Summary
이 프로토콜의 목표는 야누스 염기 나노튜브(JBNT)와 섬유네틴(FN)을 가진 생물미메틱 나노매트릭스(NM)의 조립을 보여주는 것이다. 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)와 공동 배양할 때, NM은 hMSCs 접착을 장려하는 우수한 생체 활성을 나타낸다.
Abstract
생체 모방 NM은 줄기 세포 앵커리지를 향상시킬 수 있는 조직 공학 생물학적 스캐폴드로 개발되었습니다. 생체 모방 NM은 수성 용액의 자체 조립을 통해 JBNT및 FN에서 형성됩니다. JBNT는 내부 소수성 중공 채널과 외부 친성 성 표면으로 길이 200-300 μm을 측정합니다. JBNT는 양수 충전되며 FN은 음수 로 충전됩니다. 따라서 중립 수성 용액에 주입하면 비일관성 결합을 통해 결합되어 NM 번들을 형성합니다. 자체 조립 공정은 화학 개시기, 열원 또는 자외선 없이 몇 초 이내에 완료됩니다. NM 솔루션의 pH가 FN(pI 5.5-6.0)의 등광점보다 낮으면, NM 번들은 양전하 FN의 존재로 인해 자체 방출됩니다.
NM은 세포외 매트릭스 (ECM)를 형태학적으로 모방하는 것으로 알려져 있으므로 hMSC 접착력을 향상시키는 우수한 플랫폼을 제공하는 주사용 스캐폴드로 사용할 수 있습니다. 세포 밀도 분석 및 형광 이미징 실험은 NM이 음의 대조군과 비교하여 hMSC의 앵커리지를 크게 증가시켰다는 것을 나타냈다.
Introduction
인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)는 조직1의재생 및 유지에 도움이 되는 다른 중간엽 혈통을 따라 자가 재생 및 자가 분화의 잠재력을 보여주었습니다. 분화 잠재력에 기초하여, hMSC는 중간 엽 조직 상해 및 조혈 장애 치료2에대한 후보로 간주됩니다. hMSC는 조직 수리, 혈관 신생, 염증 감소3을증가시켜 상처 치유를 촉진하는 능력을 보여주었습니다. 그러나 생화학적 또는 생체 재료 의 지원 없이, hMSC가 표적 조직에 도달하고 원하는 위치에서 기능하는 효율은 낮다4. 병변을 고수하기 위해 hMSC를 유치하기 위해 다양한 엔지니어링 스캐폴드가 활용되었지만, 긴 뼈 의 중간에 있는 성장판 골절과 같은 일부 부위는 기존의 사전 제작 된 비계로 쉽게 접근 할 수 없으며 불규칙한 모양의 부상 부위에 완벽하게 맞지 않을 수 있습니다.
여기서, 우리는 그 자리에서 스스로 조립하고 표적 영역에 도달하기 어려운 주입할 수 있는 생체 모방 나노 물질을 개발했습니다. 주사용 바이오 스캐폴드 NM은 야누스 염기 나노튜브(JBNT)와 섬유네틴(FN)으로 구성된다. 또한 로제트 나노 튜브 (RNTs)로 알려진 JBNTs는 DNA 기본 쌍, 특히 티민과 아데닌, 여기에5,6,7에서파생됩니다. 도 1에서볼 수 있듯이, 나노튜브는 유래 된 DNA 염기의 6 분자가 수소 결합을 통해 자가 조립하여 비행기6을형성할 때 형성된다. 6개의 분자는 그 때 길이200-300 μm까지 할 수 있는 강한 pi-stacking 상호 작용7을통해 평면에 서로 적층됩니다. JBNT는 FN이 그들과 반응할 수 있도록 형태학적으로 콜라겐 섬유를 모방하도록 설계되었습니다.
FN은 세포외 매트릭스(ECM)9에서발견될 수 있는 고분자 성 접착제 당단백질이다. 이들은 ECM의 다른 성분, 특히 콜라겐10의다른 성분에 줄기 세포의 부착을 중재할 수 있다. 우리는 JBNT를 형태학적으로 모방하여 FN이 비동적 결합을 통해 몇 초 안에 NM을 형성할 수 있도록 설계했습니다. 따라서, NM은 기존의 제조된 스캐폴드에 의해 접근할 수 없었던 뼈 골절 부위에 주입되는 유망한 바이오 스캐폴드이다. 여기서, 주 사용 NM은 시험관 내에서 hMSC 앵커리지를 향상시키는 우수한 능력을 제시, 조직 재생을위한 발판으로 봉사 할 수있는 자신의 잠재력을 전시.
