Summary
Целью этого протокола является показать сборку биомиметического наноматрикса (NM) с нанотрубками Janus base (JBNTs) и фибронектином (FN). При совместной культуре с человеческими мезенхимальными стволовыми клетками (HMSCs), NMs обладают отличной биоактивностью в поощрении адгезии HMSCs.
Abstract
Биомиметический НМ был разработан в качестве ткани инженерии биологических эшафот, который может повысить якорь стволовых клеток. Биомиметический НМ образуется из JBNTs и FN через самосвечение в aqueous растворе. JBNTs измеряют 200-300 мкм в длину с внутренними гидрофобными полыми каналами и внешними гидрофильные поверхности. JBNTs положительно взимается и FNs отрицательно взимается. Таким образом, при введении в нейтральный aqueous решение, они связаны друг с другом через noncovalent связи для формирования NM расслоения. Процесс самос сборки завершается в течение нескольких секунд без каких-либо химических инициаторов, источника тепла или УФ-излучения. Когда рН раствора NM ниже, чем изоэлектрический пункт FNs (pI 5.5-6.0), NM пучки будут самостоятельно выпускать из-за наличия положительно заряженных FN.
NM, как известно, имитирует внеклеточной матрицы (ECM) морфологически и, следовательно, может быть использован в качестве инъекционных эшафот, который обеспечивает отличную платформу для повышения hMSC адгезии. Анализ плотности клеток и эксперименты по визуализации флуоресценции показали, что НМ значительно увеличили крепление ГМС по сравнению с отрицательным контролем.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки человека (ГМСЦ) показали потенциал для самооб обновления и самооценки по различным мезенхимальным линиям, что помогает в регенерации и поддержаниитканей 1. Основываясь на потенциале дифференциации, HMSCs рассматриваются в качестве кандидатов для мезенхимальных травм тканей и гематопоэтического расстройстватерапии 2. HMSCs показали способность содействовать заживлению ран путем увеличения восстановления тканей, ангиогенез, и снижение воспаления3. Однако, без биохимической помощи или биоматериалов, эффективность для HMSCs для достижения целевой ткани и функции в нужном месте является низким4. Хотя различные инженерии леса были использованы для привлечения HMSCs придерживаться на поражения, некоторые сайты, такие как рост перелом пластины, в середине длинной кости, не легко доступны по обычным сборных лесов, которые не могут идеально вписываться в неправильной формы раненых сайта.
Здесь мы разработали биомиметический наноматериал, который может самостоятельно собираться на месте и вводиться в труднодоступную целевую область. Инъекционные био-эшафот NM состоит из Janus базовых нанотрубок (JBNTs) и фибронектин (FN). JBNTs, также известный как розетки нанотрубки (RNTs), являются производными от ДНК базовых пар, в частности, тимин иаденин, здесь 5,6,7. Как видно на рисунке 1, нанотрубки образуются, когда шесть молекул производных пар базы ДНК самосберуются через водородные связи, чтобы сформироватьплоскость 6. Шесть молекул затем укладываются друг на друга в плоскости через сильное взаимодействие pi-укладки7, который может быть до 200-300 мкм в длину. JBNTs предназначены для морфологически имитировать коллагеновых волокон, так что FN будет реагировать с ними.
FN является высоким молекулярным весом клей гликопротеин, который можно найти во внеклеточной матрицы (ECM)9. Они могут одолеть присоединение стволовых клеток к другим компонентам ECM, особенно коллагена10. Мы разработали JBNTs для морфологически имитировать коллагеновые волокна, чтобы FN может реагировать с ними, чтобы сформировать НМ в течение нескольких секунд с помощью нековалентной связи. Таким образом, NM является перспективным био-эшафот, который будет введен в кости перелом сайта, которые не могут быть доступны по условно изготовленные леса. Здесь, инъекционные НМ представляет собой отличную способность для повышения hMSC якорь в пробирке, демонстрировали свой потенциал, чтобы служить в качестве леса для регенерации тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез JBNTs
ПРИМЕЧАНИЕ: JBNT мономер был подготовлен, как опубликовано ранее11.
