Summary
Målet med detta protokoll är att visa monteringen av en biomimetisk nanomatrix (NM) med Janus basnanorör (JBNTs) och fibronectin (FN). När de samkulturerade med mänskliga mesenkymala stamceller (hMSCs) uppvisar NMs utmärkt bioaktivitet för att uppmuntra hMSCs vidhäftning.
Abstract
En biomimetisk NM utvecklades för att fungera som en vävnadsteknisk biologisk byggnadsställning, vilket kan förbättra stamcellsförankring. Biomimetiska NM bildas av JBNTs och FN genom självmontering i en vattenlösning. JBNTs mäter 200-300 μm i längd med inre hydrofoba ihåliga kanaler och yttre hydrofila ytor. JBNTs är positivt laddade och FNs debiteras negativt. Därför, när de injiceras i en neutral vattenlösning, binds de samman via icke-kovavalent bindning för att bilda NM-buntarna. Självmonteringsprocessen slutförs inom några sekunder utan kemiska initierare, värmekälla eller UV-ljus. När NM-lösningens pH är lägre än FN:s isoelektriska punkt (pI 5,5-6,0) frigörs NM-paketen på grund av förekomsten av positivt laddad FN.
NM är känt för att efterlikna den extracellulära matrisen (ECM) morfologiskt och kan därför användas som en injicerbar byggnadsställning, vilket ger en utmärkt plattform för att förbättra hMSC vidhäftning. Celldensitetsanalys och fluorescensavbildningsexperiment visade att NMs avsevärt ökade förankringen av hMSCs jämfört med den negativa kontrollen.
Introduction
Mänskliga mesenkymala stamceller (hMSCs) har visat potentialen för självförnyelse och själv differentiering längs olika mesenchymala härstamningar, vilket hjälper till vid regenerering och underhåll avvävnader 1. Baserat på differentieringspotentialen betraktas hMSCs som kandidater för mesenkymala vävnadsskador och hematopoetisk störningsbehandling2. hMSCs har visat förmågan att främja sårläkning genom att öka vävnadsreparation, angiogenes och minska inflammation3. Men utan biokemisk eller biomaterialhjälp är effektiviteten för hMSCs att nå en målvävnad och funktion på önskad plats låg4. Även om olika konstruerade byggnadsställningar har använts för att locka hMSCs att hålla fast vid skadorna, är vissa platser såsom tillväxtplatta fraktur, i mitten av ett långt ben, inte lättillgängliga av konventionella pre-fabricerade byggnadsställningar, som kanske inte passar perfekt in i en oregelbundet formad skadad plats.
Här har vi utvecklat ett biomimetiskt nanomaterial som självmonterar på plats och injiceras till ett svårt att nå målområdet. Den injicerbara bioställningen NM består av Janus basnanorör (JBNTs) och fibronectin (FN). JBNTs, även känd som Rosette Nanotubes (RNTs), härrör från DNA-baspar, särskilt tymin och adenin, här5,6,7. Som ses i figur 1bildas nanorören när sex molekyler av den härledda DNA-basen parar sig via vätebindningar för att bilda ett plan6. Sex molekyler staplas sedan på varandra i ett plan via en stark pi-stapling interaktion7, som kan vara upp till 200-300 μm i längd. JBNTs är utformade för att morfologiskt efterlikna kollagenfibrer så att FN kommer att reagera med dem.
FN är ett limglykoprotein med hög molekylvikt, som finns i den extracellulära matrisen (ECM)9. Dessa kan medla fastsättning av stamceller till andra komponenter i ECM, särskilt kollagen10. Vi designade JBNTs för att morfologiskt efterlikna kollagenfibrer så att FN kan reagera med dem för att bilda NM på några sekunder via icke-covalent bindning. Därför är NM en lovande bioställningar som ska injiceras i en benfrakturplats som inte kunde nås av de konventionellt tillverkade byggnadsställningarna. Här presenterar den injicerbara NM en utmärkt förmåga att förbättra hMSC-förankring in vitro, vilket uppvisar deras potential att fungera som en byggnadsställning för vävnadsregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntes av JBNTs
NOTERA: JBNT monomer förbereddes som publicerat tidigare11.
