Summary

Kvantifiering av makronäringsämnen Intag i en termogenetisk neuronal skärm med drosophila larver

Published: June 11, 2020
doi:

Summary

Beskrivs här är ett protokoll som möjliggör kolorimetrisk kvantifiering av mängden mat som äts inom ett definierat tidsintervall av Drosophila melanogaster larver utsatta för dieter av olika makronäringsämne kvalitet. Dessa analyser utförs i samband med en neuronal termogenetisk skärm.

Abstract

Foderbeteenden gör det möjligt för djur att få tillgång till energikällor och näringsämnen som är nödvändiga för deras utveckling, hälsa och kondition. Att undersöka neuronal reglering av dessa beteenden är avgörande för förståelsen av de fysiologiska och molekylära mekanismerna bakom näringsmässiga homeostas. Användningen av genetiskt dragbara djurmodeller som maskar, flugor och fisk underlättar i hög grad dessa typer av studier. Under det senaste decenniet har fruktflugan Drosophila melanogaster använts som en kraftfull djurmodell av neurobiologer som undersöker neuronal kontroll av utfodring och 40-bekämpning. Även om det utan tvekan är värdefullt, undersöker de flesta studier vuxna flugor. Här beskriver vi ett protokoll som utnyttjar det enklare larv nervsystemet för att undersöka neuronala substrat som styr utfodringsbeteenden när larver utsätts för dieter som skiljer sig åt i deras protein- och kolhydratinnehåll. Våra metoder är baserade på en kvantitativ kolorimetrisk no-choice utfodringsanalys, utförs i samband med en neuronal termogenetisk aktiveringsskärm. Som en avläsning användes mängden mat som äts av larver under ett 1 h intervall när den exponerades för en av de tre färgmärkta dieterna som skiljer sig åt i förhållandet mellan protein och kolhydrater (P:C). Effekten av detta protokoll visas i samband med en neurogenetisk skärm i larv Drosophila, genom att identifiera kandidat neuronal populationer reglera mängden mat som äts i dieter av olika makronäringsämnen kvalitet. Vi kunde också klassificera och gruppera genotyperna som testats i fenotypiska klasser. Förutom en kort genomgång av de för närvarande tillgängliga metoderna i litteraturen diskuteras fördelarna och begränsningarna med dessa metoder och dessutom ges några förslag om hur detta protokoll kan anpassas till andra specifika experiment.

Introduction

Alla djur är beroende av en balanserad kost för att förvärva de nödvändiga mängderna näringsämnen för överlevnad, tillväxt och reproduktion1. Valet av vad och hur mycket man ska äta påverkas av en mängd interagerande faktorer relaterade till djurets inre tillstånd, som mättnadsnivån och miljöförhållandena, såsom livsmedelskvalitet2,3,4,5. Protein och kolhydrater är två stora makronäringsämnen och dess balanserade intag är avgörande för att upprätthålla djurens fysiologiska processer. Därför är förståelsen av de neurala mekanismerna som styr utfodringsbeteenden och upprätthåller ett balanserat intag av dessa makronäringsämnen extremt relevant. Detta beror på att livshistoria egenskaper som livslängd, fecundity och metabolisk hälsa påverkas direkt av nivåerna av proteinintagintag 6,7,8,9,10.

Användningen av enklare mer lätthanterliga organismer som uppvisar evolutionärt bevarade utfodringsvanor med komplexa djur, inklusive däggdjur, är avgörande för denna typ av studier. Viktigt är att dessa enklare djurmodeller ger ett bra tillfälle att dissekera komplexa biologiska frågor i ett kostsamt, etiskt och tekniskt effektivare sammanhang. Under de senaste decennierna har Drosophila, med sin kraftfulla genetiska verktygslåda, invecklade och stereotypa beteende och bevarad arkitektur av perifera och näringsavkännande mekanismer med däggdjur, varit en fruktbar modell för beteendemässiga neurobiologer11. I slutändan är förhoppningen att genom att förstå hur matintag regleras i detta djur, med ett enklare nervsystem, kan vi sedan börja reda ut neuronala funktionsfel som ligger till grund för mänskliga ätstörningar.

Studien av neuronala substrat för utfodringsbeteenden är djupt beroende av att samtidigt kunna mäta djurens matintag samtidigt som deras neuronala aktivitet manipuleras. På grund av de minimala mängder mat som intas är kvantifiering av mängden mat som äts av flugor extremt utmanande, och alla metoder som för närvarande finns tillgängliga utgör betydande begränsningar. Således är guldstandarden att använda en kombination av kompletterande metoder12. Vuxna flugor har historiskt gynnats som en genetisk och beteendemässig modell. Ändå erbjuder Drosophila larver också möjligheter att undersöka neuronala substrat som kodar utfodringsbeteende. Larvens centrala nervsystem (CNS), med cirka 12 000 nervceller, är betydligt mindre komplext än det vuxna, som innehåller cirka 150 000 nervceller. Denna lägre komplexitet är inte bara numerisk utan också funktionell, eftersom larvbeteenden förlitar sig på enklare lokfunktioner och sensoriska system. Trots den uppenbara enkelheten i deras nervsystem uppvisar larver fortfarande fullständiga utfodringsbeteenden, och vissa metoder för att kvantifiera matintag i Drosophila larver har beskrivits5,13,14,15. Genom att para ihop med manipuleringar av neuronal aktivitet kan Drosophila larver utgöra en mycket lätthanterlig modell för att förstå neural reglering av matintag.

