Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار تجميع نانوماتريكس حيوي (NM) مع الأنابيب النانوية الأساسية يانوس (JBNTs) و Fibronectin (FN). عندما تشارك في الاستزراع مع الخلايا الجذعية المسكية البشرية (hMSCs)، تظهر NMs نشاطًا حيويًا ممتازًا في تشجيع الالتصاق hMSCs.
Abstract
تم تطوير NM حيويًا ليكون بمثابة سقالة بيولوجية هندسية للأنسجة ، والتي يمكن أن تعزز مرسى الخلايا الجذعية. يتم تشكيل NM الحيوية من JBNTs و FN من خلال التجميع الذاتي في محلول مائي. JBNTs قياس 200-300 μm في الطول مع قنوات جوفية الهيدربويك الداخلية والأسطح المائية الخارجية. يتم توجيه الاتهام بشكل إيجابي JBNTs والـ FNs مشحونة بشكل سلبي. لذلك، عندما حقن في حل مائي محايد، يتم ربطها معا عن طريق الترابط غير التكافؤ لتشكيل حزم NM. يتم الانتهاء من عملية التجميع الذاتي في غضون ثوان قليلة دون أي مبادرات كيميائية، مصدر الحرارة، أو الأشعة فوق البنفسجية. عندما يكون درجة النيّة المحلّل NM أقل من النقطة الأيزوكريتية لـ FNs (PI 5.5-6.0)، فإن حزم NM ستُطلق ذاتياً بسبب وجود FN مشحونة بشكل إيجابي.
ومن المعروف NM لتقليد مصفوفة خارج الخلية (ECM) شكلرفولوجي وبالتالي، يمكن استخدامها كسقالة عن طريق الحقن، والذي يوفر منصة ممتازة لتعزيز التصاق hMSC. ويشير تحليل كثافة الخلايا وتجارب التصوير المفلورة إلى أن نظم NMs زادت بشكل كبير من مرسى hMSCs مقارنة بالتحكم السلبي.
Introduction
وقد أظهرت الخلايا الجذعية mesenchymal الإنسان (hMSCs) إمكانية تجديد الذات والتمايز الذاتي على طول الأنساب mesenchymal المختلفة، مما يساعد في تجديد وصيانة الأنسجة1. وبناء على إمكانية التمايز، تعتبر hMSCs كمرشحين لإصابات الأنسجة المسكية وعلاج اضطراب الدم2. وقد أظهرت hMSCs القدرة على تعزيز التئام الجروح عن طريق زيادة إصلاح الأنسجة، الأوعية الدموية، والحد من الالتهاب3. ومع ذلك ، من دون مساعدة المواد الكيميائية الحيوية أو الحيوية ، فإن كفاءة hMSCs للوصول إلى الأنسجة المستهدفة والوظيفة في الموقع المطلوب منخفضة4. على الرغم من أن مختلف السقالات هندسيا قد استخدمت لجذب hMSCs للتمسك بالآفات، بعض المواقع مثل كسر لوحة النمو، في منتصف العظام الطويلة، لا يمكن الوصول إليها بسهولة من قبل السقالات التقليدية سابقة التصنيع، والتي قد لا تناسب تماما في موقع مصاب بشكل غير منتظم.
وقد طورنا هنا مادة نانوية ذات طبيعة حيوية يمكن أن تتجمع ذاتيا في الموقع وتحقن في منطقة يصعب الوصول إليها. وتتألف حقن الحيوي سقالة NM من نانوتيوب قاعدة جانوس (JBNTs) و Fibronectin (FN). JBNTs، والمعروف أيضا باسم الأنابيب النانوية روزيت (RNTs)، مستمدة من أزواج قاعدة الحمض النووي، وتحديدا الثيمين والأدينين، هنا5،6،7. كما رأينا في الشكل 1، تتشكل الأنابيب النانوية عند ستة جزيئات من أزواج قاعدة الحمض النووي المشتقة ذاتية التجميع عبر روابط الهيدروجين لتشكيل طائرة6. ثم يتم تكديس ستة جزيئات على بعضها البعض في طائرة عبر تفاعل قوي بين pi-stacking7، والذي يمكن أن يصل طوله إلى 200-300 ميكرومتر. تم تصميم JBNTs لتقليد ألياف الكولاجين بشكل مورفولوجي بحيث تتفاعل FN معها.