- Syntes av förening A1
- Bered en lösning som innehåller 8,50 g 2-cyanoacetsyra och 9,80 g etylkarbamat i 25 ml toluen och 2,5 ml N, N-dimetylformamid. Tillsätt 4,90 ml fosforylklorid droppvis. Värm sedan blandningen till 70 °C och fortsätt omröra i 1,5 timmar.
- Kyl reaktionsblandningen till rumstemperatur och häll i 100 g isvatten. Extrahera vattenskiktet med etylacetat (3 x 250 ml) och tvätta med 100 ml saltlake. Torka det organiska skiktet över vattenfritt natriumsulfat, filtrera och avdunsta flyktiga ämnen under vakuum för att få ett blekgult fast ämne.
- Utdriv den gula fasta till kiselgelblixtkolonnens kromatografi (3% metanol/diklormetan) för att ge 15,61 g förening A1 som vitt pulver.
- Syntes av förening A2
- Blanda 3,12 g av förening A1 och 2,75 g kaliumkarbonat i 50 ml N, N-dimetylformamid. Rör om i rumstemperatur i 2 timmar.
- Tillsätt 2,6 ml koldisulfid till reaktionsupphängningen. Fortsätt omröra i 4 timmar.
- Tillsätt absolut etanol till reaktionsblandningen vid 0 °C. Filtrera ut den gula fällningen och tvätta med dietyleter. Torka under vakuum över natten för att ge 6,18 g förening A2 som blekgul fast ämne.
- Syntes av förening A3
- Tillsätt 2,7 ml metylidodid i 15 ml acetonitril. Förbered också separat en lösning av förening A2 genom att tillsätta 6,18 g A2 till 80 ml vatten/acetonitril (7:3-förhållande). Blanda både lösningarna och rör om i rumstemperatur i 30 min.
- Värm reaktionsblandningen till 95 °C och fortsätt omröra i 3 timmar.
- Kyl reaktionsblandningen till rumstemperatur och avdunsta sedan flyktiga ämnen under vakuum.
- Extrahera återstoden 3x med 100 ml etylacetat och tvätta med saltlake. Torka det organiska skiktet över vattenfritt natriumsulfat, filtrera och avdunsta flyktiga ämnen under vakuum för att få ett gult fast ämne.
- Utsätt den gula fasta till kiselgelen blixtkolonnkromatografi (30% etylacetat/hexaner) för att ge 4,52 g av föreningen A3 som ett ljusgult fast ämne.
- Syntes av förening A4
- Bered allylaminlösning genom att tillsätta 925 μL allylamin i 20 ml etanol. Tillsätt denna lösning droppvis till lösningen av förening A3, beredd genom att tillsätta 3,14 g A3 i 75 ml absolut etanol, över 30 min. Värm sedan reaktionsblandningen för att återloppsa i 16 timmar.
- Kyl reaktionsblandningen till rumstemperatur och avdunsta flyktiga ämnen för att ge ett gult fast ämne.
- Utsätt den gula fasta till kiselgelen blixtkolonnkromatografi (50% etylacetat/hexaner till 2% metanol/diklormetan) för att ge 1,80 g förening A4 som vit kristall.
- Syntes av förening A5
- Tillsätt 2,05 g guaanidiniumhydroklorid och 7,8 ml natriumetoxid (21 wt% i etanol) i 14 ml absolut etanol. Värm blandningen till 45 °C i 15 min.
- Filtrera bort det olösliga materialet och tillsätt filtratet direkt i lösningen av förening A4, framställd genom att tillsätta 2,70 g A4 i 40 ml absolut etanol. Värm reaktionsblandningen för att återloppsa i 16 timmar.
