Summary
Целью этого исследования было разработать модель мурина заживления ожоговых ран. Тепловой ожог был вызван на спинной кожи мышей с помощью разогретого шаблона латуни. Обгоревшие ткани были обхожана и наложена с помощью пересадки кожи, собранной из хвоста генетически похожей донорской мыши.
Abstract
Тривиальные поверхностные раны заживают без осложнений по первичному замыслу. Глубокие раны, такие как ожоги полной толщины, заживают вторичным намерением и требуют хирургического разбора и прививки кожи. Успешная интеграция донорского трансплантата в раневую кровать реципиента зависит от своевременного набора иммунных клеток, надежной ангиогенной реакции и нового внеклеточного матричного образования. Разработке новых терапевтических средств, нацеленных на некоторые ключевые процессы, связанные с заживлением ран, препятствует отсутствие надежных доклинических моделей с оптимизированной объективной оценкой замыкания ран. Здесь мы описываем недорогую и воспроизводимую модель экспериментальной полной толщины ожоговой раны, реконструированной с помощью аллогенной трансплантата кожи. Рана индуцируется на поверхности спины обезболивающих инбредных диких пород мышей из balB/C и SKH1-Hrhr фонов. Ожог производится с использованием латунного шаблона диаметром 10 мм, который разогревается до 80 градусов по Цельсию и доставляется при постоянном давлении в течение 20 с. Burn eschar вырезается через 24 часа после травмы и заменяется полной толщиной трансплантата, собранного из хвоста генетически похожей донорской мыши. Для процедуры не требуется специализированного оборудования, и хирургические методы просты. Метод может быть легко реализован и воспроизведен в большинстве исследовательских параметров. Определенные ограничения связаны с моделью. Из-за технических трудностей, урожай более тонкой сплит-толщины пересадки кожи не представляется возможным. Хирургический метод, который мы здесь описываем, позволяет восстановить ожоговые раны с использованием трансплантатов полной толщины кожи. Он может быть использован для проведения доклинического терапевтического тестирования.
Introduction
Хирургическое обломок и пересадка кожи являются распространенной клинической практикой, используемой в управлении хроническими ранами1,ожоговыми ранами2,и острыми ранами, такими как травматические раны3. Прививка кожи относится к хирургической процедуре, которая включает в себя удаление здоровой кожи из одной части тела и перенос ее в другую. Донорские трансплантаты заменяют утраченные ткани и обеспечивают структурный эшафот для клеточной миграции и роста. После интеграции в сайт получателя, пересадки кожи заменить потерянный барьер кожи, обеспечивая защиту от микробного вторжения, вредное воздействие внешней среды и чрезмерная потерявлаги 4. Успешная интеграция пересадки кожи зависит от нескольких факторов. К ним относятся адекватные иммунные реакции в присутствии микробных инфекций и своевременное разрешение воспаления, надежный ангиогенез в месте раны и создание сосудистых анастомозов между кроватью-реципиентом и донорской трансплантацией5. По мере того как трансплантат начинает деградировать, клетки резидента dermal должны быть заменены клетками способными производить новую внеклеточную матрицу. В то же время, эпидермальные кератиноциты должны проползти через недавно созданную матрицу, чтобы сформировать нео-эпидермис и повторно эпителиалиализировать рану. Таким образом, очевидно, что эффективная миграция клеток из кровати-реципиента в донорский трансплантат является еще одним определяющим фактором, влияющим на успешное включение трансплантата. Учитывая огромное количество факторов, участвующих в заживлении ран6, которые могут быть невозможно контролировать в человеческих испытаний из-за этических ограничений, модели доклинических экспериментальных трансплантации кожи необходимы. Разработка доклинических моделей заживления ожоговых ран и связанных с ними прививок кожи будет иметь важное значение для понимания сложных механизмов, участвующих в восстановлении кожной ткани и необходимых для тестирования новых терапевтических средств. Модели in vitro заживления ран не в состоянии точно имитировать сложность кожной ткани. In vivo животных моделей являются незаменимым инструментом расследования в понимании механизмов, участвующих в ремонте тканей.
