Summary
Dit protocol bepaalt evenwichtsopname, penetratiediepte en niet-evenwichtsdiffusiepercentage voor kationische peptidedragers in kraakbeen. Karakterisering van transporteigenschappen is van cruciaal belang voor een effectieve biologische respons. Deze methoden kunnen worden toegepast voor het ontwerpen van een optimaal geladen drug dragers voor het richten van negatief geladen weefsels.
Abstract
Verschillende negatief geladen weefsels in het lichaam, zoals kraakbeen, vormen een barrière voor de gerichte levering van geneesmiddelen vanwege hun hoge dichtheid van negatief geladen aggrecans en vereisen daarom verbeterde targetingmethoden om hun therapeutische respons te verhogen. Omdat kraakbeen een hoge negatieve vaste ladingsdichtheid heeft, kunnen geneesmiddelen worden gewijzigd met positief geladen geneesmiddelendragers om te profiteren van elektrostatische interacties, waardoor een verbeterd intrakraakbeentransport mogelijk is. Het bestuderen van het vervoer van drugsdragers is daarom van cruciaal belang om de werkzaamheid van geneesmiddelen te voorspellen die een biologische respons opwekken. We tonen het ontwerp van drie experimenten die de evenwichtsopname, de diepte van penetratie en niet-evenwichtsdiffusiesnelheid van kationische peptidedragers in kraakbeenexplants kunnen kwantificeren. Evenwichtsopname-experimenten bieden een maat voor de oplosconcentratie in het kraakbeen in vergelijking met het omringende bad, wat handig is voor het voorspellen van het potentieel van een geneesmiddelendrager bij het verbeteren van de therapeutische concentratie van geneesmiddelen in kraakbeen. Diepte van penetratiestudies met behulp van confocale microscopie zorgen voor de visuele weergave van 1D-oplosmiddeldiffusie van de oppervlakkige tot diepe zone van kraakbeen, wat belangrijk is om te beoordelen of solutes hun matrix- en cellulaire doelsites bereiken. Niet-evenwichtsdiffusiegraadstudies met behulp van een op maat ontworpen transportkamer maakt het mogelijk de sterkte van bindingsinteracties met de weefselmatrix te meten door de diffusiesnelheden van fluorescerende gelabelde solutes over het weefsel te karakteriseren; dit is gunstig voor het ontwerpen van dragers van optimale bindingssterkte met kraakbeen. Samen vormen de resultaten van de drie vervoersexperimenten een richtlijn voor het ontwerpen van optimaal geladen geneesmiddelendragers die profiteren van zwakke en omkeerbare ladingsinteracties voor toepassingen voor de levering van geneesmiddelen. Deze experimentele methoden kunnen ook worden toegepast om het vervoer van drugs en drug-drug carrier conjugaats te evalueren. Verder kunnen deze methoden worden aangepast voor het gebruik bij het richten van andere negatief geladen weefsels zoals meniscus, hoornvlies en de glasachtige humor.
Introduction
Drug-levering aan negatief geladen weefsels in het lichaam blijft een uitdaging als gevolg van het onvermogen van geneesmiddelen om diep door te dringen in het weefsel om cel en matrix doelsites1te bereiken. Een aantal van deze weefsels bestaat uit dicht verpakte, negatief geladen aggrecans die een hoge negatieve vaste ladingsdichtheid (FCD)2 in het weefsel creëren en fungeren als een barrière voor de levering van de meeste macromoleculen3,4. Echter, met de hulp van positief geladen drugsdragers, kan deze negatief geladen weefselbarrière daadwerkelijk worden omgezet in een medicijndepot via elektrostatische ladingsinteracties voor aanhoudende levering van geneesmiddelen1,5,6,7( figuur1).
Figuur 1: Op kosten gebaseerde intrakraakbeenlevering van CPC's. Intra-articulaire injectie van CPC's in de kniegewrichtruimte. Elektrostatische interacties tussen positief geladen CPC's en negatief geladen aggrecangroepen maken een snelle en volledige dieptepenetratie door kraakbeen mogelijk. Dit cijfer is gewijzigd van Vedadghavami et al4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Onlangs, korte lengte cationic peptide dragers (CPC's) werden ontworpen met het doel van het creëren van kleine kationische domeinen in staat het dragen van grotere grootte therapeutica voor de levering aan de negatief geladen kraakbeen4. Voor effectieve levering van geneesmiddelen aan het kraakbeen voor de behandeling van heersende8,,9 en degeneratieve ziekten zoals artrose (OA)10, is het van cruciaal belang dat therapeutische concentraties van geneesmiddelen diep in het weefsel doordringen, waar een meerderheid van de kraakbeencellen (chondrocyten)11liggen. Hoewel er verschillende potentiële ziekte wijzigen van geneesmiddelen beschikbaar zijn, geen hebben opgedaan FDA goedkeuring, omdat deze niet in staat zijn om effectief te richten op hetkraakbeen 12,13. Daarom is evaluatie van de transporteigenschappen van drugsdragers noodzakelijk om de effectiviteit van geneesmiddelen te voorspellen die een therapeutische respons opwekken. Hier hebben we drie afzonderlijke experimenten ontworpen die kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de evenwichtsopname, de diepte van penetratie en de verspreidingsgraad van CPC's4zonder evenwicht.
Om ervoor te zorgen dat er een voldoende medicijnconcentratie in het kraakbeen is die een optimale therapeutische respons kan bieden, werden opname-experimenten ontworpen om de CPC-concentratie in kraakbeen4te kwantificeren. In dit ontwerp, na een evenwicht tussen het kraakbeen en het omringende bad, kan de totale hoeveelheid oplosmiddel in het kraakbeen (gebonden aan de matrix of vrij) worden bepaald met behulp van een opnameverhouding. Deze verhouding wordt berekend door de concentratie van oplosmiddel in het kraakbeen te normaliseren tot die van het evenwichtsbad. In principe zou neutrale oplosmiddel, waarvan de verspreiding door het kraakbeen niet wordt bijgestaan door ladingsinteracties, een opnameverhouding van minder dan 1 hebben. Omgekeerd vertonen kationische oplosmiddelen, waarvan het transport wordt verbeterd via elektrostatische interacties, een opnameverhouding van meer dan 1. Zoals blijkt uit CPC's kan het gebruik van een optimale positieve lading echter leiden tot een veel hogere opnameratio (groter dan 300)4.