- Filtrera ut fällningen för att erhålla 2,65 g förening A5 som ett offvitt fast ämne.
- Syntes av förening A6
- Tillsätt 24,9 ml trietylamin långsamt till den slamblandning som erhålls genom att tillsätta 2,11 g förening A5 och 1,10 g 4-Dimethylaminopyridin i 120 ml tetrahydrofuran under 1 min. Rör om i rumstemperatur i 2 min.
- Tillsätt 20,7 ml di-tert-butyl-dikarbonat droppvis till reaktionsblandningen och fortsätt omröra vid rumstemperatur i 40 timmar.
- Tillsätt 20 ml vatten för att släcka reaktionen. Avdunsta flyktiga ämnen under vakuum.
- Extrahera de röda viskösa resterna med 500 ml etylacetat. Tvätta sedan in det med 250 ml vatten, 75 ml 10% citronsyra, 2x med 200 ml vatten, 200 ml mättat natriumbikarbonat och 200 ml saltlake. Torka det organiska skiktet över vattenfritt natriumsulfat, filtrera och avdunsta flyktiga ämnen under vakuum för att ge ett rött/orange fast ämne.
- Utsätt den fasta till kiselgelen blixtkolonnkromatografi (0-20% etylacetat/hexaner) för att ge 3,87 g förening A6 som vitt skum.
- Syntes av förening A7
- Tillsätt N-metylmorfolin N-oxid (50 wt.% i vatten, 1,64 ml) droppevis till lösningen av förening A6 (2,93 g) i aceton/vatten (8:1, 58,5 ml) och rör om vid rumstemperatur i 5 min.
- Tillsätt osmiumtetraoxid (4% vattenlösning) droppevis till blandningen under en period av 3 min och fortsätt omröra vid rumstemperatur i 24 timmar.
- Släcker reaktionen med 1,0 M vattenhaltig natriumsulfit tills lösningen blir färglös. Ta bort flyktiga ämnen under vakuum för att resultera i en vit uppslamning i vatten. Extrahera återstoden med 350 ml diklormetan och tvätta sedan med 150 ml vatten följt av en tvätt med 150 ml saltlake.
- Torka det organiska skiktet över vattenfritt natriumsulfat, filtrera och avdunsta flyktiga ämnen under vakuum för att ge 2,45 g förening A7 som ett vitt fast ämne.
- Syntes av förening A8
- Tillsätt 760 g natriumtid till blandningen av 1,36 g förening A7 i 35 ml diklormetan/vatten (6:1, 35 ml) och rör om vid rumstemperatur i 42 timmar.
- Filtrera bort det olösliga materialet och koncentrera filtratet under vakuum. Extrahera de resulterande resterna med 250 ml diklormetan och tvätta sedan med 100 ml vatten och 100 ml saltlake. Torka det organiska skiktet över vattenfritt natriumsulfat, filtrera och avdunsta flyktiga ämnen under vakuum för att ge råvaran.
- Låt råprodukten för kiselgelblixtkolonnkromatografi (5-40% etylacetat/hexaner, sedan 5% metanol/diklormetan) ge 1,08 g förening A8.
- Syntes av förening A9
- Bered en lösning på 830 mg förening A8 i 15 ml 1,2-diklormetan. Tillsätt lösningen av dropwise till blandningen av 6-bensyloxykarbonylamino-2-L-amino-hexanosyra trimetylsilyletylester (649,5 mg) och N,N-diisopropyletylamin (591 μL) i 24 ml 1,2-dikloretan över 3 min och rör om i rumstemperatur i 15 min.
- Tillsätt 360,3 mg natriumtriacetoxyborohydrid till lösningen och fortsätt omröra i rumstemperatur i 24 timmar.
