Summary
Detta protokoll beskriver metoder som används för att förbereda råtta vokala veck för histochemical neuromuskulära studie.
Abstract
Syftet med denna handledning är att beskriva beredningen av råtta vokala vikning för histochemical neuromuskulära studie. Detta protokoll beskriver förfaranden för råtta laryngeal dissekering, flash-frysning och cryosectioning av vokala veck. Denna studie beskriver hur man cryosection vokala veck i både longitudinella och tvärsnitt plan. En nyhet i detta protokoll är laryngeal spårning under cryosectioning som säkerställer korrekt identifiering av de inneboende laryngeal musklerna och minskar risken för vävnad förlust. Siffror visar den progressiva kryosektionen i båda planen. Tjugonio råtta hemi-larynges var cryosectioned och spåras från uppkomsten av sköldkörteln brosk till utseendet på den första sektionen som ingår full vokala vikning. Den fullständiga vokala vikningen visualiserades för alla djur i båda planen. det fanns hög variabilitet i avståndet från utseendet på sköldkörteln brosk till utseendet på den fulla vokala vikningen i båda planen. Vikt var inte korrelerade till djupet av laryngeal landmärken, vilket tyder på individuell variabilitet och andra faktorer relaterade till vävnad beredning kan vara ansvarig för den höga variabiliteten i utseendet på landmärken under sektionering. Denna studie beskriver en metodik och presenterar morfologiska data för att förbereda råtta vokala vikning för histochemical neuromuskulära undersökning. På grund av hög individuell variabilitet bör laryngeala landmärken spåras noggrant under kryosektion för att förhindra överavsnitt av vävnad och vävnadsförlust. Användningen av en konsekvent metod, inklusive adekvat vävnadsberedning och medvetenhet om landmärken inom råttstruphuvudet, kommer att bidra till konsekventa resultat i alla studier och hjälpa nya forskare som är intresserade av att använda råttans vokala vikning som modell för att undersöka laryngeala neuromuskulära mekanismer.
Introduction
Råttstruphuvudet är en väletablerad modell för att undersöka strukturella och funktionella neuromuskulära laryngeala anpassningar till utveckling, åldrande, sjukdom och farmakologiska medel1,2,3,4,5. Konsekvens av histologiska metoder är avgörande för denna arbetslinje, eftersom det finns flera invecklingar involverade i muskelberedning och analys samt utmaningar i samband med laryngeal storlek, form och topografi av musklerna inkapslade i laryngeal brosk1,6,7,8,9,10,11 . På grund av den lilla storleken på råtta inneboende laryngeal muskler, systematiska inbäddning, frysning och cryosectioning är avgörande för att uppnå konsekventa och exakta resultat. Till exempel, när man delar upp råttans vokala vikning i koronalplanet, ligger de neuromuskulära korsningarna (NMJs) av fyra av de inneboende laryngeala musklerna inom mindre än 1,8 mm vävnadsdjup11. Därför är exakt övervakning av laryngeal muskel anatomi under cryosectioning absolut nödvändigt att noggrant identifiera de avsnitt av intresse och förhindra överavsnitt av vävnad. Överavsnitt av målmuskeln kan resultera i felaktig identifiering av antal och topografi av NMJs11 eller kan resultera i övergripande minskningar av provstorleken om målmuskeln kasseras på grund av landmärke orientering förvirring12. Som nya modeller för studier av laryngeal muskel och deras respektive anpassningar utvecklas, standard operativa förfaranden är avgörande för att säkerställa resultaten är exakta, tillförlitliga och reproducerbara över studier.
Syftet med denna artikel är att beskriva beredningen av råtta vokala vikning för optimal längsgående och tvärsnittsanalys. Detaljerade metoder som används regelbundet i vårt laboratorium beskrivs för att identifiera mål muskel landmärken under cryosectioning. Även om liknande metoder används i flera laboratorier, ges större detaljer här än i litteraturen för att säkerställa tillförlitlig och korrekt replikering när den implementeras av nybörjare utredare. Målet med denna handledning är att tillhandahålla en standard metodik för immunohistochemical (IHC) utvärdering av råtta vokala vikning för att förbättra konsistensen mellan laboratorier och undersökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie utfördes i enlighet med Institutional Animal Care and Use Committee vid New York University School of Medicine.