Hoewel een hoge medicijnconcentratie in het kraakbeen belangrijk is voor het bereiken van therapeutisch voordeel, is het ook van cruciaal belang dat geneesmiddelen zich verspreiden door de volledige dikte van het kraakbeen. Daarom zijn studies die de diepte van penetratie laten zien nodig om ervoor te zorgen dat geneesmiddelen diep in het kraakbeen reiken, zodat de matrix- en cellulaire doellocaties kunnen worden bereikt, waardoor een effectievere therapie wordt geboden. Dit experiment was ontworpen om de eenrichtingspreiding van oplosmiddelen door kraakbeen te beoordelen, waarbij de verspreiding van geneesmiddelen in kraakbeen na intra-articulaire injectie in vivo werd gesimuleerd. Fluorescentie beeldvorming met behulp van confocale microscopie zorgt voor de evaluatie van de diepte van penetratie in kraakbeen. Netto deeltjeslading speelt een belangrijke rol bij het matigen van hoe diepe geneesmiddelen zich door de matrix kunnen verspreiden. Een optimale nettolading op basis van een weefsel FCD is vereist om zwakke-omkeerbare binding interacties tussen kationische deeltjes en de anionische weefselmatrix mogelijk te maken. Dit houdt in dat elke interactie zwak genoeg is, zodat deeltjes zich kunnen loskoppelen van de matrix, maar omkeerbaar van aard, zodat het kan binden aan een andere matrix binding site dieper in het weefsel4. Omgekeerd kan een overmatige positieve nettolading van een deeltje schadelijk zijn voor diffusie, omdat een te sterke matrixbinding het losmaken van deeltjes van de oorspronkelijke bindingsplaats in de oppervlakkige zone van kraakbeen verhindert. Dit zou resulteren in een onvoldoende biologische respons, aangezien een meerderheid van de doellocaties diep in het weefsel ligt11.
Om de sterkte van de bindende interacties verder te kwantificeren, is analyse van de verspreidingssnelheden van geneesmiddelen via kraakbeen voordelig. Niet-evenwichtsdiffusiestudies maken het mogelijk om real-time diffusiepercentages tussen verschillende oplospercentages te vergelijken. Als geneesmiddelen verspreiden door de oppervlakkige, middelste en diepe zones van kraakbeen, de aanwezigheid van bindende interacties kan sterk veranderen diffusie tarieven. Wanneer bindende interacties aanwezig zijn tussen geneesmiddelen en de kraakbeenmatrix, wordt deze gedefinieerd als de effectieve diffusiviteit (DEFF). In dit geval, zodra alle bindende plaatsen zijn bezet, wordt het verspreidingspercentage van drugs beheerst door de steady-state diffusie (DSS). Vergelijking tussen de DEFF van verschillende oplosmiddel bepaalt de relatieve bindende sterkte van de oplosmiddel met de matrix. Voor een bepaalde oplosmiddel, als de DEFF en DSS binnen dezelfde orde van grootte zijn, impliceert dit dat er minimale binding aanwezig is tussen het medicijn en de matrix tijdens diffusie. Als DEFF echter groter is dan DSS,bestaat er een aanzienlijke binding van deeltjes aan matrix.
De ontworpen experimenten individueel zorgen voor de karakterisering van het vervoer oplosbaar door het kraakbeen, echter, een holistische analyse inclusief alle resultaten is vereist voor het ontwerpen van een optimaal geladen drug drager. De zwakke en omkeerbare aard van lading interacties regelt deeltjes diffusie en zorgt voor een hoge evenwichtsopname en snelle volledige diepte penetratie door kraakbeen. Door middel van experimenten met evenwichtsopnames moeten we zoeken naar dragers die een hoge opname vertonen als gevolg van ladingsinteracties die kunnen worden geverifieerd met behulp van niet-evenwichtsdiffusieratiostudies. Deze bindende interacties moeten echter zwak en omkeerbaar van aard zijn om volledige diktepenetratie van het oplosmiddel door kraakbeen mogelijk te maken. Een ideale drug drager zou beschikken over een optimale lading die het mogelijk maakt sterk genoeg binding voor opname en hoge intra-kraakbeen drug concentraties, maar niet te sterk om volledige dikte diffusie4belemmeren. De gepresenteerde experimenten zullen helpen bij de ontwerpkenmerken voor op lading gebaseerd weefsel gericht op geneesmiddelendragers. Deze protocollen werden gebruikt voor het karakteriseren van CPC-transport viakraakbeen 4,maar deze kunnen ook worden toegepast op een verscheidenheid van geneesmiddelen en drugsdragers via kraakbeen en andere negatief geladen weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Universitaire goedkeuringen werden verkregen voor het uitvoeren van de experimenten met dode weefsels. Runderverbindingen werden commercieel verkregen uit een slachthuis.
1. Kraakbeenexplant extractie
- Met behulp van een scalpel (#10 blad), knippen en verwijderen van vet, spieren, ligamenten, pezen en alle andere bindweefsel om het kraakbeen bloot te stellen van de femoropatellar groef van runderkniegewrichten.
- Met behulp van 3 mm en 6 mm huidstoten, maak loodrecht stoten in het kraakbeen om cilindrische pluggen te extraheren. Plaats onmiddellijk de pluggen in individuele putten van een 48-put plaat met 500 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 1% v/v antibioticum-antimycotic.