- Släcker reaktionsblandningen med 6 ml vatten. Extrahera reaktionsblandningen 3x med 200 ml diklormetan och tvätta med 200 ml 10% citronsyra i vatten, 2x med 200 ml vatten, 200 ml mättat natriumbikarbonat och 200 ml saltlake i den ordningen. Torka det organiska skiktet över vattenfritt natriumsulfat, filtrera och avdunsta flyktiga ämnen under vakuum för att erhålla råprodukten.
- Utsätta råprodukten för kiselgelblixtkolonnkromatografi (5-30% etylacetat/hexaner) för att ge 885 mg förening A9.
- Syntes av JBNT monomer
- Lös upp 0,54 g förening A9 (0,54 g) i 10 ml 94% trifluoratisk syra/tioanollösning och rör om i rumstemperatur i 72 timmar.
- Tillsätt dietyleter (80 ml) till reaktionsblandningen och centrifugera fällningen nedåt. Häll ut den klara trifluoracetiska syran som innehåller supernatant och tvätta den vita fällningen med dietyleter och metanol för att ge 168,6 mg rå JBNT monomer (Kompletterande fil 1).
- Rena den råa JBNT monomeren med en högpresterande flytande kromatografi (HPLC) med en omvänd faskolonn. Isoleringsprogrammet listas nedan: Lösningsmedel A: 100% vatten; lösningsmedel B: 100% acetonitril; lösningsmedel C: pH=1 HCl vattenlösning; Flöde: 3 ml/min (se tabell 1).
- Samla den största toppen på ca 7,2 min.
2. Tillverkning för JBNT/FN
- Tillsätt 80 μL 1 mg/ml JBNT vattenlösning till 40 μL 1 mg/ml FN vattenlösning och pipett flera gånger.
- Kontrollera om det finns vit fast fjädring efter pipetting i ca 10 s.
OBS: En video spelades in för att fånga självmonteringsprocessen för NM (Kompletterande fil 2).
3. Observation av lyofila exemplar
OBS: Detta steg utförs för att visa ställningsstrukturen hos NM tillverkad av JBNTs och FN.
- Förbered FN-, JBNT- och FN/JBNT NM-lösningar för lyofiliserad materialobservation. Späd 10 μL 100 μg/ml FN med 40 μL destillerat vatten för att göra en 20 μg/ml-lösning av FN.
- Bered 100 mg/ml lösning av JBNTs genom att späda ut 5 μL 1 mg/ml JBNT i 45 μL DI-vatten.
- Blanda 10 μL 100 μg/ml FN och 5 μL 1 mg/ml JBNT i 35 μL DI-vatten för att bilda NM-lösningen.
- Täck tre brunnar med 96-väl klara runda bottenmikroplattor med FN-, JBNT-lösning respektive NM-lösning. Varje brunn får 50 μL av lösningen.
- Utför lyofilisering, som beskrivs nedan, för att visualisera NM:s ställningsstruktur.
- Frys plattan vid -80 °C över natten.
- Slå på det lyofila instrumentet och vakuumpumpen.
- Tryck på nedkylningsknappen för att sänka temperaturen i systemet till -50 °C.
- Lägg den frusna plattan i det fryst instrumentet och stäng instrumentens alla öppningar.
- Klicka på startknappen för att minska systemtrycket till 0,9 mbar.
- Efter 4 timmar trycker du på luftningsknappen och öppnar ventilen för att öka systemtrycket till atmosfärstrycket.
- Ta ut plattan ur det lyofila instrumentet.
- Använd ett mikroskop för att observera FN, JBNTs och den resulterande självmonterade NM. Ta flera fotografier med en kamera för materialet.
4. Absorptionsspektramätning
OBS: Använd ändringen av spektra för FN och JBNTs för att presentera den självmonterade JBNT / FN NM12.
- Blanda 30 μL 100 μg/ml FN med 15 μL destillerat vatten och 5 μL 1 mg/ml JBNT för att förbereda JBNT/FN NM-lösningen. Vit fast fjädring kan ses efter pipetting lösningen flera gånger.
