Summary
여기에 제시 된 3D 문화 조건에서 돼지 난모세포의 캡슐화를위한 두 가지 프로토콜이 있습니다. 첫 번째, 적수-oocyte 복합체 (COC) 피브린-알자네이트 구슬에 캡슐화 된다. 두 번째, 그들은 불소 에틸렌 프로필렌 분말 입자로 동봉되어 (미생물 반응기). 두 시스템 모두 최적의 조건을 통해 3D 조직을 유지관리합니다.
Abstract
생식 생물학에서 인공 수정 및 배아 전달 기술로 시작된 생명 공학 혁명은 체외 성숙 (IVM), 체외 수정 (IVF) 및 체세포에서 핵 전송에 의한 국산 동물의 복제와 같은 보조 생식 기술의 개발로 이어졌습니다. IVM은 특히 중요한 방법입니다. 상업적으로 중요하거나 멸종 위기에 처한 종의 생성 간격 의 감소, 체외 인간 생식에 관한 연구, 세포 치료를 위한 형질 전환 동물의 생산 과 같은 응용 분야에 대한 성숙하고 양질의 난모세포의 공급을 위한 플랫폼 기술입니다. 난모세포 품질이라는 용어에는 성숙을 완료하고 수정되어 건강한 자손이 될 수 있는 능력이 포함됩니다. 이것은 좋은 품질의 난모세포가 IVF 절차를 포함하여 성공적인 수정을 위해 가장 중요하다는 것을 의미합니다. 이것은 인간 난모세포의 뿐 아니라 또한 그밖 큰 포유류 종의 성장을 지원하는 믿을 수 있는 문화 방법을 개발하는 많은 어려움을 제기합니다. IVM의 첫 번째 단계는 난모세포의 체외 배양입니다. 이 작품은 돼지 난모세포의 3D 문화에 대한 두 가지 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째, 3D 모델 적혈구-oocyte 복합체(COC)는 피브린-알기네이트 비드 상호 침투 네트워크에 캡슐화되어 피브린과 알기네이트의 혼합물이 동시에 겔화된다. 두 번째 하나에서, COC는 액체 대리석 (LM)으로 정의 된 미생물 반응기를 형성하기 위해 응소 에틸렌 프로필렌 (FEP; 헥사 플루오로 프로필렌과 테트라 플루오로로틸렌의 합합체) 분말 입자로 캡슐화 된 중간 방울로 중단됩니다. 두 3D 시스템은 체외 배양 환경에서 기체를 유지합니다. 또한 COC 3D 조직을 유지하여 수축및 갭 접합의 결과적으로 중단을 방지하여 난소 세포와 주변 여포 세포 사이의 기능적 관계를 보존합니다.
Introduction
3차원(3D) 시스템을 포함한 다양한 문화 시스템의 개발은 개발 초기 단계인 여포로부터 분리된 난모세포의 성장과 성숙을 위한 최적의 조건을 제공하는 것을 목표로 하고 있습니다. 이는 특히 암치료후 불임으로 어려움을 겪고 있는 여성의 수가 증가하고 있다는 점에서 보조 생식 기술(ART)에 매우 중요합니다. 체외 조건에서 난모세포의 성숙 (IVM)은 이미 가축 재생을 목적으로 체외 배아 생성에 주로 사용되는 잘 확립 된기술이다 2. 그러나, 대부분의 포유류 종에서는 적혈구-난낭체 복합체(COC)의 성숙률이 높더라도 달성할 수 있다(범위 60~ 90%)3,그들의 발달 능력은 여전히 필요에 부적당하다. 이는 발아세포 단계까지도 그런 방식으로 얻어진 자고테의 발달이 낮고 대리동물로 옮겨진 후 용어에 대한 생존능력이 감소하기 때문이다. 따라서, IVM 시술4를받은 난모세포로부터 얻어진 배아의 발달 능력을 증가시킬 필요가 있다. 따라서, 새로운 성숙배지(5)가 고안되고 있으며, 다양한 성장인자와 분자를 가진 배양매체의5 보충과 함께8,6,,7, 7의 시험관내 배양문화가 시험되고있다.