- Plaats de oppervlakkige kant van een kraakbeenplug naar beneden in een put in de snijarminrichting(figuur 2). Met behulp van een scheermesje snijdt u de stekker langs het oppervlak van de snijarmmatuur om een 1 mm dik kraakbeenexplant te verkrijgen dat inclusief de oppervlakkige zone is. Herhaal dit voor elke kraakbeenplug.
- Bewaar kraakbeenexplants individueel in polypropyleenbuizen met 500 μL 1x PBS aangevuld met proteaseremmers (PBS-PI, 1 PI mini-tablet per 50 mL 1x PBS) bij -20 °C.
- Voordat u elk van de volgende transportexperimenten uitvoert, ontdooit u de explanthoudende flesjes gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C.
Figuur 2: Op maat ontworpen snijarmatuur. Ontwerpparameters van roestvrijstalen snijarmatuur die wordt gebruikt voor het snijden van kraakbeenexplants met een diameter van 3 en 6 mm. Plastic inzetstukken van verschillende dikte werden geplaatst in putten om de dikte van gesneden explants aan te passen. Roestvrijstalen cilindrische pin van <1 mm diameter werd gebruikt om explant uit de armatuur te duwen. Alle numerieke waarden worden gepresenteerd in mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
2. Evenwichtsopname van CPC's in kraakbeen
- Dep kraakbeenexplants (3 mm dia. X 1 mm dik.) met een delicate taakdoek om overtollige 1x PBS van het explantoppervlak te verwijderen. Met behulp van een evenwicht, snel opnemen van het natte gewicht van elke explant en plaats dan onmiddellijk in een 1x PBS bad om uitdroging te voorkomen.
- Bereid 30 μM-oplossingen (300 μL per explant) van fluorescerende CPC's voor in 1x PBS-PI. Gebruik RNase-vrije polypropyleenbuizen voor reconstitutie.
- In een 96-put plaat, pipet 300 μL van elke 30 μM CPC oplossing in afzonderlijke putten. Vermijd het gebruik van putten in de buurt van de rand van de plaat om verdamping te voorkomen. Breng met behulp van een spatel elke explant over naar de oplossing met putten.
- Vul de omringende putten met 300 μL 1x PBS en bedek de putplaat met deksel. Verzegel de randen van de plaat met flexibele folie om verdamping te minimaliseren.
- Plaats de plaat in een couveuse van 37 °C op een plaatshaker om de deeltjessedimentatie te beperken. Incubeer gedurende 24 uur onder zachte rotatie (50 tpm met een baan van 15 mm) om de evenwichtsopname van CPC's in het kraakbeen mogelijk te maken (figuur 3).
- Een standaardcurve genereren voor correlatie van fluorescentie tot CPC-concentratie
- Bereid seriële verdunningen van CPC-oplossingen van 30 μM – 0 μM (10 2-voudige verdunningen) in 1x PBS-PI in polypropyleenbuizen. Zorg ervoor dat ten minste 500 μL van elke verdunning aanwezig is.
- Voeg 200 μL van elke verdunning toe aan opeenvolgende putten in een zwarte 96-putplaat. Dupliceer in een andere rij om de steekproefgrootte te vergroten.
- Verkrijg fluorescentiemetingen van elk monster met behulp van een plaatlezer bij de excitatie en emissiegolflengten van het fluorescerende etiket met behulp van een plaatlezer.
- Plot fluorescentie lezing vs CPC concentratie en afleiden van een vergelijking voor het lineaire gedeelte van de curve.
OPMERKING: Om de variabiliteit bij fluorescentiemetingen te beperken, moet u de CPC-voorraadoplossing onder dezelfde omstandigheden als de monsterplaat vóór het genereren van de standaardcurve uitbroeden.
- Na 24 uur incubatie, verzamel het evenwichtsbad van elke put in afzonderlijke polypropyleenbuizen.
- Breng 200 μL van elke oplossing over in aparte putten van een zwarte 96-putplaat. Verkrijg fluorescentiemetingen van elk monster onder dezelfde fluorescerende instellingen als voor de standaardcurve. Verdun het monster indien nodig in 1x PBS-PI om ervoor te zorgen dat de metingen binnen het lineaire gedeelte van de standaardcurve vallen.
Figuur 3: Schematisch van experimenten met evenwichtsopname. Kraakbeenexplants (3 mm dia. x 1 mm dik) werden geplaatst in individuen putten in een 96-put plaat met fluorescerende cpc oplossing. Na 24 uur werden CPC's opgenomen door het kraakbeen, waardoor de fluorescentie van het omliggende bad werd verminderd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
3. Diepte van penetratie van CPC's in het kraakbeen
- Bereid 30 μM-oplossingen (300 μL per explant) van fluorescerende CPC's voor in 1x PBS-PI. Gebruik RNase-vrije polypropyleenbuizen voor reconstitutie.
- Met behulp van een scalpel, gesneden kraakbeen explants (6 mm diameter x 1 mm dikte) in de helft om halve schijven te maken. Houd de explant gehydrateerd met een laag van 1x PBS-PI tijdens het snijden.
- Lijm een halfschijf uitplanten in het midden van een put van de op maat ontworpen 1-dimensionale transportkamer met behulp van een epoxy (figuur 4, figuur 5). Zorg ervoor dat epoxy wordt toegepast op de omtrek (gebogen) kant van de explant. Verwijder overtollige lijm uit de put om contact met het diffusieoppervlak van kraakbeen te voorkomen en noteer de oppervlakkige kant van de explant.
- Voeg 80 μL 1x PBS-PI toe aan beide zijden van de explant. Pipette de vloeistof op en neer van de ene kant van de explant om te controleren op lekkage aan de andere kant. Als er lekkage optreedt, past u de explant aan en breng epoxy indien nodig aan.
