Summary
Ce protocole détermine l’absorption d’équilibre, la profondeur de pénétration et le taux de diffusion non-équilibre pour les porteurs de peptide cationique dans le cartilage. La caractérisation des propriétés du transport est essentielle pour assurer une réponse biologique efficace. Ces méthodes peuvent être appliquées pour la conception d’un transporteur de drogue chargé de façon optimale pour cibler les tissus chargés négativement.
Abstract
Plusieurs tissus chargés négativement dans le corps, comme le cartilage, présentent une barrière à l’administration ciblée de médicaments en raison de leur forte densité d’agvrecans chargés négativement et, par conséquent, nécessitent des méthodes de ciblage améliorées pour augmenter leur réponse thérapeutique. Parce que le cartilage a une forte densité négative de charge fixe, les médicaments peuvent être modifiés avec des transporteurs de médicaments chargés positivement pour tirer parti des interactions électrostatiques, permettant un transport amélioré de médicaments intra-cartilage. L’étude du transport des transporteurs de médicaments est donc cruciale pour prédire l’efficacité des médicaments dans l’induction d’une réponse biologique. Nous montrons la conception de trois expériences qui peuvent quantifier l’absorption d’équilibre, la profondeur de pénétration et le taux de diffusion non-équilibre des porteurs de peptide cationique dans les explants de cartilage. Les expériences d’absorption d’équilibre fournissent une mesure de la concentration de soluté dans le cartilage par rapport à son bain environnant, qui est utile pour prédire le potentiel d’un porteur de drogue dans l’amélioration de la concentration thérapeutique des médicaments dans le cartilage. La profondeur des études de pénétration utilisant la microscopie confocale permet la représentation visuelle de la diffusion de soluté 1D de la zone superficielle à profonde du cartilage, ce qui est important pour évaluer si les solutés atteignent leurs sites cibles matriciels et cellulaires. Les études sur le taux de diffusion hors équilibre à l’aide d’une chambre de transport conçue sur mesure permettent de mesurer la force des interactions de liaison avec la matrice tissulaire en caractérisant les taux de diffusion des solutés fluorescents étiquetés dans le tissu; ceci est bénéfique pour la conception de porteurs de la force de liaison optimale avec le cartilage. Ensemble, les résultats obtenus à partir des trois expériences de transport fournissent une ligne directrice pour la conception de transporteurs de médicaments chargés de façon optimale qui tirent parti des interactions faibles et réversibles de charge pour les applications de livraison de médicaments. Ces méthodes expérimentales peuvent également être appliquées pour évaluer le transport de médicaments et de conjugués de trafiquants de drogues. En outre, ces méthodes peuvent être adaptées pour l’utilisation dans le ciblage d’autres tissus chargés négativement tels que le ménisque, la cornée et l’humour vitreux.
Introduction
L’administration de médicaments aux tissus chargés négativement dans le corps reste un défi en raison de l’incapacité des médicaments à pénétrer profondément dans le tissu pour atteindre les sites cibles cellulaires et matricielles1. Plusieurs de ces tissus comprennent des agglements de charges denses et chargés négativement qui créent une densité de charge fixe négative élevée (FCD)2 dans le tissu et agissent comme une barrière pour la livraison de la plupart des macromolécules3,4. Toutefois, avec l’aide de transporteurs de médicaments chargés positivement, cette barrière tissulaire chargée négativement peut en fait être convertie en dépôt de drogue par l’intermédiaire d’interactions de charge électrostatique pour la livraison soutenue de médicaments1,5,6,7(Figure 1).
Figure 1 : Livraison intra-cartilage basée sur les frais des CPC. Injection intra-articulaire de CPC dans l’espace des articulations du genou. Les interactions électrostatiques entre les CPC chargés positivement et les groupes aggrecans chargés négativement permettent une pénétration rapide et complète de la profondeur par le cartilage. Ce chiffre a été modifié à partir de Vedadghavami et al4. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Récemment, les porteurs de peptides cationiques de courte longueur (CPC) ont été conçus dans le but de créer de petits domaines cationiques capables de transporter des thérapies de plus grande taille pour la livraison au cartilage chargé négativement4. Pour l’administration efficace de médicaments au cartilage pour le traitement des maladies répandues8,,9 et dégénératives telles que l’arthrose (OA)10, il est essentiel que les concentrations thérapeutiques de médicaments pénètrent profondément dans le tissu, où la majorité des cellules du cartilage (chondrocytes) se trouvent11. Bien qu’il existe plusieurs médicaments potentiels de modification de la maladie disponibles, aucun n’a obtenu l’approbation de la FDA parce que ceux-ci sont incapables de cibler efficacement le cartilage12,13. Par conséquent, l’évaluation des propriétés de transport des transporteurs de médicaments est nécessaire pour prédire l’efficacité des médicaments dans l’induction d’une réponse thérapeutique. Ici, nous avons conçu trois expériences distinctes qui peuvent être utilisées pour évaluer l’absorption de l’équilibre, la profondeur de pénétration et le taux de diffusion hors équilibre des CPC4.