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Protocol
1. JBNT의 합성
참고 : JBNT 단조량은 이전에 출판 된 대로 준비되었다11.
- 화합물 A1의 합성
- 톨루엔 25mL및 N-디메틸포르미드의 2.5mL에서 8.50g의 시아노아세이스틱산과 9.80 g의 에틸카르바메이트를 함유한 용액을 준비한다. 4.90mL의 인산화를 드롭와이즈로 넣습니다. 그런 다음 혼합물을 70 °C로 가열하고 1.5 시간 동안 계속 저어줍니다.
- 반응 혼합물을 실온으로 식히고 얼음 물 100g을 붓습니다. 에틸 아세테이트(3 x 250mL)로 수성 층을 추출하고 100mL의 소금물로 세척합니다. 무수성 나트륨 황산나트륨 위에 유기층을 건조시키고, 진공 상태에서 휘발성을 걸러내고 증발하여 옅은 노란색 고체를 얻습니다.
- 노란 고체내지 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(3% 메탄올/디클로로메탄)를 주체하여 백색 분말로서 화합물 A1의 15.61g을 산출한다.
- 화합물 A2의 합성
- 화합물 A1 3.12 g와 탄산칼륨 2.75 g를 N, N-디메틸포르마미드의 50mL에 섞는다. 실온에서 2시간 동안 저어줍니다.
- 반응 현탁액에 2.6mL의 탄소 이황화를 추가합니다. 4 시간 동안 교반 유지합니다.
- 0°C에서 반응 혼합물에 절대 에탄올을 넣습니다. 노란 침전을 걸러내고 디틸 에테르로 씻습니다. 밤새 진공 상태에서 건조하여 6.18g의 화합물 A2를 옅은 노란색 고체로 산출합니다.
- 화합물 A3의 합성
- 아세토닐릴의 15mL에 메틸 요오드 2.7mL를 추가합니다. 또한, 물/아세토나이트(7:3비율)의 A2~80mL 6.18g을 첨가하여 화합물 A2용액을 별도로 준비한다. 용액을 모두 섞고 실온에서 30분 간 저어줍니다.
- 반응 혼합물을 95°C로 가열하고 3시간 동안 계속 저어줍니다.
- 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 다음 진공 상태에서 휘발성을 증발시보세요.
- 에틸 아세테이트 100mL로 잔류물 3배 추출하고 소금물로 씻어내다. 무수성 나트륨 황산나트륨 위에 유기층을 건조시키고, 진공 하에서 휘발성을 피하여 노란색 고체를 얻습니다.
- 노란색 고체내지 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(30% 에틸 아세테이트/헥산)를 주체하여 A3의 4.52 g를 연황고체로서 산출한다.
- 화합물 A4의 합성
- 에탄올 20mL에 925 μL의 아를라민을 추가하여 아일라민 용액을 준비하십시오. 이 용액을 절대 에탄올 75mL에 3.14 g의 A3를 추가하여 30분 이상 제조한 화합물 A3용액에 드롭와이즈를 추가합니다. 그런 다음 반응 혼합물을 16 시간 동안 역류로 가열합니다.
- 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 휘발성을 증발하여 노란색 고체를 줍니다.
- 노란색 고체내지 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(50% 에틸 아세테이트/헥산~메탄올/디클로로메탄)를 주체하여 백색 결정으로서 1.80g의 화합물 A4를 산출한다.
- 화합물 A5의 합성
- 2.05 g의 과니디늄 염산염과 7.8 mL의 나트륨 에탄올 (에탄올21 wt%)을 절대 에탄올 14mL에 넣습니다. 혼합물을 45°C로 15분 동안 가열합니다.
- 불용성 물질을 걸러내고 40mL 절대 에탄올에 A4 2.70 g을 첨가하여 제조한 화합물 A4의 용액에 직접 여과물을 첨가한다. 반응 혼합물을 16시간 동안 역류에 가열합니다.