완전한 IVM 시스템의 첫 번째 단계는 체외 문화 동안 난모세포의 지속 가능한 성장을위한 최적의 조건을 만드는 것입니다. 난소 세포 성장은 meiosis10,,11을재개하는 oocyte의 능력의 특정 지표 중 하나입니다. 또한, 체외 배양 시스템의 적절한 난모세포는 핵 성숙과 세포질분화(12)를지원할 수 있어야 한다. 적혈구-오낭복합체의 형태는 인간과가축(12,,13)에서체외 수정(IVF) 절차의 후속 단계에 가장 적합한 난피티를 선택하기 위해 ART 클리닉에서 사용되는 또 다른 중요한 지표이다. 고려 된 COC의 형태학적 특성 중 에는 난십성 직경, 세포질 과립 및 최초의 극지 체 무결성14,15. 게다가, 난소 세포 발달 잠재력은 나낭세포를 둘러싼 적수 세포의 외관 그리고 다짐 및 수와 상관관계가 있습니다. 체외 배양 시스템에서 적절한 난낭체에 매우 중요한 것은 또한 난퀴트-적혈구 세포의 유지보수가 적절한 상호작용및 세포골격안정성(16,,17,,18,,19)이다. 지금까지, 인간 COC 내의 체외 난십성장은20을입증되었다. 소 COC의 사용은 또한 살아있는 출생으로 귀착되었습니다. 이들은 미숙한 난소 여포에서 격리된 다음 14일 동안 배양되어 난소가 IVF절차(21)를겪을 수 있는 충분히 커졌다. 유사하게, 개코원숭이 개성적인 여포로부터 분리된 COC는, 체외 배양 후 IVM을 실시하여 정상적인 스핀들구조(22)를가진 대사 II 단계에 메이오시스를 재연할 수 있는 난모세포를 산출하였다. 그러나, 이 연구에서 저자는 그들을 비옥하 하려고 하지 않았다. 그럼에도 불구하고 이러한 결과는 유사한 절차가 이러한 특정 포유류 종뿐만 아니라 성공적인 IVF 기술에 적합한 양질의 난동을 얻을 수 있어야 할 여포에서 얻은 인간의 적혈구 -oocyte 복합체에 적용 될 수 있음을 나타냅니다.
상기 설명된 결과는 2차원(2D) 시스템에서 난모세포가 배양되는 동안 기존의 IVM 프로토콜의 적용으로 얻어졌다. 2D 배양 시스템의 일상적인 절차는 미네랄 오일23,24와함께 적절한 배양 매체의 한 방울에 침지 된 난모세포를 다루고 있습니다., 체외 내 분피 배양 중 오일 오버레이는 액체 증발을 방지하여 배양시 적절한 pH 및 삼투압의 유지를 보장하는 역할을 한다고 가정합니다. 이러한 2D 배양 시스템은 성숙한 돼지난우세포(25)의87%까지도 얻을 수 있지만, 미네랄 오일 오버레이가 적절한 난소세포 개발에 필요한 지질 용해성 물질의 상당한 확산을 야기한다는 것이입증되었다(26) 또한, 스테로이드(황체호르몬 및 에스트로겐) 난모세포 배양 시 미네랄 오일로 확산되기 때문에, 돼지 난모세포의 개발 능력 달성의 핵 성숙 및 감소가 관찰되었다. 이로 인해 소수의 zygotes를 획득할 수 있으며, 이는 또한 배반물의 단계에 낮은 발달 능력을 특징으로 하며, 수령인동물(27)으로이송된 후 생존력이 떨어지는 것을 특징으로 한다. 따라서, IVM 시술 후에 수신된 난모세포에서 유래된 배아의 발달 능력을 높이기 위한 시도가 이루어지고 있으며, 특히 3차원(3D) 시스템을 사용하여 복잡한 C와 함께 배양된 난모세포의 세포질 및 핵 성숙도를 달성하기 위한 최적의 조건을 조성함으로써, 특히 3차원(3D) 시스템을 사용하고 있다. 다양한 혁신적인 체외 배양 시스템은 지난28년,29년에개발되었다.28 이들은 세포의 자연적인 공간 조직을 유지하고 전통적인 2D 문화권에서 달성할 수 없는 문화 접시에서 그들의 평탄화를 피하기 위하여 디자인되었습니다. 배양된 COC의 구조적 및 기능적 활동은 다양한구획(30)의간격 접합을 통해 적절한 아키텍처와 방해받지 않는 통신의 유지보수에 의해 보장될 수 있다. 적수-오사이클 복합체의 체외 배양3D에 대한 바이오 스캐폴드의 적합성은 세포외 매트릭스(ECM; 콜라겐 및 히알루론산)31 또는 불활성 중합체(alginate)32의다양한 성분과 같은 천연 생체 물질을 사용하여 평가되었다. 여러 종에서 테스트 이러한 시도는 oocyte meiosis 재개 및 그들의 전체 능력의 성취의 측면에서 유망한 결과를 가져왔다33,,34,,35. 그러나 지금까지 돼지를 포함한 대형 국산 동물으로부터 분리된 COC 성숙에 적합한 3D 시스템은 개발되지 않았습니다.