- Vervang de 1x PBS-PI van de zijkant naar het oppervlakkige oppervlak van kraakbeen (stroomopwaarts) door 80 μL van 30 μM CPC-oplossing. Houd 80 μL 1x PBS-PI aan de zijkant naar de diepe zone van kraakbeen (stroomafwaarts).
- Plaats de transportkamer voorzichtig in een afdekbare container. Bedek de basis van de container met een laag 1x PBS om verdamping van oplossingen te voorkomen. Zorg ervoor dat er geen direct contact is tussen oplossingen van upstream- en downstreamkamers.
- Plaats de overdekte container op een plaatshaker om deeltjessedimentatie te beperken. Incubeer voor 4 of 24 uur bij kamertemperatuur onder zachte rotatie (50 rpm met een baan van 15 mm).
- Na incubatie, verwijder de explant uit de kamer en snijd ~ 100 μm slice uit het midden van de explant.
OPMERKING: Deze dwarsdoorsnede is inclusief de oppervlakkige, midden- en diepe zones van kraakbeen. - Plaats het segment tussen een glazen schuif en een coverslip. Hydrateer het segment met een laag van 1x PBS-PI.
- Bij 10x vergroting, beeld door de volledige dikte van het segment om z-stack van fluorescerende beelden te verkrijgen met behulp van een confocale microscoop.
- Met behulp van ImageJ project de gemiddelde intensiteit van de beelden binnen de z-stack om de diepte van penetratie van CPC's in kraakbeen te bepalen.
- Open de afbeeldingsstack door op Bestand te klikken | Open.
- Klik op 'Afbeelding'op de taakbalk en klik op Afbeelding | Stapels | Z Project vanuit het vervolgkeuzemenu.
- Invoersegmentnummers van 1 tot het uiteindelijke segment. Selecteer 'Gemiddelde intensiteit'onder projectietype. Klik op' OK.'
Figuur 4: Op maat ontworpen 1D-transportkamer. Ontwerpparameters van PMMA 1D transportkamer met 6 individuele putten. Alle numerieke waarden worden gepresenteerd in mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Schematisch van diepte van penetratiestudies. Kraakbeenexplants (6 mm diameter x 1 mm dikte) werden doormidden gesneden en bevestigd aan het midden van 1D diffusive transportputten. Fluorescerend gelabelde CPC-oplossing werd toegevoegd aan de zijkant van de put in contact met de oppervlakkige zone (SZ) van kraakbeen. 1x PBS-PI werd toegevoegd aan de zijkant van de put in contact met de diepe zone (DZ) van kraakbeen. Na diffusie werd een dwarsdoorsnede van kraakbeen (3 mm x 1 mm) afgebeeld met behulp van confocale microscopie. Dit cijfer is gewijzigd van Vedadghavami et al.4 en Bajpayee et al.3Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
4. Verspreidingspercentage van CPC's zonder evenwicht in het kraakbeen
- Breng de twee helften van de op maat ontworpen transportkamer(figuur 6)samen om de kamer te monteren en te sluiten. Gebruik ringen, moeren en bouten om de kamer goed te sluiten met een moersleutel.
LET OP: De transportkamer moet doorschijnend zijn om fluorescerende metingen niet te verstoren. De transportkamers die in dit protocol worden gebruikt, zijn gemaakt van polymethylmethacrylaat (PMMA). - Bedek de binnenruimte van de kamer met 0,5% w/v vetvrije rundermelkoplossing in 1x PBS (2 mL voor elke kamer) gedurende 15 minuten om niet-specifieke binding van CPC's aan kamerwanden te voorkomen. Spoel vervolgens de kamer af met 1x PBS (2 mL voor elke kamer).
- Met behulp van de speciaal ontworpen snijarmatuur(figuur 2) en een scheermesje, snijd een 6 mm diameter kraakbeen explant (dwarsvlak) tot een dikte van 500-800 μm, inclusief de oppervlakkige zone. Laat de explant gehydrateerd met 1x PBS.
- Met behulp van hamer-aangedreven en huid stoten, maak pakkingen van rubberen platen zoals weergegeven in figuur 7.
- Monteer elke halve transportkamer met 1 grote rubberen pakking, 1 PMMA insert en 1 kleine rubberen pakking elk. Plaats de explant in de putten van de kunststof insert, met de oppervlakkige zone tegenover de stroomopwaartse kamer. Sandwich de twee helften samen om de montage te voltooien en schroef stevig met behulp van een moersleutel (Figuur 7).
- Vul de bovenloopkamer met 2 mL 1x PBS-PI en observeer de stroomafwaartse kamer voor lekkage van vloeistof uit de stroomopwaartse kamer. Als er lekkage aanwezig is, de kamer weer in elkaar zetten, de pakkingspositie en de dichtheid van schroeven aanpassen. Als er geen lekkage, vul de downstream kamer met 2 mL 1x PBS-PI ook.
- Voeg een mini-roerbar toe aan zowel boven- als stroomafwaartse kamers en plaats de kamer op een roerplaat. Lijn de kamer zo uit dat de laser van de spectrofotometer is gericht op het midden van de stroomafwaartse kamer. Plaats het signaalontvangergedeelte van de spectrofotometer achter de stroomafwaartse kamer(figuur 8).
OPMERKING: De laser en ontvanger van de spectrofotometer moeten zijn uitgerust met de juiste filters om signalen van het fluorescerende eiwit op te wekken, uit te zenden en door te geven. Bescherm de transportkamer tegen licht met behulp van een zwarte doos tijdens het experimenteren om interferentie in fluorescentiesignaal te voorkomen. Het is de beste praktijk om de openingen op de top van de kamer te verzegelen met flexibele folie om verdamping te voorkomen. - Verzamel real-time downstream fluorescentie emissiemetingen en zorg voor een stabiel signaal gedurende ten minste 5 minuten.