Несколько методов при пересадки кожи были разработаны у грызунов, чтобы имитировать хирургическое иссечение и восстановление ожоговраны 7,,8,,9. Тем не менее, большинство из ранее описанных процедур не удалось вызвать термическое повреждение ожога до прививки кожи. Вместо ожоговой раны была индуцирована ицивидная рана полной толщины, которая затем была реконструирована с полной толщиной аллотрансплантата7. Различные анатомические ориентиры, такие как ухо, хвост и спина были использованы для сбора кожи донора у грызунов7,8. Различные методы фиксации и стабилизации трансплантата были зарегистрированы, в том числе "без шов техники"9, швы7 и хирургический клей10,11,12.
Целью этого исследования было разработать модель мурина полной толщины ожог раны, которые бы резюмировать текущий золотой стандарт подход в лечении ожогов, которая включает в себя нежизнеспособные ткани исстановки и пересадки кожи. Тепловой ожог был вызван на поверхности спины мыши с помощью разогретого латунного шаблона. Burn eschar был вырезан и заменен полной толщиной трансплантата, собранного из хвоста донорской мыши. Эта экспериментальная модель имеет три ключевых преимущества. Во-первых, более одной ожоговой раны могут быть вызваны на задней части мыши-реципиента, и четыре донорских пересадки кожи могут быть собраны из одного хвоста донорской мыши. Это означает, что несколько экспериментальных и контрольных методов лечения потенциально могут быть сопоставлены с использованием одного и того же реципиента и донора животных. В зависимости от желаемого маршрута введения, контрольное лечение может включать местное или системное введение транспортного средства или контроль плацебо (например, актуальное применение мази, подкожное, внутриперитонное или внутривенное введение раствора). Во-вторых, сроки лечения и конечная точка эксперимента могут быть проконтролированы. В-третьих, эта модель зависит от реконструкции ран с использованием полной толщины трансплантатов, собранных из хвоста, которые, как известно, имеют более высокую вероятность для успешного включения в донорской сайт по сравнению с кожей, собранной из задней13. Это может быть связано с меньшим числом эпидермальных клеток Лангерганса, которые играют ключевую роль в кожной иммунобиологии, и связаны с отказом от пересадки кожи14.
Предлагаемая модель заживления ран и интеграции трансплантата вполне может быть применена к трансгенным и нокаутирующим мышам. Использование генетически модифицированных мышей поможет в выяснении роли, которые некоторые гены могут играть во время восстановления раны. Также может быть рассмотрено экзогенное применение актуальных раневых препаратов или подкожное введение терапевтических антител в месте травмы.
Из-за технических трудностей, сплит-толщины кожи трансплантатов, состоящих из эпидермиса и часть дермы трудно получить у мышей. Полная толщина кожи трансплантатов, состоящий из эпидермиса и полной толщины дермы, как известно, требуют хорошо васкуляризованной раневой кровати для успешной интеграции. Неспособность собрать сплит-толщины кожи трансплантатов у мышей можно рассматривать как ограничение этой модели. Фиксация пересадки кожи на раневую кровать реципиента была достигнута с помощью применения хирургического клея, который связан с меньшей травмой и быстрой деградацией по сравнению с другими средствами фиксации тканей15. Предыдущие исследования показали, что стить связано с более сильной фиксации тканей, чем хирургический клей на 24 ч после хирургической процедуры15, которые могут рассматриваться как недостаток процедуры. Однако, в более поздние моменты времени, биомеханическая прочность ран, обработанных хирургическим клеем, становится сопоставимой с швами15 и лучше, чем основная фиксация16. После фиксации тканей хирургическим клеем раны должны быть покрыты раневой повязкой. Хотя раны на спинной поверхности мыши трудно для животного, чтобы достичь, рана повязка, с другой стороны, легко для животного, чтобы манипулировать и удалить. Частые изменения раны одевания может быть оправданным.
Анестезия индуцированной гипотермии у мелких грызунов является хорошо документированным явлением17. Гипотермия является побочным эффектом этой процедуры, которая вызывает осложнения, и потенциально ставит под угрозу здоровье животных и качество данных. Таким образом, этот метод требует реализации стратегий управления температурой, особенно если используются лысые SKH1-Hrhr.
Наиболее значительным ограничением использования мышей для имитации закрытия человеческих ран является разница между анатомией кожи и физиологии. Мышь раны заживают в основном через сокращение, в то время как человеческие раны заживают через образование гранулированных тканей и реэпителиализации18. Чтобы объяснить это несоответствие, текущая модель может быть изменена и использована в сочетании с шинным кольцом плотно прилипли вокруг раны, чтобы предотвратить сокращение кожи19. Учитывая некоторые преимущества и недостатки этого in vivo протокола, эта модель может служить в качестве инструмента для изучения определенных процессов, связанных с заживлением ран, которые невозможно изучить в пробирке.