이 작품은 돼지 COC의 3D 문화에 사용할 수있는 두 가지 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째 프로토콜은 피브린 알기네이트 구슬(FAB)의 캡슐화를 설명합니다. FAB는 동기적 젤화 과정을 거치는 알기네이트 및 피브린 용액을 동시에 혼합하여 형성될 수 있다. 이 조합은 두 구성 요소 모두 매트릭스 강성에 기여하기 때문에 동적 기계적 환경을 제공합니다. 마우스 난소 여포 문화와 성숙(36)에대해 유사한 해결책이 이전에 사용되었습니다. 제시된 프로토콜의 경우, 알기네이트-피브린 네트워크의 조기 분해를 피하기 위해, 염화칼슘 용액의 농도가 적절히 높아 빠르고 안정적인 겔화 과정을 보장한다. 역동적인 기계적 환경은 COCs가 상주하고 크기가 증가하는 자연적인 여포 내 환경에서 이와 유사한 조건을 만듭니다. 또한, 이 작품은 이들 중간 의 한 방울에 일시 중단되고 불소 에틸렌 프로필렌 (FEP; 헥사플루오로 프로필렌과 테트라 플루오로로틸렌) 분말 입자로 캡슐화되는 COC 3D 배양 시스템의 대표적인 결과를 보여 주며 미생물 반응기 (액체 대리석, LM)를 형성합니다. LM은 이전에 살아있는미생물(37),종양 스페로이드(38) 및 배아 줄기세포(39)의 성장을 지원하는 것으로39나타난 3D 생물반응기의 한 형태이다.38 LM은 양 오사이클배양(40)에도성공적으로 사용되었습니다. LM을 이용한 대부분의 실험에서, 생물반응기는 1 μm41의입자 크기로 폴리테트라플루오로로틸렌(PTFE) 분말 침대를 사용하여 제조하였다. 제시된 프로토콜은 FEP를 사용하며, 이는 플루오로폴리머 PTFE에 대한 조성 및 특성에서 매우 유사하다. 그러나 FEP는 PTFE보다 더 쉽고 부드럽고 특히 중요한 것은 매우 투명합니다.
두 3D 시스템은 체외 배양 환경에서 기체를 유지합니다. 그(것)들은 또한 그들의 편평하고 간격 접합의 결과로 중단을 방지하고, oocyte와 주변 여포 세포 사이 그들의 기능적인 관계를 보존하여 COCs 3D 조직을 유지합니다.
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Protocol
다음 절차는 야기엘로니안 대학의 동물학 및 생물 의학 연구 연구소의 동물 복지 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 돼지 적혈구 -oocyte 복합체의 격리
- 난소 여포의 격리를 위한 물질을 수집하기 위해, 지역 도살장에서 프레우버탈 금(약 6-7개월, 무게 70~80kg)에서 돼지 난소를 소비한다. 각 실험에서 COC 격리를 위해 10마리의 동물중 약 20마리의 돼지 난소를 선택하십시오.
참고: 각 난소가 3-5여포를 산출한다는 가정하에 총 여포 수는 60개에서 100개로 다양합니다. - 멸균 인산염 완충식식염(PBS; pH 7.4; 38°C)이 1% AAS를 함유한 보온병에 난소를 놓습니다. 실험 물질이 항생제를 함유한 멸균 PBS로 두 번 헹구는 1 시간 이내에 실험실로 이송되는지 확인하십시오.
- 난소를 헹구고, HM 배지로 채워진 비커로 옮기고 모든 조작시 동안 38°C의 인큐베이터에 보관한다.
참고: 난낭 처리 중 최적의 결과를 얻으려면, 2.5%의 항생제/항mycotic 솔루션(AAS) 및 10%의 태아 소 혈청(FBS)을 추가하여 DMEM/F12 배지(취급 매체, HM)의 모든 절차를 수행하고 온도 조절(38°C) 이하의 온도 조절이 가능한 가열 테이블에서 PH를 제어합니다.2 - 큰 돼지 여포 (직경 6-8 mm)에서 실온에서 10 분 동안 100 x g에서 포부 및 원심 분리에 의해 여포 액액 (FF)을 수집합니다. 그 후, 0.2 μm 멤브레인 모공 필터에 부착된 멸균 주사기를 사용하여 상체를 필터링하고 -80 ° C에서 동결합니다.
참고: 인슐린 주사기(u-40)를 사용하여 여포액을 포부합니다. - 건강한 중형 모낭(직경 4~6mm)만 코크스절연(42)에대해 선택되도록 한다.
참고: 동질적인 ooplasm 및 다층(적어도 3-4) 소형 적정체가 있는 온전하고 둥근 난미를 소지하고 있는 1급 의 COC는 추가 3D IVM시술(43)에적합한 것으로 간주된다. - COC를 분리하려면 2-3 난소를 HM으로 채워진 멸균 10cm 직경페트리 접시로 옮기고 아래 절차 중 하나를 따라 중형 여포에서 COC를 분리합니다.
- 돌출난소 여포의 표면을 멸균 수술 블레이드 15C로 부드럽게 자릅니다. 이것은 COCs와 더불어 여포 액체가 페트리 접시로 흘러 나가는 원인이 될 것입니다.
