여기에서, 우리는 라인 피질-해마 organotypic 조각의 준비를 설명합니다. 혈청의 점진적이고 통제된 박탈에서, 이 조각은 진화하는 간질 같이 사건을 묘사하고 간질 발생의 전 생체 권 모형으로 간주될 수 있습니다. 이 시스템은 자발적인 활동의 역학을 모니터링뿐만 아니라 간질 발생 과정을 통해 신경 염증 기능의 진행을 평가하기위한 훌륭한 도구를 나타냅니다.
Organotypic 슬라이스 배양은 뇌 질환을 모델링하는 데 널리 사용되어 왔으며 약물의 신경 보호 및 치료 잠재력을 평가하기위한 훌륭한 플랫폼으로 간주됩니다. Organotypic 슬라이스는 이식 된 조직에서 제조되고 복잡한 다세포 전 생체 환경을 나타냅니다. 그(것)들은 3 차원 세포 건축 및 두뇌 세포의 현지 환경을 보존하고, 신경 연결및 신경 신경교 상호 작용을 유지합니다. 해마 조직화 조각은 간질 발생의 기본 메커니즘을 탐구하기에 적합한 것으로 간주되지만 간질의 임상 연구 및 동물 모델은 복경동맥 및 내경 코르티체로 구성된 비랄 피질이 발작 발생에 관련 역할을한다고 제안했습니다.
여기에서, 우리는 라인 피질-해마 organotypic 조각의 준비를 설명합니다. 완전한 성장 매체와 관류 하에서 CA3 영역에서 자발적활동의 기록은 생리적 온도와 약리학적 조작의 부재에서, 이러한 조각이 문화에서 시간 내내 진화 간질 과 같은 이벤트를 묘사 하는 것으로 나타났다. 증식 요오드 섭취 분석및 글리오증을 통해 세포사멸증가, 형광결합 면역히스토케로 평가된 글리오증도 관찰되었다. 제시된 실험적인 접근은 간질 발생의 역학 그리고 진행을 공부하고 이 두뇌 병학을 위한 잠재적인 치료 표적을 검열하기 위하여 플랫폼으로 라인 피질-해마 organotypic 슬라이스 문화의 가치를 강조합니다.
간질, 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 신경 장애 중 하나, 뇌에서 동기화 및 과도 한 신경 활동의 주기적이고 예측할 수 없는 발생에 의해 특징입니다. 다양한 항질약물(AEDs)에도 불구하고 간질 환자의 3분의 1은 치료1에 내성이며 발작과 인지 기능 저하를 계속 경험하고 있습니다. 또한, 사용 가능한 AEDs 신경 활동에 그들의 상대적으로 일반화 된 행동으로 인해 인식 방해. 간질 발생은 인간에서 공부하기 어렵다, 때문에 다발성 간질 간질 부상, 수십 년 동안 지속 긴 잠복 기간, 첫 번째 자발적인 발작 후 항 경련제 치료의 오해의 소지가 효과.
간질 치료를 위한 잠재적인 치료제의 식별은 간질의 동물 모델로 인해 가능해졌습니다: 1) 발작이 자발적으로 또는 감각 자극에 반응하여 발생하는 유전적 걸리기 쉬운 동물을 사용하는 유전 적 모델; 2) 전기 자극 유발 발작의 모델; 및 3) 필로카핀 (무스카리닉 수용체 작용제), 카이네이트 (kainate 수용체 작용제) 또는 4-아미노피리딘 (칼륨 채널 차단제)을 사용하는 발작 유도의 약리학적 모델. 이 모형은 간질의 근본적인 분자 및 세포 기계장치 뿐만 아니라 행동 변경의 이해에서 중요했습니다, 그리고 많은 AEDs2의발견으로 이끌어 냈습니다.
Ex vivo 제제는 또한 간질 발생 및 착형성의 근본적인 기계장치를 탐구하는 강력한 도구입니다. 급성 해마 슬라이스는 6-12 시간 동안 살아있는 세포의 전기 생리학적 연구를 가능하게 하고, 며칠 또는 몇 주 동안 인큐베이터에서 보존될 수 있는 organotypic 해마 슬라이스가 간질 활성3의연구에 광범위하게 사용되어 왔다.
Organotypic 뇌 슬라이스는 이식 된 조직에서 제조되며 뇌의 생리적 3 차원 모델을 나타냅니다. 이 조각은 관심 영역의 세포 구조를 보존하고 모든 뇌 세포와 세포 간 통신4를포함한다. 장기 organotypic 배양에 대 한 가장 사용 되는 영역은 해 마, 이 지역은 여러 신경 퇴행 조건에서 신경 손실에 의해 영향을. 그들은 널리 뇌 질환을 모델링 하는 데 사용 되었습니다 및 약물의 신경 보호 및 치료 잠재력을 평가 하기 위한 우수한 도구로 간주 됩니다5,6. 간질 발생, 뇌졸중 및 Aβ 유도 독성의 모델은 해마 조직성 조각7,8,9,10에서기술되었다. 파킨슨 병은 복부 심연전증과 줄무늬뿐만 아니라 피질 -코퍼스 캘로섬 -striatum-substantia nigra, organotypic 슬라이스11에서탐구되었다. Organotypic 소뇌 슬라이스 배양은 축삭 골수화 및 소뇌 기능의 많은 측면을 모방하고 다발성 경화증12에서새로운 치료 전략을 조사하기위한 광범위한 모델이다.
