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Biology

एक जले हुए घाव का एक मुरीन मॉडल एक एलोजेनिक त्वचा भ्रष्टाचार के साथ खंगाला

Published: August 8, 2020 doi: 10.3791/61339
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 2, 1, 1,2
1Laboratoire de Physique des Plasmas, École Polytechnique, Sorbonne Université, CNRS, 2Institut de Recherche Biomédicale des Armées, Clamart, INSERM UMRS-MD
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन का उद्देश्य बर्न घाव भरने का एक मुरीन मॉडल विकसित करना था। एक थर्मल बर्न चूहों की पृष्ठीय त्वचा पर एक पूर्व गरम पीतल टेम्पलेट का उपयोग कर प्रेरित किया गया था । जला ऊतक एक आनुवंशिक रूप से इसी तरह के दाता माउस की पूंछ से काटा एक त्वचा भ्रष्टाचार के साथ debrided और मढ़ा गया था ।

Abstract

तुच्छ सतही घाव प्राथमिक इरादे से जटिलताओं के बिना ठीक हो जाते हैं। गहरे घाव, जैसे पूर्ण मोटाई जलता है, माध्यमिक इरादे से ठीक होता है और सर्जिकल डिब्राइडमेंट और त्वचा ग्राफ्टिंग की आवश्यकता होती है। एक प्राप्तकर्ता घाव बिस्तर में दाता भ्रष्टाचार का सफल एकीकरण प्रतिरक्षा कोशिकाओं की समय पर भर्ती, मजबूत एंजियोजेनिक प्रतिक्रिया और नए बाह्राश मैट्रिक्स गठन पर निर्भर करता है। उपन्यास चिकित्सकीय एजेंटों का विकास, जो घाव भरने में शामिल कुछ प्रमुख प्रक्रियाओं को लक्षित करता है, घाव बंद होने के अनुकूलित उद्देश्य मूल्यांकन के साथ विश्वसनीय प्रीक्लिनिकल मॉडल की कमी से बाधित होता है। यहां, हम प्रयोगात्मक पूर्ण मोटाई जला घाव एक एलोजेनिक त्वचा भ्रष्टाचार के साथ खंगाला के एक सस्ती और प्रजनन मॉडल का वर्णन । घाव बाल्ब/सी और SKH1-Hrhr पृष्ठभूमि से एनेस्थेटाइज्ड इनब्रीड जंगली प्रकार चूहों की डोरसम सतह पर प्रेरित किया जाता है । जला एक पीतल के व्यास में 10 मिमी मापने टेम्पलेट का उपयोग कर उत्पादित है, जो ८० डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम है और 20 एस के लिए एक निरंतर दबाव पर दिया जाता है । जला एस्चर चोट के 24 घंटे बाद excised है और एक पूर्ण मोटाई एक आनुवंशिक रूप से इसी तरह के दाता माउस की पूंछ से काटा कलम के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है । प्रक्रिया के लिए कोई विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है और शल्य चिकित्सा तकनीकों का पालन करने के लिए सीधा कर रहे हैं। विधि को सहजता से लागू किया जा सकता है और अधिकांश शोध सेटिंग्स में पुन: पेश किया जा सकता है। कुछ सीमाएं मॉडल के साथ जुड़ी हुई हैं। तकनीकी कठिनाइयों के कारण, पतली विभाजित मोटाई त्वचा ग्राफ्ट की फसल संभव नहीं है। सर्जिकल विधि हम यहां वर्णन पूर्ण मोटाई त्वचा कलम का उपयोग कर जला घावों के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है । इसका उपयोग प्रीक्लीनिकल चिकित्सकीय परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

शल्य चिकित्सा विकृति और त्वचा की ग्राफ्टिंग सामान्य नैदानिक प्रथाएं हैं जिनका उपयोग पुराने घावों के प्रबंधन में कियाजाताहै 1 , घाव जलाएं2, और दर्दनाक घाव जैसे तीव्र घाव3. त्वचा ग्राफ्टिंग शल्य प्रक्रिया को संदर्भित करता है, जिसमें शरीर के एक हिस्से से स्वस्थ त्वचा को हटाना और इसे दूसरे में स्थानांतरित करना शामिल है। दाता ग्राफ्ट खोए हुए ऊतकों को बदलते हैं और सेलुलर माइग्रेशन और विकास के लिए एक संरचनात्मक पाड़ प्रदान करते हैं। प्राप्तकर्ता साइट में एकीकरण के बाद, त्वचा ग्राफ्ट माइक्रोबियल आक्रमण, बाहरी वातावरण के हानिकारक प्रभावों और नमी 4 के अत्यधिक नुकसान से सुरक्षा प्रदान करके खोई हुई त्वचा बाधा को बदलदेतेहैं। सफल त्वचा भ्रष्टाचार एकीकरण कई कारकों पर निर्भर करता है। इनमें माइक्रोबियल संक्रमणों की उपस्थिति में पर्याप्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं और सूजन का समय पर समाधान, घाव स्थल पर मजबूत एंजियोजेनेसिस और प्राप्तकर्ता बिस्तर और दाता भ्रष्टाचार5के बीच संवहनी एनास्टोमोस की स्थापना शामिल है। जैसे ही भ्रष्टाचार नीचा दिखाना शुरू होता है, निवासी डर्मल कोशिकाओं को नए बाह्राश मैट्रिक्स का उत्पादन करने में सक्षम कोशिकाओं द्वारा प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। साथ ही, एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स को नव-एपिडर्मिस बनाने और घाव को फिर से एपिथेलाइज करने के लिए नए उत्पादित मैट्रिक्स पर क्रॉल करना चाहिए। इसलिए, यह स्पष्ट है कि प्राप्तकर्ता बिस्तर से दाता भ्रष्टाचार में कोशिकाओं का कुशल प्रवास एक और निर्धारण कारक है जो सफल भ्रष्टाचार निगमन को प्रभावित करता है । घाव उपचार6में शामिल कारकों की विशाल संख्या को देखते हुए, जो नैतिक सीमाओं के कारण मानव परीक्षणों में नियंत्रित करना असंभव हो सकता है, पूर्व-नैदानिक प्रयोगात्मक त्वचा ग्राफ्टिंग के मॉडल आवश्यक हैं। बर्न घाव भरने और संबंधित त्वचा ग्राफ्टिंग के पूर्व-नैदानिक मॉडलों का विकास जटिल तंत्र की समझ के लिए महत्वपूर्ण होगा जो क्यूटेनियस ऊतक मरम्मत में शामिल हैं और नए चिकित्सीय एजेंटों के परीक्षण के लिए आवश्यक हैं। घाव भरने के इन विट्रो मॉडल क्यूटेनियस ऊतक की जटिलता की सटीक नकल करने में असमर्थ हैं। वीवो पशु मॉडल में ऊतक की मरम्मत में शामिल तंत्र को समझने में एक अनिवार्य खोजी उपकरण हैं।