Pour s’assurer qu’il y a une concentration suffisante de drogue dans le cartilage qui peut fournir une réponse thérapeutique optimale, des expériences d’absorption ont été conçues pour quantifier la concentration de CPC d’équilibre dans le cartilage4. Dans cette conception, suivant un équilibre entre le cartilage et son bain environnant, la quantité totale de soluté à l’intérieur du cartilage (soit lié à la matrice ou libre) peut être déterminée à l’aide d’un rapport d’absorption. Ce rapport est calculé en normalisant la concentration de solutés à l’intérieur du cartilage par rapport à celle du bain d’équilibre. En principe, les solutés neutres, dont la diffusion par le cartilage n’est pas assistée par des interactions de charge, auraient un rapport d’absorption inférieur à 1. Inversement, les solutés cationiques, dont le transport est amélioré par des interactions électrostatiques, montrent un taux d’absorption supérieur à 1. Toutefois, comme le montrent les CPC, l’utilisation d’une charge positive optimale peut entraîner des ratios d’absorption beaucoup plus élevés (supérieurs à 300)4.
Bien que la concentration élevée de drogue dans le cartilage soit importante pour réaliser l’avantage thérapeutique, il est également critique que les drogues diffusent par toute l’épaisseur du cartilage. Par conséquent, des études montrant la profondeur de pénétration sont nécessaires pour s’assurer que les médicaments atteignent profondément dans le cartilage de sorte que la matrice et les sites cibles cellulaires peuvent être atteints, fournissant ainsi une thérapie plus efficace. Cette expérience a été conçue pour évaluer la diffusion à sens unique des solutés par le cartilage, simulant la diffusion des drogues dans le cartilage suivant l’injection intra-articulaire in vivo. L’imagerie par fluorescence à l’aide de la microscopie confocale permet d’évaluer la profondeur de pénétration dans le cartilage. La charge nette des particules joue un rôle clé dans la modération de la façon dont les médicaments profonds peuvent se diffuser à travers la matrice. Une charge nette optimale basée sur un tissu FCD est nécessaire pour permettre des interactions de liaison faible-réversible entre les particules cationiques et la matrice anionique de tissu. Cela implique que toute interaction est assez faible pour que les particules puissent se dissocier de la matrice mais réversibles dans la nature afin qu’elle puisse se lier à un autre site de liaison matricielle plus profondément dans le tissu4. Inversement, la charge nette positive excessive d’une particule peut être préjudiciable à la diffusion, car une liaison matricielle trop forte empêche le détachement des particules du site de liaison initial dans la zone superficielle du cartilage. Cela se traduirait par une réponse biologique insuffisante car la majorité des sites cibles se trouvent profondément dans le tissu11.
Pour quantifier davantage la force des interactions de liaison, l’analyse des taux de diffusion de drogue par le cartilage est avantageuse. Les études de diffusion hors équilibre permettent de comparer les taux de diffusion en temps réel entre les différents solutés. Comme les médicaments diffusent à travers les zones superficielles, moyennes et profondes du cartilage, la présence d’interactions contraignantes peut modifier considérablement les taux de diffusion. Lorsque des interactions de liaison sont présentes entre les médicaments et la matrice du cartilage, il est défini comme la diffusion efficace (DEFF). Dans ce cas, une fois que tous les sites contraignants ont été occupés, le taux de diffusion des médicaments est régi par la diffusion à l’état stable (DSS). La comparaison entre le DEFF de différents solutés détermine la force relative de liaison des solutés avec la matrice. Pour un soluté donné, si le DEFF et le DSS sont dans le même ordre de grandeur, cela implique qu’il y a une liaison minimale entre le médicament et la matrice pendant la diffusion. Toutefois, si le DEFF est supérieur à DSS,il existe une liaison substantielle des particules à la matrice.
