Beskrivs här är ett protokoll som möjliggör kolorimetrisk kvantifiering av mängden mat som äts inom ett definierat tidsintervall av Drosophila melanogaster larver utsatta för dieter av olika makronäringsämne kvalitet. Dessa analyser utförs i samband med en neuronal termogenetisk skärm.
Foderbeteenden gör det möjligt för djur att få tillgång till energikällor och näringsämnen som är nödvändiga för deras utveckling, hälsa och kondition. Att undersöka neuronal reglering av dessa beteenden är avgörande för förståelsen av de fysiologiska och molekylära mekanismerna bakom näringsmässiga homeostas. Användningen av genetiskt dragbara djurmodeller som maskar, flugor och fisk underlättar i hög grad dessa typer av studier. Under det senaste decenniet har fruktflugan Drosophila melanogaster använts som en kraftfull djurmodell av neurobiologer som undersöker neuronal kontroll av utfodring och 40-bekämpning. Även om det utan tvekan är värdefullt, undersöker de flesta studier vuxna flugor. Här beskriver vi ett protokoll som utnyttjar det enklare larv nervsystemet för att undersöka neuronala substrat som styr utfodringsbeteenden när larver utsätts för dieter som skiljer sig åt i deras protein- och kolhydratinnehåll. Våra metoder är baserade på en kvantitativ kolorimetrisk no-choice utfodringsanalys, utförs i samband med en neuronal termogenetisk aktiveringsskärm. Som en avläsning användes mängden mat som äts av larver under ett 1 h intervall när den exponerades för en av de tre färgmärkta dieterna som skiljer sig åt i förhållandet mellan protein och kolhydrater (P:C). Effekten av detta protokoll visas i samband med en neurogenetisk skärm i larv Drosophila, genom att identifiera kandidat neuronal populationer reglera mängden mat som äts i dieter av olika makronäringsämnen kvalitet. Vi kunde också klassificera och gruppera genotyperna som testats i fenotypiska klasser. Förutom en kort genomgång av de för närvarande tillgängliga metoderna i litteraturen diskuteras fördelarna och begränsningarna med dessa metoder och dessutom ges några förslag om hur detta protokoll kan anpassas till andra specifika experiment.
Alla djur är beroende av en balanserad kost för att förvärva de nödvändiga mängderna näringsämnen för överlevnad, tillväxt och reproduktion1. Valet av vad och hur mycket man ska äta påverkas av en mängd interagerande faktorer relaterade till djurets inre tillstånd, som mättnadsnivån och miljöförhållandena, såsom livsmedelskvalitet2,3,4,5. Protein och kolhydrater är två stora makronäringsämnen och dess balanserade intag är avgörande för att upprätthålla djurens fysiologiska processer. Därför är förståelsen av de neurala mekanismerna som styr utfodringsbeteenden och upprätthåller ett balanserat intag av dessa makronäringsämnen extremt relevant. Detta beror på att livshistoria egenskaper som livslängd, fecundity och metabolisk hälsa påverkas direkt av nivåerna av proteinintagintag 6,7,8,9,10.
Användningen av enklare mer lätthanterliga organismer som uppvisar evolutionärt bevarade utfodringsvanor med komplexa djur, inklusive däggdjur, är avgörande för denna typ av studier. Viktigt är att dessa enklare djurmodeller ger ett bra tillfälle att dissekera komplexa biologiska frågor i ett kostsamt, etiskt och tekniskt effektivare sammanhang. Under de senaste decennierna har Drosophila, med sin kraftfulla genetiska verktygslåda, invecklade och stereotypa beteende och bevarad arkitektur av perifera och näringsavkännande mekanismer med däggdjur, varit en fruktbar modell för beteendemässiga neurobiologer11. I slutändan är förhoppningen att genom att förstå hur matintag regleras i detta djur, med ett enklare nervsystem, kan vi sedan börja reda ut neuronala funktionsfel som ligger till grund för mänskliga ätstörningar.
Studien av neuronala substrat för utfodringsbeteenden är djupt beroende av att samtidigt kunna mäta djurens matintag samtidigt som deras neuronala aktivitet manipuleras. På grund av de minimala mängder mat som intas är kvantifiering av mängden mat som äts av flugor extremt utmanande, och alla metoder som för närvarande finns tillgängliga utgör betydande begränsningar. Således är guldstandarden att använda en kombination av kompletterande metoder12. Vuxna flugor har historiskt gynnats som en genetisk och beteendemässig modell. Ändå erbjuder Drosophila larver också möjligheter att undersöka neuronala substrat som kodar utfodringsbeteende. Larvens centrala nervsystem (CNS), med cirka 12 000 nervceller, är betydligt mindre komplext än det vuxna, som innehåller cirka 150 000 nervceller. Denna lägre komplexitet är inte bara numerisk utan också funktionell, eftersom larvbeteenden förlitar sig på enklare lokfunktioner och sensoriska system. Trots den uppenbara enkelheten i deras nervsystem uppvisar larver fortfarande fullständiga utfodringsbeteenden, och vissa metoder för att kvantifiera matintag i Drosophila larver har beskrivits5,13,14,15. Genom att para ihop med manipuleringar av neuronal aktivitet kan Drosophila larver utgöra en mycket lätthanterlig modell för att förstå neural reglering av matintag.