OBS: De slutliga koncentrationerna av JBNTs och FN i lösningen är 100 μg/ml respektive 60 μg/ml. JBNTs och FN-lösningar i samma koncentration som den som användes i NM-lösningen utarbetades också som kontrolllösningar. - Späd 5 μL 1 mg/ml JBNT med 45 μL destillerat vatten för att förbereda JBNT-styrlösning.
- Späd 30 μL 100 μg/ml FN med 20 μL destillerat vatten för att förbereda FN:s kontrolllösning.
- Mät UV-vis absorptionsspektrat i FN-, JBNT- och JBNT/FN NM-lösningarna med spektrofotometern (se Materialförteckningen)för att karakterisera monteringen av NM.
- Klicka på UV-Vis-knappen. Rengör spektrofotometerns testyta och släpp 2 μL destillerat vatten på den. Mät den som tom från 190-850 nm.
- Rengör spektrofotometerns testyta och släpp 2 μL FN-lösning på den. Mät UV-Vis absorptionsspektra av FN-lösningen från 190 nm till 850 nm.
- Rengör spektrofotometerns testyta och släpp 2 μL JBNT-lösning på den. Mät absorptionsspektrat för JBNT-lösningen från 190 nm till 850 nm.
- Rengör spektrofotometerns testyta och släpp 2 μL JBNT/FN NM-lösning på den. Mät absorptionsspektrat för JBNT/FN NM-lösning från 190 nm till 850 nm.
5. Förberedelse av JBNT/FN NM för elektronisk transmissionsmikroskopi (TEM)
- Rengör flera galler före negativ färgning med en grundläggande plasmarengöringsmedel (se Materialförteckning).
- Utför den negativa färgningen för proverna efter två olika processer.
- Släpp 3 μL 1 mg/ml JBNTs vattenlösning och 3 μL JBNT/FN NM-lösning på separerade galler och låt den vara i 2 minuter. Skölj sedan varje galler med 100 μL av 0,5% uranylacetatlösning (UA). Töm överskottslösningen med filterpapper och lufttorka gallren.
- Blanda 9 μL JBNT/FN NM-lösning med 3 μL 2,0% UA-lösning och pipett flera gånger. Pipett den blandade lösningen på gallret och håll den på gallret i 2 min. Använd ett filterpapper för att ta bort den blandade lösningen från gallret och torka gallret vid rumstemperatur.
- Slutligen karakterisera exemplaret för JBNTs, JBNT/FN NM färgat med steg 5.2.1 och JBNT/FN NM färgat med steg 5.2.2 med TEM.
6. In vitro biologisk funktionsanalys
- Lägg till 200 μL negativa kontroller (NC, PBS), JBNTs, FN och JBNT/FN NM-lösningarna i en brunn i en 8-brunns kammarbild.
- Frys torrt det 8-brunniga kammade täckglaset med det frystorkade instrumentet för att täcka material på botten av brunnar. Protokollet för frystorkning är detsamma som steg 3.5.
- Tillsätt sedan 10 000 celler/brunnar hMSCs (Passage 3) i brunnarna och inkubera dem i 24 timmar vid 37 °C med 5% CO2.
- Efter inkubation, pipett ut cellkulturmediet från brunnarna och skölj kulturen med 1x PBS-lösning.
- Tillsätt 100 μL av fixeringslösningen till varje brunn med celler och låt den vara i 5 minuter. Skölj cellerna försiktigt med 1x PBS två gånger.
- Späd 1% Triton-X 100 till 0,1%. Tillsätt 100 μL 0,1% Triton-X 100 till varje brunn med celler och lämna i 10 min. Skölj cellerna försiktigt med 1x PBS två gånger.
- Späd rhodaminphalloidin till 1,65 μM. Tillsätt 100 μL Rhodamine Phalloidin till varje brunn med celler och inkubera det kammade täckglaset som håller sig från ljus vid rumstemperatur i 30 min. Skölj cellerna försiktigt med 1x PBS två gånger.