1. Dissekera råttstruphuvudet
- Avliva råtta enligt det institutionellt godkända protokollet. Raka ventrala halsen från underkäken till manubrium och svabba med alkohol för att förhindra pälsförorening i vävnadsproverna.
- Under ett dissekerande scope med 10x förstoring punkt punkt hela struphuvudet genom att skapa ett mittlinje nacksnitt med en skalpell tills luftstrupen exponeras.
- Separera de ventrala extrinsiska laryngealmusklerna vid mittlinjen för att exponera struphuvudet med tång och dissekerande sax eller en skalpell.
- Avskilj trachea caudal till den tredje trakealringen och gör ett snitt rostral till hyoidbenet för att ta bort hela struphuvudet med dissekerande sax.
- Ta bort extrinsiska laryngeal vävnader (matstrupe, sköldkörtel och extrinsic laryngeal muskler) från struphuvudet med hjälp av mikrodissection verktyg (pincett, stift och microscissors) under förstoring.
- Med mikroscissorer, bisect struphuvudet dorsally mellanarytenoids med hjälp av mittlinjen mellan de bakre cricoarytenoid musklerna som ett landmärke. Fäst struphuvudets laterala väggar för att exponera vokalvecken och sedan dela ventrally genom mitten av sköldkörtelbrosket mellan vokalveckens främre commissure med mikroscissorer (figur 1).
Det här steget kan vara valfritt. det kan hoppas över för att hålla struphuvudet helt. Bisection av struphuvuden tillåter flera immunostaining tekniker genom att separat använda höger och vänster sida av samma struphuvudet. - Skölj varje hemi-struphuvud i fosfatbuffrad lösning (PBS) i ~10 s och torka försiktigt med en uppgiftstorkare för att minska iskristallbildningen under frysning.
2. Fixera och/eller blixtfrysa laryngeal vävnad
OBS: Fixering kanske inte är idealisk för alla immunstainingprotokoll. Ofta är laryngeal vävnader flash-fryst färska omedelbart efter dissekering. Hoppa över steg 2.1 för att blixtfrysa laryngeal vävnad utan fixering.
- För att fixa hemi-struphuvuden placera vävnader i centrifugrör fyllda med 4% formaldehyd i PBS i 1 h vid rumstemperatur på en orbital shaker vid 70 rpm. Överför vävnader till ett rent centrifugrör och skölj 3x i 20 min i PBS. Överför sedan till ett rent centrifugrör och sänk ner i en 20% sackaros/5% glycerollösning (~ 18 h eller tills vävnaden sjunker) vid 4 °C.
VARNING: Formaldehyd är farligt och bör användas i en rökhuv tillsammans med lämplig personlig skyddsutrustning. - Placera alla hemi-struphuvuden i ett enhetligt läge i en kryoform fylld med optimal skärtemperatur (OCT) förening. För en hemilarynx, placera vävnaden med den mediala ytan av vokalvecket mot botten av kryomolden och den längsgående aspekten av vokalvecket parallellt med den nedre kanten av kryomoldöppningen. För hela struphuvuden, placera vävnaden med de bakre cricoarytenoidsna vända mot botten av cryomold och den längsgående aspekten av vokalvecket parallellt med den nedre kanten av kryold öppningen.
OBS: Konsekvent laryngeal orientering inom OCT förening är avgörande för cryosectioning av råtta vokala vikning. När hemilarynxen är inbäddad och frusen måste den tinas upp för att ändra dess orientering, vilket medför risker för vävnadsskador från flera upptiningsfrysningscykler. - Flashfrysningsvävnader med isopentan (2-metylbutan) kylda i en stål bägare omgiven av flytande kväve.