- 오프 화이트 고체로서 화합물 A5의 2.65 g를 얻기 위해 밖으로 침전물을 필터링합니다.
- 화합물 A6의 합성
- 24.9mL의 트리에틸라민을 1분 이상 테트라하이드로푸란 120mL에 화합물 A5 2.11g과 4-디메틸아미노피리딘 1.10g을 첨가하여 얻은 슬러리 혼합물에 천천히 첨가한다. 실온에서 2분 간 저어줍니다.
- 디테르트부틸 디카보네이트 20.7mL을 반응 혼합물에 드롭와이즈로 넣고 40시간 동안 실온에서 계속 저어줍니다.
- 20mL의 물을 추가하여 반응을 담금질합니다. 진공 상태에서 휘발성을 증발시다.
- 에틸 아세테이트 500mL로 적점 잔류물을 추출합니다. 이어서 250mL의 물, 구연산 75mL, 200mL의 물, 포화나트륨 200mL, 소금물 200mL로 세척한다. 무수성 나트륨 황산나트륨 위로 유기층을 건조시키고, 진공 상태에서 휘발성을 걸러내고 증발하여 빨간색/주황색 고체를 줍니다.
- 고체내지 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(0-20% 에틸 아세테이트/헥산)를 주체하여 백색 폼으로서 화합물 A6 3.87g을 산출한다.
- 화합물 A7의 합성
- N-메틸모포린 N-Oxide(물 50w.%, 1.64mL)를 아세톤/물(8:1, 58.5mL)에 화합물 A6(2.93g)의 용액에 넣고 실온에서 5분 간 저어줍니다.
- 3분 동안 혼합물에 오스뮴 테트라옥사이드(4% 수성 용액)를 드롭방향으로 넣고 실온에서 24시간 동안 계속 저어줍니다.
- 용액이 무색으로 변할 때까지 1.0M 수성 나트륨 황산염으로 반응을 담금질합니다. 진공 상태에서 휘발성을 제거하여 물에 백색 슬러리를 생성합니다. 350mL의 디클로로메탄으로 잔류물을 추출한 다음 150mL의 물로 씻어내고 150mL의 소금물로 세척합니다.
- 무수성 나트륨 황산나트륨위에 유기층을 건조시키고, 진공 하에서 휘발성을 증발시키고, 백색 고체로서 2.45g의 화합물 A7을 산출한다.
- 화합물 A8의 합성
- 디클로로메탄/물(6:1, 35mL)의 35mL에 1.36 g의 화합물 A7을 혼합하고 42시간 동안 실온에서 저어줍니다.
- 불용성 물질을 걸러내고 진공 상태에서 여과물을 농축합니다. 디클로로메탄 250mL로 생성된 잔류물을 추출한 다음 100mL의 물과 100mL의 소금물로 세척합니다. 무수성 나트륨 황산나트륨 위에 유기층을 건조시키고, 진공 상태에서 휘발성을 걸러내고 증발하여 원유 제품을 제공합니다.
- 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(5-40% 에틸 아세테이트/헥산, 5% 메탄올/디클로로메탄)를 통해 1.08g의 화합물 A8을 산출한다.
- 화합물 A9의 합성
- 1,2-디클로로에탄의 15mL에서 830 mg의 화합물 A8용액을 준비한다. 6-벤질옥시카보라미노-2-L-아미노 헥사노산 트리메틸실릴 에틸 에스테르(649.5 mg)와 N,N-이소프로틸레틸레틸라민(591 μL)을 1,2-디클로로탄 24mL로 첨가하고 15분 이상 15분 동안 15분 이상 저어줍니다.
- 360.3 mg의 트리아세톡시보라이드 나트륨을 용액에 넣고 실온에서 24시간 동안 계속 저어줍니다.
- 반응 혼합물을 6mL의 물로 담금질합니다. 디클로로메탄 200mL로 반응 혼합물 3x를 추출하고 물 속 100mL의 구연산 200mL, 200mL의 물, 포화 나트륨 중탄산염 200mL, 염수 200mL로 세척한다. 무수성 나트륨 황산나트륨 위에 유기층을 건조시키고, 진공 상태에서 휘발성을 걸러내고 증발하여 원유 제품을 얻습니다.