- Fånga cellbilderna med ett fluorescerande mikroskop.
- Räkna cellnumren på fluorescerande bilder för varje grupp. Beräkna cellens vidhäftningsdensitet genom att i genomsnitt använda tre slumpmässiga områden i varje brunn.
- Presentera alla data som genomsnittlig ± standardavvikelse (SD). Utför statistiska analyser med hjälp av ett enstjärtat t-test, följt av variansanalys (ANOVA) med p<0,05, vilket anses vara statistiskt signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våra studier upptäckte att bildandet av NM av JBNTs och FN är snabbt, vilket hände på 10 sekunder. Som visas i figur 2erhölls vit floccule när JBNT-lösningen blandades med FN-lösningen och pipetterades flera gånger. Bildandet av NM är helt biomimetisk. Inga yttre stimuli behövs. Tillverkningsprocessen är mycket enklare än för vissa framväxande biomaterial, som är baserade på ultraviolett ljus eller kemisk initiator för korslänkning13.
Vi fångade och analyserade kamerabilderna av FN, JBNTs och NM (Figur 3). För FN-gruppen, förutom korta vita fläckar, observerades inga långa fibrer. De korta klustren var proteinförstärkningarna som bestod av FN, vilket tyder på att ställningsstrukturen inte kan bildas enbart med FN utan JBNTs (Figur 3A). Som visas i figur 3Banger de långa och tunnare fibrerna förekomsten av JBNTs. Bredden på NM:s vita strängar är bredare jämfört med JBNTs, vilket indikerar att JBNTs och FN korslänkade med varandra som bildar NM. NM-fibern kan bli upp till flera centimeter lång (Figur 3C).
Vi fick UV-Vis-spektrat för att indikera monteringen mellan JBNTs och FN. Som visas i figur 4uppvisar JBNTs två absorptionstoppar vid 220 nm respektive 280 nm. Jämfört med JBNTs har JBNT/FN NM två absorptionstoppar på samma plats med ett betydligt reducerat värde, som kom från JBNTs men påverkades av de icke-kovanta självmonterade JBNTs och FN däremellan.
TEM användes för att karakterisera morfologin hos JBNTs och NM. Som visas i figur 5Aär JBNTs smala rör med enhetliga diametrar. Under neutrala förhållanden debiteras JBNTs positivt medan FN debiteras negativt. När de blandades bildade de lång myom NM via laddningsinteraktioner (Figur 5B). När pH är lägre än FN:s isoelektriska punkt (pI på 5,5-6,0) presenterar NM-buntarna självfrisättning på grund av den positivt laddade FN. Som visas i figur 5C, när den bevarades i en lösning med lågt pH (4,0), dissekerades NM, och en hel del FN släpptes från NM. FN som distribueras tillsammans med nanotuben är också ett starkt bevis på att NM tillverkades av JBNTs och FN10.
Vi undersökte effekten av JBNT/FN NM på cell vidhäftning. Som visas i figur 6visade NM-gruppens cell vidhäftningstäthet signifikant skillnad (p-värde <0,05) jämfört med den negativa kontrollen. Skillnaden kan bero på att NM är utformade för att morfologiskt efterlikna ECM, som ger en byggnadsställning för cell vidhäftning14. ECM bestod av kollagener och celllim glykoproteiner, såsom fibronectin15. Kollagen har presenterats med förmågan att främja högre vidhäftning och spridning av hMSCs16. Dessutom har fibronectin visat sig förbättra hMSCs vidhäftning i den skadade platsen samt15. Fluorescensavbildning visade också att NM-gruppens hMSC-vidhäftning ökade betydligt jämfört med den negativa kontrollgruppen (figur 7)15,17.
Figur 1: Schematisk illustration av JBNTs hierarkiska självmontering med en lysin sidokedja.
Den här siffran skrivs ut igen med tillstånd från föregående publikation12. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Demonstration för NM:s självmonterade process.