कृंतकों में त्वचा ग्राफ्टिंग तकनीक के कई तरीके विकसित किए गए थे ताकि शल्य चिकित्सा की नकल की जा सके और घाव पुनर्निर्माण को जलाया जा सके7,8,9. हालांकि, पहले वर्णित प्रक्रियाओं में से अधिकांश त्वचा ग्राफ्टिंग से पहले थर्मल बर्न इंजरी को प्रेरित करने में विफल रहे। जलने के घाव के बजाय, एक पूर्ण मोटाई उत्तेजना घाव को प्रेरित किया गया था, जिसे तब पूरी मोटाई त्वचा एलोबेड़ा7के साथ खंगाला गया था। कृंतक7,,8में दाता त्वचा की कटाई के लिए कान, पूंछ और पीठ जैसे विभिन्न शारीरिक स्थलों का उपयोग किया गया है। विभिन्न भ्रष्टाचार निर्धारण और स्थिरीकरण तकनीकों की सूचना दी गई, जिसमें "कोई सीवन तकनीक"9,टांके7 और सर्जिकल गोंद10,11,,12शामिल हैं।,

इस अध्ययन का उद्देश्य एक पूर्ण मोटाई जला घाव है कि जला उपचार है, जो अकवित ऊतक उत्तेजना और त्वचा ग्राफ्टिंग शामिल है में वर्तमान सोने के मानक दृष्टिकोण को पुनः प्राप्त होगा की एक murine मॉडल विकसित करने के लिए किया गया था । एक थर्मल बर्न एक पूर्व गरम पीतल टेम्पलेट का उपयोग कर एक माउस की डोरसम सतह पर प्रेरित किया गया था। बर्न एस्चर को उत्पादित किया गया था और एक दाता माउस की पूंछ से काटा गया पूर्ण मोटाई भ्रष्टाचार के साथ प्रतिस्थापित किया गया था। इस प्रयोगात्मक मॉडल के तीन प्रमुख फायदे हैं। सबसे पहले, प्राप्तकर्ता माउस की पीठ पर एक से अधिक जला घाव को प्रेरित किया जा सकता है, और दाता माउस की एक पूंछ से चार दाता त्वचा ग्राफ्ट काटा जा सकता है। इसका मतलब यह है कि कई प्रयोगात्मक और नियंत्रण उपचार संभवतः एक ही प्राप्तकर्ता और दाता जानवरों का उपयोग कर तुलना की जा सकती है । प्रशासन के वांछित मार्ग के आधार पर, नियंत्रण उपचार में वाहन या प्लेसबो नियंत्रण के स्थानीय या प्रणालीगत प्रशासन (उदाहरण के लिए, मरहम, चमड़े के नीचे, नसों में नसों के नसों में या समाधान के नसों में इंजेक्शन) का सामयिक अनुप्रयोग शामिल हो सकता है। दूसरा, उपचार का समय और प्रयोग के अंत बिंदु को नियंत्रित किया जा सकता है। तीसरा, यह मॉडल पूंछ से काटा गया पूर्ण मोटाई ग्राफ्ट का उपयोग करके घावों के पुनर्निर्माण पर निर्भर करता है, जो वापस13से काटी गई त्वचा की तुलना में दाता साइट में सफल समावेश के लिए उच्च संभावना के लिए जाना जाता है। यह एपिडर्मल लैंगरहंस कोशिकाओं की कम संख्या के कारण हो सकता है, जो क्यूटेनियस इम्यूनोबायोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और त्वचा भ्रष्टाचार अस्वीकृति14से जुड़े हैं।

घाव भरने और भ्रष्टाचार एकीकरण के प्रस्तावित मॉडल को ट्रांसजेनिक और नॉकआउट चूहों पर अच्छी तरह से लागू किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग उन भूमिकाओं को स्पष्ट करने में सहायता करेगा जो कुछ जीन घाव की मरम्मत के दौरान खेल सकते हैं। चोट की साइट पर सामयिक घाव की तैयारी या चिकित्सीय एंटीबॉडी के चमड़े के नीचे प्रशासन के बहिर्जात आवेदन पर भी विचार किया जा सकता है।