- 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(5-30% 에틸 아세테이트/헥산)에 원유 제품을 적용하여 885 mg 화합물 A9를 산출합니다.
- JBNT 단조량합성
- 화합물 A9(0.54g)을 94% 트리플루오로아세트산/티오아니솔 용액의 10mL에 0.54g을 녹이고 실온에서 72시간 동안 저어줍니다.
- 다이틸 에테르(80mL)를 반응 혼합물에 넣고 침전물원심을 줄입니다. 초월제를 함유한 맑은 트리플루오로아세트산을 붓고 168.6 mg의 원유 JBNT 단조량을 산출하기 위해 다이틸 에테르와 메탄올로 백색 침전물을 씻어낸다(보충파일 1).
- 역상 컬럼을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 원유 JBNT 단조량을 정화합니다. 격리 프로그램은 다음과 같습니다: 용매 A: 100% 물; 용매 B: 100% 아세토닐트릴; 용매 C: pH=1 HCl 용액; 유량: 3mL/min(표 1참조).
- 약 7.2 분에 가장 큰 피크를 수집합니다.
2. JBNT/FN용 제작
- 1 mg/mL JBNT 수성 용액 의 80 μL을 1 mg/mL FN 수성 용액 및 파이펫의 40 μL에 여러 번 추가합니다.
- 약 10s에 대한 파이펫팅 후 흰색 고체 서스펜션의 존재를 확인합니다.
참고: NM(보충파일 2)의자체 조립 프로세스를 캡처하기 위해 비디오가 촬영되었습니다.
3. lyophilized 표본의 관찰
참고: 이 단계는 JBNT및 FN으로 만든 NM의 비계 구조를 보여주기 위해 수행됩니다.
- Lyophilized 물질 관찰을 위한 FN, JBNT 및 FN/JBNT NM 솔루션을 준비합니다. FN의 100 μg/mL의 10 μL을 40 μL의 증류수로 희석하여 FN의 20 μg/mL 용액을 만듭니다.
- DI 수의 45 μL에 1 mg/mL JBNT의 5 μL을 희석하여 JBNT의 100 mg/mL 용액을 준비하십시오.
- 100 μg/mL FN의 10 μL과 5 μL의 1mg/mL을 DI 수의 35 μL에 JBNT의 1 mg/mL의 5μL을 혼합하여 NM 용액을 형성합니다.
- FN, JBNT 솔루션 및 NM 솔루션으로 96웰의 투명한 둥근 하단 마이크로 플레이트의 3개의 웰을 각각 코팅합니다. 각 웰은 용액의 50 μL을 받습니다.
- 아래에 설명된 바와 같이, NM의 비계 구조를 시각화하기 위해, lyophilization을 수행한다.
- 하룻밤 -80 °C에서 접시를 동결.
- lyophilized 기기와 진공 펌프를 켭니다.
- 냉각 버튼을 눌러 시스템의 온도를 -50 °C로 줄입니다.
- 냉동 판을 lyophilized 악기에 넣고 악기의 모든 구멍을 닫습니다.
- 시작 버튼을 클릭하여 시스템 압력을 0.9 mbar로 줄입니다.
- 4시간 후, 대격자 버튼을 누르고 밸브를 열어 기압에 대한 시스템 압력을 증가시다.
- lyophilized 악기에서 접시를 꺼내.
- 현미경을 사용하여 FN, JBNT 및 생성된 자체 조립 NM을 관찰합니다. 재료에 대한 카메라와 함께 여러 사진을 촬영합니다.
4. 흡수 스펙트럼 측정
참고: FN 및 JBNT에 대한 스펙트럼 변경을 사용하여 자체 조립된 JBNT/FN NM12를제시합니다.
- 100 μg/mL FN의 30 μL을 증류수 15μL과 5 μL의 1 mg/mL JBNT와 혼합하여 JBNT/FN NM 솔루션을 준비합니다. 백색 고체 서스펜션은 용액을 여러 번 피펫팅한 후 볼 수 있습니다.
참고: 용액의 JBNT와 FN의 최종 농도는 각각 100 μg/mL 및 60 μg/mL입니다. NM 솔루션에 사용된 것과 동일한 농도의 JBNT 및 FN 솔루션도 제어 솔루션으로 제조되었다. - JBNT 제어 솔루션을 준비하기 위해 증류수 45μL로 JBNT 1 mg/mL의 5 μL을 희석합니다.