Här finns ett detaljerat protokoll för att kvantifiera födointag i larver som utsätts för dieter av olika makronäringsämneskvalitet. Dieterna, så kallade makronäringsämnen balanserande dieter, skilde sig åt i protein- och kolhydratinnehållet, särskilt när det gäller förhållandet mellan protein och kolhydrater (P:C), som visas i figur 1A. Kortfattat fastställdes en kvantitativ no-choice utfodringsanalys med hjälp av dessa tre isocaloric sackarosjäst (SY)-baserade dieter färgade med ett blått matfärgämne. Eftersom jästextrakt och sackaros användes som protein- och kolhydratkällor, och båda innehåller kolhydrater, erhölls variation i P:C-kvoterna genom att ändra balansen mellan dessa två komponenter, som tidigare beskrivits16 och som anges i figur 1B. En schematisk översikt över protokollet, som visar de viktigaste experimentella stegen, finns i figur 2.

Detta protokoll inrättades i syfte att undersöka rollen av specifika neuronal populationer på regleringen av larv utfodring nivåer i dieter av olika P:C förhållanden och i samband med en termogenetisk neuronal skärm. Ett väl karakteriserat neurogenetiskt verktyg användes från transientreceptorpotentialfamiljen (TRP) : Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), som är en temperatur- och spänningsportad katjonkanal, vilket möjliggör avfyrning av åtgärdspotentialer när omgivningstemperaturen stiger över 25 °C17. För att uttrycka dTRPA1-transgenen utnyttjade vi Gal4-linjerna baserade på cis-regulatoriskaregioner från Drosophila-genomet, etablerat i Rubin-laboratoriet, inom ramen för FlyLight-projektet vid Janelia Research Campus18,19.

Även om protokollet, här beskrivet, har upprättats i samband med en aktiveringsskärm, kan det enkelt anpassas av experimenteraren till andra specifika behov eller intressen, nämligen att utföra en undertryckande skärm med den temperaturkänsliga neuronala ljuddämparen ShibireTS20, i alternativ till dTRPA1. Denna och andra anpassningar diskuteras i protokoll- och diskussionsavsnitten.

Protocol

1. Beredning av sackarosjäst (SY) dieter Väg alla torra ingredienser (agar, jäst, sackaros) för makronäringsämnena balansering och L3-uppfödningsdieter. Mängderna i gram för var och en av de ingredienser som behövs för att förbereda 1 L mat anges i figur 1B.OBS: Ta hänsyn till att cirka 13 ml mat behövs för att fylla en 60 mm Petri-skål. Lös upp alla ingredienser i sterilt destillerat vatten (använd cirka 50% av den totala volymen vatten som behövs …

Representative Results

Drosophila larver reglerar sitt proteinintag till priset av att inta överskott avkolhydrater 23 (schematiskt område i figur 2E). Egentligen har denna prioritering av proteinintag observerats hos många andra djur och kallas proteinet som utnyttjar24,25. Dra nytta av detta robusta utfodring beteendemässiga svar, en beteendebaserad skärm utformades syftar till att identif…

Discussion

Med detta protokoll kan man testa larvernas förmåga under termogenetisk aktivering av specifika neuronala populationer att reglera intagsnivåerna av protein och kolhydrater, två stora makronäringsämnen, när de utsätts för dieter med olika P:C-sammansättning. Denna metod testades i samband med en larv preliminär screening syftar till att identifiera neuronal populationer är associerade med kontroll av matintag över dieter av olika makronäringsämne kvalitet. Detta arbete bidrar också till att visa att D…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka Instituto Gulbenkian de Ciência (regeringskonferensen) för att ha gett oss tillgång till en del av den experimentella utrustning som beskrivs i detta protokoll. Detta arbete stöddes av Portugisiska stiftelsen för vetenskap och teknik (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 och La Caixa HR17-00595 till PMD och av Australian Research Council Future Fellowship (FT170100259) till CKM.