- 일회용 주사기에 부착된 5/8"의 크기를 갖는 28 G 바늘을 사용하여 여포 함량을 흡인시키고 페트리 접시에 옮긴다.
참고 : 난소 조직의 유해를 폐기하십시오. 격리의 후속 단계는 스테레오 현미경으로 수행됩니다.
- 3-5 60mm IVF 페트리 요리를 준비합니다.
- 중앙 우물에 HM 1mL을 추가하고 외부 고리에 3-4 방울의 HM (드롭 당 50 μL)을 놓습니다.
- 그런 다음 폴리카보네이트 마이크로파이프를 사용하여 손상되지 않은 COC를 외부 고리에 HM을 떨어뜨려 3-4시간 간 간략하게 헹구도록 합니다.
- 결국, 개별적으로 중앙 우물로 전송합니다. 이 IVF 플레이트를 인큐베이터에 저장하여 추가 절차를 진행합니다.
- COC를 수집한 후 아래에 나열된 두 개의 다른 IVM 캡슐화 프로토콜에 무작위로 할당하여 최종 선택 단계를 수행합니다.
2. 피브린 알기네이트 하이드로겔 구슬 캡슐화
- 트리스 버퍼식 식염수(TBS; pH 7.4)에서 50IU/mL 혈소판 1mL를 2.0mL 멸균 마이크로센티리후지 튜브에 100mMMMCaCl2로 준비한다.
- 피브리노겐 스톡 솔루션(TBS에서 50 mg/mL)을 준비하고 냉동 상태로 유지하십시오.
참고: TBS에서 피브리노겐을 용해할 때 응집하지 않으려면 TBS를 37°C로 가열합니다.- 시술 당일, 얼음에 천천히 해동하고 사용 직전에 실온으로 가져 온다.
- 1:1 비율 알자네이트 용액과 50 mg/mL 피브리노겐 용액에서 혼합을 사용하기 직전 2mL(FA)를 얻을 수 있습니다. 멸균 미세 원심 분리기 튜브에서 혼합물을 부드럽게 소용돌이시다. 거품을 하지 마십시오.
- "인큐베이션 챔버"를 준비하려면 유리 현미경 슬라이드에 파라핀 필름의 얇은 스트립을 적용하십시오.
참고: 사용하기 전에 70% EtOH로 슬라이드를 닦아냅니다. 하나의 배양 챔버는 두 개의 슬라이드로 형성된다. 그들을 분리하려면, 그들 중 하나에 3mm 스페이서를 배치합니다. - 파이펫 7.5 μL은 FA 혼합물을 이 파라핀 필름 코팅 유리 슬라이드에 떨어뜨려 스페이서를 분리합니다. 한 슬라이드 플레이스에 8-10 방울, 두 개의 행으로 배열.
- 마이크로피펫, 3-5 개의 COC를 사용하여 성숙 매체 (MM)의 최소 부피 (최대 5 μL)를 사용하여 FA 드롭의 중심에 정확하게 배치합니다. 이 절차는 좋은 수동 기술과 정밀도가 필요합니다.
참고: 성숙 배지(MM)는 DMEM/F12로 구성되어 있으며, 10IU/mL PMSG, 10IU/mL hCG, 10% FBS 및 50% 돼지 여포액(FF)으로 구성됩니다. - 각 FA 드롭에 7.5 μL의 혈전/Ca2+ 용액을 추가하여 커버합니다. 젤이 거의 즉각적으로 형성되기 때문에 혼합 할 필요가 없습니다.
- 이전에 준비된 두 번째 유리 슬라이드를 FA 캡슐에 적용하여 인큐베이션 챔버를 덮습니다. 매우 신중하지만 단단한 움직임으로 챔버를 거꾸로 뒤집어 건조를 피하기 위해 촉촉한 필터 종이가 늘어선 100mm 페트리 접시에 놓습니다.
- 이어서, 페트리 접시를 약 5-7분 동안 5% CO2 인큐베이터(38°C)로 옮기다. 그 후, FA 캡슐 때문에 피브린과 알기네이트의 동시 젤레이션의 흐린 될 것입니다.
- FA 캡슐을 우물당 100 μL MM을 함유한 96개의 웰 플레이트(웰당 1캡슐)로 옮직합니다.
참고: 형성된 FA 캡슐을 손상시키지 않도록 외과 용 포셉을 사용하여 이 단계를 신중하게 수행하십시오. - 2일마다 MM(50 μL)의 절반을 신선하고 미리 평형된 MM으로 대체합니다. 반전 된 빛 현미경을 사용하여 이미지 COC (10 배율에서).