Protocol
Все эксперименты были одобрены Французским департаментом высшего образования и исследований (Номер исследования: 1221620171161616517670v2 и DAP180012). Все мыши были одноместными по прибытии в пластиковых клетках и были разрешены 7-дневный период акклиматизации до исследования. Комната для животных была сохранена в 12/12 ч светлого/темного цикла (свет включен в 07:00). Продовольствие и водопроводная вода были предоставлены ad libitum. МЫшей BALB/c и SKH1-Hrhr кормили традиционной пшеницей/соей. Пилы постельные принадлежности были предоставлены вместе с вложенным материалом.
1. Подготовка оборудования
- Подготовьте горящее устройство для процедуры и установите его до 80 градусов по Цельсию с помощью контроллера температуры(Рисунок 1A). Проверить температуру латунного шаблона(Рисунок 1B,C) с помощью инфракрасной тепловизионной камеры.
- Убедитесь, что цифровой манометр работает правильно.
- Обложка сцены с хирургической драпировки и настроить высоту стола(рисунок 1A).
2. Предоперационный и внутриоперационный уход за животными
- Приобретайте мышей BALB/c и SKH1-Hrhr, 6-8 недель.
- Добавить суспензию парацетамола на 3 мг/мл в питьевую воду и поставлять 12 часов до и до 72 часов после процедуры.
- Используя шприц 1 мл и 26 Г иглу, ввести бупренорфин подкожно на 0,05 мкг/г 30 мин до процедуры и каждые 6 часов в течение первых 72 часов после процедуры.
- Используя шприц 1 мЛ и иглу 26 г, ввести лидокаин в спину мыши и 2-3 мм дистального в область ожоговой раны. Введите лидокаин при 0,05 мкг/г подкожно за 15 мин до индукции ожоговой раны.
- Намшамы с помощью интраперитонеальной инъекции ксилазина по 10 мг/кг и кетамина 100 мг/кг. Используйте шприц 1 mL и иглу 26 G для того чтобы administer впрыска.
- Критический шаг: Поместите анестезируемую мышь на нагретую площадку и держите мышь теплой, чтобы предотвратить переохлаждение в течение первых 30 минут после индукции анестезии и в течение по крайней мере 15 минут после восстановления после анестезии. В дополнение к нагретой площадке, другие условия, включая тепловые лампы,циркулирующие теплые жидкости или воздух, и предварительно разогретые тепловые резервуары могут быть использованы для регулирования температуры тела.
- Нанесите смазочный гель на глаза мыши, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы.
- Используйте рефлекс отмены высвещит ног, чтобы оценить глубину анестезии.
- Использование 1 мл шприца и 26 G иглы администрировать 200 мл лактированного решения Ringer дополняется 5% декстрозы. Администрирование замены жидкости подкожно сразу после индукции анестезии и через 6 часов после процедуры для предотвращения обезвоживания.
3. Полная толщина ожога раны индукции
- Бритье анестезируемой мыши с ножницами для волос.
- Нанесите депиляционный крем на поверхность спины мыши в течение 1 минуты. Протрите сливки с помощью стерильной марли и очистить область с куском влажной марли. Помарка кожи с некоторыми марли до высыхания.
- Поместите мышь на сцену, покрытую хирургической драпировкой, и переместите сцену вверх ближе к разогретой латунной шаблон.
- Примените круговой шаблон латуни на задней части мыши (80 градусов по Цельсию на 20 с), используя постоянное давление 0,15 N(рисунок 2).
- Критический шаг: Сразу же после индукции ожога поместите обезболиваемое животное на нагретую подушечку, чтобы предотвратить переохлаждение и сохранить мышь теплой во время и после процедуры. Оправившись от анестезии, верните мышь обратно в клетку.
- Критический шаг: Обеспечьте пюре на полу клетки в течение первых 72 часов после хирургической процедуры. Мыши иногда неохотно достигают до трубки sipper пить воду после травмы ожоговой раны.