FN هو ارتفاع الوزن الجزيئية جليكوبروتين لاصقة، والتي يمكن العثور عليها في مصفوفة خارج الخلية (ECM)9. هذه يمكن أن تتوسط في تعلق الخلايا الجذعية على مكونات أخرى من ECM، ولا سيما الكولاجين10. قمنا بتصميم JBNTs لتقليد ألياف الكولاجين بشكل مورفولوجي حتى تتمكن FN من التفاعل معها لتشكيل NM في بضع ثوان عبر الترابط غير التكافؤ. لذلك، NM هو سقالة بيو واعدة ليتم حقنها في موقع كسر العظام التي لا يمكن الوصول إليها من قبل السقالات ملفقة تقليديا. هنا, NM عن طريق الحقن يقدم قدرة ممتازة لتعزيز المرسى hMSC في المختبر, عرض إمكاناتها لتكون بمثابة سقالة لتجديد الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليفة من JBNTs
ملاحظة: تم إعداد monomer JBNT كما تم نشرهاسابقاً 11.
- تركيب المركب A1
- إعداد حل يحتوي على 8.50 غرام من حمض 2-cyanoacetic و 9.80 غرام من الإيثيلكاراماتي في 25 مل من التولوين و 2.5 مل من N, N-dimethylformamide. إضافة 4.90 مل من الفوسفور كلوريد قطرة. ثم سخني الخليط إلى 70 درجة مئوية وحفاظ على التحريك لمدة 1.5 ساعة.
- يبرد خليط التفاعل لدرجة حرارة الغرفة ويصب في 100 غرام من الماء المثلج. استخراج طبقة مائي مع خلات الإيثيل (3 × 250 مل)، وغسل مع 100 مل من محلول ملحي. جفف الطبقة العضوية فوق كبريتات الصوديوم اللامائية، فلتر ويتبخر التقلبات تحت الفراغ للحصول على صلبة شاحبة صفراء.
- إخضاع الصلبة الصفراء للسيليكا هلام فلاش العمود اللوني (3٪ الميثانول / ثنائي كلورو الميثان) لإنتاج 15.61 غرام من مركب A1 كمسحوق أبيض.
- تركيب المركب A2
- مزيج 3.12 غرام من مركب A1 و 2.75 غرام من كربونات البوتاسيوم في 50 مل من N, N-dimethylformamide. يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
- إضافة 2.6 مل من ثاني كبريتيد الكربون إلى تعليق رد الفعل. استمر في التحريك لمدة 4 ساعات.
- يضاف الإيثانول المطلق إلى خليط التفاعل عند 0 درجة مئوية. تصفية الترسب الأصفر خارج وغسل مع الأثير ديثيل. الجافة تحت فراغ بين عشية وضحاها إلى تسفر عن 6.18 غرام من مركب A2 كما الصلب شاحب أصفر.
- توليف المركب A3
- إضافة 2.7 مل من يوديد الميثيل في 15 مل من الأسيتونيتريل. أيضا، إعداد حل بشكل منفصل من مركب A2 بإضافة 6.18 غرام من A2 إلى 80 مل من الماء / الأسيتونيتريل (7:3 نسبة). اخلطي كل من الحلول وحركي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- سخني خليط التفاعل إلى 95 درجة مئوية و استمر في التحريك لمدة 3 ساعات.
- يبرد خليط التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم يتبخر المتطايرات تحت الفراغ.
- استخراج بقايا 3x مع 100 مل من خلات الإيثيل وغسل مع محلول ملحي. تجفيف الطبقة العضوية على كبريتات الصوديوم اللامائية، تصفية وتتبخر التقلبات تحت فراغ للحصول على صلبة صفراء.
- إخضاع الصلبة الصفراء للسيليكا هلام فلاش العمود الكروماتوغرافيا (30٪ خلات الإيثيل / سداسية) لتحقيق 4.52 غرام من مركب A3 كما الصلبة الضوء الأصفر.