OBS: Isopentanen når optimal temperatur för vävnadsfrysning när vita fällningar börjar bildas på bägarens sidor och botten13. Isopentan används eftersom det har en högre värmeledningsförmåga än flytande kväve, vilket hjälper till att förhindra sprickbildning av vävnadsblocket under snabb frysning. För en mer detaljerad beskrivning av frysning vävnad i OTC se Kumar et al.13. - Linda varje form i förmärkt folie och lägg i en individuell fryspåse för att förhindra uttorkning och förvara omedelbart på torris tills den överförs för förvaring i en frys på -80 °C.
3. Kryodd hemilarynx i tvärsnittsplan
- Ställ in kammartemperaturen i kryostaten till -20 °C, som ligger i mitten av temperaturområdet (15−25 °C) som rekommenderas för muskelvävnadssektion enligt tillverkarens handbok.
- Ställ in kryostatsektionens tjocklek på 10 μm tjocka sektioner.
OBS: För muskelfiber tvärsnittsanalys är 10 μm tjocka sektioner optimala för att möjliggöra fullständig färgning och robust bildintensitet av de märkta muskelfibrerna för fiberskrivningsanalys14,15,16. Vissa protokoll kan kräva olika sektion tjocklek beroende på neuromuskulära mål. - Överför vävnader till kryostatkammaren, tillsätt ett enhetligt lager av OCT-förening på kryostatprovskivan (chuck) och placera det inbäddade vävnadsblocket ovanpå OCT-föreningen på provskivan. För att erhålla tvärsnitt av vokalvecket för thyroarytenoid (TA) muskelfiberanalys, fäst provet på chucken så att det ventrala sköldkörtelbrosket vetter mot kryostatbladet och det aarytenoid brosket är vänd mot provskivan.
OBS: Det är viktigt att notera att dessa landmärken inte är synliga i detta skede, på grund av att OCT-föreningen blir vit och ogenomskinlig när den fryses. Denna brist på synlighet är anledningen till att det är viktigt att notera orienteringen av hemilarynx under blixtfrysningsstadiet. - Trimma OCT-föreningen genom att föra fram provhuvudet med 100 μm tills den ventrala delen av sköldkörtelbrosket uppträder.
- Trimma och spåra sedan 30 μm sektioner från uppkomsten av sköldkörtelbrosket tills lamina propria, mediala TA muskler och laterala TA-muskeln exponeras.
OBS: Laryngeal landmärken bör spåras och noteras från början av sköldkörtelbrosket var 100 μm för att säkerställa att sektionsvinkeln inte är sned. Figur 2 representerar de två uppsättningarna laryngeala landmärken i tvärsnittsplanet vid 10x förstoring. - När mål-TA-muskeln har nåtts samlar du sektioner på positivt laddade diabilder vid 10 μm.
- Förvara sektioner i PBS vid 4 °C för att behålla fukt tills de är redo att färgas.
OBS: Fast vävnad kan lagras i PBS upp till en vecka beroende på IHC-målet medan ofixerad vävnad omedelbart bör bearbetas.
4. Kryodd hemilarynx i längsgående plan
- Med kryostatkammaren igen inställd på -20 °C, ändra sektionstjockleken till 30 μm.
OBS: För NMJ-analys kan en vävnadstjocklek mellan 30−60 μm användas för att fånga flera kompletta NMJs i laryngealmusklerna utan fragmentering av antingen nervterminalen eller motorisk endplate11,12,17. - För att erhålla longitudinella vokala vikningssektioner för NMJ-analys av TA-muskeln, fäst proverna på chucken så att epiglottis är orienterade mot kryostatbladet och trakeallumen vetter ner mot provskivan.
- Trimma OCT-föreningen genom att föra fram provhuvudet med 100 μm tills sköldkörtelbrosket uppträder.