4. Сбор донорского трансплантата
- Сделайте продольный разрез скальпелем в верхней части хвоста донорской мыши и аккуратно удалите кожу с помощью хирургических щипцов.
- Поместите хвостовую кожу в стерильную чашку Петри, наполненную 10 мЛ стерильного 0,9% солевого раствора. Используйте линейку для измерения отдельных трансплантатов и разрезать хвостовую кожу на куски, каждый измерения 15 мм, используя скальпель.
- После подготовки, держать пересадку кожи в 0,9% солевого раствора при 4 градусов по Цельсию до 2 часов.
5. Хирургическое иссечение и прививка кожи
- Через 24 часа после индукции ожога подготовьте мышь к анестезии путем вдыхания изофлурана. Поместите мышь в индукционную камеру и индуцировать анестезию с помощью 5% изофлурана в 100% кислорода со скоростью потока 4 л/мин. Для поддержания анестезии во время операции, используйте 2% изофлуран на 2 Л/мин.
- Поместите хирургическую драпировку на мышь и вырежьте окно, чтобы разоблачить хирургическое поле. Используя асептическую технику, мазок раны сначала povidone- йод, а затем с 70% алкоголя.
- Аккуратно подберите обожженную ткань с помощью пары хирургических пинцета и отведайте всю некротическую и нежизнеспособную ткань стерильными хирургическими ножницами и пинцетом. Удалите слой panniculus carnosus гиподермиса, чтобы создать стабильную кровать получателя.
- Поместите пересадку кожи на свежеприготовленную раневую кровать. Аккуратно потяните окружающую кожу к пересадке кожи с помощью хирургических пинцетов. Нанесите хирургический клей, чтобы прикрепить трансплантат к раневой кровати и осторожно нажмите, чтобы выровнять края кожи. Критический шаг: Размер раневой кровати должен быть немного больше, чем размер трансплантата кожи, чтобы обеспечить успешное прививку.
- Разрешить мыши, чтобы оправиться от анестезии. Критический шаг: Поместите мышь на нагретую площадку. Держите мышь теплой во время и после процедуры, чтобы предотвратить переохлаждение.
- Наносить инертную парфиновую марлевую повязку и клеевую вторичную повязку на привитую рану.
- Поместите мышь в отдельную клетку. Критический шаг: Обеспечить некоторые пюре диеты на полу клетки в течение первых 72 часов после хирургической процедуры и контролировать ежедневно.
- Предоставьте игрушки и обогащают окружающую среду.
6. Цифровая визуализация и посмертная коллекция ран
- Фотография раны с цифровой камерой, поставив линейку рядом с раной (Рисунок 3).
- В конце эксперимента усыпляют животных путем воздействия углекислого газа и вывиха шейки матки. Критический шаг: Чрезмерное вытягивать действие кожи во время цервикального вывиха может повредить трансплантата.
- При вскрытии, хирургическим путем акциз спинной ожоговые раны фасции с помощью ножниц. Бисектные раны. Исправить половину в 10% буферизированных формалин и процесс гистологии и иммуногистохимии. Быстрая заморозка другой половины в жидком азоте для извлечения РНК и количества белка и держать на -80 градусов по Цельсию.
7. Гистология кожи, иммуногистохимия и коллагеновая визуализация
- Вставьте образцы кожи в парафин, разрезать на 4 мкм разделы и поместить на положительно заряженные слайды.
- Используйте слайды, окрашенные гематоксилином и эозином, чтобы оценить скорость реэпителиализации (% от исходной раны). Область раны, покрытой неоэпидермисом, может быть выражена в процентах от всей раны(рисунок 4). Используйте цифровое приложение микроскопа и программное обеспечение ImageJ для выполнения микроскопического анализа разделов.
- Используйте гистологические секции (толщина 4 мкм), подготовленные из формалин-фиксированной и парафин-встроенной ткани и подвергайте их иммуногистохимии.
- Для оценки коллагена I и экспрессии фибронектина в ранах, применять первичные антитела и инкубировать на 1 ч. Обнаружение может быть выполнено видов-специфических пероксидазы хрена (HRP) или щелочной фосфатазы (AP) конъюгированных вторичных антител.
- Реагировать разделы либо: (i) HRP,3,3'-diaminobenzidine (DAB) или (ii) AP, Бонд Полимер Уточнение Красный (Таблица Материалов), который дает ярко-красный цвет (Рисунок 5). Сканирование разделов с помощью инструмента и анализировать с помощью цифрового микроскопа приложения и ImageJ.