참고: COC FA 문화에 대한 문화 조건: 38°C, 5% CO2 분위기 및 상대 습도 95%. IVM의 4 일 후에, 하이드로겔은 fibrin 성분의 점진적인 저하 때문에 거의 명확하게 나타납니다. 나머지 알기네이트는 효소적으로 분해되어야 합니다 - 알기네이트-리아제, 특히 알기네이트를 저하시키고 동물 세포에 영향을 미치지 않는 식물 유래 효소에 의해.- 캡슐이 들어 있는 우물에서 MM을 제거하고 DMEM에 IU/mL 알기네이트 리아아제 10μL을 추가합니다. 배양판을 인큐베이터에 25-30분 간 둡니다.
- 용존 캡슐에서 COC를 제거합니다.
참고: 이 작업은 절단 파이펫 팁으로 수행할 수 있습니다. - 신선한 DMEM에서 여러 세척 후, PBS를 포함하는 IVF 접시 (접시 당 5-10 COC)의 내부 링으로 COC를 전송합니다. 지금, 추가 형태학적 또는 생화학 적 분석을 위해 그들을 사용.
3. 초소수성 불소 에틸렌 프로필렌 (FEP) 미생물 반응기에서 캡슐화.
참고: 모든 IVM 절차가 온도 조절 테이블에서 수행되고 COC가 처리 기간 내내 38°C로 유지되도록 하십시오.
- FEP 파우더 침대 평균 입자 크기 1 μm 5g을 함유한 30mm 페트리 접시를 준비합니다.
참고: 신선한 FEP 파우더를 사용하는 것이 중요합니다. 재사용된 FEP는 응집하고 덩어리를 형성하는 경향이 있습니다. - FEP 분말의 침대에 1.6 단계에서 격리된 3-5개의 COC를 포함하는 MM(~30 μL 볼륨)의 단일 액적을 분배합니다. 이러한 입자가 액체 낙하 및 형성 된 액체 대리석 (LM)의 표면을 완전히 덮었는지 확인하기 위해 원형 모션으로 플레이트를 부드럽게 회전합니다.
- 1,000 μL 팁이 있는 파이펫을 사용하여 형성된 LM을 선택합니다.
참고: LM(4-5mm)의 직경을 수용하기 위해 가장자리에 파이펫 팁을 잘라냅니다. 이러한 준비 된 팁의 대략적인 직경은 LM보다 약간 커야합니다. - 60mm IVF 페트리 요리를 준비합니다. 3-4mL의 멸균 수를 외부 고리에 추가하여 습도 챔버를 준비합니다. 다음으로 LM 하나를 중앙 우물에 배치합니다.
참고 : 이 절차는 좋은 수동 기술과 정밀도가 필요합니다 - 대리석이 부주의하게 배치되거나 낮은 높이에서 떨어지면 파괴됩니다. - 5 % CO2 인큐베이터에서 38 °C에서 4 일 동안 구슬을 배양하십시오.
- 절차 다음 매일 매체를 변경: 각 LM에 MM의 30 μL을 적용, 직접 액체 접촉 코팅 FEP 분말의 소수성을 방해하기 때문에 확산을 일으킬 것입니다. 대리석 함량이 용해되면 생물 반응기에서 방출된 COC를 페트리 접시에 신선한 MM 한 방울로 옮습니다.
참고: 방출된 COC를 정확하게 전송하려면 폴리카보네이트 마이크로파이프를 사용하십시오. - FEP 입자를 제거하기 위해 MM(3-4회)에서 여러 번 세차한 후, 30 μL의 신선한 MM로 FEP 파우더 침대에 옮겨 넣습니다. 분말 입자가 액체 낙하의 표면을 완전히 덮고 새로운 LM을 형성하도록 원형 모션으로 플레이트를 부드럽게 회전시킵니다.
- 그런 다음 3.3-3.4 단계에서 절차를 따르십시오.
참고: FEP 분말의 투명한 코팅을 통해 가벼운 현미경을 사용하여 LM 함량을 모니터링할 수 있습니다.
- 절차 다음 매일 매체를 변경: 각 LM에 MM의 30 μL을 적용, 직접 액체 접촉 코팅 FEP 분말의 소수성을 방해하기 때문에 확산을 일으킬 것입니다. 대리석 함량이 용해되면 생물 반응기에서 방출된 COC를 페트리 접시에 신선한 MM 한 방울로 옮습니다.
4. 두 개의 3D 시스템을 사용하여 96-h IVM 절차 후 COC의 특성화
참고: 사용되는 IVM 시스템의 효율성을 결정하기 위해 가벼운 현미경으로 COCs를 형태학적으로 채점합니다. 또한, COC 생존가능성44의분석을 위해 칼세인 AM과 에디듐 호모이머(EthD-1) 염료를 사용한 이중 형광 라벨링을 사용한다.
- 빛과 형광 현미경 검사에 의해 IVM 후 난모세포의 형태학적 검사.
- 38 °C 1x PBS로 CC (FAB를 사용하여 배양에서 파생 된 것과 LM에서 파생 된 COC 모두)를 세척하십시오.