- Синтез соединения А1
- Приготовьте раствор, содержащий 8,50 г 2-цианоацетической кислоты и 9,80 г этилкарбамата в 25 мл толуола и 2,5 мл N, N-диметилформамида. Добавьте 4,90 мл фосфорилхлорида. Затем нагрейте смесь до 70 градусов по Цельсию и продолжайте помешивать в течение 1,5 ч.
- Охладить реакционной смеси до комнатной температуры и влить 100 г ледяной воды. Извлекить акевый слой с этил ацетатом (3 х 250 мл) и промыть 100 мл рассола. Высушите органический слой над сульфатом натрия, прокрикните и испарите летучие вещества под вакуумом, чтобы получить бледно-желтый твердый.
- Субъект желтый твердый кремнезем гель флэш-колонки хроматографии (3% метанола / дихлорметана), чтобы дать 15,61 г соединения А1 в качестве белого порошка.
- Синтез соединения А2
- Смешайте 3,12 г соединения А1 и 2,75 г карбоната калия в 50 мл N, N-диметилформамида. Перемешать при комнатной температуре в течение 2 ч.
- Добавьте 2,6 мл дисульфида углерода в реакционной подвеске. Продолжайте помешивать в течение 4 ч.
- Добавьте абсолютный этанол в реакционной смеси при 0 градусов по Цельсию. Фильтр желтый осадок и мыть с диэтил эфира. Высушите под вакуумом на ночь, чтобы дать 6,18 г соединения А2 в качестве бледно-желтого твердого тела.
- Синтез соединения А3
- Добавьте 2,7 мл метилового йодида в 15 мл ацетонитрила. Также отдельно подготовьте раствор соединения А2, добавив 6,18 г А2 до 80 мл воды/ацетонитрила (7:3 соотношения). Смешайте растворы и перемешайте при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Нагрейте реакционной смеси до 95 градусов по Цельсию и продолжайте помешивать в течение 3 ч.
- Охладить реакционной смеси до комнатной температуры, а затем испарять летучих веществ в вакууме.
- Извлекить остатки 3x с 100 мл этилового ацетата и промыть рассолом. Высушите органический слой над сульфатом натрия, прокрикните и испарите летучие вещества под вакуумом, чтобы получить желтую твердую.
- Субъект желтый твердый кремнезем гель флэш-колонки хроматографии (30% этилового ацетата / гексан), чтобы дать 4,52 г соединения A3 в качестве светло-желтого твердого тела.
- Синтез соединения А4
- Приготовьте раствор стиламина, добавив 925 л ариламина в 20 мл этанола. Добавьте этот раствор к раствору соединения A3, приготовленное путем добавления 3,14 г А3 в 75 мл абсолютного этанола, более 30 мин. Затем нагрейте реакционной смеси на рефлюкс в течение 16 ч.
- Охладить реакционной смеси до комнатной температуры и испарять летучих веществ, чтобы дать желтый твердых.
- Субъект желтого твердого кремнезема гель флэш-колонки хроматографии (50% этилового ацетата / гексанов до 2% метанола / дихлорметана), чтобы дать 1,80 г соединения А4 в качестве белого кристалла.
- Синтез соединения А5
- Добавьте 2,05 г гидрохлорида гуанидиния и 7,8 мл этиксида натрия (21 вт% этанола) в 14 мл абсолютного этанола. Нагрейте смесь до 45 градусов по Цельсию в течение 15 мин.
- Отфильтруйте нерастворимый материал и добавьте фильтрат непосредственно в раствор соединения А4, приготовленного путем добавления 2,70 г А4 в абсолютный этанол 40 мл. Нагрейте реакционной смеси на рефлюкс в течение 16 ч.