- Для проведения гистологической оценки осаждения коллагена выполняйте трихромное окрашивание на гистологические секции с помощью коммерческого комплекта.
- Для визуализации коллагенового волокна используйте мультифотонную микроскопию и технику второго гармоничного поколения(рисунок 5). Используйте мультифотонный микроскоп для визуализации тканей, как описано ранее20. Используйте лазер Ti:Sapphire с центральной длиной волны на 810 нм в качестве лазерного источника для генерации второго гармонического и двухфотовых возбужденных сигналов флуоресценции (TPEF).
- Используйте лазерный луч, оснащенный целью 25x/0.95 W для сбора и возбуждения второго гармонического поколения (SHG) и TPEF. Обнаружение сигналов, описанных ранее21 детекторами NDD PMT. Используйте программное обеспечение для управления лазерным сканированием и получения изображений.
Representative Results
Результаты показывают, что разработанный протокол является простым методом, который позволяет индукции полной толщины ожог раны у мышей. Ожоги индуцируются с помощью разогретого латунного шаблона(Рисунок 1A-C). Обгоревшие области отображаются как круглая рана с белым eschar и гиперемической зоны. Размер ожоговой раны немного больше в 24 часов после ожога травмы в результате хорошо описанного явления, известного как прогрессия ожоговой травмы, которая, возможно, из-за острого воспаления22. После иссечения, ожоговые раны реконструируются с помощью аллогенной пересадки кожи(рисунок 3). На 7-й день после ожоговой травмы, раны становятся васкуляризированными5, что свидетельствует об успешном прививке. Эпидермальные кератиноциты мигрируют из соседней кожи реципиента в попытке закрыть рану и преодолеть разрыв между двумя краями ран. Микроскопический анализ H и E окрашенных разделе ран показали, что длина нео-эпидермиса становится значительно длиннее на 7 день после ожогового травмы по сравнению с 3-й день после ожогового повреждения (Рисунок 4B). Перед проведением большого исследования, настоятельно рекомендуется, чтобы исследователи завершить экспериментальное исследование, которое позволяет изучение нового вмешательства, оценка осуществимости, определение изменений в метод для обеспечения воспроизводимости. Статистически значимые эффекты трудно обнаружить в небольших образцах, в то время как увеличение размера выборки является одним из способов повышения статистической мощности теста. Например, для выявления статистически значимой разницы (p q lt; 0,05) в скорости реэпителиализации ран(рисунок 4)между группами размер выборки должен составлять от шести до восьми мышей на группу. Все эксперименты следует повторять не менее двух раз. Как матрицы производства клеток, таких как фибробласты, мигрируют из ткани реципиента в трансплантат, ключевые компоненты внеклеточной матрицы, в том числе коллагена I и фибронектина становятся высоко выраженными в вновь сформированной матрицы (Рисунок 5).
Рисунок 1: Установка горящего устройства. (A) Размещение и настройка горящего устройства. Горящее устройство подключено к регулятору температуры и крепится к цифровому монометру для мониторинга давления. Горящее устройство подвешенное над регулируемой стадией - плоская поверхность, на которую помещаются мыши для индукции ожога. (B-C) Крупным планом изображение латуни шаблон используется для индуцирования раны ожоги. (C) Диаметр латуни шаблон 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схематическая иллюстрация различных шагов, необходимых для воспроизведения экспериментальной модели, описанной в данной статье. Есть три основных шага к процедуре: i) индукция ожоговой раны с помощью разогретого латунного шаблона; ii) хирургическое иссечение нежизнеспособной некротической ткани через 24 часа после ожогового ранения; iii) хирургическая реконструкция ран с использованием полной толщины аллогенной трансплантата кожи, собранного из донорской мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Макроскопический вид реконструированных ран с ожогами мыши. Представитель цифровых изображений ожоговых ран реконструированы с аллогенной пересадки кожи в дни 0, 1, 3 и 7 после ожоговой травмы. Линейка на изображениях в миллиметрах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Микроскопическое появление ран через 3 и 7 дней после ожогового ранения. H и E-окрашенные участки ран 3 и 7 дней после ожоговой травмы. Длина нео-эпидермиса (пунктирная линия) значительно увеличена в (A) день 3 раны по сравнению с (B) день 7 ран. В (A) и (B), шкала бар 100 мкм . (C) Графическое представление процент раны реэпителиализации. Это было оценено путем измерения длины нео-эпидермиса на день 3 и 7 после ожога травмы и выражается в процентах от всей длины раны. Результаты представляют собой среднее значение S.E.M. (n 6 мышей в группе 3 дня; n 6 мышей в группе дня 7, зп й lt; 0.05; Студенческий тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Оценка внеклеточной матрицы и визуализации коллагена I. Представитель изображения иммуногистохимии анализа на день 7 мышь раны окрашенных для ()коллагена и (B) фибронектин. Обратите внимание на интенсивное красное окрашивание в удлиненные шпиндельообразные коллагена I-положительных клеток. Обратите внимание на коричневое окрашивание в фибронектин-положительных клеток в дерме 7 ран. Масштабная штанга 50 мкм на всех изображениях. В (A) и (B), e обозначает эпидермис и d обозначает дерму. (C) Визуализация коллагеновых волокон и гистологическая оценка осаждения коллагена. (D) Представитель TPEF / SHG коллагена изображение день 7 раны мыши. Одновременное приобретение TPEF/SHG с использованием круговой поляризации и сигналов SHG было выборочно обработано для получения двоичного распределения SHG после применения порога. Изображения TPEF (зеленые) и SHG изображения (белые) были псевдо-цветными и накладными. Масштабная штанга No 50 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
По классификации толщины ожогового повреждения23,ожоги полной толщины характеризуются явным участием всей толщины кожи и определенной части подкожной ткани. Этот тип раны может исцелить только путем сокращения или с пересадкой кожи2. Неотъемлемое ограничение метода, описанного в этой статье, заключается в том, что из хвоста мыши были собраны только трансплантаты полной толщины, в отличие от трансплантатов с разделенной толщиной, которые часто используются в клинических условиях. Это было связано с технической сложностью, так как кожа мыши слишком тонкая, чтобы получить трансплантаты раздвоицы толщины. Следует отметить, что полные толщины трансплантатов требуют хорошо васкуляризированной раневой кровати, в то время как сплит-толщины кожи трансплантаты способны выжить на донорских участках с меньшей сосудистости24. Предыдущие исследования показали, что ожог раны, индуцированной на задней части мыши был связан с надежной формирования новых сосудов5. Это говорит о том, что хорошо васкуляризированная область, такая как спинной части мыши, может рассматриваться как анатомическая ориентир для индукции ожоговых ран.
Глубина ожога раны является важным фактором, чтобы рассмотреть. Глубина ожоговой раны должна быть последовательной между отдельными мышами. Воспроизводимость глубины ожоговой раны зависит от температуры латунного шаблона, давления и продолжительности теплового воздействия. Глубина ожоговой раны должна быть проверена гистотологически. Важно иметь в виду, что чрезмерное давление или длительное воздействие кожи на разогретый шаблон латуни может повредить основные ткани. Ткани, окружающие позвоночный столб, включая компоненты центральной и периферической нервной системы, чувствительны к теплу, а при повреждении могут привести к параличу задней ноги.
Хотя послеоперационная смертность не была непосредственно связана с хирургической процедурой, у небольшого числа лысых мышей SKH1-Hrhr, которые особенно чувствительны к простуде, развились переохлаждения и не смогли восстановиться после общей анестезии. Таким образом, дополнительное тепло должно быть предоставлено во время всех эстетических событий и постоянного наблюдения требуется в то время как мышь анестезируется.
Метод, описанный в данном исследовании, не был связан с хирургической инфекцией участка. Тем не менее, асептический метод должен быть использован для предотвращения передачи микроорганизмов в хирургическую рану в периоперационный период. Прививка раны с биолюминесцентными или флуоресцентными микроорганизмами может быть включена в процедуру. Этот метод может быть полезен при изучении инфекционных организмов и их патогенеза25. Например, экзогенное добавление или инъекция биолюминесцентных бактерий, может позволить мониторинг микробной нагрузки с помощью in vivo всей визуализации животных25. Учитывая, что волосы мыши, как известно, вмешиваться в in vivo целом животных флуоресценции и биолюминесценции изображений, голые мыши SKH1-Hrhr являются идеальными хозяевами для исследований с участием флуоресцентных или биолюминесцентных репортеров.