- FN 제어 솔루션을 준비하기 위해 증류수 20μL로 100 μg/mL FN의 30 μL을 희석시하십시오.
- NM의 조립을 특성화하기 위해 분광계(재료 표 참조)를 사용하여 FN, JBNT 및 JBNT/FN NM 솔루션의UV-vis 흡수 분광 분광을 측정합니다.
- UV-Vis 버튼을 클릭합니다. 분광계의 시험 표면을 청소하고 증류수 2 μL을 떨어 뜨립니다. 190-850 nm에서 빈 것으로 측정합니다.
- 분광계의 테스트 표면을 청소하고 FN 용액의 2 μL을 떨어 뜨립니다. FN 용액의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 190nm에서 850nm로 측정합니다.
- 분광계의 테스트 표면을 청소하고 JBNT 용액의 2 μL을 떨어 뜨립니다. JBNT 용액의 흡수 스펙트럼을 190nm에서 850nm로 측정합니다.
- 분광계의 테스트 표면을 청소하고 JBNT /FN NM 용액의 2 μL을 떨어 뜨립니다. 190nm에서 850nm까지 JBNT/FN NM 용액의 흡수 스펙트럼을 측정합니다.
5. 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)에 대한 JBNT / FN NM의 준비
- 기본 플라즈마 클리너로 음수 염색하기 전에 여러 그리드를 청소하십시오(재료 표참조).
- 두 개의 서로 다른 프로세스에 따라 시편에 대한 음의 염색을 수행합니다.
- JBNT의 1 mg/mL의 3 μL과 분리된 그리드에 JBNT/FN NM 용액 3μL을 떨어뜨리고 2분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 0.5 % uranyl 아세테이트 (UA) 용액의 100 μL로 각 그리드를 헹구는 다. 필터 용지로 과도한 용액을 배출하고 그리드를 건조시다.
- JBNT/FN NM 용액 9μL을 2.0% UA 용액3μL과 여러 번 섞는다. 그리드의 혼합 솔루션을 파이펫하고 2 분 동안 그리드에 보관하십시오. 필터 용지를 사용하여 그리드에서 혼합 된 솔루션을 제거하고 실온에서 그리드를 건조시다.
- 마지막으로, JBNT, JBNT/FN NM에 대한 표본을 5.2.1단계로 염색하고, JBNT/FN NM에 대한 표본을 TEM으로 5.2.2단계로 염색했다.
6. 체외 생물학적 기능 분석
- 각각 8웰 챔버 슬라이드의 한 웰에 음수 컨트롤 (NC, PBS), JBNT, FN 및 JBNT / FN NM 솔루션의 200 μL을 추가합니다.
- 8웰 챔버 커버글래스를 구균 밑의 소재를 코팅하기 위해 리오필화 된 악기로 얼립니다. 동결 건조 프로토콜은 3.5 단계와 동일합니다.
- 그런 다음 10,000 개의 세포 / 우물 hMSC (Passage 3)를 우물에 넣고 5 % CO2로37 °C에서 24 시간 동안 배양하십시오.
- 인큐베이션 후, 우물에서 세포 배양 배지를 피펫하고 1x PBS 용액으로 배양을 헹구는다.
- 고정 용액의 100 μL을 셀과 잘 추가하고 5 분 동안 둡니다. 1x PBS로 부드럽게 헹구십시오.
- 1% 트리톤-X 100 ~ 0.1%를 희석합니다. 세포와 잘 각 웰에 0.1 % 트리톤 X 100의 100 μL을 추가하고 10 분 동안 둡니다. 1x PBS로 부드럽게 헹구십시오.
- 로다민 팔로이드를 1.65 μM으로 희석. 세포와 잘 각 잘 에 로다민 Phalloidin의 100 μL을 추가하고 30 분 동안 실온에서 빛으로부터 유지 챔버 커버 글래스를 배양. 1x PBS로 부드럽게 헹구십시오.
- 형광 현미경으로 세포 이미지를 캡처합니다.
- 각 그룹에 대한 형광 이미지의 세포 수를 계산합니다. 각 웰에 있는 세 개의 임의 영역을 평균화하여 셀 접착 밀도를 계산합니다.