- توليف المركب A4
- إعداد حل اليلامين بإضافة 925 ميكرولتر من الأليلامين في 20 مل من الإيثانول. إضافة هذا الحل دروبا إلى حل A3 المركبة، التي أعدتها إضافة 3.14 غرام من A3 في 75 مل من الإيثانول المطلق، أكثر من 30 دقيقة. ثم سخني خليط التفاعل ليرتد لمدة 16 ساعة.
- يبرد خليط التفاعل إلى درجة حرارة الغرفة ويتبخر المتطايرات لإعطاء صلب أصفر.
- إخضاع الصلبة الصفراء للسيليكا هلام فلاش العمود اللوني (50٪ خلات الإيثيل / سداسية إلى 2٪ الميثانول / ثنائي كلوروميثان) لإنتاج 1.80 غرام من مركب A4 كبلورة بيضاء.
- توليف المركب A5
- إضافة 2.05 غرام من هيدروكلوريد غواندينيوم و 7.8 مل من اكسيد الصوديوم (21 wt٪ في الإيثانول) في 14 مل من الإيثانول المطلق. سخني الخليط إلى 45 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- تصفية قبالة المواد غير قابلة للذوبان وإضافة الترشيح مباشرة إلى حل A4 المركب، التي أعدت عن طريق إضافة 2.70 غرام من A4 في 40 مل الإيثانول المطلق. سخني خليط التفاعل للارتجاع لمدة 16 ساعة.
- تصفية الترسبات إلى الحصول على 2.65 غرام من مركب A5 كما الصلبة بيضاء.
- توليف المركب A6
- إضافة 24.9 مل من ثلاثي اليثيلامين ببطء إلى خليط الطين التي تم الحصول عليها عن طريق إضافة 2.11 غرام من مركب A5 و 1.10 غرام من 4-Dimethylaminopyridine في 120 مل من رباعي هيدروفوران أكثر من 1 دقيقة. يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
- إضافة 20.7 مل من دي-ثلثي-بوتيل ديكاربونات قطرة إلى خليط رد فعل والحفاظ على اثارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 ساعة.
- إضافة 20 مل من الماء لإخماد رد الفعل. يتبخر المتطايرات تحت فراغ.
- استخراج بقايا اللزجة الحمراء مع 500 مل من خلات الإيثيل. ثم، وغسله في مع 250 مل من الماء، 75 مل من 10٪ حامض الستريك، 2x مع 200 مل من الماء، 200 مل من بيكربونات الصوديوم المشبعة، و 200 مل من محلول ملحي. تجفيف الطبقة العضوية على كبريتات الصوديوم اللامائية، تصفية وتتبخر المتطايرات تحت فراغ لإعطاء الصلبة الأحمر / البرتقالي.
- إخضاع الصلبة إلى السيليكا هلام فلاش العمود الكروماتوغرافيا (0-20٪ خلات الإيثيل / سداسية) لتحقيق 3.87 غرام من مركب A6 كرغوة بيضاء.
- توليف المركب A7
- إضافة N-ميثيلمورفينولين ن أكسيد (50 wt.٪ في الماء, 1.64 مل) قطرة إلى حل مركب A6 (2.93 ز) في الأسيتون / الماء (8:1, 58.5 مل) ويحرك في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة رباعي أكسيد أوسميوم (4٪ محلول مائي) قطرة إلى الخليط على مدى فترة 3 دقائق والحفاظ على اثارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
- إخماد التفاعل مع 1.0 M كبريت الصوديوم مائي حتى يتحول الحل عديم اللون. إزالة المواد المتطايرة تحت فراغ يؤدي إلى الطين الأبيض في الماء. استخراج بقايا مع 350 مل من ديكلوروميثان ثم يغسل مع 150 مل من الماء تليها غسل مع 150 مل من محلول ملحي.
- جفف الطبقة العضوية فوق كبريتات الصوديوم اللامائية، فلتر وتتبخر المواد المتطايرة تحت الفراغ لتسفر عن 2.45 غرام من مركب A7 كما الصلبة البيضاء.