- Фильтр осадок, чтобы получить 2,65 г соединения A5 в качестве небелого твердого тела.
- Синтез соединения А6
- Добавьте 24,9 мл триэтиламина медленно в смесь суспензии, полученную путем добавления 2,11 г соединения A5 и 1,10 г 4-диметиламинопиридин в 120 мл тетрагидрофурана в течение 1 мин. Перемешать при комнатной температуре в течение 2 мин.
- Добавьте 20,7 мл ди-терт-бутила дикарбоната в реакционной смеси и продолжайте помешивать при комнатной температуре в течение 40 ч.
- Добавьте 20 мл воды, чтобы утолить реакцию. Испарить летучих веществ в вакууме.
- Извлекайте красный вязкий остаток с 500 мл этилового ацетата. Затем промойте его 250 мл воды, 75 мл 10% лимонной кислоты, 2x с 200 мл воды, 200 мл насыщенного бикарбоната натрия и 200 мл рассола. Высушите органический слой над сульфатом натрия, прокрикните и испарите летучие вещества под вакуумом, чтобы дать красный/оранжевый твердый.
- Субъект твердых кремнезема гель флэш-колонки хроматографии (0-20% этилового ацетата / гексан), чтобы дать 3,87 г соединения A6 в качестве белой пены.
- Синтез соединения A7
- Добавить N-метилморфолин N-оксид (50 wt.% в воде, 1,64 мл) dropwise к раствору соединения A6 (2,93 г) в ацетон / вода (8:1, 58,5 мл) и перемешать при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавить осмий тетраоксид (4% aqueous раствор) dropwise к смеси в течение 3 мин и держать перемешивания при комнатной температуре в течение 24 ч.
- Утолить реакцию с 1,0 М aqueous сульфита натрия, пока раствор оказывается бесцветным. Удалите летучие веществ под вакуумом, чтобы привести к белой суспензии в воде. Извлекить остатки с 350 мл дихлорметана, а затем промыть 150 мл воды с последующим мытьем с 150 мл рассола.
- Высушите органический слой над сульфатом натрия, прокрикните и испарите летучие вещества под вакуумом, чтобы дать 2,45 г соединения A7 в качестве белого твердого тела.
- Синтез соединения A8
- Добавьте 760 г натрия в смесь 1,36 г соединения А7 в 35 мл дихлорметана/воды (6:1, 35 мл) и перемешайте при комнатной температуре 42 ч.
- Отфильтруй нерастворимый материал и сконцентрируй фильтрат в вакууме. Извлекить полученный остаток с 250 мл дихлорметана, а затем промыть 100 мл воды и 100 мл рассола. Высушите органический слой над сульфатом натрия, прокрикните и испарите летучие вещества под вакуумом, чтобы дать сырой продукт.
- Субъект сырой продукт кремнезема гель флэш-колонки хроматографии (5-40% этилового ацетата / гексанов, а затем 5% метанола / дихлорметана), чтобы дать 1,08 г соединения A8.
- Синтез соединения A9
- Приготовьте раствор из 830 мг соединения A8 в 15 мл 1,2-дихлороэтана. Добавить раствор dropwise в смесь 6-бензилоксикарбониламино-2-L-амино-гексаноиновой кислоты триметилсилил этилэстер (649,5 мг) и N,N-diisopropylethylamine (591 йл) в 24 мл 1,2-дихлороэтана в течение 3 мин и перемешать при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Добавьте 360,3 мг триацетоксиборогидрида натрия в раствор и продолжайте помешивать при комнатной температуре в течение 24 ч.
- Утолить реакционной смеси с 6 мл воды. Извлекайте реакционной смеси 3x с 200 мл дихлорметана и мыть с 200 мл 10% лимонной кислоты в воде, 2x с 200 мл воды, 200 мл насыщенного бикарбоната натрия, и 200 мл рассола в этом порядке. Высушите органический слой над сульфатом натрия, прокрикните и испарите летучие вещества под вакуумом для получения сырого продукта.