Här finns ett detaljerat protokoll för att kvantifiera födointag i larver som utsätts för dieter av olika makronäringsämneskvalitet. Dieterna, så kallade makronäringsämnen balanserande dieter, skilde sig åt i protein- och kolhydratinnehållet, särskilt när det gäller förhållandet mellan protein och kolhydrater (P:C), som visas i figur 1A. Kortfattat fastställdes en kvantitativ no-choice utfodringsanalys med hjälp av dessa tre isocaloric sackarosjäst (SY)-baserade dieter färgade med ett blått matfärgämne. Eftersom jästextrakt och sackaros användes som protein- och kolhydratkällor, och båda innehåller kolhydrater, erhölls variation i P:C-kvoterna genom att ändra balansen mellan dessa två komponenter, som tidigare beskrivits16 och som anges i figur 1B. En schematisk översikt över protokollet, som visar de viktigaste experimentella stegen, finns i figur 2.
Detta protokoll inrättades i syfte att undersöka rollen av specifika neuronal populationer på regleringen av larv utfodring nivåer i dieter av olika P:C förhållanden och i samband med en termogenetisk neuronal skärm. Ett väl karakteriserat neurogenetiskt verktyg användes från transientreceptorpotentialfamiljen (TRP) : Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), som är en temperatur- och spänningsportad katjonkanal, vilket möjliggör avfyrning av åtgärdspotentialer när omgivningstemperaturen stiger över 25 °C17. För att uttrycka dTRPA1-transgenen utnyttjade vi Gal4-linjerna baserade på cis-regulatoriskaregioner från Drosophila-genomet, etablerat i Rubin-laboratoriet, inom ramen för FlyLight-projektet vid Janelia Research Campus18,19.
Även om protokollet, här beskrivet, har upprättats i samband med en aktiveringsskärm, kan det enkelt anpassas av experimenteraren till andra specifika behov eller intressen, nämligen att utföra en undertryckande skärm med den temperaturkänsliga neuronala ljuddämparen ShibireTS20, i alternativ till dTRPA1. Denna och andra anpassningar diskuteras i protokoll- och diskussionsavsnitten.
Med detta protokoll kan man testa larvernas förmåga under termogenetisk aktivering av specifika neuronala populationer att reglera intagsnivåerna av protein och kolhydrater, två stora makronäringsämnen, när de utsätts för dieter med olika P:C-sammansättning. Denna metod testades i samband med en larv preliminär screening syftar till att identifiera neuronal populationer är associerade med kontroll av matintag över dieter av olika makronäringsämne kvalitet. Detta arbete bidrar också till att visa att D…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Instituto Gulbenkian de Ciência (regeringskonferensen) för att ha gett oss tillgång till en del av den experimentella utrustning som beskrivs i detta protokoll. Detta arbete stöddes av Portugisiska stiftelsen för vetenskap och teknik (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 och La Caixa HR17-00595 till PMD och av Australian Research Council Future Fellowship (FT170100259) till CKM.
1.5 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.690.001 | |
10xPBS | Nytech | MB18201 | |
2.0 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.695.500 | |
60 mm petri dishes | Greiner Bio-one, Austria | 628161 | |
96 well microplates | Santa Cruz Biotechnology | SC-204453 | |
Agar | Pró-vida, Portugal | ||
Bench cooler | Nalgene, USA | Labtop Cooler 5115-0032 | |
Blue food dye | Rayner, Billingshurst, UK | ||
Cell disruption media | Scientific Industries, Inc. | 888-850-6208 | (0.5 mm glass beads) |
Dish weight boats | Santa Cruz Biotechnology | SC-201606 | |
Embryo collection cage for 60 mm petri dishes | Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK | FLY1212 (59-100) | |
Featherweight forceps | BioQuip Products, USA | 4750 | |
Fly food for stocks maintenance | 1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid | ||
Forceps #5 | Dumont | 0108-5-PS | Standard tips, INOX, 11cm |
Incubator | LMS Ltd, UK | Series 2, Model 230 | For thermogenetic feeding assay (30∘C) |
Incubator | Percival Scientific, USA | DR36NL | To stage larvae (19∘C) |
Janelia lines | Janelia Research Campus | Detailed information in Table 2 | |
Macronutrient balancing diets | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
Methanol | VWR | CAS number: 67-56-1 | |
Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
Nitrile gloves | VWR, USA | ||
Refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | 5804 R / Serial number: 5805CI364293 | |
Rubin Gal4 ines | Janelia Research Campus | Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center | |
ShibireTS UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 66600 | Provided by Carlos Ribeiro Group |
Soft brushes | For sorting anaesthetised fruit flies | ||
Spectrophotometer plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan Go 51119300 | |
Stereo microscope | Nikon | 1016625 | |
Sucrose | Sidul, Portugal | ||
Third-instar larvae (L3) rearing diet | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
Timer | |||
Tissue lyzer / bead beater | MP Biomedicals, USA | FastPrep-24 6004500 | |
TRPA1 UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 26264 | Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C |
Water bath | Sheldon Manufacturing Inc., USA | W20M-2 / 03068308 / 9021195 | |
Yeast extract | Pró-vida, Portugal | 51% Protein, 15% Carbohydrate |