- توليف المركب A8
- إضافة 760 غرام من الصوديوم periodide إلى خليط من 1.36 غرام من مركب A7 في 35 مل من ثنائي كلوروميثان / الماء (6:1، 35 مل) ويحرك في درجة حرارة الغرفة لمدة 42 ساعة.
- تصفية المواد غير قابلة للذوبان قبالة والتركيز على الترشيح تحت فراغ. استخراج المخلفات الناتجة مع 250 مل من ديكلوروميثان، ثم يغسل مع 100 مل من الماء و 100 مل من محلول ملحي. تجفيف الطبقة العضوية على كبريتات الصوديوم اللامائية، تصفية وتتبخر المتطايرات تحت فراغ لإعطاء المنتج الخام.
- اخضاع المنتج الخام للسيليكا هلام فلاش العمود الكروماتوغرافيا (5-40٪ خلات الإيثيل / سداسية، ثم 5٪ الميثانول / ثنائي كلوروميثان) لإنتاج 1.08 غرام من مركب A8.
- تركيب المركب A9
- إعداد حل من 830 ملغ من مركب A8 في 15 مل من 1،2-ديكلورويتان. إضافة محلول قطرة إلى خليط من 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-أمينو-الهيكسانويك حمض ثلاثيthylsilyl إثيل إستر (649.5 ملغ) وN،N-diisopropylethylamine (591 ميكرولتر) في 24 مل من 1،2-ديكلورويتين أكثر من 3 دقائق، ويحرك في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 360.3 ملغ من الصوديوم triacetoxyborohydride إلى المحلول والحفاظ على اثارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
- إخماد خليط التفاعل مع 6 مل من الماء. استخراج خليط التفاعل 3x مع 200 مل من ديكلوروميثان وغسل مع 200 مل من حمض الستريك 10٪ في الماء، 2x مع 200 مل من الماء، 200 مل من بيكربونات الصوديوم المشبعة، و 200 مل من محلول ملحي في هذا النظام. تجفيف الطبقة العضوية على كبريتات الصوديوم اللامائية، تصفية وتبخير المواد المتطايرة تحت فراغ للحصول على المنتج الخام.
- اخضاع المنتج الخام للسيليكا هلام فلاش العمود اللوني (5-30٪ خلات الإيثيل / سداسية) لتحقيق 885 ملغ مركب A9.
- توليف من مونومر JBNT
- يُحلّ 0.54 غرام من مركب A9 (0.54 جم) في 10 مل من 94٪ حمض ثلاثي الفلوراستيكت/thioanisole حل ويحرك في درجة حرارة الغرفة ل 72 ساعة.
- إضافة ديثيل الأثير (80 مل) إلى خليط التفاعل والطرد المركزي الترسب إلى أسفل. صب حمض ثلاثي الفلوراستيك واضح يحتوي على افراط بها وغسل الترسبات البيضاء مع الإثير ديثيل والميثانول إلى 168.6 ملغ الخام JBNT مونومر(ملف تكميلية 1).
- تنقية مونومر JBNT الخام من قبل الكروماتوغرافيا السائل عالية الأداء (HPLC) مع عمود المرحلة العكسية. ويرد أدناه برنامج العزل: المذيب A: 100٪ المياه؛ المذيب B: 100٪ الأسيتونتريل؛ المذيب C: درجة ح =1 HCl محلول المياه؛ معدل التدفق: 3 مل/دقيقة (انظر الجدول 1).
- جمع أكبر ذروة في حوالي 7.2 دقيقة.
2- تلفيق نظام JBNT/FN
- إضافة 80 μL من 1 ملغ / مل JBNT محلول مائي إلى 40 ميكرولتر من 1 ملغم / مل FN محلول مائي والماصات عدة مرات.
- تحقق من وجود تعليق أبيض صلب بعد الأنابيب لحوالي 10 s.
ملاحظة: تم تصوير فيديو لالتقاط عملية التجميع الذاتي لـ NM(الملف التكميلي 2).
3- مراقبة العينات التي تُزَمَّل على نحو مُزَمَّل
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لإظهار بنية سقالة NM مصنوعة من JBNTs و FN.