- Подай сырой продукт кремнезема гель флэш-колонки хроматографии (5-30% этилового ацетата / гексана), чтобы дать 885 мг соединения A9.
- Синтез мономера JBNT
- Растворите 0,54 г соединения A9 (0,54 г) в 10 мл 94% трифтороакетической кислоты/тиоанисола раствора и перемешайте при комнатной температуре 72 ч.
- Добавьте диэтил эфир (80 мл) в реакционной смеси и центрифуга осадка вниз. Налейте четкую трифтороацетную кислоту, содержащую супернатант, и вымойте белый осадок диэтил эфиром и метанолом, чтобы дать 168,6 мг сырого мономера JBNT(дополнительный файл 1).
- Очистить сырой мономер JBNT высокой производительностью жидкой хроматографии (HPLC) с обратной фазовой колонкой. Программа изоляции приведена ниже: Solvent A: 100% вода; растворитель B: 100% ацетонитрил; растворитель C: раствор воды рН-1 HCl; скорость потока: 3 мл/мин (см. таблицу 1).
- Соберите самый большой пик примерно в 7,2 мин.
2. Изготовление для JBNT/FN
- Добавьте 80 л раствора 1 мг/мл JBNT в 40 л раствора FN и пипетки несколько раз.
- Проверьте наличие белой твердой подвески после пипетки около 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Видео было снято, чтобы захватить процесс самос сборки NM(Дополнительный файл 2).
3. Наблюдение за лиофилизированными образцами
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется, чтобы показать эшафот структуры НМ из JBNTs и FN.
- Подготовка решений FN, JBNT и FN/JBNT NM для наблюдения за лиофилизированными материалами. Разбавить 10 МКЛ из 100 мкг/мл FN с 40 йл дистиллированной воды, чтобы сделать 20 мкг / мл раствор FN.
- Приготовьте раствор JBNTs на 100 мг/мл, разбавляя 5 МКЛ 1 мг/мл JBNTs в 45 МКЛ воды DI.
- Смешайте 10 МКЛ из 100 мкг/мл FN и 5 МКЛ 1 мг/мл JBNTs в 35 МКЛ воды DI для формирования раствора НМ.
- Пальто три скважины 96-ну ясно круглые круглые микроплоцы с FN, JBNT решения и NM решение, соответственно. Каждая колодец получает 50 йл раствора.
- Выполните лиофилизацию, как описано ниже, чтобы визуализировать структуру эшафота NM.
- Заморозить пластину при -80 градусов по Цельсию на ночь.
- Включите лиофилизированный инструмент и вакуумный насос.
- Нажмите кнопку охлаждения, чтобы снизить температуру системы до -50 градусов по Цельсию.
- Положите замороженную пластину в лиофилизированный инструмент и закройте все отверстия инструментов.
- Нажмите кнопку "Пуск", чтобы снизить давление в системе до 0,9 мбара.
- После 4 ч нажмите кнопку аэрата и откройте клапан, чтобы увеличить давление системы до атмосферного давления.
- Вывими тарелку из лиофилизированного инструмента.
- Используйте микроскоп для наблюдения за FN, JBNTs и в результате самостоятельно собранных НМ. Сделай несколько фотографий с камерой для материалов.
4. Измерение спектров абсорбции
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте изменение спектров для FN и JBNTs, чтобы представить самосборные JBNT/FN NM12.
- Смешайте 30 МКЛ из 100 МКГ/мл FN с 15 л дистиллированной воды и 5 л 1 мг/мл JBNTs для подготовки раствора JBNT/FN NM. Белая твердая подвеска можно увидеть после трубы раствора несколько раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации JBNTs и FN в растворе 100 мкг/мл и 60 мкг/мл, соответственно. Решения JBNTs и FN в той же концентрации, что и решения NM, также были подготовлены в качестве контрольных решений. - Разбавить 5 л 1 мг/мл JBNTs с 45 йл дистиллированной воды для подготовки раствора управления JBNT.