참고: COC의 처리를 용이하게 하고 염색 절차 중에 손상시키지 않도록 하려면 96 또는 48 웰 플레이트를 사용하고 COC를 후속 우물로 이송하여 각 염색 단계를 수행하십시오. - 1.6mM 칼신 AM의 100 μL및 37°C에서 30-45분 동안 5.5mM EthD-1로 배양한다. 두 물질을 1x PBS로 희석합니다.
참고: 이것은 2색 형광 분석이므로 어둠 속에서 이 단계를 수행하십시오. - 인큐베이션 후, PBS에서 COC를 두 번 세척한 다음 형광 단백질과형광염(재료표)의빠른 광표백을 방지하도록 설계된 안티페이드 장착 배지에 담급니다.
참고: 매니큐어로 건조하지 않도록 커버 글래스의 가장자리를 보호합니다. - 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 염색된 샘플을 시각화합니다.
참고: 두 프로브의 형광을 자극하기 위해 (즉, 칼세인과 에티듐 호모디머-1, EthD-1)는 488nm에 아르곤 레이저를 튜닝합니다. 방출된 형광은 트리플 이크로릭 필터 488/561/633으로 분리된 다음 녹색 필터(calcein)에 대해 505-570 nm로 측정하고 빨간색 필터(EthD-1)의 경우 630-750 nm로 측정됩니다. - 죽은 과립세포의 비율에 따라 공초점 형광 이미징에 기초하여 배양에서 난소 여포에 적용되는 수정된 분류를 사용하여 4가지 범주로 COC를분류한다(35). V1: 약 100% 실행 가능한 C를 가진 COC; V2: 죽은 CC의 10%를 가진 COC; V3: 죽은 CC의 10-50%를 가진 COC; V4: 죽은 C의 50%를 보유한 COC.
참고 : 기술적으로, 살아있는 죽은 분석과 난모세포의 생존가능성을 평가하기어렵다; 따라서 미토콘드리아 초구조 또는 활성을 분석하여 예를 들어 추정되어야 한다.
- 38 °C 1x PBS로 CC (FAB를 사용하여 배양에서 파생 된 것과 LM에서 파생 된 COC 모두)를 세척하십시오.
- 전염 전자 현미경 검사에 의해 IVM 후 난모세포의 초구조체를 검사한다.
- COC를 100 μL 2.5% 글루타랄데히드에서 0.1M 나트륨 코코디레이트 버퍼(pH 7.2, 실온)로 2시간 동안 수정합니다.
- COC를 100 μL 0.1 M 나트륨 코코디레이트 버퍼(하룻밤 4°C)에 침수하고 동일한 버퍼로 헹구는다.
- 1시간 동안 0.1M 나트륨 코코디레이트 버퍼(실온)에서 1% 오스뮴 테트산화물을 함유한 엽서 COC를 후퇴한다.
- 우란아액아테이트(1%)에 염색한 후, 에탄올 희석제(50%, 60%, 70%, 90%, 100%) 증가하는 시리즈에서 탈수된 COC가 실온에서 하룻밤 동안 침투한 후, 두 번의 짧은 수지 변경이 뒤이어 LR 화이트에 포함시됩니다.
- 다음으로, 메틸렌 블루/azure II로 시료를 지향하고 평가하기 위해 반박형 섹션(1 μm)을 염색한다.
- 마지막으로 TEM을 통해 초구조적 수준에서 초박하고 이중으로 얼룩진 섹션을 검사합니다.
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Representative Results
두 IVM 시스템을 모두 사용하는 COC에서, 과립 세포는 서로 단단히 부착하고, 복구 된 COC의 대부분은 적혈구 세포의 그대로 층을 가졌다(그림 1A, B). 추가적으로, 적수 세포의 상당한 비율이 유지되었다.
COC 생존가능성 분석에서 얻은 결과는 두 시스템이 시험관내 조건에서 3D에서 돼지 난우세포의 캡슐화를 위해 적용된 것이 최적의 성장 조건을 보장하는 것을 확인하였다(그림2). 두 그룹에서는 V1 = 13 %, V2 = 87 % FAB 및 10 % V1, LM의 경우 90 % V2만 관찰하였다(표1).
전염 전자 현미경 검사법(TEM)에 의해 관찰된 미토콘드리아는 난모세포로 균등하게 분포되었고, IVM 후 의 형상은 쉘과 같은45이었다. 그들 중 몇 명만이 길어졌으며, 또한 그들의 클러스터링은 산발적으로 관찰되었다(그림1C,D). 내피 성 망상은 미토콘드리아와 연관되거나 난모세포 세포질에서 무료인 것으로 관찰되었다. 지질 방울은 작은 어두운 둥근 구조로 나타났고 골기 장치는 팽창 된 시스테나(그림 1C, D)로나타났다.
| V1 | V2 | V3 | V4 | ||||
| % | 수 | % | 수 | % | 수 | % | |
| 팹 | 13% | 7 | 87% | 48 | - | - | |
| Lm | 10% | 9 | 90% | 80 | - | - | |
| COC 총 수: 144 | 16a | 128b | 0 | 0 | |||
표 1. 피브린-알기네이트 비드(FAB) 및 미생물반응기 FEP, 리퀴드 구슬(LM)을 사용하여 캡슐화 후 COC의 생존 가능성에 대한 결과. 결과는 평균으로 주어졌다. 슈퍼스크립트(a, b)가 있는 값은 통계적으로 크게 다릅니다(p&0.05).