- إعداد حلول FN و JBNT و FN/JBNT NM لمراقبة المواد الزنجية. تمييع 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام/مل من FN مع 40 ميكرولتر من الماء المقطر لصنع محلول 20 ميكروغرام/مل من FN.
- إعداد 100 ملغ / مل من محلول JBNTs عن طريق تخفيف 5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل JBNTs في 45 ميكرولتر من المياه DI.
- مزيج 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل FN و 5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل من JBNTs في 35 ميكرولتر من المياه DI لتشكيل حل NM.
- معطف ثلاثة آبار من 96-واضح جيدا الألواح الدقيقة أسفل الجولة مع FN، حل JBNT وحل NM، على التوالي. كل بئر يتلقى 50 ميكرولتر من الحل.
- إجراء التجميل، كما هو موضح أدناه، لتصور هيكل سقالة من NM.
- تجميد لوحة في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- بدوره على أداة مُزَمَّل ومضخة فراغ.
- اضغط على زر التبريد لخفض درجة حرارة النظام إلى -50 درجة مئوية.
- وضع لوحة المجمدة في صك مُزَمَّد وإغلاق جميع الفتحات من الصكوك.
- انقر فوق زر البدء لتقليل ضغط النظام إلى 0.9 mbar.
- بعد 4 ساعات، اضغط على زر الهواء وفتح صمام لزيادة ضغط النظام إلى الضغط الجوي.
- أخرجي الطبق من الآلة المُزهّنة.
- استخدام المجهر لمراقبة الجبهة الوطنية، JBNTs وما ينتج عن ذلك NM تجميعها ذاتيا. التقط عدة صور فوتوغرافية مع كاميرا للمواد.
4. قياس طيف الامتصاص
ملاحظة: استخدام تغيير الأطياف ل FN و JBNTs لتقديم JBNT/FN NM12تجميعها ذاتياً.
- مزيج 30 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل FN مع 15 ميكرولتر من الماء المقطر و 5 ميكرولتر من 1 ملغم / مل JBNTs لإعداد حل JBNT / FN NM. ويمكن رؤية تعليق الصلبة الأبيض بعد الأنابيب الحل عدة مرات.
ملاحظة: التركيزات النهائية من JBNTs و FN في الحل هي 100 ميكروغرام / مل و 60 ميكروغرام / مل، على التوالي. كما تم إعداد حلول JBNTs و FN بنفس التركيز على الحل المستخدم في حل NM كحلول تحكم. - تخفيف 5 ميكرولتر من 1 ملغم / مل من JBNTs مع 45 ميكرولتر من الماء المقطر لإعداد حل التحكم JBNT.
- تخفيف 30 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل FN مع 20 ميكرولتر من الماء المقطر لإعداد FN حل التحكم.
- قياس أطياف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية فيس من FN، JBNT وJN / الجبهة الوطنية للأرصاد الجوية مع الطيف (انظر جدول المواد)لوصف تجميع NM.
- انقر فوق الزر UV-Vis. تنظيف سطح اختبار من الطيفية وإسقاط 2μL من الماء المقطر على ذلك. قياسه كما فارغة من 190-850 نانومتر.
- تنظيف سطح الاختبار من مقياس الطيف وإسقاط 2 ميكرولتر من حل FN على ذلك. قياس أطياف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية-فيس من حل FN من 190 نانومتر إلى 850 نانومتر.
- تنظيف سطح اختبار من الطيفي وإسقاط 2 ميكرولتر من حل JBNT على ذلك. قياس أطياف امتصاص من حل JBNT من 190 نانومتر إلى 850 نانومتر.
- تنظيف سطح الاختبار من مقياس الطيف وإسقاط 2 ميكرولتر من JBNT / FN NM حل على ذلك. قياس أطياف امتصاص من جبنت / FN حل NM من 190 نانومتر إلى 850 نانومتر.
5- إعداد نظام JBNT/FN NM للمجهر الإلكتروني للإرسال (TEM)
- تنظيف عدة شبكات قبل تلطيخ السلبي مع نظافة البلازما الأساسية (انظر جدول المواد).
- تنفيذ تلطيخ السلبية للعينات بعد عمليتين مختلفتين.