- Разбавить 30 МКЛ из 100 мкг/мл FN с 20 йл дистиллированной воды для подготовки FN контрольный раствор.
- Измерьте уф-виз абсорбционные спектры решений FN, JBNT и JBNT/FN NM с помощью спектрофотометра (см. таблицу материалов),чтобы охарактеризовать сборку NM.
- Нажмите кнопку UV-Vis. Очистите испытательную поверхность спектрофотометра и опустите на него 2 мл дистиллированной воды. Измерьте его как пустой от 190-850 nm.
- Очистите испытательную поверхность спектрофотометра и опустите на него 2 МКЛ раствора FN. Измерьте спектр поглощения UV-Vis раствора FN от 190 нм до 850 нм.
- Очистите испытательную поверхность спектрофотометра и опустите на него 2 мл раствора JBNT. Измерьте спектры поглощения раствора JBNT от 190 нм до 850 нм.
- Очистите испытательную поверхность спектрофотометра и опустите на него 2 МКЛ раствора JBNT/FN NM. Измерьте спектр поглощения раствора JBNT/FN NM со 190 нм до 850 нм.
5. Подготовка JBNT/FN NM к передаче электронной микроскопии (TEM)
- Очистите несколько сеток перед отрицательным окрашивание с помощью основного очистителя плазмы (см. таблицу материалов).
- Выполните отрицательное окрашивание для образцов после двух различных процессов.
- Падение 3 л 1 мг/мл aqueous раствора JBNTs и 3 л раствора JBNT/FN NM на разделенных сетках и оставьте его на 2 мин. Затем промойте каждую сетку раствором уранил ацетата (UA) 100 МКЛ 0,5%. Слейте излишки раствора с фильтровальной бумагой и высушите сетки.
- Смешайте 9 МКЛ раствора JBNT/FN NM с 3 йл раствора 2,0% UA и пипетка его несколько раз. Pipette смешанный раствор на сетках и держать его на сетках в течение 2 минут. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы удалить смешанный раствор из сетки и высушить сетки при комнатной температуре.
- Наконец, характеризовать образец для JBNTs, JBNT / FN NM окрашенных шаг 5.2.1, и JBNT / FN NM окрашенных шаг 5.2.2 с TEM.
6. Анализ биологических функций in vitro
- Добавьте 200 мкл отрицательных элементов управления (NC, PBS), JBNTs, FN и РЕШЕНИЯ JBNT/FN NM в одну колодец 8-хорошо камерного слайда, соответственно.
- Заморозить сухой 8-хорошо камерный стекло с лиофилизированным инструментом для покрытия материалов на дне скважин. Протокол замораживания сушки такой же, как шаг 3.5.
- Затем добавьте 10 000 ячеек/колодцев HMSCs (Passage 3) в скважины и инкубировать их в течение 24 ч при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
- После инкубации, пипетка из среды клеточной культуры из колодцев и промыть культуру с 1x PBS раствор.
- Добавьте 100 МКЛ фиксаторного раствора в каждую колодец с клетками и оставьте на 5 минут. Промыть клетки осторожно с 1x PBS в два раза.
- Разбавить 1% Triton-X 100 до 0,1%. Добавьте 100 йл 0,1% Triton-X 100 к каждому колодец с клетками и оставьте на 10 мин. Промыть клетки осторожно с 1x PBS в два раза.
- Разбавить ромин фаллоидин до 1,65 МКМ. Добавить 100 МКЛ ромамина фаллоидин к каждому хорошо с клетками и инкубировать камерное стекло, удерживая от света при комнатной температуре в течение 30 мин. Промыть клетки осторожно с 1x PBS в два раза.