- Trim- och spårsektioner på 30 μm från sköldkörtelns början tills laminapropria och mediala och laterala uppdelningar av TA-muskeln exponeras.
OBS: Fem uppsättningar laryngeala landmärken i det längsgående planet rekommenderas att spåra vävnadsdjupsprogression mot mål-TA-muskeln. Figur 3 representerar de laryngeala landmärkena i det längsgående planet vid 10x förstoring. - När mål-TA-muskeln har nåtts samlar du sektioner på positivt laddade diabilder vid 30 μm.
- Förvara sektioner i PBS vid 4 °C för att behålla fukt tills de är redo att färgas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representativa resultaten var en del av en pågående undersökning av effekterna av vocal motion på laryngeal neuromuskulära systemet. Tjugonio manliga Fischer 344/bruna norge råttor (12 9 månader gamla, 17 24 månader gamla) vägdes och avlivades med CO2 inandning följt av en bilaterala thoracotomy.
Förfarandena följde det skisserade protokollet att märka NMJs och fiber storlek av laterala och mediala TA muskler. Avståndet mellan laryngeal landmärken spårades i både longitudinella och tvärsnittsplan med hjälp av laryngeal muskler och omgivande brosk för att bestämma progression under cryosectioning (tabell 1). Spårning började vid det första utseendet på sköldkörtelbrosk i båda riktningsplan. Figur 2 illustrerar utseendet på laryngeala landmärken under tvärsnitts cryosectioning i tidsordning med sköldkörteln (figur 2a,b) som förekommer före den mediala TA-muskeln och lamina propria (figur 2c,d). Figur 3 illustrerar utseendet på laryngeala landmärken under längsgående kryosektion i tidsordning med alarmuskeln (figur 3a,b) som förekommer före den mediala TA-muskeln (figur 3c,d) och laminapropria (figur 3e,f).
I båda riktningsplan varierade avstånden mellan landmärken kraftigt för enskilda djur.
Vikt- och laryngealt landmärke utseenden hade svaga till måttliga korrelationer för unga råttor och svaga korrelationer för åldrade råttor (tabell 2 och tabell 3). Avstånden mellan landmärken inom varje plan var måttligt korrelerade för båda åldersgrupperna, men svagt korrelerade mellan de två dissekeringsplan. Därför kunde variationen i landmärke utseende inte redovisas efter vikt eller individuella variationer i laryngeal storlek.
Figur 1: Ett råttstruphuvud dorsally bisected mellan dearytenoid brosk (ArC).
Höger sida av hemi-struphuvudet är kommenterat med landmärken i det längsgående planet (LZ1-LZ5) som motsvarar de fem längsgående landmärkena i tabell 1. Den vänstra sidan av hemi-struphuvudet är kommenterad med landmärken i tvärsnittsplanet (CZ1 och CZ2) som motsvarar början av den laterala TA-muskeln respektive hela tvärsnittet av vokalvecket. VF = vokal vikning, CrC = cricoid brosk, AlC = alar brosk och T1 = första trakeal ring. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Två tvärsnitt avbildade vid 10x förstoring i brightfield (höger) och i fluorescerande 488-kanalen (vänster) efter immunostaining för laminin för att beskriva muskelfibrer.
Sektionerna (uppifrån och ned) visar progressionen under kryosektion i tidsordning med sköldkörteln (a,b) som uppträder före den mediala TA-muskeln och för lamina propria av vokala vikningen (c,d). ThC = sköldkörtelbrosk, LTA = laterala thyroarytenoid och MTA = medial thyroarytenoid. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Tre längsgående sektioner avbildade vid 10x förstoring i brightfield (höger) och i fluorescerande 488-kanalen (vänster) efter immunstaining för neuromuskulära korsningar.