그러나, 간질의 임상 연구 및 동물 모델은 회선 및 내경 피질에 의해 구성된 비랄 피질이 발작 세대13에서역할을 한다는 것을 건의했습니다. 따라서, 비경피질-해마 에서 간질 발생의 모형이 설치되었다14. 혈청의 점진적이고 통제된 박탈하에서, 라인 피질-해마 organotypic 조각은 항상 혈청을 함유하는 매체에 보관되는 유사한 조각과는 달리, 진화하는 간질 과 같은 사건을 묘사합니다.
간질에서, 중추 신경계의 많은 급성 및 만성 질병에서와 같이, 신경 중심비전은 근본적인 질병 개시 및 진행을 기전을 해명하는 데 실패합니다. 임상 및 실험 적 증거는 간질 과정에 기여하는 주요 선수 중 하나로서 미세 글리아와 성상 세포가 관련 역할을하는 뇌 염증을 가리킵니다. 간질의 동물 모델의 약리학 실험은 항 염증 경로를 표적으로 함으로써 항간질 제행성 효과를 달성 할 수 있음을 시사하며, 요즘 신경 염증은 간질 에 대한 치료 접근법의 개발을위한 새로운 옵션으로 간주됩니다15.
여기서는 라인 피질-해마 의 조직화 배양의 준비와 자발적인 간질 활성을 기록하는 세부 사항을 철저히 설명합니다. 우리는 이 시스템이 간질의 몇몇 신경선동적인 양상을 모방한다는 것을 강조합니다, 이렇게 이 병리학에 있는 신경교 세포 및 신경염증의 역할을 탐구하기 위하여 적당하다. 더욱이, 간질에 대한 잠재적치료접근법의 선별을 위한 사용하기 쉬운 플랫폼을 나타낸다.
간질의 동물 모델은 많은 AEDs의 발견에 매우 중요했지만 많은 동물이 필요하고 발작 발병을위한 잠복 기간으로 인해 대부분의 동물이 시간이 많이 걸립니다. 해마 급성 슬라이스에서 간질 활성의 저마그네슘 유도도 문헌3에서철저하게 개정되었지만 급성 슬라이스는 6-12h의 생존력을 가지므로 장기적인 변화를 평가하는 것이 불가능합니다. organotypic 슬라이스는 급성 슬라이스의 짧은 생존 시간을 극복 할 수 있도록, 일에서 주에서 문화에서 유지 될 수 있으며, organotypic 해마 슬라이스에서 간질 발생의 모델이 제안되었다3,7,8.
여기서 우리는 라인 피질과 해마를 포함하는 organotypic 조각의 준비를 설명합니다. 이 조각은 동물당 준비하는 데 15-20 분이 걸리며, 동물 희생에서 시작하여 삽입에 슬라이스를 배치할 때까지, 반구 당 6-8 조각을 얻을 수 있습니다. 해마를 노출하기 위해 반구를 열 때와 슬라이스 후 필터 용지에서 조직을 제거 할 때 추가주의를 기울여야합니다. 해마 위의 과잉 조직은 또한 슬라이스 하는 동안 슬라이스 무결성을 손상시킬 수 있습니다.
라인 피질-해마 organotypic 조각은 생체 간질에서 닮은 진화하는 간질 같이 활동을 묘사합니다. 문화에서 일주일 후, 대부분의 조각은 문화에서 시간이 지남에 따라 전적으로 ictal 같은 이벤트에 진행 혼합 interictal 및 ictal 같은 활동을 묘사. 지금까지, 우리는 2-3 주 와 조각에 몇 가지 간 방전을 기록했다. 이 시스템에서 간질과 같은 활동은 organotypic 해마 조각보다 빠르게 발생하는 것으로 보입니다. 이것은 해마에 기능 입력의 대부분을 보존 하는 라인 피 질의 존재에 기인 할 수 있습니다. 이 문제를 완전히 해결하기 위해, 그들의 진폭 및 주파수와 함께 ictal 이벤트의 수 및 기간과 같은 문화에서 시간 내내 이러한 조각에 의해 표시되는 간질 신호의 완전한 특성화가 현재 수행되고 있습니다.
이 시스템은 3 주 이상 문화에서 유지 될 수 있으며, 간질의 많은 분자 상관 관계를 모방, 신경 죽음과 같은, 마이크로 글리아와 성상 세포의 활성화 및 프로 염증 성 사이토 카인의 증가 생산14,이러한 측면의 장기 특성화를 허용. 또한 특정 세포 경로를 대상으로 한 약리학적 개입이 구현되고 잠재적인 치료 목표를 테스트할 수 있는 사용하기 쉬운 선별 플랫폼을 나타냅니다. 의심 할 여지없이, 본원에 제시 된 시스템은 간질 발생의 메커니즘을 더 계몽하는 데 도움이 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 이미지 취득에 관한 모든 제안에 대한 Instituto 드 메디치나 분자 주앙 로보 안튠스의 바이오 이미징 단위를 인정하고 싶습니다.
이 프로젝트는 보조금 계약 Nº 952455, Fundação 파라 프로젝트 PTDC / MEDFAR / 30933/2017, 그리고 Faculdade 드 메키나 다 유니베르시다데 드 Lversidade de Lisboaa를 통해 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받았다.
50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
Nail polish | Cliché | ||
Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
Phosphate standard solutions, PO₄3- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
Platinum 5 blades | Gillette | ||
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 |