그림 1: 캡슐화 96h 후 COC의 형태및 초구조를 보여주는 대표적인 이미지. (A)FAB 내부의 COC의 형태 - 빛 현미경 검사법; (B)LM 내부 의 COC의 형태 - 빛 현미경 검사; C: 난피세포 초구조(TEM) 내부체외 배양 후; D: LM 내부의 체외 배양 후 오사이클 울트라 구조(TEM). O: 오키테; C: 적수 세포; ZP: 조나 펠루치다; N: 핵; M: 미토콘드리아; G: 골기 장치; ER: 풍토성 망상; Lp: 지질 물방울; FA: 알기네이트와 피브린 필라멘트; FEP: 헥사플루오로프로필렌과 테트라플루오로에틸렌의 중합체 분말. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 캡슐화 96h 후 COC의 대표적인 형광 이미지. (A,B) 두 개의 필터를 사용하여 체외 배양 후 동일한 COC를 획득한 이미지는 각각 살아있는 또는 죽은 세포에 대한 녹색 형광 또는 적색 형광을 시각화하고(C)둘 다의 병합한다. (D,E) LM을 이용한 체외 배양 후 동일한 COC를 획득한 이미지는 각각 살아있는 또는 죽은 세포에 대한 녹색 형광 또는 적색 형광을시각화하고(F)병합한다. 스케일 바 = 50 μm. 백색 별표는 세포가 자멸을 겪고 있음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
체외 성장뿐만 아니라 난소 세포를 둘러싸고 동시에 성숙을 지원하는 능력은 성공적인 보조 생식 기술과 특히 인간이나 돼지와 같은 장기간 여포 성장을 겪고있는 종에서 체세포 / oocyte 상호 작용에 대한 이해를 증진하는 데 매우 중요합니다. 지속적으로 향상된 IVM 기술은 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 조기 난소 실패, 또는 결정적인 불임 (종양 요법)의 경우에 생식 옵션을 보존하는 유용한 도구가되고있다. 또한, 특정 난소 기능 장애는 변이 조절 된 여포 성장에 의해 발생할 수 있기 때문에, 난소 세포의 적절한 개발을 제어하는 분자 및 세포 메커니즘을 이해하는 것은 이러한 조건의 병리 생리학 및 합리적인 치료에 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. IVM 동안 COC 3D 아키텍처의 유지 관리를 지원하는 체외 배양 시스템은 매트릭스 또는 생물 반응기 내부에 캡슐화 단계가 필요합니다. 이 작품은 돼지 난모세포의 문화에 적용할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. 여기에 제시된 체외 배양 시스템은 모두 사용자 친화적이며 난낭 세포 와 적수 세포 생존을 효과적으로 제어할 수 있도록 하기 위해 여기에 제시된 시험관 내 배양 시스템입니다.
여기에 제시된 피브린-알지네이트 하이드로겔 비즈(FAB)에서 캡슐화를 이용한 COC의 첫 번째 체외 배양 방법은 능동적으로 세포 반응성 매트릭스 환경에서 3D 난사이클로 성장할 수 있게 한다. 알기네이트 하이드로겔을 기반으로 이전에 발표된 프로토콜은 일반적으로 매우 유망한 결과32를가진 수많은 동물 종에서 분리된 난소 여포의 발달을 조사하는 데 사용되었다. 흥미롭게도, 알기네이트하이드로겔(32) 또는 캡슐화 방법자체(46)의최종 조성에 관계없이, 이러한 연구는 알자네이트 비드 기반 3D 배양 시스템이 여포 성장과 생존을 지원할 수 있었다는 것을 보여주었다.
Alginate 하이드로겔은 여포에 부드럽게, 그들의 추가 생존 또는 시험관 내 발달에 영향을 미치지 않습니다. 유사하게, 여기에서 처음으로 기술된 COC의 체외 배양 프로토콜은 형태학적 및 초구조적 수준에서 문서화되었기 때문에 양질의 돼지 난모를 생성하는 것이 적합하다. 알게네이트 용액과 동시 겔화에 피브리노겐의 존재는 3차원 환경을 생성하고 더욱 안정화시키는 상호 관통 네트워크의 형성을 초래합니다. 이러한 매트릭스 내부의 특정 구조 적 지지로 인해, 난피세포와 적수 세포 사이의 세포-세포 접촉 및 파라크리온 통신은 생체 내에서 존재하는 이들와 유사하게 유지된다.