तकनीकी कठिनाइयों के कारण, एपिडर्मिस और डर्मिस के हिस्से से मिलकर विभाजित मोटाई त्वचा ग्राफ्ट चूहों में प्राप्त करना मुश्किल है। एपिडर्मिस और पूर्ण मोटाई डर्मिस से मिलकर पूर्ण मोटाई त्वचा ग्राफ्ट को सफल एकीकरण के लिए एक अच्छी तरह से संवहनी घाव बिस्तर की आवश्यकता होती है। चूहों में विभाजित मोटाई त्वचा ग्राफ्ट फसल करने में असमर्थता इस मॉडल की एक सीमा के रूप में माना जा सकता है । प्राप्तकर्ता घाव बिस्तर के लिए त्वचा भ्रष्टाचार का निर्धारण सर्जिकल चिपकने वाला गोंद के आवेदन के माध्यम से प्राप्त किया गया था, जो ऊतक निर्धारण15के अन्य साधनों की तुलना में कम आघात और तेजी से गिरावट से जुड़ा हुआ है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि शल्य प्रक्रिया15के बाद 24 घंटे में सर्जिकल गोंद की तुलना में मजबूत ऊतक निर्धारण के साथ जुड़ा हुआ है, जिसे प्रक्रिया का नुकसान माना जा सकता है। हालांकि, बाद के समय बिंदुओं पर, सर्जिकल चिपकने वाले घावों की जैव यांत्रिक शक्ति टांके15 और मुख्य निर्धारण16से बेहतर हो जाती है। सर्जिकल गोंद के साथ ऊतक निर्धारण के बाद, घावों को घाव ड्रेसिंग से कवर किया जाना चाहिए। हालांकि माउस की पृष्ठीय सतह पर घाव जानवर तक पहुंचने के लिए मुश्किल हैं, दूसरी ओर घाव ड्रेसिंग, जानवर के लिए हेरफेर और हटाने के लिए आसान है। लगातार घाव ड्रेसिंग परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है।

छोटे कृंतक में संज्ञाहरण प्रेरित हाइपोथर्मिया एक अच्छी तरह से प्रलेखित घटना17है। हाइपोथर्मिया इस प्रक्रिया का एक दुष्प्रभाव है, जो जटिलताओं का कारण बनता है, और संभावित रूप से पशु स्वास्थ्य और डेटा गुणवत्ता दोनों से समझौता करता है। इसलिए, यह विधि तापमान प्रबंधन रणनीतियों के कार्यान्वयन की आवश्यकता है, खासकर यदि गंजे SKH1-Hrhr का उपयोग किया जाता है।

मानव घाव बंद करने की नकल करने के लिए चूहों का उपयोग करने की सबसे महत्वपूर्ण सीमा त्वचा शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान के बीच अंतर है। माउस घाव ज्यादातर संकुचन के माध्यम से ठीक होते हैं, जबकि मानव घाव ग्रैनुलेशन ऊतक गठन और पुनः-एपीथेलाइजेशन18के माध्यम से ठीक होते हैं। इस विसंगति के लिए खाते में, वर्तमान मॉडल को संशोधित किया जा सकता है और त्वचा संकुचन19को रोकने के लिए घाव के चारों ओर कसकर पालन की गई स्प्लिंटिंग रिंग के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है। वीवो प्रोटोकॉल में इसके कुछ फायदों और नुकसानों को देखते हुए, यह मॉडल घाव भरने में शामिल कुछ प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में काम कर सकता है जो विट्रो में अध्ययन करना असंभव है।

Protocol

सभी प्रयोगों को फ्रांस के उच्च शिक्षा और अनुसंधान विभाग (अध्ययन संख्या: 1221620171116517670v2 और DAP180012) द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी चूहों को प्लास्टिक पिंजरों में आगमन पर एकल रखे गए थे और अध्ययन से पहले 7 दिन की अनुकूलन अवधि की अनुमति दी गई थी। पशु कमरे में एक 12/12 घंटे प्रकाश/अंधेरे चक्र (07:00 पर रोशनी) पर बनाए रखा गया था । भोजन और नल का पानी विज्ञापन लिबिटम प्रदान किया गया। BALB/c और SKH1-Hrhr चूहों पारंपरिक गेहूं/सोया आधारित आहार खिलाया गया । घोंसले की सामग्री के साथ बुरादा बिस्तर प्रदान किया गया था।

1. उपकरण तैयार करना

  1. प्रक्रिया के लिए एक जलते हुए उपकरण तैयार करें और तापमान नियंत्रक(चित्रा 1A)का उपयोग करके इसे 80 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। इन्फ्रारेड थर्मल इमेजिंग कैमरे का उपयोग करके पीतल के टेम्पलेट(चित्रा 1बी, सी)के तापमान को सत्यापित करें।
  2. सुनिश्चित करें कि डिजिटल मनोमीटर सही ढंग से काम कर रहा है।
  3. एक शल्य चिकित्सा कपड़ा के साथ मंच को कवर और मेज की ऊंचाई समायोजित(चित्रा 1A)।