- 모든 데이터를 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시합니다. 한 꼬리 t-테스트를 사용하여 통계 분석을 수행하고, 그 다음으로 통계적으로 유의한 것으로 간주되는 p&05를 가진 분산(ANOVA)의 분석이 뒤따릅니다.
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Representative Results
우리의 연구는 JBNT와 FN의 NM의 형성이 빠르다는 것을 것을을 발견했습니다, 이는 10 초에 일어났습니다. 도 2에도시된 바와 같이, JBNT 용액이 FN 용액과 혼합되고 여러 번 배관되었을 때 백색 플록을 얻었다. NM의 형성 과정은 완전히 생물모방이다. 외부 자극이 필요하지 않습니다. 제조 과정은13을교차연결하기 위한 자외선 또는 화학 개시자를 기반으로 하는 일부 신흥 생체 재료보다 훨씬 쉽습니다.
FN, JBNT, NM(그림3)의카메라 이미지를 캡처하고 분석했습니다. FN 군의 경우 짧은 백색 반점을 제외하고는 긴 섬유가 관찰되지 않았다. 짧은 클러스터는 FN으로 구성된 단백질 응집체였으며, 이는 JBNT(그림3A)없이는FN만으로는 스캐폴드 구조를 형성할 수 없음을 나타낸다. 도 3B에도시된 바와 같이, 길고 얇은 섬유는 JBNT의 존재를 나타낸다. NM의 흰색 가닥의 폭은 JBNT에 비해 넓으며, JBNT와 FN이 NM을 형성하는 서로 교차한다는 것을 나타냅니다. NM 섬유는 길이가 몇 센티미터까지 자랄 수있습니다(그림 3C).
우리는 JBNT와 FN 사이의 어셈블리를 나타내는 UV-Vis 스펙트럼을 획득했습니다. 도 4에도시된 바와 같이, JBNT는 각각 220nm와 280nm에서 2개의 흡수 피크를 나타낸다. JBNT와 비교하여 JBNT/FN NM은 JBNT에서 나온 값이 현저히 감소하는 두 개의 흡수 피크를 가지고 있지만 그 사이에 비공유 자조립 JBNT와 FN의 영향을 받았습니다.
TEM은 JBNT 및 NM의 형태를 특성화하는 데 사용되었습니다. 그림 5A에표시된 바와 같이 JBNT는 균일한 직경의 날씬한 튜브입니다. 중립적인 조건에서 JBNT는 FN이 음수 충전되는 동안 양적으로 충전됩니다. 혼혈시, 그들은 전하 상호 작용을 통해 긴 자궁 근종 NM을 형성(도 5B). pH가 FN(5.5-6.0의 pI)의 등온점보다 낮을 때, NM 번들은 양전하 FN으로 인해 자가 방출을 제시한다. 도 5C에도시된 바와 같이, 낮은 pH(4.0)를 가진 용액으로 보존될 때, NM은 해체되었고, 많은 FN이 NM에서 방출되었다. 나노튜브와 함께 배포된 FN은 또한 NM이 JBNT와 FN10에의해 조작되었다는 강력한 증거이다.
JBNT/FN NM이 세포 접착에 미치는 영향을 탐구했습니다. 도 6에도시된 바와 같이, NM 그룹의 세포 접착 밀도는 음의 대조군에 비해 유의한 차이(p-value &05) 값을 나타냈다. 차이점은 NM이 형태학적으로 ECM을 모방하도록 설계되었기 때문일 수 있으며, 이는 세포접착(14)에대한 스캐폴드를 제공한다. ECM은섬유넥틴(15)과같은 콜라겐 및 세포 접착제 당단백질로 구성되었다. 콜라겐은 hMSC16의더 높은 접착 및 증식을 촉진할 수 있는 기능을 제시하고 있다. 또한, 섬유넥틴은 부상당한 부위의 hMSC 접착력을 향상시키는 것으로나타났으며, 15. 형광 화상 진찰은 또한 NM 군의 hMSCs 준수가 음성 대조군에 비해 현저하게 증가한다는 것을 입증하였다(도7)15,17.
그림 1: 리신 사이드 체인을 가진 JBNT의 계층적 자체 조립의 회로도 그림.