OPMERKING: Aliquots uit de stroomafwaartse kamer kunnen worden verkregen en beoordeeld op fluorescentie met behulp van een plaatlezer als een op maat ontworpen spectrofotometer of doorschijnende transportkamer niet beschikbaar is. - Pipette een vooraf berekend volume van de voorraad oplossing van fluorescerend getagde CPC's in de upstream kamer om een uiteindelijke concentratie van 3 μM in de upstream kamer te garanderen. Observeer het stroomafwaartse fluorescentiesignaal en laat het vervoer oplosmiddel toe om een gestage toename van de helling te bereiken.
OPMERKING: Een dikkere kraakbeen explant zal meer tijd nodig hebben om steady-state te bereiken. - Zodra de steady state is bereikt, neem 20 μL uit de upstream kamer en voeg toe aan de downstream kamer ("spike test").
OPMERKING: Een piek in de stroomafwaartse fluorescentie zal worden waargenomen. Dit zal zorgen voor correlatie tussen fluorescentie metingen en CPC concentratie. - Verzamel real-time downstream fluorescentie metingen.
Figuur 6: Op maat ontworpen niet-evenwichtsverspreidingstransportkamer. Ontwerpparameters van PMMA non-equilibrium diffusie transportkamer. De kamer moet doorschijnend zijn om de fluorescentiemetingen niet te verstoren. De volledige transportkamer bestond uit twee identieke helften van het getoonde armatuur. Twee cilindrische roestvrijstalen pinnen (~ 2,94 mm diameter, ~ 18 mm lang) waren nodig om uitlijning en volledige sluiting van de helften van de kamer te garanderen. Vier identieke sleuven voor 6-32 draadschroeven werden gemaakt in elke hoek van de kamer voor schroef strakke montage. Alle numerieke waarden worden weergegeven in millimeters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Vergadering van de transportkamer van niet-evenwichtsverspreiding. Ontwerpparameters van (A) zwarte PMMA wisselplaten en (B) grote en kleine rubberen pakkingen. De dikte van rubberen pakkingen werd aangepast om een strakke sluiting van de kamer te garanderen. Alle numerieke waarden worden weergegeven in mm. (C) Schematisch met de volgorde van de montage voor twee helften van de transportkamer met kraakbeen explant geplaatst in het midden. SZ geeft oppervlakkige zone van kraakbeen die werd geconfronteerd met de upstream kamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Schematisch van experimenten met niet-evenwichtsdiffusie. Kraakbeenexplants (6 mm diameter x 1 mm dikte) werden geplaatst in het midden van de transportkamer met het oppervlakkige oppervlak naar de stroomopwaartse kamer. Zowel up als downstream zijkanten van de kamer werden gevuld met 1x PBS-PI en gemengd met behulp van een mini roerstaaf. Met een laser wees naar de downstream kamer om fluorescerende lezingen te verzamelen, fluorescerend gelabeld CPC oplossing werd toegevoegd aan de upstream kamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na evenwichtsabsorptie van CPC's door kraakbeen neemt de badfluorescentie af wanneer het oplosmiddel door het weefsel is opgenomen. Echter, als de fluorescentie waarde van het uiteindelijke bad blijft vergelijkbaar met de eerste, het geeft aan dat er geen / minimale oplosmiddel opname. Een andere bevestiging van de opname van solute is als het weefsel zichtbaar van kleur is veranderd in de kleur van de fluorescerende kleurstof. De kwantitatieve opname van oplosmiddel in kraakbeen werd bepaald aan de hand van de opnameverhouding (RU)nadat de fluorescentiewaarden werden omgezet in concentratie met behulp van de standaardcurve. Met behulp van de initiële badconcentratie (CBath,i)en de concentratie evenwichtsbad (CBath),werd de oplosconcentratie in kraakbeen (CKraakbeen)als volgt berekend waar VBath=300 μL:
Met behulp van CKraakbeen en CBathwerd de opnameverhouding bepaald met behulp van de onderstaande vergelijking.
Waarden >>1 geven een verbeterde opname aan als gevolg van laadinteracties, terwijl waarden <1 wijzen op een lage opname. Bijvoorbeeld, grotere, neutrale oplosmiddelen zoals Neutravidin (60 kDa, pI 7) hebben aangetoond RU<1 als gevolg van sterische hinder met het kraakbeen matrix1, terwijl kleinere, neutrale oplosbare stoffen worden verwacht dat RU~ 1, als ze in staat zijn om diffuus in het kraakbeen, het bereiken van evenwicht. Avidin (pI 10,5), de positief geladen tegenhanger van Neutravidin, heeft daarentegen een RU~180 in kraakbeen1getoond. Verder, kleine CPC's (~ 2,5-4 kDa) tonen een RU tot 4004. Zoals blijkt uit figuur 9, vertoonden de opnameratio's een lastenafhankelijke respons4.
Figuur 9: Representatieve resultaten van de opname van CPC's in kraakbeen. CPC's met wisselende nettolading (+8, +14 en +20) en hun respectieve opnameratio's in kraakbeen toonden aan dat de opname niet eentonig toeneemt met toenemende heffing. Dit cijfer is gewijzigd van Vedadghavami et al.4Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
In het geval dat de fluorescentie van het bad is toegenomen na het bereiken van evenwicht, zou dit erop wijzen dat de initiële badconcentratie van de fluorescerende oplosmiddel te hoog was. Dit zou ertoe leiden dat de emissie te worden gevangen in de oplossing na excitatie via plaatlezer. Om dit probleem op te lossen, verlaag de initiële badconcentratie.