Materials

1.5 mL microtubes Sarstedt AG & Co. 72.690.001
10xPBS Nytech MB18201
2.0 mL microtubes Sarstedt AG & Co. 72.695.500
60 mm petri dishes Greiner Bio-one, Austria 628161
96 well microplates Santa Cruz Biotechnology SC-204453
Agar Pró-vida, Portugal
Bench cooler Nalgene, USA Labtop Cooler 5115-0032
Blue food dye Rayner, Billingshurst, UK
Cell disruption media Scientific Industries, Inc. 888-850-6208 (0.5 mm glass beads)
Dish weight boats Santa Cruz Biotechnology SC-201606
Embryo collection cage for 60 mm petri dishes Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK FLY1212 (59-100)
Featherweight forceps BioQuip Products, USA 4750
Fly food for stocks maintenance 1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid
Forceps #5 Dumont 0108-5-PS Standard tips, INOX, 11cm
Incubator LMS Ltd, UK Series 2, Model 230 For thermogenetic feeding assay (30∘C)
Incubator Percival Scientific, USA DR36NL To stage larvae (19∘C)
Janelia lines Janelia Research Campus Detailed information in Table 2
Macronutrient balancing diets Composition and nutritional information in Figure 1
Methanol VWR CAS number: 67-56-1
Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate) Sigma-Aldrich H5501
Nitrile gloves VWR, USA
Refrigerated centrifuge Eppendorf, Germany 5804 R / Serial number: 5805CI364293
Rubin Gal4 ines Janelia Research Campus Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS UAS line Bloomington Drosophila Stock Center BDSC number: 66600 Provided by Carlos Ribeiro Group
Soft brushes For sorting anaesthetised fruit flies
Spectrophotometer plate reader Thermo Fisher Scientific Multiskan Go 51119300
Stereo microscope Nikon 1016625
Sucrose Sidul, Portugal
Third-instar larvae (L3) rearing diet Composition and nutritional information in Figure 1
Timer
Tissue lyzer / bead beater MP Biomedicals, USA FastPrep-24 6004500
TRPA1 UAS line Bloomington Drosophila Stock Center BDSC number: 26264 Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C
Water bath Sheldon Manufacturing Inc., USA W20M-2 / 03068308 / 9021195
Yeast extract Pró-vida, Portugal 51% Protein, 15% Carbohydrate

References

  1. Raubenheimer, D. . Nature of nutrition – a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).
  2. Carvahlo, M. J. a., Mirth, C. K. Coordinating morphology with behavior during development: an integrative approach from a fly perspective. Frontiers in Ecology and Evolution. , (2015).
  3. Steck, K., et al. Internal amino acid state modulates yeast taste neurons to support protein homeostasis in Drosophila. Elife. 7, 31625 (2018).
  4. Itskov, P. M., Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Frontiers in Neuroscience. 7, 12 (2013).
  5. Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
  6. Grandison, R. C., Piper, M. D., Partridge, L. Amino-acid imbalance explains extension of lifespan by dietary restriction in Drosophila. Nature. 462 (7276), 1061-1064 (2009).
  7. Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2498-2503 (2008).
  8. Levine, M. E., et al. Low protein intake is associated with a major reduction in IGF-1, cancer, and overall mortality in the 65 and younger but not older population. Cell Metabolism. 19 (3), 407-417 (2014).
  9. Solon-Biet, S. M., et al. The ratio of macronutrients, not caloric intake, dictates cardiometabolic health, aging, and longevity in ad libitum-fed mice. Cell Metabolism. 19 (3), 418-430 (2014).
  10. Piper, M. D., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  11. Jones, W. D. The expanding reach of the GAL4/UAS system into the behavioral neurobiology of Drosophila. BMB Reports. 42 (11), 705-712 (2009).
  12. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  13. Neckameyer, W. S. A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit. Developmental Neuroscience. 32 (3), 217-237 (2010).
  14. Gasque, G., Conway, S., Huang, J., Rao, Y., Vosshall, L. B. Small molecule drug screening in Drosophila identifies the 5HT2A receptor as a feeding modulation target. Scientific Reports. 3, (2013).
  15. Schoofs, A., et al. Selection of motor programs for suppressing food intake and inducing locomotion in the Drosophila brain. PLoS Biology. 12 (6), 1001893 (2014).
  16. Pocas, G. M., Crosbie, A. E., Mirth, C. K. When does diet matter? The roles of larval and adult nutrition in regulating adult size traits in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. , 104051 (2020).
  17. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  18. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  19. Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Reports. 2 (4), 991-1001 (2012).
  20. Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. Journal of Neurobiology. 47 (2), 81-92 (2001).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  22. Shirangi, T. R., Stern, D. L., Truman, J. W. Motor control of Drosophila courtship song. Cell Reports. 5 (3), 678-686 (2013).
  23. Mirth, C. M. J. Food intake and food choice are altered by the developmental transition at critical weight in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 126, 195-208 (2017).
  24. Simpson, S. J., Raubenheimer, D. Obesity: the protein leverage hypothesis. Obesity Reviews. 6 (2), 133-142 (2005).
  25. Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Integrative models of nutrient balancing: application to insects and vertebrates. Nutrition Research Reviews. 10 (1), 151-179 (1997).
  26. Li, H. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Reports. 8 (3), 897-908 (2014).
  27. Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).
  28. Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).
  29. Almeida-Carvalho, M. J., et al. The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).
  30. Rodrigues, M. A., et al. Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time. Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).
  31. Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).
  32. Wu, Q., et al. Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system. Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).
  33. Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).
  34. Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster. Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).

Play Video

Cite This Article
Poças, G. M., Domingos, P. M., Mirth, C. K. Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (160), e61323, doi:10.3791/61323 (2020).

View Video