2. प्री-ऑपरेटिव और इंट्रा-ऑपरेटिव एनिमल केयर

  1. BALB/c और SKH1-Hrhr चूहों, उम्र के 6-8 सप्ताह प्राप्त करें ।
  2. पीने के पानी के लिए 3 मिलीग्राम/एमएल पर पैरासिटामोल निलंबन जोड़ें और प्रक्रिया के 12 घंटे पहले और ७२ घंटे बाद तक आपूर्ति करें ।
  3. एक 1 मिलील सिरिंज और एक 26 जी सुई का उपयोग करना, प्रक्रिया से पहले 0.05 μg/g 30 मिनट पर और प्रक्रिया के बाद पहले 72 घंटे के लिए हर 6 घंटे में buprenorphine चमड़े का प्रशासन।
  4. 1 एमएल सिरिंज और 26 जी सुई का उपयोग करके, माउस के डोरसम और बर्न घाव के क्षेत्र में 2-3 मिमी डिस्टल के लिए लिडोकेन का प्रशासन करें। जला घाव के प्रेरण से पहले 0.05 μg/g चमड़े के 15 मिनट पर लिडोकेन इंजेक्ट करें।
  5. 10 मिलीग्राम/किलो और केटामाइन १०० मिलीग्राम/किलोग्राम पर जाइलाज़ीन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें । इंजेक्शन को प्रशासित करने के लिए 1 एमएल सिरिंज और 26 जी सुई का उपयोग करें।
  6. महत्वपूर्ण कदम: एनेस्थेटाइज्ड माउस को गर्म पैड पर रखें और संज्ञाहरण के प्रेरण के बाद पहले 30 मिनट के लिए हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए माउस को गर्म रखें और संज्ञाहरण से वसूली के बाद कम से कम 15 मिनट के लिए। गर्म पैड के अलावा, गर्मी लैंप, गर्म तरल पदार्थ या हवा परिसंचारी, और पूर्व गर्म गर्मी जलाशयों सहित अन्य तौर-तरीकों का उपयोग शरीर के तापमान को विनियमित करने के लिए किया जा सकता है।
  7. कॉर्निया के निर्जलीकरण को रोकने के लिए माउस की आंखों पर स्नेहन जेल लगाएं।
  8. संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करने के लिए अंगुली चुटकी वापसी पलटा का प्रयोग करें।
  9. एक 1 मिलील सिरिंज और एक 26 जी सुई का उपयोग करके 5% डेक्सट्रोस के साथ पूरक स्तनपान कराने वाले रिंगर के समाधान के 200 माइक्रोन का प्रशासन करते हैं। एनेस्थीसिया के प्रेरण के तुरंत बाद और निर्जलीकरण को रोकने की प्रक्रिया के 6 घंटे बाद तरल पदार्थ प्रतिस्थापन को कम से कम प्रशासित करें।

3. पूर्ण मोटाई जला घाव प्रेरण

  1. बालों की कतरनी के साथ एनेस्थेटाइज्ड माउस दाढ़ी।
  2. माउस की डोरसम सतह पर 1 मिनट के लिए डिपिलिंग क्रीम लगाएं। कुछ बाँझ धुंध का उपयोग कर क्रीम को मिटा दें और नम धुंध के टुकड़े के साथ क्षेत्र को साफ करें। सूखी जब तक कुछ धुंध के साथ त्वचा दाग।
  3. एक शल्य चिकित्सा कपड़े के साथ कवर मंच पर माउस रखें और पहले से गरम पीतल टेम्पलेट के करीब मंच ऊपर की ओर ले जाएं।
  4. 0.15 एन (चित्रा 2) के निरंतर दबाव का उपयोग करके माउस (80 डिग्री सेल्सियस20एस के लिए) के पीछे परिपत्र पीतल टेम्पलेट लागू करें।
  5. महत्वपूर्ण कदम: बर्न इंडक्शन के तुरंत बाद, हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए एनेस्थेटाइज्ड जानवर को गर्म पैड पर रखें और प्रक्रिया के दौरान और बाद में माउस को गर्म रखें। एक बार संज्ञाहरण से बरामद, माउस पिंजरे में वापस लौटें ।
  6. महत्वपूर्ण कदम: सर्जिकल प्रक्रिया के बाद पहले 72 घंटे के लिए पिंजरे के फर्श पर एक मैश किए हुए आहार प्रदान करें। चूहे कई बार बर्न घाव की चोट के बाद पानी पीने के लिए सिपर ट्यूब तक पहुंचने से कतराते हैं ।

4. दाता भ्रष्टाचार की कटाई

  1. दाता माउस की पूंछ के ऊपरी हिस्से में एक स्केलपेल के साथ एक देशांतर चीरा बनाएं और सर्जिकल संदंश का उपयोग करके त्वचा को धीरे-धीरे हटा दें।
  2. पूंछ की त्वचा को बाँझ 0.9% खारा समाधान के 10 एमएल से भरा बाँझ पेट्री डिश में रखें। व्यक्तिगत ग्राफ्ट को मापने के लिए एक शासक का उपयोग करें और पूंछ की त्वचा को टुकड़ों में काटें, प्रत्येक स्केलपेल का उपयोग करके 15 मिमी मापता है।
  3. एक बार तैयार होने के बाद, त्वचा के ग्राफ्ट को 2 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.9% खारा समाधान में रखें।