Na confocale beeldvorming, werd een stapel beelden geproduceerd met elk beeld dat de diepte van penetratie van fluorescerend gelabelde CPC's bij verschillende lagen kraakbeen toont. Het beeld verkregen uit het midden van het kraakbeen explant toonde de verste diepte van penetratie in vergelijking met een ander beeld in de dikte van de explant. Met behulp van een software als ImageJ, de stapel beelden werd bedekt om een beeld met de gemiddelde intensiteit van CPC penetratie te produceren. Deze bedekte beelden boden de beste vergelijking van de algehele diepte van penetratie tussen verschillende geladen drugdragers. Er werd een lastenafhankelijke respons waargenomen voor CPC's in het weefsel(figuur 10). Grote neutraal geladen dragers (bijvoorbeeld Neutravidin) zullen niet veel verder doordringen dan de oppervlakkige zone omdat ze niet in staat zijn om ladingsinteracties te gebruiken om binding met de matrix1te induceren. Ook zal een te hoge positieve lading beperkt blijven tot de oppervlakkige zone (zoals blijkt uit CPC+20 zelfs na 24 uur)4, maar dit is een gevolg van het feit dat de vervoerder te sterk aan de matrix gebonden is; ze zijn niet in staat om los te komen van hun oorspronkelijke doel. Een optimaal geladen drug drager zou echter in staat zijn om door te dringen tot de diepe zones van kraakbeen als het kan profiteren van de zwakke en omkeerbare aard van elektrostatische interacties (zoals blijkt uit CPC +14)4. Dit zorgt ervoor dat de drager te binden aan zijn oorspronkelijke doel, unbind om dieper te bewegen door de matrix, en vervolgens weer te binden aan doelen verder in het weefsel. Avidin (~7 nm diameter, 66 kDa, pI 10,5) binding met negatief geladen matrix glycosaminoglycans (GAG's) heeft bijvoorbeeld een dissociatieconstante (KD)van 150 μM, die als zwak genoeg werd beschouwd om de omkeerbare binding mogelijk te maken die nodig is voor volledige diktepenetratie1. Ondanks de zwakke binding vertoonde Avidin een hoge retentie en opname in kraakbeen als gevolg van de aanwezigheid van een hoge dichtheid van negatief geladen GAGs (Bindingsdichtheid NT = 2900 μM)1. Verder, zoals blijkt uit CPC +8, volledige dikte penetratie was zichtbaar binnen 4 uur, terwijl CPC + 14 vereist 24 uur om volledige diepte te bereiken4. Dus, meerdere tijdstippen moeten worden gekozen om effectief te vergelijken tarief van verschillende oplosmiddelen bij indringende weefseldikte. Voor een meer kwantitatief begrip van de diepte van penetratie, kunnen de relatieve intensiteiten van oplosmiddel langs de dikte van weefsel worden verkregen met behulp van ImageJ.
Figuur 10: Representatieve resultaten van diepte van penetratiestudies in kraakbeen. CPC's van wisselende nettolading (+8, +14 en +20) en hun respectieve diepte van penetratie door kraakbeen onthulden zwak-omkeerbare binding zoals gezien door CPC+8 en CPC+14 is de sleutel voor volledige dieptepenetratie. Echter, te sterke binding zoals gezien voor CPC +20 belemmerd volledige dikte penetratie. Dit cijfer is gewijzigd van Vedadghavami et al.4Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Als er geen fluorescerend signaal is waargenomen in het kraakbeen tijdens de beeldvorming, kunnen er twee problemen aanwezig zijn; ofwel het oppervlak voor diffusie werd geblokkeerd door de epoxy, of de initiële badconcentratie was te laag om een fluorescerend signaal te produceren. Om deze problemen op te lossen, verwijder overtollige epoxy van de kraakbeenoppervlakken en verhoog de oplosconcentratie.
Niet-evenwichtsdiffusieexperimenten resulteerden in een curve zoals aangegeven in figuur 11. Het eerste deel van de curve vertegenwoordigt oplossing door kraakbeen als oplosmiddel-matrix bindende interacties plaatsvinden. Met een verhoogde lading van de drager, sterkere matrix binding opgetreden die zal resulteren in een langere tijd voor oplosbare stoffen om de downstream kamer te bereiken. Zodra de oplosmiddel door de diepte van het kraakbeen doordrong en de stroomafwaartse kamer bereikte, werd een toename van de helling van de curve waargenomen toen de fluorescentiemeting in de loop van de tijd toenam. Dit tweede deel van de curve bereikte een gestage helling, wat neerkomt op een gestage verspreiding. Een tangentiale lijn werd getrokken op de steady-state helling om de tijd die nodig is om steady-state diffusie (τLag),gekenmerkt door de x-onderschepping te bereiken. De effectieve diffusiviteit (DEFF),de diffusiesnelheid van CPC's terwijl er bindende interacties in kraakbeen aanwezig zijn, werd berekend met behulp van de τLag en explant dikte (L) als volgt:
Na overdracht van 20 μL oplossing van de stroomopwaartse naar de stroomafwaartse kamer, werd een piek in fluorescentie waargenomen; de resulterende gestabiliseerde fluorescentieintensiteit werd gebruikt voor correlatie met de concentratie. De concentratie van CPC's in stroomafwaarts (CD)genormaliseerd tot de upstreamconcentratie (CU)werd vervolgens tegen de tijd uitgezet. De helling van deze curve werd gebruikt om de steady-state diffusie te schatten wanneer alle bindingsplaatsen in kraakbeen bezet zijn (DSS)zoals hieronder wordt weergegeven. Deze waarde was inclusief de verdelingscoëfficiënt. Hier vertegenwoordigen φ, VD en A respectievelijk kraakbeenpopoositeit (~0,8), stroomafwaarts kamervolume (2 mL) en doorsnedegebied van kraakbeen (0,1257 cm2). Representatieve DEFF- enD-SS-waarden, berekend op basis van niet-evenwichtsexperimenten voor CPC's , zijn te vinden in tabel 1.