이 그림은 이전 간행물12의허가하에 재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: NM의 자체 조립 프로세스에 대한 데모입니다.
(A)FN 솔루션. (B)JBNTs가 FN과 혼합. 이 그림은 이전 간행물12의허가하에 재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 브라이트필드 사진.
JBNT와FN에 의해형성된 JBNT와(C)NM의 브라이트필드 사진. 각 영역의 직경은 2cm입니다. 이 그림은 이전 간행물12의허가하에 재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: FN, JBNT 및 JBNT/FN NM의 흡수 스펙트럼.
이 그림은 이전 간행물12에서다시 인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: TEM 이미지입니다.
(A)JBNTS(B)JBNT/FN NM,(C)JBNT/FN NM 의 TEM 이미지가 출시되었습니다. 이 그림은 이전 간행물12의허가하에 재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 세포 접착의 통계 분석.
세포 접착 밀도는 본 실험에서 기록되었다. *p&0.01 은 음수 컨트롤에 비해. **p&05 는 JBNT에만 비해. N=3. 이 그림은 이전 간행물12의허가하에 재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 형광 이미지.
(A)hMSC 및(B)HMSC의 형광 이미지는 JBNT와 함께 배양된 hMSC(C) HMSCFN.(D)의 HMSC를 JBNT/FN NM으로 배양하였다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림은 이전 간행물12의허가하에 재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시간 | A% | B% | C% |
| 0.00분 | 98 | 0 | 2 |
| 15.00분 | 68 | 30 | 2 |
| 25.00분 | 8 | 90 | 2 |
| 26.00분 | 0 | 100 | 0 |
표 1: 그라데이션 용출 시간.
보충 파일 1: JBNT 단조량의 합성을 위한 계획. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: FN/JBNT NM의 자체 조립을 위한 비디오입니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서는 DNA에서 영감을 얻은 JBNT와 FN으로 형성된 자체 조립 된 생체 Mimetic NM을 개발했습니다. JBNT 용액을 준비할 때, PBS가 조립을 억제하는 JBNT의 응집을 유발하기 때문에 JBNT 리오필화 분말은 PBS 대신 물에 용해되어야 합니다. 또한, NM은 PBS의 염이 NM 섬유와 번들되기 때문에 NM의 나노 피브릴 구조를 관찰하려는 경우에도 물로 조립되어야 하며, 이는 이미지의 해상도를 크게 감소시킬 수 있다.
NM은 hMSCs 접착 및 분화를 용이하게하는 데 사용 된 조직 재생 비계를 제조하기 위해 많은 노력이 이루어졌지만 새로운 조직 공학 발판으로 봉사 할 수있는 큰 잠재력을 보여주었습니다. 그러나, 이러한 물질의 대부분은 3D 프린팅 스캐폴드18,19와같은 특정 형상으로 미리 만들어집니다. 따라서 관절 깊숙이 있는 부상당한 부위에 이식하기가 쉽지 않습니다. 그러나, 여기서 NM 용액은 액체로 주입된 다음 세포 접착을 위한 발판역할을 할 수 있다.
한 가지 제한사항은 NM이 기계적으로 강하지 않다는 것입니다. 폴리머와 달리 비동적 상호 작용의 자체 조립을 통해 제작되므로 기계적 적재 또는 장력을 많이 견딜 수 없습니다. 한편, 비일관성 구조는 또한 생물학적 기능에 적합한 매우 양호한 생분해성 및 생체 적합성을 제시한다8,20,21.
주사용 NM은 신체의 뼈 골절 치유를 향상시키기 위해 MSC 호밍을위한 표적 위치와 발판을 제공하는 큰 잠재력을 보여주었습니다. 그러나, 부상당한 부위에 주입될 때, 비응성 NM은 오랫동안 제자리에 머무르지 않을 수 있으며, 이는 치료 효과를 감소시킬 수 있다. 앞으로는 다른 재료(예: 하이드로겔)를 통합하거나 NM 구조를 번갈아 가며 NM 스캐폴드의 특성을 더욱 최적화할 것입니다.
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Disclosures
유펑 첸 박사는 나노드 테라피의 공동 창립자입니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (보조금 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF 경력 상 (1653702) 및 코네티컷 대학에 의해 재정적으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
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