5. सर्जिकल एक्सिशन और स्किन ग्राफ्टिंग

  1. बर्न इंडक्शन के चौबीस घंटे बाद, आइसोफ्लुनाणे के साँस लेकर संज्ञाहरण के लिए माउस तैयार करें। माउस को इंडक्शन चैंबर में रखें और 4 एल/मिनट की प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में 5% आइसोफ्लुन का उपयोग करके संज्ञाहरण को प्रेरित करें। सर्जरी के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए, 2 एल/मिनट पर 2% आइसोफ्लुन का उपयोग करें ।
  2. माउस पर एक सर्जिकल कपड़ा रखें और सर्जिकल क्षेत्र का पर्दाफाश करने के लिए एक खिड़की से बाहर काट दें। एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करके, पोविडोन-आयोडीन के साथ पहले घाव को झाड़ू दें और फिर 70% शराब के साथ।
  3. धीरे से सर्जिकल चिमटी और आबकारी बाँझ शल्य कैंची और चिमटी के साथ सभी परिगलित और अकवय ऊतक की एक जोड़ी के साथ जला ऊतक उठाओ । एक स्थिर प्राप्तकर्ता बिस्तर बनाने के लिए हाइपोडर्मिस की पैनिकुलस कार्नोसस परत को हटा दें।
  4. ताजा तैयार घाव बिस्तर पर त्वचा भ्रष्टाचार रखें। धीरे सर्जिकल चिमटी का उपयोग कर त्वचा भ्रष्टाचार की ओर आसपास की त्वचा खींचो। घाव बिस्तर पर भ्रष्टाचार को संलग्न करने के लिए कुछ सर्जिकल चिपकने वाला लागू करें और त्वचा के किनारों को संरेखित करने के लिए धीरे-धीरे दबाएं। महत्वपूर्ण कदम: घाव बिस्तर का आकार सफल एनग्रेफ्टमेंट सुनिश्चित करने के लिए त्वचा भ्रष्टाचार के आकार से थोड़ा बड़ा होना चाहिए।
  5. माउस को संज्ञाहरण से उबरने की अनुमति दें। महत्वपूर्ण कदम:माउस को गर्म पैड पर रखें। हाइपोथर्मिया को रोकने की प्रक्रिया के दौरान और बाद में माउस को गर्म रखें।
  6. ग्राफ्टेड घाव पर निष्क्रिय पैराफिन धुंध ड्रेसिंग और चिपकने वाला माध्यमिक ड्रेसिंग लागू करें।
  7. माउस को एक व्यक्तिगत पिंजरे में रखें। महत्वपूर्ण कदम: सर्जिकल प्रक्रिया के बाद पहले 72 घंटों के लिए पिंजरे के फर्श पर कुछ मैश किए हुए आहार प्रदान करें और दैनिक निगरानी करें।
  8. खिलौने प्रदान करें और पर्यावरण को समृद्ध करें।

6. डिजिटल इमेजिंग और पोस्टमार्टम घाव संग्रह

  1. घाव के बगल में एक शासक रखकर एक डिजिटल कैमरे के साथ तस्वीर घाव(चित्रा 3)।
  2. प्रयोग के अंत बिंदु पर, कार्बन डाइऑक्साइड और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के संपर्क में आने से जानवरों को इच्छामृत्यु दें। महत्वपूर्ण कदम:गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के दौरान त्वचा की अत्यधिक खींचने की कार्रवाई भ्रष्टाचार को नुकसान पहुंचा सकती है।
  3. पोस्टमार्टम में, शल्य चिकित्सा से कैंची का उपयोग कर प्रावरणी को पृष्ठीय जला घावों को आबकारी । बाइसेक्ट घाव। हिस्टोलॉजी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए 10% बफर फॉर्मेलिन और प्रक्रिया में आधा फिक्स करें। आरएनए निष्कर्षण और प्रोटीन क्वांटिटेशन के लिए तरल नाइट्रोजन में दूसरे आधे को तेजी से फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

7. स्किन हिस्टोलॉजी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और कोलेजन विज़ुअलाइज़ेशन

  1. त्वचा के नमूनों को पैराफिन में एम्बेड करें, 4 माइक्रोन सेक्शन में कटौती करें और सकारात्मक चार्ज स्लाइड पर रखें।
  2. री-एपिथेलाइजेशन (मूल घाव का%) की दर का मूल्यांकन करने के लिए हेमेटॉक्सीलिन और ईओसिन से सना हुआ स्लाइड्स का उपयोग करें। घाव का क्षेत्र जो नव-एपिडर्मिस से ढका हुआ है, पूरे घाव(चित्र 4)के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जा सकता है। वर्गों के सूक्ष्म विश्लेषण करने के लिए एक डिजिटल माइक्रोस्कोप आवेदन और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  3. फॉर्मेलिन-फिक्स्ड और पैराफिन एम्बेडेड ऊतक से तैयार हिस्टोलॉजिकल सेक्शन (4 माइक्रोन मोटाई) का उपयोग करें और उन्हें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के अधीन करें।
  4. घावों में कोलेजन I और फाइब्रोनेक्टिन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करें और 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें। का पता लगाना प्रजातियों-विशिष्ट सहिजन पेरोक्सिडेज (एचआरपी) या क्षारीय फॉस्फेट (एपी) द्वारा किया जा सकता है- संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी।
  5. या तो के साथ अनुभागों प्रतिक्रिया: (i) HRP, 3,3'-diaminobenzidine (DAB) या (ii) एपी, बांड बहुलक रिफाइन लाल (सामग्री की तालिका), जो एक उज्ज्वल लाल रंग(चित्रा 5)पैदावार । एक उपकरण का उपयोग कर वर्गों को स्कैन करें और डिजिटल माइक्रोस्कोप एप्लिकेशन और इमेजजे के साथ विश्लेषण करें।
  6. कोलेजन जमाव के हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए, वाणिज्यिक किट का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल वर्गों पर त्रिकोणीय धुंधला प्रदर्शन करें।
  7. कोलेजन फाइबर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी और दूसरी हार्मोनिक जेनरेशन तकनीक(चित्रा 5) काइस्तेमाल करें। ऊतक इमेजिंग के लिए एक मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें जैसा कि पहले20वर्णित है । एक Ti का प्रयोग करें: दूसरे हार्मोनिक और दो फोटॉन उत्तेजित फ्लोरेसेंस संकेतों (TPEF) पैदा करने के लिए लेजर स्रोत के रूप में ८१० एनएम पर एक केंद्र तरंग दैर्ध्य के साथ नीलमणि लेजर ।
  8. दूसरी हार्मोनिक जनरेशन (एसएचजी) और टीपीईएफ को इकट्ठा करने और उत्तेजित करने के लिए 25x/0.95 डब्ल्यू उद्देश्य से लैस लेजर बीम का उपयोग करें। एनडीडी पीएमटी डिटेक्टरों द्वारा पहले21 वर्णित संकेतों का पता लगाएं। लेजर स्कैनिंग नियंत्रण और छवि अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