Figuur 11: Representatieve resultaten van niet-evenwichtsdiffusiestudies door middel van kraakbeen. CPC+8 diffusiecurve, uitgezet als de downstreamconcentratie (CD)genormaliseerd naar de upstreamconcentratie (CU), tegen de tijd. Een tangentiale lijn getrokken op de steady-state helling (blauw) kruist de x-as op τLag, die werd gebruikt om DEFFte berekenen . De helling van de raaklijn werd gebruikt om DSSte berekenen. De spiketest (grijs) vertegenwoordigt de gestabiliseerde concentratie in de stroomafwaartse kamer na overdracht van 20 μL CPC-oplossing van stroomopwaarts naar stroomafwaarts, gebruikt voor het normaliseren van de downstreamconcentratie. Dit cijfer is gewijzigd van Vedadghavami et al.4Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Als de stroomafwaartse fluorescentie niet te stabiliseren voorafgaand aan de toevoeging van fluorescerend getagd peptide aan de upstream kamer, is het waarschijnlijk dat er oplosbare residu vast op de muren van een vorig experiment. In dit geval, demonteren van de kamer en wassen met zeep en sonicaat. Als er een toename is van de stroomafwaartse fluorescentie onmiddellijk na de toevoeging van fluorescerend getagd peptide aan de upstream kamer, kan dit erop wijzen dat lekkage aanwezig is. Dit zou een hermontage van de transportkamer vereisen en opnieuw testen op lekken. Als het stroomafwaartse fluorescentiesignaal een plateau bereikt in tegenstelling tot een gestage toename, duidt dit op een mogelijk concentratieverlies in de upstreamkamer, waarschijnlijk veroorzaakt door oplosbare stoffen die aan de wanden van de kamer kleven. Toevoeging van 0,005% w/v runder serum albumine (BSA) aan de upstream kamer kan helpen voorkomen dat steken.
| Cpc | DEFF (cm2/s) | DSS (cm2/s) |
| CPC+8 | 1,7 ± 0,4 x 10-7 | 5,8 ± 0,0 x 10-5 |
| CPC+14 | 9,8 ± 0,2 x 10-8 | 2,6 ± 1,2 x 10-5 |
| CPC+20 | 4,7 ± 0,1 x 10-8 | 1,4 ± 0,9 x 10-5 |
Tabel 1: Representatieve DEFF- enD-SS-waarden voor CPC-vervoer door kraakbeen. Deze tabel is gewijzigd van Vedadghavami et al.4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methoden en protocollen die hier worden beschreven zijn belangrijk voor het gebied van gerichte levering van geneesmiddelen aan negatief geladen weefsels. Vanwege de hoge dichtheid van negatief geladen aggrecans aanwezig in deze weefsels, wordt een barrière gecreëerd, waardoor drugs hun cellulaire doelsites die diep in de matrix liggen, niet bereiken. Om deze nog opmerkelijke uitdaging het land aan te pakken, kunnen geneesmiddelen worden aangepast om positief geladen drugsdragers op te nemen die het vervoerspercentage, de opname en de binding van geneesmiddelen in weefsel1,3,4,14,,15, 16,,17,18,19kunnen verbeteren .16 Zoals hier met de ontwikkelde methoden wordt getoond, kan het vervoer van positief geladen drugsdragers worden gekarakteriseerd om de evenwichtsopname, de diepte van penetratie en de verspreidingssnelheid van niet-evenwicht te bepalen. We hebben met succes drie afzonderlijke experimentele opstellingen ontworpen die kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van het transport door kraakbeenexplants.
Voor een succesvolle karakterisering van het vervoer moeten kritische stappen in de procedure worden gevolgd. Het gebruik van proteaseremmers (P's) in alle oplossingen is van cruciaal belang voor het nauwkeurig karakteriseren van intrakraakbeentransport van CPC's via kraakbeen, omdat ze functioneren om enzymatische vertering van eiwitten in weefsel20te voorkomen. Daarom, indien niet gebruikt, kraakbeen matrix componenten zoals aggrecans en collageen kan beginnen te degraderen en afscheiden in het omliggende bad tijdens experimenten. Dit kan de FCD van kraakbeen sterk verlagen, waardoor het aantal op lading gebaseerde bindingsplaatsen in de kraakbeenmatrix wordt verminderd. Het resulterende weefsel zou niet langer representatief zijn voor gezond kraakbeen. Omgekeerd kunnen de gepresenteerde experimenten ook worden gebruikt om het transport van CPC's door artritis kraakbeen te evalueren waar het aggrecangehalte veel lager is, zoals te zien is in OA20. Met behulp van trypsine of Chondroitinase ABC om kraakbeen explants verteren, de aggrecan dichtheid kan worden gecontroleerd, waardoor voor de evaluatie van het vervoer en de levering van geneesmiddelen in een zieke toestand. In dit geval kan op lading gebaseerde binding in het gedrang komen, terwijl andere soorten interacties zoals waterstofbindingen en hydrofobe interacties de intrakraakbeenbinding en -retentie synergetisch verbeteren4.
Het handhaven van hydratatie van het kraakbeen explant is de sleutel tijdens de voorbereiding en experimenten van het monster. Uitdroging door blootstelling aan lucht gedurende meer dan 6 minuten is aangetoond dat onomkeerbare schade aan gewrichtskraakbeen21veroorzaken . Als gevolg hiervan kunnen onverwachte veranderingen in het vervoer van CPC's optreden. Op dezelfde manier kan verdamping van CPC-baden leiden tot uitdroging van uitdroging; dit kan worden voorkomen door afdichting met een flexibele folie. Echter, bad verdamping kan niet alleen leiden tot uitdroging uitdroging uitdroging, maar het kan ook leiden tot een verandering in CPC bad concentratie, wat resulteert in valse fluorescerende lezingen. Verder is het belangrijk op te merken dat de diepte van penetratiestudies vereisen dunne dwarsdoorsnedes (~ 100 μM) van kraakbeen worden afgebeeld. Dit is een techniek die oefening vereist, zodat plakjes van uniforme dikte kunnen worden verkregen. Het is ook van cruciaal belang voor niet-evenwichtsdiffusie-experimenten, dat de transportkamer doorschijnend is, zodat real-time fluorescentiemetingen kunnen worden verkregen met de op maat ontworpen spectrofotometer. Als alternatief kunnen aliquots uit de downstreamkamer echter worden verkregen en beoordeeld op fluorescentie met behulp van een plaatlezer of een andere spectrofotometrische lezer.