Sektionerna (uppifrån och ned) visar progressionen under kryosektion i tidsordning med alarmuskeln (a,b) som uppträder före den mediala TA-muskeln (c,d) och lamina propria (e,f) i vokalvecket. AlC = alarbrosk, ThC = sköldkörtelbrosk, ArC =arytenoid brosk, LTA = laterala thyroarytenoid, MTA = medial thyroarytenoid och SCA = överlägsen cricoarytenoid. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Längsgående landmärken | Medelvärde (standardavvikelse) i μm | Räckvidd i μm | |
| 1. Alla tre stora brosk (sköldkörtel, alar,arytenoid) uppträdde med uppkomsten av muskelfibrer | 1,591 (665) | 350–2,800 | |
| 2. Överlägsen cricoarytenoid (SCA), alar cricoarytenoid (ACA) och laterala thyroarytenoid (LTA) muskler uppträdde | 2,344 (591) | 91–3,500 | |
| 3. ACA- och LTA-muskler förlängdes helt utan fragmentering | 2,631 (532) | 1505–3,640 | |
| 4. Aarytenoid brosk förstorat, ACA försvann, mediala thyroarytenoid (MTA) muskel uppstod | 2,948 (606) | 1765–4,305 | |
| 5. Mål full vokal vikning avsnitt: LTA och MTA muskler förlängdes helt utan fragmentering och lamina propria framkom | 3,131 (542) | 2205–4410 | |
| Landmärken över flera sektioner | |||
| 1. LTA-muskeln uppträdde | 303 (138) | 110–690 | |
| 2. MTA muskel uppträdde och var ~ 50% av LTA storlek med klar lamina propria och epitel noterade. | 482 (167) | 210–850 | |
Tabell 1: Avstånd i μm från sköldkörtelbroskets första framträdande till varje laryngeal landmärke under kryosektion (n = 29).
| CSA | Längsgående | |||||||
| LTA | MTA | Brosk | Alar/SCA | LTA | MTA | LP | ||
| CSA | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.88 | 1 | ||||||
| Längsgående | Brosk | 0.42 | 0.42 | 1 | ||||
| Alar/SCA | 0.57 | 0.47 | 0.77 | 1 | ||||
| LTA | 0.59 | 0.47 | 0.71 | 0.98 | 1 | |||
| MTA | 0.53 | 0.39 | 0.72 | 0.97 | 0.98 | 1 | ||
| LP | 0.53 | 0.41 | 0.76 | 0.96 | 0.97 | 0.99 | 1 | |
| Vikt | -0.55 | -0.35 | 0.08 | -0.45 | -0.46 | -0.46 | -0.41 | |
Tabell 2: Resultat av Pearsons korrelation mellan vikt och djupet av laryngeala landmärken i tvärsnittsflygplan (CSA) och longitudinella plan för unga hanråttor. LTA = lateral thyroarytenoid, MTA = medial thyroarytenoid, SCA = överlägsen cricoarytenoid och LP = lamina propria.
| CSA | Längsgående | |||||||
| LTA | MTA | Brosk | Alar/SCA | LTA | MTA | LP | ||
| CSA | LTA | 1 | ||||||
| MTA | 0.9 | 1 | ||||||
| Längsgående | Brosk | 0.21 | 0.33 | 1 | ||||
| Alar/SCA | 0.05 | 0.07 | 0.73 | 1 | ||||
| LTA | -0.06 | -0.04 | 0.64 | 0.96 | 1 | |||
| MTA | -0.02 | -0.02 | 0.6 | 0.79 | 0.84 | 1 | ||
| LP | -0.17 | -0.15 | 0.52 | 0.76 | 0.85 | 0.91 | 1 | |
| Vikt | 0.23 | 0.13 | -0.24 | -0.07 | -0.15 | -0.15 | -0.3 | |
Tabell 3: Resultat av Pearsons korrelation mellan vikt och djupet av laryngeala landmärken i tvärsnittsflygplan (CSA) och longitudinella plan för gamla hanråttor. LTA = lateral thyroarytenoid, MTA = medial thyroarytenoid, SCA = överlägsen cricoarytenoid och LP = lamina propria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att förbereda råtta vokala veck för neuromuskulär analys kan presentera med olika utmaningar. Laryngeal muskler är inte bara små och omgivna av brosk, vilket gör det svårt att direkt extrahera målmuskeln, hög variabilitet hittades också mellan djur i djupet av laryngeal anatomiska landmärken. För muskeln visades tvärsnittsprotokollet, kompletta vokala vikningssektioner mellan 21−85 sektioner (10 μm per sektion) efter det första utseendet på ventrala sköldkörtelbrosket, vilket är ganska lite färre än 63−126 sektionerna (35 μm per sektion) i det längsgående planet för NMJ-analysprotokoll (tabell 1).