Representative Results

परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि विकसित प्रोटोकॉल एक सीधी विधि है, जो चूहों में पूर्ण मोटाई बर्न घाव को शामिल करने की अनुमति देता है। बर्न्स को पहले से गरम पीतल के टेम्पलेट(चित्रा 1ए-सी)का उपयोग करके प्रेरित किया जाता है। जला हुआ क्षेत्र एक सफेद एस्चर और हाइपरमिक जोन के साथ एक गोलाकार घाव के रूप में दिखाई देता है। बर्न घाव का आकार बर्न इंजरी के परिणामस्वरूप बर्न इंजरी के परिणामस्वरूप बर्न इंजरी के 24 घंटे बाद थोड़ा बड़ा होता है, जिसे बर्न इंजरी प्रोग्रूस के रूप में जाना जाता है, जो संभवतः तीव्र सूजन22के कारण होता है। उत्तेजना के बाद, जल घावों को एलोजेनिक त्वचा भ्रष्टाचार(चित्रा 3)का उपयोग करके खंगाला जाता है। बर्न इंजरी के बाद 7 दिन में घाव5हो जाते हैं, जो सफल एनग्रेफ्टमेंट का संकेत है । एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स घाव को बंद करने और घावों के दो किनारों के बीच के अंतर को पाटने के प्रयास में आसन्न प्राप्तकर्ता त्वचा से प्रवास करते हैं। घावों के एच और ई दाग अनुभाग के सूक्ष्म विश्लेषण से पता चला है कि नव-एपिडर्मिस की लंबाई बर्न इंजरी(चित्रा 4B)के बाद 3 दिन की तुलना में बर्न इंजरी के बाद 7 दिन में काफी लंबी हो जाती है । एक बड़े अध्ययन करने से पहले, यह अत्यधिक सिफारिश की जाती है कि शोधकर्ता एक प्रायोगिक अध्ययन पूरा करें, जो एक उपन्यास हस्तक्षेप की खोज, व्यवहार्यता का आकलन, प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए विधि में संशोधनों की पहचान करने में सक्षम बनाता है। सांख्यिकीय महत्वपूर्ण प्रभाव छोटे नमूनों में पता लगाने के लिए मुश्किल है, जबकि नमूना आकार में वृद्धि एक परीक्षण की सांख्यिकीय शक्ति को बढ़ावा देने के लिए एक तरीका है । उदाहरण के लिए, समूहों के बीच घाव पुनः एपीथेलाइजेशन(चित्रा 4)की दर में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर (पी एंड एलटी; 0.05) का पता लगाने के लिए, नमूना आकार प्रति समूह छह और आठ चूहों के बीच होना चाहिए। सभी प्रयोगों को कम से कम दो बार दोहराया जाना चाहिए। जैसे फाइब्रोब्लास्ट के रूप में मैट्रिक्स उत्पादन कोशिकाओं,, प्राप्तकर्ता ऊतक से भ्रष्टाचार में स्थानांतरित, कोलेजन मैं और फाइब्रोनेक्टिन सहित एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स के प्रमुख घटकों, अत्यधिक नवगठित मैट्रिक्स(चित्रा 5)में व्यक्त हो जाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: बर्निंग डिवाइस सेटअप। (A)बर्निंग डिवाइस का प्लेसमेंट और सेट-अप । जलने वाला उपकरण तापमान नियंत्रक से जुड़ा हुआ है और दबाव की निगरानी को सक्षम करने के लिए डिजिटल मोनोमीटर से जुड़ा हुआ है। जलने वाले उपकरण को समायोज्य चरण के ऊपर निलंबित कर दिया जाता है - सपाट सतह जिस पर चूहों को जला के प्रेरण के लिए रखा जाता है। (बी-सी) घाव जलने को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पीतल के टेम्पलेट की एक बंद छवि। (ग)पीतल के टेम्पलेट का व्यास 1 सेमी है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इस लेख में वर्णित प्रयोगात्मक मॉडल को पुन: पेश करने के लिए आवश्यक विभिन्न चरणों का योजनाबद्ध चित्रण। प्रक्रिया के तीन मुख्य चरण हैं: (i) पहले से गरम पीतल के टेम्पलेट का उपयोग करके बर्न घाव को शामिल करना; (ii) बर्न इंजरी के 24 घंटे बाद गैर-व्यवहार्य परिगलित ऊतकों का शल्य चिकित्सा उत्तेजना; (iii) सर्जिकल घाव पुनर्निर्माण एक दाता माउस से काटा एक पूर्ण मोटाई एलोजेनिक त्वचा ग्राफ्ट का उपयोग कर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: पुनर्निर्मित माउस के स्थूल दृश्य घाव जलाते हैं। बर्न चोट के बाद 0, 1, 3 और 7 दिनों पर एलोजेनिक त्वचा ग्राफ्ट के साथ पुनर्निर्माण घावों के प्रतिनिधि डिजिटल छवियों। छवियों पर शासक मिलीमीटर में है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: चोट जलाने के 3 और 7 दिनों में घावों की सूक्ष्म उपस्थिति। एच एंड ई-घावों के 3 और 7 दिन बाद चोट जलाते हैं। (ए)दिन 7 घावों की तुलना में(ए)दिन 3 घावों में नव-एपिडर्मिस (बिंदीदार रेखा) की लंबाई में काफी वृद्धि हुई है। (ए)और(बी)में, स्केल बार 100 माइक्रोन है।(C)घाव के प्रतिशत का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व पुनः epithelialization। यह 3 दिन में नव एपिडर्मिस की लंबाई को मापने और 7 के बाद जला चोट और पूरे घाव की लंबाई का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त द्वारा मूल्यांकन किया गया था । परिणाम 3 दिन के समूह में मतलब ± एसईएम (एन = 6 चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं; एन = 6 चूहों दिन 7 समूह में, * पी & 0.05; छात्र का टी-टेस्ट) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स और कोलेजन आई विजुअलाइजेशन का आकलन। दिन में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण की प्रतिनिधि छवियां 7 माउस घावों के लिए दाग(ए)कोलेजन और(बी)फाइब्रोनेक्टिन । विस्तारित धुरी के आकार के कोलेजन आई-पॉजिटिव कोशिकाओं में तीव्र लाल धुंधला ध्यान दें। दिन के 7 घावों के डर्मिस में फाइब्रोनेक्टिन-पॉजिटिव कोशिकाओं में ब्राउन धुंधला नोट करें। स्केल बार = सभी छवियों में 50 माइक्रोन। (ए)और(बी)में, ई एपिडर्मिस को दर्शाता है और डी डर्मिस को दर्शाता है। (ग)कोलेजन फाइबर का दृश्य और कोलेजन जमाव का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन। (घ)प्रतिनिधि टीपीईएफ/एसएचजी कोलेजन छवि दिन 7 माउस घावोंकी । परिपत्र ध्रुवीकरण और एसएचजी संकेतों का उपयोग करके एक साथ टीपीईएफ/एसएचजी अधिग्रहण को एक सीमा लागू करने के बाद एसएचजी के बाइनरी वितरण को प्राप्त करने के लिए चुनिंदा रूप से संसाधित किया गया था । टीपीईएफ छवियां (हरी) और एसएचजी छवियां (सफेद) छद्म रंग और मढ़ा मढ़ा थे। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