- إسقاط 3 μL من 1 ملغ / مل من JBNTs محلول مائي و 3 ميكرولتر من JBNT / FN NM حل على الشبكات المنفصلة وتركها لمدة 2 دقيقة. ثم شطف كل شبكة مع 100 μL من 0.5٪ أورانيل خلات (UA) الحل. استنزاف الحل الزائد مع ورقة فلتر والهواء الجافة الشبكات.
- مزيج 9 ميكرولتر من JBNT / FN NM الحل مع 3 ميكرولتر من 2.0٪ UA الحل والماصة عدة مرات. الميette الحل المختلط على الشبكات والاحتفاظ بها على الشبكات لمدة 2 دقيقة. استخدم ورقة تصفية لإزالة الحل المختلط من الشبكات وتجفيف الشبكات في درجة حرارة الغرفة.
- وأخيراً، تصف العينة لJBNTs، JBNT / FN NM ملطخة الخطوة 5.2.1، وJN/FN NM ملطخة الخطوة 5.2.2 مع TEM.
6. في المختبر مقايسة وظيفة البيولوجية
- إضافة 200 μL من الضوابط السلبية (NC، PBS)، JBNTs، الجبهة الوطنية وJNT / الجبهة الوطنية حلول NM في بئر واحد من شريحة 8-جيدا، على التوالي.
- تجميد الجافة غطاء 8-جيدا الغرف مع صك مكسو بغلي للمواد معطف على الجزء السفلي من الآبار. بروتوكول التجميد التجفيف هو نفس الخطوة 3.5.
- ثم إضافة 10000 الخلايا / الآبار hMSCs (الممر 3) في الآبار واحتضانها لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- بعد الحضانة ، والماصات خارج الخلية ثقافة المتوسطة من الآبار وشطف الثقافة مع 1x برنامج تلفزيوني الحل.
- إضافة 100 μL من الحل المثبت لكل بئر مع الخلايا وترك لمدة 5 دقائق. شطف الخلايا بلطف مع 1X PBS مرتين.
- تمييع 1٪ تريتون-X 100 إلى 0.1٪. إضافة 100 μL من 0.1٪ تريتون-X 100 إلى كل بئر مع الخلايا وترك لمدة 10 دقيقة. شطف الخلايا بلطف مع 1X PBS مرتين.
- تخفيف Phalloidin رودامين إلى 1.65 μM. إضافة 100 ميكرولتر من Phalloidin رودامين إلى كل بئر مع الخلايا واحتضان غطاء من الحجرة حفظ من الضوء في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. شطف الخلايا بلطف مع 1X PBS مرتين.
- التقط صور الخلية مع مجهر الفلورسنت.
- عد أرقام الخلايا على صور الفلورسنت لكل مجموعة. حساب كثافة التصاق الخلية بمتوسط ثلاث مناطق عشوائية في كل بئر.
- تقديم كافة البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار t-1 الذيل الواحد، متبوعاً بتحليل التباين (ANOVA) مع p<0.05، والذي يعتبر ذا أهمية إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اكتشفت دراساتنا أن تشكيل NM من JBNTs و FN سريع ، وهو ما حدث في 10 ثوان. كما هو مبين في الشكل 2، تم الحصول على floccule الأبيض عندما تم خلط حل JBNT مع حل FN و pipetted عدة مرات. عملية تشكيل NM هو محاكاة حيوية تماما. لا توجد حاجة إلى محفزات خارجية. عملية تصنيع أسهل بكثير من بعض المواد الحيوية الناشئة، والذي يقوم على الأشعة فوق البنفسجية أو البادئ الكيميائية ل crosslinking13.
