses de idade, estima-se que os insetos não-estéreis sejam o sétimo instar (média: 16,7 mm) enquanto os insetos estéreis são estimados como quintos instar (média: 11,2 mm). Como resultado, não podemos, ainda, verificar se nossas baratas gnotobióticas podem se reproduzir com sucesso. No entanto, dada a facilidade com que novas coortes gnotobióticas podem ser estabelecidas usando essa abordagem, este método mostra grande promessa mesmo na ausência de reprodução comprovada de insetos gnótobitos.
Em conclusão, este protocolo fornece uma ferramenta versátil que permite aos pesquisadores de microbioma operar sua própria "instalação" gnotobiótica de baixo custo usando materiais de laboratório comuns. Essa abordagem pode ser usada para gerar baratas gnotobióticas para experimentos que examinam o papel da microbiota na formação do comportamento hospedeiro, imunidade, desenvolvimento e respostas ao estresse21,26,27. Esses insetos gnotobióticos também podem ser inoculados com comunidades sintéticas ou xenobióticas e posteriormente utilizados como sujeitos para estudos de microbioma intestinal23,28. Além disso, elementos dessa abordagem, incluindo o uso de câmaras de incubação bacteriológicas alinhadas à mídia como uma verificação de esterilidade incorporada, são generalizáveis a outros sistemas de modelo e podem facilitar a manutenção rotineira de animais gnóbitos em instalações de menor escala.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Esta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número R35GM133789. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial dos Institutos Nacionais de Saúde. Os autores gostariam de reconhecer Josey Dyer por rastrear taxas de esterilização, taxas de escotilha e taxas de crescimento das baratas gnotobióticas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X master mix | New England BioLabs | M0482 | OneTaq MasterMix |
| Autoclavable rat chow | Zeigler | NIH-31 Modified Auto | |
| Bacterial DNA extraction kit | Omega Bio-Tek | D-3350 | E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube |
| binding buffer | Omega Bio-Tek | PD099 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer) |
| brain-heart infusion (BHI) broth | Research Products International | B11000 | |
| Delicate task wipes | KimWipe | JS-KCC-34155-PK | KimWipes |
| DNA purification kit | Omega Bio-Tek | D6492 | E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution) |
| elution buffer | Omega Bio-Tek | PDR048 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| glass beads | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| Hybridization oven | UVP | 95-0330-01 | we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used |
| Laminar flow biological safety cabinet | NuAire, Inc. | NU-425-400 | Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity |
| lysozyme | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| peracetic acid stock solution (32%) | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Petroleum jelly | Vaseline | n/a | |
| proteinase K buffer | Omega Bio-Tek | PD061 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer") |
| purifying buffer | Omega Bio-Tek | PDR042 | included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer) |
| RsaI | New England BioLabs | R0167 | Includes CutSmart (digestion) buffer |
| Secondary container | n/a | n/a | a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes |
| spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | Catalog info is for NanoDrop2000 |
| thermal shaker | Eppendorf | EP5386000028 | Thermomixer R |
| Tris-EDTA | Fisher | BP1338-1 | 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
| wash buffer | Omega Bio-Tek | PDR044 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer) |
| Woodchip bedding | P.J. Murphy Forest Products | Sani-Chips |
References
- Yi, P., Li, L. The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).
- Nature Biotechnology. Laying better plans for mice. Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).
- Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents. ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).
- Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Eun, C. S., et al. Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice. Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).
- Cherbuy, C., et al. Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).
- Van Den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats. Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).
- Stecher, B., Berry, D., Loy, A. Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle. FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).
- Sugahara, H., et al. Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community. Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).
- Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).
- Mallapaty, S. Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom. Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
- Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host–Microbiota Interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).
- Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).
- Engel, P., Moran, N. A. The gut microbiota of insects - diversity in structure and function. FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).
- Tinker, K. A., Ottesen, E. A. The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts. Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).
- Zurek, L., Keddie, B. A. Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L. Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).
- Cruden, D. L., Markovetz, A. J. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).
- Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest. PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).
- Benschoter, C., Wrenn, R. Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches. Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Clayton, R. A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions. Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies. American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).
- Wada-Katsumata, A., et al. Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach. Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).
- Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate. PeerJ. 7, 6914 (2019).
- Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches. Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).
- Katoh, K., et al. Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches. Zoological Letters. 3, 3 (2017).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).
- Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids. Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).
- Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , Taylor & Francis. Philadelphia, PA. (2008).
- House, H. L. Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique. The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).
- Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses. Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).
- Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).
- Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).
- Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Muñoz-Garcia, A. The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana. PeerJ. 6, 4717 (2018).
- Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation. Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).
- Rowland, I., et al. Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components. European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).
- Gier, H. T. Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn). Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).