बर्न इंजरी23की मोटाई वर्गीकरण के अनुसार, पूर्ण मोटाई जलने की विशेषता त्वचा की पूरी मोटाई और चमड़े के नीचे के ऊतकों के कुछ हिस्से की स्पष्ट भागीदारी होती है। इस प्रकार का घाव केवल संकुचन या त्वचा ग्राफ्टिंग2से ही ठीक हो सकता है । इस लेख में वर्णित विधि की एक अंतर्निहित सीमा यह है कि विभाजन मोटाई ग्राफ्ट के विपरीत केवल पूर्ण मोटाई ग्राफ्ट, जो अक्सर नैदानिक सेटिंग में उपयोग किए जाते हैं, माउस की पूंछ से काटा गया था। यह तकनीकी कठिनाई के कारण था, क्योंकि माउस की त्वचा विभाजन मोटाई ग्राफ्ट प्राप्त करने के लिए बहुत पतली है। यह बताया जाना चाहिए कि पूर्ण मोटाई ग्राफ्ट के लिए एक अच्छी तरह से संवहनी घाव बिस्तर की आवश्यकता होती है, जबकि विभाजित मोटाई त्वचा ग्राफ्ट कम संवहनी24के साथ दाता साइटों पर जीवित रहने में सक्षम हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि माउस के पीछे एक जला घाव नए वास्कुलेचर 5 के एक मजबूतगठनके साथ जुड़ा हुआ था । इससे पता चलता है कि माउस के पृष्ठ के रूप में एक अच्छी तरह से संवहनी क्षेत्र, जला घावों के प्रेरण के लिए शारीरिक मील का पत्थर के रूप में माना जा सकता है।

घाव गहराई को जलाने पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। जला घाव की गहराई व्यक्तिगत चूहों के बीच सुसंगत होना चाहिए। जला घाव गहराई की प्रजनन क्षमता पीतल के टेम्पलेट, दबाव और गर्मी के जोखिम की अवधि के तापमान पर निर्भर करता है। जले घाव की गहराई को हिस्टोलॉजिकल रूप से सत्यापित किया जाना चाहिए। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पहले से गरम पीतल के टेम्पलेट में त्वचा के अत्यधिक दबाव या लंबे समय तक संपर्क अंतर्निहित ऊतक को घायल कर सकता है। कशेरुकी स्तंभ के आसपास के ऊतक, जिसमें केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र के घटक शामिल हैं, गर्मी के प्रति संवेदनशील होते हैं, और यदि क्षतिग्रस्त हो जाती है तो पिछले पैर पक्षाघात हो सकता है।

यद्यपि कोई पश्चात मृत्यु दर सीधे शल्य प्रक्रिया से जुड़ी नहीं थी, लेकिन गंजे SKH1-Hrhr चूहों की एक छोटी संख्या, जो विशेष रूप से ठंड के प्रति संवेदनशील हैं, हाइपोथर्मिया विकसित की गई हैं और सामान्य एनेस्थीसिया के बाद ठीक होने में विफल रही हैं। इसलिए, सभी सौंदर्य घटनाओं के दौरान पूरक गर्मी प्रदान की जानी चाहिए और माउस को एनेस्थेटाइज्ड होने के दौरान निरंतर निगरानी की आवश्यकता होती है।