Variabilitet noterades i avstånd mellan laryngeal landmärken trots enhetlig inbäddning, orientering och avsnitt av vävnader för varje typ av protokoll. Dessutom tog skillnader i kroppsvikt inte hänsyn till variabiliteten i de stora vävnadsdjupen från en uppsättning laryngeala landmärken till nästa. Denna variation i avståndet mellan laryngeala landmärken kan bero på individuella skillnader i laryngeal anatomi mellan djur, små skillnader i orientering av struphuvuden i kryold inom OCT-föreningen vid tidpunkten för dissekering, eller hur proverna placerades på provskivan i kryostaten vid sektionering (dvs. mängden OCT-förening som placerades på provskivan före montering eller små skillnader i placeringsvinkel).
Med en förståelse för att dessa små skillnader i provberedning kan leda till betydande variationer i djupet av laryngeal vävnad landmärken, är det viktigt att nybörjare utredare har en referenskarta att arbeta från. Skisserade studieprotokoll som definierar metoder för att identifiera muskler av intresse och förhindra protokoll fallgropar - till exempel de som beskrivs i detta dokument - kan förbättra reproducerbarheten och förhindra oönskad vävnadsförlust.
Även om denna studie fokuserade på TA muskeln, denna metod är tillämplig för andra inneboende laryngeal muskler samt. Till exempel, avsnitt i den längsgående vokala vikning plan ger längsgående muskel fiber delar av alar, laterala TA, mediala TA, laterala cricoarytenoid och överlägsen cricoarytenoid muskler och tvärsnitt av de bakre cricoarytenoid musklerna. Sektionering i tvärsnitt vokala vikning plan ger tvärsnitt av alar, laterala TA, mediaial TA, laterala cricoarytenoid, överlägsen cricoarytenoid och cricothyroid muskler, liksom längsgående delar av de bakre cricoarytenoid musklerna. Dessutom, även om denna studie inte inkluderade honråttor, förväntas skillnader mellan hanråttor och honråttor i laryngeal landmärke utseende inte eftersom sexuell dimorfism inom råtta struphuvudet är muskelspecifik och inte relaterad till laryngeal ram anatomi16,18.
Variationen i avståndet mellan laryngeal landmärken kan göra cryosectioning råtta vokal vikning svårt för nybörjare utredare. Denna studie visade att trots konsekvens i hur råttstruparna var frusna, inbäddade och kryosectioned, varierade avståndet mellan laryngeala landmärken kraftigt; djurvikten inte tog hänsyn till denna variabilitet. Denna studie ger detaljerade förfaranden med tillhörande bilder om hur man på lämpligt sätt förbereda laryngeal muskelvävnad och identifiera laryngeal landmärken för neuromuskulära histologiska undersökning av råtta vokala vikning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av bidrag F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) och K23DC014517 (Johnson, PI) från National Institute on Dövhet och andra kommunikationsstörningar vid National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane Certified | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostat blades | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Disposable Base Molds 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Disposable Underpads | Medline | 23-666-062 | |
| Dissection kit | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | 11999054 | |
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Needle holders | Assi | ASSI.B148 | |
| Non-Woven Sponges, 4 Ply | Quick Medical | 9023 | |
| Orbital shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Specimen Storage Bags | Fisherbrand | 19240093 | |
| Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Task wiper | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern Scissors | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods. |
References
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