본 문서에서 설명된 성숙 프로토콜에서 가장 중요한 두 단계는 인큐베이션 챔버에서 MM(단계 2.10.)을 포함하는 96웰 플레이트로 FA 캡슐을 옮기고, 알자네이트 리아제(steps 2.11.)를 사용하여 남은 알자네이트의 효소 분해 후 용존 캡슐에서 COC를 제거하는 것이다. 두 단계 모두 COC손상 - 두 번째 경우 캡슐의 파괴를 피하기 위해 상당한 수동 기술과 정밀도가 필요합니다.
이 방법의 주요 강점은, 큰 국내 동물의 난모성 성숙을 위한 최적 조건을 확립하는 것 이외에, TEM, 광 현미경 또는 공초점 현미경 검사를 사용하여 분석하는 동안, 캡슐 제거가 필요하지 않다는 것입니다. 알기네이트는 이미징 할 때 장벽이 아닙니다. 캡슐에 COC를 두면 염색 시술 중에 조작이 용이합니다.
여기에 제시된 두 번째 COC 내 체외 배양은 일반적으로 미세 스케일 입자로 덮여 있고 매우 소수성분말(47)에서소량의 액체를 압연하여 얻어지는 비스틱 액적LM을 사용하는 LM의 사용이다. 문화용 LM의 사용과 함께 이전 연구는, 그 외섬유아세포(48),적혈구(49),종양의 오르간이드(38), 췌장세포(50 또는 양 난낭36)를 사용하여 소수성 폴리머(PTFE)를 사용하여 소수성 폴리머를 제조하였다.3850 36 PTFE는 클리닉 (예 : 심혈관 이식)에서 널리 사용됩니다.
이 작품에서, 우리는 처음으로, 돼지 COC의 체외 배양을 위한 FEP 입자로 만든 미생물 반응기를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. PTFE와 조성 및 속성과 매우 유사한 제시 된 프로토콜에서 FEP를 사용하면 LM을 훨씬 쉽게 준비할 수 있습니다. 이 분말은 PTFE보다 부드럽고 특히 중요한 것은 투명합니다. 이것은 차례로 그것의 사용으로 배양된 구조물의 화상 진찰 도중 작업을 단순화합니다. FEP를 사용하여 LM을 형성하는 용이성은 이 방법의 확실한 이점입니다.
이 문서에서 설명한 성숙 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 파이펫 팁(Step 3.3. 및 3.4.)을 사용하여 형성된 LM을 60mm IVF 페트리 접시로 집어 들고 옮기는 것입니다. 이러한 단계는 LM의 파괴를 피하기 위해 상당한 수동 기술과 정밀도가 필요합니다.
아마도, 여기에 제시 된 3D 난소 세포 성숙 유도 프로토콜의 주요 제한은 항생제로 치료되지 않는 동물에서 수집 된 적절한 연구 자료를 얻기에 상대적으로 큰 어려움이다, 단백 동화 스테로이드 (즉, nadrolone, boldenone) 또는 그들의 급속한 성장을 촉진 하는 멜겐게스트롤 아세테이트. 이러한 스테로이드, 유럽에서 금지 되 고 그들의 사용에도 불구 하 고, 여전히 널리 살찌는 기간의 마지막 2 개월 동안 산업 가축 사육에 활용, 원인, 다른 사람의 사이에서, 방해 성적 성숙.
결론적으로, 여기에 제시된 두 3D 시스템은 체외 배양 환경에서 최적의 기체를 유지합니다. 또한 COC 3D 조직을 유지하여 간격 접합의 평평화 및 결과적으로 중단을 방지하여 난소세포와 주변 여포 세포 사이의 기능적 관계를 보존하여 적절한 난피세포 성숙에 매우 중요합니다. 따라서, 두 모델 모두 생식 생물학에 있는 기본적인 연구를 위한 귀중한 공구이고 또한 향상된 불모 처리로 이끌어 내는 임상 관련성이 있을 수 있습니다. 또한, 그들은 또한 새로운 생명 공학 방법 개발에 대 한 적용 될 수 있습니다., 가축 개선에 대 한 뿐만 아니라.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 매우 감사: 박사 Waclaw Tworzydlo (발달 생물학 및 무척추 동물 형태학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, Jagiellonian 대학) TEM의 기술 시설에 대 한; 기술 지원을 위해 비타 스나코프스카 (내분비학 학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, 야기엘로니아 대학)에게; 세포 생물학 및 이미징학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, 자지엘로니아 대학, JEOL JEM 2100HT (JEOL, 도쿄, 일본). 이 작품은 폴란드 국립 과학 센터로부터 2018/29/N/NZ9/00983교부금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm - EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
References
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).