इस अध्ययन में वर्णित विधि सर्जिकल साइट संक्रमण से जुड़ी नहीं थी। हालांकि, पेरिऑपरेटिव अवधि के दौरान सर्जिकल घाव में सूक्ष्मजीवों के हस्तांतरण को रोकने के लिए एसेप्टिक तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए। बायोल्यूमिनेसेंट या फ्लोरोसेंट सूक्ष्मजीवों के साथ घाव का टीका प्रक्रिया में शामिल किया जा सकता है। यह तकनीक संक्रामक जीवों और उनके रोगजनन25का अध्ययन करने में उपयोगी हो सकती है . उदाहरण के लिए, बायोल्यूमिनेसेंट बैक्टीरिया के बहिर्जात जोड़ या इंजेक्शन, वीवो पूरे पशु इमेजिंग25में उपयोग कर माइक्रोबियल बोझ की निगरानी की अनुमति दे सकते हैं। यह देखते हुए कि माउस बाल वीवो पूरे पशु फ्लोरेसेंस और बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है, हेयरलेस SKH1-Hrhr चूहों फ्लोरोसेंट या बायोल्यूमिनेसेंट रिपोर्टर्स से जुड़े अध्ययनों के लिए आदर्श मेजबान हैं।

घाव ऊतक नमूनों को विभिन्न समय बिंदुओं पर एकत्र किया जा सकता है और हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है। प्रोटीन और आरएनए त्वचा बायोप्सी से अलग किया जा सकता है और आणविक जीव विज्ञान तकनीकों घाव भरने में शामिल प्रमुख अणुओं की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

वर्तमान अध्ययन में, हमने बर्न घाव भरने और एलोजेनिक त्वचा एनग्रेफ्टमेंट का एक प्रायोगिक मॉडल बताया। इस प्रक्रिया को संशोधित किया जा सकता है और प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में काम कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को ला दिशा गेनेरले डी एल'आर्ममेंट, एल'एग्नेस डी एल'इनोवेशन डी डेफेन्स और इकोले पॉलीटेक्निक द्वारा समर्थित किया गया था। हम अपने सहयोगी श्री यान प्लांटियर को इकोले पॉलीटेक्निक से धन्यवाद देते हैं जिन्होंने अंतर्दृष्टि और विशेषज्ञता प्रदान की जिसने वीडियो फ़ाइल के उत्पादन में बहुत सहायता की। लेखक इस परियोजना के दौरान प्रदान की गई अपनी पशु भलाई और देखभाल विशेषज्ञता के लिए श्री बेनोत पेटमैन और सुश्री शार्लोट ऑरियू को INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, होपिटल पॉल ब्रोस, विल्लेजुफ को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringue Terumo SS + 01T1
26 G needle Terumo Agani NN-2613R 1/2'' - 0,45 X 12mm
96X21 mm Petri Dish Dutscher 193199
Animal Weighing scale Kern EMB 5.2K5
BALB/c mouse Janvier labs BALB/cAnNRj 6-weeks old
Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm Simport M476-1
Bond polymer Refine Red Leica Biosystems DS9390
Brass block BVG custom-designed Circular 10 mm in diameter
Buprenorphine (BUPRECARE) Axience FR/V/6328396 3/2011 administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Burning apparatus Kausistar 400 TraçaMatrix 34010
CaseViewer 3DHISTECH Ltd. 3Dhistech, Budapest, Hungary
Collagen I antibody Abcam ab34710 Recommanded concentration 1:50; 1:200
D-(+)- glucose (Dextrose) Sigma Aldrich G-8769-100 ml
DAB Leica Biosystems AR9432
Digital camera NIKON D3400 objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45
Depilating cream Veet
Disposable scalpels Swann Morton 6601
DPBS PAN biotech P04-36300
Ethanol absolute VWR chemicals 20821.310
Fibronectin antibody Abcam ab23750 Recommanded dilution 1:1000
Filter 0.22um Sartorius 16532
Fine Scissors F.S.T. 14094-11
Forceps Dumont F.S.T. 11295-10
Hair clippers AESCULAP B00VAQ4KUY (ISIS)
Heating pad Petelevage 120070
Isofluorane Piramal healthcare FR/V/03248850/2011
Ketamine Imalgene FR/V/0167433 4/1992 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg
Lactated Ringers solution Flee-Flex 1506443
Lamina multilabel slide scanner Perkin Elmer
LAS software Leica version 2.7.3
Leica Bond III Leica Biosystem 1757
Leukosilk dressing BSN medical 72669-01
Lidocaine Aguettant N01BB02 local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Manometer Kern HDB-5K5
Masson Trichrome Staining kit Sigma-Aldrich HT15-1KT
Micromesh Biopsy cassettes Simport M507
Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope Leica microsystems DM500 Scanner 8000Hz NDD PMT detectors
Non adhering dressing Adaptic Systagenix A6222 12.7cm X 22.9 cm
Ocrygel Tvm France ###
Paracetamol 300mg Dolliprane Liquiz
Paraformaldheyde 4% VWR chemicals 1169945
Povidone-iodine MEDA pharma D08AG02 diluted to 1:2
SKH1-Hrhr mouse Charles river 686SKH1-HR 6-weeks old
Slides Thermoscientific AGAA000080
Surgical adhesive BSN medical 9927
Sterile Gauze Hartmann 418545/9 10 X 10 cm
Sterile water Versylene Fresenius B230521
Surgical drape Hartmann 2775161
Ti:Sapphire ChameleonUltra Coherent DS 16-02-16 F 690-1040 nm
Thermal imaging Camera Testo Testo 868
Xylazine (Rompum 2%) Bayer FR/V/ 8146715 2/1980 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg

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जीव विज्ञान अंक 162 घाव भरने पूर्ण मोटाई जला त्वचा प्रत्यारोपण मुरीन एलोबेड़ा घाव पुनर्निर्माण वीवो माउस मॉडल में प्यारा चोट
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Blaise, O., Duchesne, C., Banzet,… More

Blaise, O., Duchesne, C., Banzet, S., Rousseau, A., Frescaline, N. A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft. J. Vis. Exp. (162), e61339, doi:10.3791/61339 (2020).

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