- Захват изображений клеток с помощью флуоресцентного микроскопа.
- Подсчитайте числа клеток на флуоресцентных изображениях для каждой группы. Рассчитайте плотность адгезии клеток путем усреднения трех случайных областей в каждой хорошо.
- Представить все данные в качестве среднего ± стандартного отклонения (SD). Выполняйте статистические анализы с использованием однохвостый t-тест, а затем анализ дисперсии (ANOVA) с p'lt;0.05, который считается статистически значимым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наши исследования показали, что образование NM JBNTs и FN быстро, что произошло в 10 секунд. Как показано на рисунке 2, белый floccule был получен, когда решение JBNT был смешан с раствором FN и pipetted несколько раз. Процесс образования НМ полностью биомиметичен. Внешние стимулы не нужны. Процесс изготовления гораздо проще, чем у некоторых новых биоматериалов, который основан на ультрафиолетовом свете или химическом инициаторе перекрестногопересечения 13.
Мы захватили и проанализировали изображения камеры FN, JBNTs, и NM(рисунок 3). Для группы FN, за исключением коротких белых пятен, длинных волокон не наблюдалось. Короткие кластеры были белковые агломерации, состоящие из FN, что указывает на то, что структура леса не может быть сформирована с FN в одиночку без JBNTs (Рисунок 3A). Как показано на рисунке 3B, длинные и тонкие волокна указывают на существование JBNTs. Ширина белых нитей НМ шире по сравнению с JBNTs, что указывает на то, что JBNTs и FN пересекаются друг с другом, образуя NM. Волокно NM может вырасти до нескольких сантиметров в длину(рисунок 3C).
Мы получили спектры UV-Vis, указывающие на сборку между JBNTs и FN. Как показано на рисунке 4, JBNTs экспонатов два пика поглощения на 220 нм и 280 нм, соответственно. По сравнению с JBNTs, JBNT/ FN NM имеет два пика поглощения в одном и том же месте со значительно сниженным значением, которое было от JBNTs, но пострадавших от нековалентных самостоятельно собранных JBNTs и FN между ними.
TEM был использован для характеристики морфологии JBNTs и NM. Как показано на рисунке 5A, JBNTs тонкие трубки с единым диаметром. В нейтральных условиях, JBNTs положительно взимается в то время как FN отрицательно взимается. При смешивании, они образуются длинные миомы НМ через заряд взаимодействия (Рисунок 5B). Когда рН ниже, чем изоэлектрический пункт FN (pI 5,5-6,0), NM расслоения настоящее самоотпустить из-за положительно заряженных FN. Как показано на рисунке 5C, при хвату в растворе с низким рН (4,0), НМ был разобран, и много FN был выпущен из НМ. FN распространяется вместе с нанотрубки также является вейным доказательством того, что NM был изготовлен JBNTs и FN10.
Мы исследовали влияние JBNT/FN NM на клеточное адгезию. Как показано на рисунке 6, плотность адгезии клеток группы NM показала существенную разницу (p-значение lt;0.05) значение по сравнению с отрицательным контролем. Разница может быть потому, что NM предназначены для морфологически имитировать ECM, которые обеспечивают эшафот для клеточной адгезии14. ECM состоял из коллагенов и клеточных клеевых гликопротеинов, таких как фибронектин15. Коллаген был представлен с возможностью содействия более высокой адгезии и распространения HMSCs16. Кроме того, фибронектин было показано для повышения ХМСК адгезии в пострадавшем месте, атакже 15. Флуоресценция изображения также показали, что присоединение HMSCs группы NM значительно увеличилось по сравнению с отрицательнойконтрольной группы (рисунок 7)15,17.
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация иерархической самосвечения JBNTs с лизиновой боковой цепью.
Эта цифра перепечатывается с разрешения предыдущей публикации12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Демонстрация самособорного процесса НМ.