نحن القبض على وتحليل صور الكاميرا من الجبهة الوطنية، JBNTs، وNME(الشكل 3). بالنسبة لمجموعة الجبهة، باستثناء البقع البيضاء القصيرة، لم يتم ملاحظة أي ألياف طويلة. وكانت المجموعات القصيرة التجمعات البروتين تتكون من الجبهة الوطنية، مما يدل على أن هيكل سقالة لا يمكن أن تتشكل مع الجبهة الوطنية وحدها دون JBNTs (الشكل 3A). كما هو مبين في الشكل 3B، فإن الألياف الطويلة والأرق تشير إلى وجود JBNTs. عرض خيوط بيضاء من NM أوسع بالمقارنة مع JBNTs، مما يدل على أن JBNTs و FN المتداخلة مع بعضها البعض تشكيل NM. يمكن أن تنمو الألياف NM يصل إلى عدة سنتيمترات في الطول (الشكل 3C).
حصلنا على أطياف الأشعة فوق البنفسجية-فيس للإشارة إلى التجميع بين JBNTs و FN. كما هو مبين في الشكل 4، JBNTs يعرض اثنين من قمم الامتصاص في 220 نانومتر و 280 نانومتر ، على التوالي. بالمقارنة مع JBNTs، وJNT/ FN NM لها اثنين من قمم الامتصاص في نفس الموقع مع قيمة مخفضة بشكل كبير، والتي كانت من JBNTs ولكن تتأثر غير التكافؤ الذاتي تجميع JBNTs و FN في ما بين.
تم استخدام TEM لتوصيف مورفولوجيا JBNTs و NM. كما هو مبين في الشكل 5A، وJBNTs هي أنابيب نحيلة مع أقطار موحدة. تحت شروط محايدة، يتم توجيه الاتهام JBNTs إيجابيا في حين يتم اتهام الجبهة الوطنية سلبا. عندما مختلطة، فإنها شكلت NM الورم الليفي الطويل عن طريق التفاعلات تهمة (الشكل 5B). عندما يكون درجة الـ PH أقل من نقطة isoelectric من FN (PI من 5.5-6.0) ، فإن حزم NM تقدم الإصدار الذاتي بسبب FN المشحونة بشكل إيجابي. كما هو مبين في الشكل 5C، عندما يتم الحفاظ عليها في حل مع انخفاض الرقم الH (4.0) ، تم تفكيك NM ، وتم إطلاق الكثير من الجبهة الوطنية من NM. الجبهة الوطنية وزعت جنبا إلى جنب مع الأنابيب النانوية هو أيضا دليل قوي على أن NM تم تلفيقها من قبل JBNTs و FN10.
استكشفنا تأثير NM JBNT/FN على التصاق الخلية. كما هو مبين في الشكل 6، أظهرت كثافة التصاق الخلية لمجموعة NM فرقًا كبيرًا (قيمة p < 0.05) مقارنة بالتحكم السلبي. قد يكون الفرق لأن NM مصممة لتقليد شكلي ECM، والتي توفر سقالة للتصاق الخلية14. ويتألف ECM من الكولاجين والخلايا لاصقة glycoproteins، مثل فيبرومينيكات15. وقد قدم الكولاجين مع القدرة على تعزيز الالتصاق أعلى وانتشار hMSCs16. بالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت fibronectin لتعزيز التصاق hMSCs في الموقع المصاب وكذلك15. كما أظهرت تقنية التصوير الفلوري أن التزام مجموعة NM بالفلورانس زاد بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة التحكم السلبية(الشكل 7)15,17.
الشكل 1: رسم توضيحي تخطيطي للتجميع الذاتي الهرمي لـ JBNTs مع سلسلة جانبية من اللين.
تتم إعادة طبع هذا الرقم بإذن من المنشور السابق12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مظاهرة من أجل عملية التجمع الذاتي لـ NM.
(A) FN الحل. (ب) JBNTs مختلطة مع الجبهة الوطنية. تتم إعادة طبع هذا الرقم بإذن من المنشور السابق12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور برايتفيلد.
برايتفيلد صور من (A) FN (B) JBNTs و (C) NM التي شكلتها JBNTs و FN. يبلغ قطر كل منطقة 2 سم. تتم إعادة طبع هذا الرقم بإذن من المنشور السابق12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أطياف الاستيعاب لـ FN وJBNTs وJNT/FN NM.
وقد أعيد طبع هذا الرقم من المنشور السابق12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور TEM.