A)FN-lösning. B)JBNTs blandade med FN. Den här siffran skrivs ut igen med tillstånd från föregående publikation12. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3: Brightfield fotografier.
Brightfield fotograferar av (A) FN (B) JBNTs och (C) NM bildat av JBNTs och FN. Varje område har en diameter på 2 cm. Den här siffran skrivs ut igen med tillstånd från föregående publikation12. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Absorptionsspektra av FN, JBNTs och JBNT/FN NM.
Denna siffra trycks om från föregående publikation12. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5: TEM-bilder.
TEM-bilder av( A) JBNTs (B) JBNT / FN NM, och (C) släppte JBNT / FN NM. Den här siffran skrivs ut igen med tillstånd från föregående publikation12. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Statistisk analys av cellulär vidhäftning.
Cell vidhäftning densitet registrerades i detta experiment. *p<0,01 jämfört med negativa kontroller. **p<0,05 jämfört med JBNT ensam. N=3. Den här siffran skrivs ut igen med tillstånd från föregående publikation12. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 7: Fluorescensbilder.
Fluorescensbilder av( A) hMSCs och (B) hMSC inkuberade med JBNTs. (C) hMSC inkuberade med FN. (D) hMSC inkuberade med JBNT/ FN NM. Skalstång: 100 μm. Den här siffran skrivs ut igen med tillstånd från föregående publikation12. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Tid | A% | B% | C% |
| 0,00 min | 98 | 0 | 2 |
| 15.00 min | 68 | 30 | 2 |
| 25.00 min | 8 | 90 | 2 |
| 26.00 min | 0 | 100 | 0 |
Tabell 1: Gradient elueringstid.
Kompletterande fil 1: Schema för syntesen av JBNT monomer. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande arkiv 2: Video för självmontering av FN/JBNT NM. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie utvecklade vi en självmonterad biomimetisk NM, som bildades med DNA-inspirerade JBNTs och FN. Vid beredning av JBNT-lösningen bör JBNT-lyofiliiserat pulver lösas upp i vattnet istället för PBS eftersom PBS kommer att orsaka agglomeration av JBNTs, vilket hämmar deras montering. Dessutom bör NM också monteras i vatten om vi vill observera NM: s nanofibrila strukturer, eftersom saltet i PBS kommer att bunta med NM-fibrer, vilket kraftigt kan minska bildernas upplösning.
NM har visat stor potential att fungera som en ny vävnadsteknik byggnadsställning även om många ansträngningar har gjorts för att tillverka vävnad regenerativa byggnadsställningar, som användes för att underlätta hMSCs vidhäftning och differentiering. De flesta av dessa material är dock förgjorda med en specifik form, till exempel en 3D-utskrivenbyggnadsställning 18,19. Som sådan är de inte lätta att implanteras i skadade platser som är djupt i leden. NM-lösningen här kan dock injiceras som en vätska och sedan fungera som en byggnadsställning för cell vidhäftning.
En begränsning är att NM inte är mekaniskt stark. Till skillnad från polymerer tillverkas de via självmontering av icke-covalenta interaktioner, så de kan inte bära mycket mekanisk belastning eller spänning. Å andra sidan presenterar den icke-kovaverade strukturen också mycket god biologisk nedbrytbarhet och biokompatibilitet lämplig för biologiska funktioner 8,20,21 .
Den injicerbara NM har visat stor potential att ge en målplats och en ställning för MSC-homing för att förbättra benfrakturläkning i kroppen. När den injiceras på den skadade platsen får dock den icke-kovaviva NM inte stanna på plats under lång tid, vilket kan minska den terapeutiska effekten. I framtiden kommer vi att utforska att införliva andra material (såsom hydrogeler) eller att alternera NM-strukturerna för att ytterligare optimera egenskaperna hos NM-ställningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Yupeng Chen är en av grundarna av NanoDe Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Detta arbete stöds ekonomiskt av NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) och University of Connecticut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Onec UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
References
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