Образцы раневых тканей могут быть собраны в разных точках времени и обработаны для гистологического и иммуногистохимического анализа. Белок и РНК могут быть выделены из биопсии кожи и молекулярной биологии методы могут быть использованы для оценки экспрессии ключевых молекул, участвующих в заживлении ран.
В настоящем исследовании мы описали экспериментальную модель заживления ожогов и аллогенной инплантирования кожи. Эта процедура может быть изменена и служить моделью для доклинических исследований.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана La Direction G'rae де L'Armement, l'Agence de l'Innovation де ДеФесенс и Политехническая школа. Мы благодарим нашего коллегу г-на Янн Плантье из Политехнической школы, который предоставил информацию и опыт, которые в значительной степени помогли производство видео файла. Авторы благодарят г-на Бенуа Пеутемана и г-жу Шарлотту Аурио из INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, h'pital Paul Brousse, Villejuif за их благополучие животных и опыт ухода, предоставленный в ходе этого проекта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringue | Terumo | SS + 01T1 | |
| 26 G needle | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' - 0,45 X 12mm |
| 96X21 mm Petri Dish | Dutscher | 193199 | |
| Animal Weighing scale | Kern | EMB 5.2K5 | |
| BALB/c mouse | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6-weeks old |
| Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm | Simport | M476-1 | |
| Bond polymer Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Brass block | BVG | custom-designed | Circular 10 mm in diameter |
| Buprenorphine (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Burning apparatus Kausistar 400 | TraçaMatrix | 34010 | |
| CaseViewer | 3DHISTECH Ltd. | 3Dhistech, Budapest, Hungary | |
| Collagen I antibody | Abcam | ab34710 | Recommanded concentration 1:50; 1:200 |
| D-(+)- glucose (Dextrose) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
| DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
| Digital camera | NIKON | D3400 | objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
| Depilating cream | Veet | ||
| Disposable scalpels | Swann Morton | 6601 | |
| DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
| Ethanol absolute | VWR chemicals | 20821.310 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | ab23750 | Recommanded dilution 1:1000 |
| Filter 0.22um | Sartorius | 16532 | |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14094-11 | |
| Forceps Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
| Hair clippers | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
| Heating pad | Petelevage | 120070 | |
| Isofluorane | Piramal healthcare | FR/V/03248850/2011 | |
| Ketamine | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg |
| Lactated Ringers solution | Flee-Flex | 1506443 | |
| Lamina multilabel slide scanner | Perkin Elmer | ||
| LAS software | Leica | version 2.7.3 | |
| Leica Bond III | Leica Biosystem | 1757 | |
| Leukosilk dressing | BSN medical | 72669-01 | |
| Lidocaine | Aguettant | N01BB02 | local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Manometer | Kern | HDB-5K5 | |
| Masson Trichrome Staining kit | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
| Micromesh Biopsy cassettes | Simport | M507 | |
| Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope | Leica microsystems | DM500 | Scanner 8000Hz NDD PMT detectors |
| Non adhering dressing Adaptic | Systagenix | A6222 | 12.7cm X 22.9 cm |
| Ocrygel | Tvm France | ### | |
| Paracetamol 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
| Paraformaldheyde 4% | VWR chemicals | 1169945 | |
| Povidone-iodine | MEDA pharma | D08AG02 | diluted to 1:2 |
| SKH1-Hrhr mouse | Charles river | 686SKH1-HR | 6-weeks old |
| Slides | Thermoscientific | AGAA000080 | |
| Surgical adhesive | BSN medical | 9927 | |
| Sterile Gauze | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
| Sterile water | Versylene Fresenius | B230521 | |
| Surgical drape | Hartmann | 2775161 | |
| Ti:Sapphire ChameleonUltra | Coherent | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
| Thermal imaging Camera | Testo | Testo 868 | |
| Xylazine (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg |
References
- Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
- Greenhalgh, D. G. Management of Burns. New England Journal of Medicine. 380 (24), 2349-2359 (2019).
- Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
- Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. StatPearls. , (2019).
- Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266 (2014).
- Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), New Rochelle. 58-70 (2019).
- Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , Chapter 4, Unit 4 4 (2009).
- Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
- Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
- Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
- Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
- Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
- Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
- Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145 (2015).
- Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
- Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
- Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
- Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663 (2019).