TEM صور من (A) JBNTs (B) JBNT / FN NM ، و (C) صدر JBNT / FN NM. تتم إعادة طبع هذا الرقم بإذن من المنشور السابق12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التحليل الإحصائي للتصاق الخلوي.
تم تسجيل كثافة التصاق الخلية في هذه التجربة. *p<0.01 مقارنةً بالضوابط السلبية. **p<0.05 مقارنة بـ JBNT فقط. N = 3. تتم إعادة طبع هذا الرقم بإذن من المنشور السابق12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: صور الفلوريسنس.
صور الفلورانس من (A) hMSCs و (B) المحتضنة HMSC مع JBNTs. (C)hMSC المحتضنة مع الجبهة الوطنية (D)hMSC المحتضنة مع JBNT / FN NM. شريط مقياس: 100 μm. تتم إعادة طبع هذا الرقم بإذن من المنشور السابق12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الوقت | نسبة مئوية | باء- النسبة المئوية | جيم٪ |
| 0.00 دقيقة | 98 | 0 | 2 |
| 15.00 دقيقة | 68 | 30 | 2 |
| 25.00 دقيقة | 8 | 90 | 2 |
| 26.00 دقيقة | 0 | 100 | 0 |
الجدول 1: وقت التدرج.
ملف إضافي 1: مخطط لتوليف مونومر JBNT. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
ملف تكميلي 2: فيديو للتجميع الذاتي من FN/JBNT NM. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة ، طورنا NM حيويًا ذاتي التجميع ، والذي تم تشكيله مع JBNTs و FN المستوحى من الحمض النووي. عند إعداد حل JBNT، ينبغي أن يذوب مسحوق التحلل JBNT في الماء بدلا من برنامج تلفزيوني لأن PBS سوف يسبب التكتل من JBNTs، الذي يمنع تجميعها. وعلاوة على ذلك، وينبغي أيضا أن يتم تجميعها في المياه NM إذا كنا نريد أن نلاحظ هياكل نانو فيبريل من NM، لأن الملح في برنامج تلفزيوني سوف حزمة مع ألياف NM، والتي يمكن أن تقلل إلى حد كبير من القرار من الصور.
وقد أظهرت NM إمكانات كبيرة لتكون بمثابة سقالة هندسة الأنسجة الجديدة على الرغم من بذل الكثير من الجهود لاختلاق النسيج تجديد السقالات، والتي كانت تستخدم لتسهيل الالتصاق hMSCs والتمايز. ومع ذلك، فإن معظم هذه المواد هي مسبقة الصنع مع شكل معين، مثل سقالة مطبوعة 3D18،19. على هذا النحو، ليس من السهل زرعها في المواقع المصابة التي هي في عمق المفصل. ومع ذلك، يمكن حقن حل NM هنا كسائل ثم تكون بمثابة سقالة للتصاق الخلية.
أحد القيود هو أن NM ليست قوية ميكانيكيا. على عكس البوليمرات ، يتم تصنيعها عن طريق التجميع الذاتي للتفاعلات غير التكافؤ ، لذلك لا يمكن أن تتحمل الكثير من التحميل الميكانيكي أو التوتر. من ناحية أخرى ، فإن الهيكل غير التكافؤ يعرض أيضا التحلل الحيوي جيدة جدا والقابلية البيولوجية مناسبة للوظائف البيولوجية8، 20 ،21.
وقد أظهرت NM عن طريق الحقن إمكانات كبيرة لتوفير موقع الهدف وسقالة لMSC توجيه لتعزيز شفاء كسر العظام في الجسم. ومع ذلك، عند حقنها في الموقع المصاب، قد لا يبقى NM غير التكافؤ في مكانه لفترة طويلة، مما قد يقلل من التأثير العلاجي. في المستقبل، سوف نستكشف لدمج مواد أخرى (مثل الهيدروجيلز) أو لتناوب هياكل NM لزيادة تحسين خصائص سقالة NM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الدكتور يوبنغ تشن هو أحد مؤسسي شركة NanoDe Therapeutics.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل ماليا من قبل المعاهد القومية للصحة (المنح 1R01AR072027-01، 1R03AR069383-01)، NSF جائزة الوظيفي (1653702) وجامعة كونيتيكت.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