(A)решение FN. (B) JBNTs смешивается с FN. Эта цифра перепечатывается с разрешения предыдущей публикации12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Яркие фотографии.
Брайтфилд фотографии (A) FN (B) JBNTs и (C) NM формируется JBNTs и FN. Каждая область имеет диаметр 2 см. Эта цифра перепечатывается с разрешения предыдущей публикации12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Спектр абсорбции FN, JBNTs и JBNT/FN NM.
Эта цифра перепечатывается из предыдущей публикации12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Изображения TEM.
TEM изображения (A) JBNTs (B) JBNT / FN NM, и (C) выпустила JBNT / FN NM. Эта цифра перепечатывается с разрешения предыдущей публикации12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Статистический анализ клеточной адгезии.
Плотность адгезии клеток была зарегистрирована в этом эксперименте. По сравнению с отрицательным контролем. По сравнению с JBNT в одиночку. No3. Эта цифра перепечатывается с разрешения предыдущей публикации12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Флуоресценция изображений.
Флуоресценцииизображения( A ) hMSCs и (B) hMSC инкубируется с JBNTs. (C) hMSC инкубируется с FN. (D) hMSC инкубируется с JBNT / FN NM. Шкала бар: 100 мкм. Эта цифра перепечатывается с разрешения предыдущей публикации12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Время | A% | B% | C% |
| 0,00 мин. | 98 | 0 | 2 |
| 15.00 мин. | 68 | 30 | 2 |
| 25.00 мин. | 8 | 90 | 2 |
| 26.00 мин. | 0 | 100 | 0 |
Таблица 1: Время градиентного обутовки.
Дополнительный файл 1: Схема синтеза мономера JBNT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительный файл 2: Видео для самостоятельной сборки FN/JBNT NM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы разработали самосборный биомиметический НМ, который был сформирован с помощью ДНК-вдохновил JBNTs и FN. При подготовке решения JBNT лиофилизированный порошок JBNT должен растворяться в воде вместо PBS, потому что PBS вызовет агломерацию JBNTs, которая препятствует их сборке. Кроме того, NM также должны быть собраны в воде, если мы хотим наблюдать нано-фибрилляции структур НМ, потому что соль в PBS будет в комплекте с NM волокон, которые могут значительно уменьшить разрешение изображений.
НМ показал большой потенциал, чтобы служить в качестве нового строительного эшафота тканевой инженерии, хотя было приложить много усилий, чтобы изготовить регенеративные леса тканей, которые были использованы для облегчения адгезии и дифференциации HMSCs. Тем не менее, большинство из этих материалов являются готовыми с определенной формой, такие как 3D печатныхэшафот 18,19. Таким образом, они не легко имплантировать в травмированных участках, которые находятся глубоко в суставе. Тем не менее, nm раствор здесь может быть введен в качестве жидкости, а затем служить в качестве эшафота для клеточной адгезии.
Одним из ограничений является то, что НМ не является механически сильным. В отличие от полимеров, они изготавливаются с помощью самосожжения нековалентных взаимодействий, поэтому они не могут вынести много механической нагрузки или напряжения. С другой стороны, нековалентная структура также представляет собой очень хорошую биоразлагаемость и биосовместимость,подходящую для биологических функций8,20,21.
Инъекционные НМ показал большой потенциал, чтобы обеспечить целевое местоположение и эшафот для MSC самонаведения для повышения заживления перелома кости в организме. Однако при введении в пострадавшее место нековалентный НМ может не оставаться на месте в течение длительного времени, что может уменьшить терапевтический эффект. В будущем мы будем изучать включить другие материалы (например, гидрогели) или чередовать структуры НМ для дальнейшей оптимизации свойств эшафота NM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Д-р Yupeng Чэнь является соучредителем NanoDe терапии, Inc
Acknowledgments
Эта работа финансово поддерживается NIH (Гранты 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Карьера премии (1653702) и Университета Коннектикута.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