De hier gepresenteerde methoden zijn van groot belang omdat ze een bench-scale methode bieden voor het karakteriseren van het vervoer van geneesmiddelendragers door het kraakbeen om in vivo medicijnretentie en biologische werkzaamheid op lange termijn beter te voorspellen. Onlangs werd een eindig element kader voor computationele vloeistofdynamica geïmplementeerd voor het meten van oplosmiddel transport via poreuze media22. Arbabi et al. hebben eindige elementenanalyse gebruikt in combinatie met experimentele gegevens verkregen uit micro-CT-beeldvorming om diffusiepercentages van negatief geladen contrastmiddel, ioxaglate in kraakbeen23,24te meten . Verder werden met behulp van een multi-zone, multi-phasic model, de diffusiecoëfficiënten van ioxaglate in verschillende zones van kraakbeen gemeten samen met de FCD van elke zone. Terwijl micro-CT beeldvorming alleen kan worden gebruikt met contrastmiddelen, onze experimentele setup zorgt voor de karakterisering van het vervoer van alle drugs en drugsdragers die fluorescerend kunnen worden gelabeld. De geavanceerde berekeningsmodellering die Arbabi et al. gebruikt, biedt echter een uitgebreidere analyse van het transportgedrag oplosmiddel en kan worden toegepast op onze experimentele methoden13,24.
Een beperking van de gepresenteerde methode is dat de experimentele opstelling voor elk oplosmiddelexperiment niet volledig de in vivo-omgeving omvat. Biologische reacties en mechanische en dynamische krachten die zich voordoen in het natuurlijke gewricht worden hier niet gesimuleerd. Om deze krachten op te nemen, kan de transportkamer worden aangepast met een zuiger om convectieve stroompatronen te simuleren die optreden tijdens activiteiten als wandelen en hardlopen. Hoewel de convectieve stroom de opname met 2-voudige kan verhogen, kan de opname als gevolg van elektrostatische interacties 100-400x toenemen. Zo geven de hier gepresenteerde experimentele opstellingen een goede schatting voor het vervoer en de opname op basis van kosten25. Verder, omdat het kniegewricht van nature synoviale vloeistof bevat, kan het worden gebruikt in de badoplossingen voor transportexperimenten in plaats van 1x PBS-PI. Geschat wordt dat de opname van kationische dragers in kraakbeen zou afnemen in synoviale vloeistof in vergelijking met in 1x PBS als gevolg van de aanwezigheid van hyaluronan ketens met negatief geladen carboxyl groepen in synoviale vloeistof. Het is mogelijk dat kationische dragers concurrerend binden met de hyaluronan ketens van de synoviale vloeistof in aanvulling op de GAG's van kraakbeen. De dichtheid van negatief geladen groepen is echter aanzienlijk hoger in kraakbeen in vergelijking met synoviale vloeistof, als gevolg van de aanwezigheid van zowel negatief geladen carboxylated hyaluronan ketens als sulfated GAGs in kraakbeen15. Dus, hoewel de opname in kraakbeen in aanwezigheid van synoviale vloeistof lager zal zijn dan in 1x PBS, wordt nog steeds verwacht dat het een hoge intrakraakbeenopname zal handhaven. In vivo heeft Avidin een hoge intrakraakbeenopname aangetoond in zowel ratten- als konijnenkraakbeen in aanwezigheid van synoviale vloeistof16,26. Verder heeft Avidin een hoge opname en retentie in kraakbeen aangetoond tot 2 weken na intra-articulaire injectie in een voorste kruisbandtype27.
Het gebruik van runderkraakbeen in dit systeem zorgt voor een nauwkeurigere weergave van de penetratie van geneesmiddelen door kraakbeen vanwege de gelijkenissen met menselijk kraakbeen in termen van dikte (~1,5-2 mm)28,29. Het vervoer van oplosmiddelen door het kraakbeen kan variëren met dikte; drugdragers kunnen minder bindende interacties nodig hebben om volledig door muizen of rattenkraakbeen te dringen, die veel dunner zijn, maar kunnen aanzienlijk worden belemmerd om dieper in dikker menselijk kraakbeen te doordringen1. Verder, hoewel deze experimenten werden ontworpen om oplosbare transport te karakteriseren binnen het kraakbeen, deze methoden kunnen worden gewijzigd en toegepast op andere negatief geladen weefsels zoals meniscus, hoornvlies en glasvocht humor van het oog, en de kern pulposus van tussenwervelschijven. De methoden van experimenten die hier zijn ontworpen zijn voordelig omdat de afmetingen van armaturen en transportkamers kunnen worden aangepast aan de grootte en soorten weefsel. Het effect van deze methoden is wijdverbreid, niet alleen beperkt tot drugsdragers, maar ook voor de evaluatie van het vervoer van drugs en drug-drug drager conjugaats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Amerikaanse ministerie van Defensie door middel van de Congressionally Directed Medical Research Programs (CDMRP) onder contract W81XWH-17-1-0085, en het National Institute of Health R03 EB025903-1. AV werd gefinancierd door het College of Engineering Dean's Fellowship aan de Northeastern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18x18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
References
- Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
- Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, Pt 2 335-347 (1976).
- Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
- Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
- Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238 (2019).
- Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898 (2020).
- Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
- Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
- Martel-Pelletier, J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
- Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).
- Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. Progress in intra-articular therapy. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).
- He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
- Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
- Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882 (2020).
- Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
- Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
- Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
- Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
- Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
- Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).
- Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).