Les expériences conçues individuellement permettent la caractérisation du transport soluté à travers le cartilage, cependant, une analyse holistique comprenant tous les résultats est nécessaire pour concevoir un transporteur de drogue chargé de façon optimale. La nature faible et réversible des interactions de charge contrôle le taux de diffusion des particules et permet une absorption d’équilibre élevé et une pénétration rapide de la pleine profondeur par le cartilage. Grâce à des expériences d’absorption d’équilibre, nous devrions rechercher des porteurs qui montrent une forte absorption à la suite d’interactions de charge qui peuvent être vérifiées à l’aide d’études de taux de diffusion hors équilibre. Cependant, ces interactions de liaison devraient être faibles et réversibles dans la nature pour permettre la pénétration de pleine épaisseur du soluté par le cartilage. Un transporteur de médicaments idéal posséderait une charge optimale qui permet une liaison assez forte pour l’absorption et des concentrations élevées de médicaments intra-cartilage, mais pas trop forte pour entraver la diffusion de pleine épaisseur4. Les expériences présentées aideront à concevoir des tissus ciblant les tissus à charge. Ces protocoles ont été utilisés pour caractériser le transport CPC par le cartilage4, cependant, ceux-ci peuvent également être appliqués à une variété de médicaments et de transporteurs de médicaments par le cartilage et d’autres tissus chargés négativement.
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Protocol
Des autorisations universitaires ont été obtenues pour mener des expériences avec des tissus morts. Les joints de bovins ont été obtenus commercialement à partir d’un abattoir.
1. Extraction d’explantation de cartilage
- À l’aide d’un scalpel (#10 lame), couper et enlever la graisse, les muscles, les ligaments, les tendons et tout autre tissu conjonctif pour exposer le cartilage de la rainure femoropatellar des articulations du genou bovin.
- À l’aide de poinçons de 3 mm et 6 mm dermiques, faire des poinçons perpendiculaires dans le cartilage pour extraire les bouchons cylindriques. Placez immédiatement les bouchons dans des puits individuels d’une plaque de 48 puits contenant 500 μL de 1x phosphate tamponné saline (PBS) complétée par 1% v/v antibiotique-antimycotique.
- Placez le côté superficiel d’un bouchon de cartilage orienté vers le bas dans un puits dans le dispositif de tranchage (Figure 2). À l’aide d’une lame de rasoir, trancher le bouchon le long de la surface de l’appareil de tranchage pour obtenir une explant de cartilage de 1 mm d’épaisseur qui comprend la zone superficielle. Répéter pour chaque prise de cartilage.
- Conserver les explants de cartilage individuellement dans des tubes en polypropylène contenant 500 μL de 1x PBS complétés par des inhibiteurs de la protéase (PBS-PI, 1 mini-comprimé PI par 50 mL 1x PBS) à -20 °C.
- Avant de mener chacune des expériences de transport suivantes, décongeler les flacons contenant des explants pendant 30 min dans un bain d’eau de 37 °C.
Figure 2 : Luminaire de coupe sur mesure. Paramètres de conception de l’appareil de découpage en acier inoxydable utilisé pour trancher les explants de cartilage de 3 et 6 mm de diamètre. Des inserts en plastique d’épaisseur variable ont été placés à l’intérieur des puits pour ajuster l’épaisseur des explants tranchés. Une goupille cylindrique en acier inoxydable de 1 mm de diamètre a été utilisée pour pousser l’explant hors de l’appareil. Toutes les valeurs numériques sont présentées en mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
2. Absorption d’équilibre des CPC dans le cartilage
- Tamponnez doucement les explants de cartilage (3 mm dia. X 1 mm d’épaisseur.) avec un essuie-tout délicat pour enlever l’excès de 1x PBS de la surface de l’explant. À l’aide d’un équilibre, enregistrez rapidement le poids humide de chaque explant, puis placez immédiatement dans un bain 1x PBS pour prévenir la déshydratation.
- Préparer 30 solutions μM (300 μL par explant) de CPC fluorescents dans 1x PBS-PI. Utilisez des tubes en polypropylène sans RNase pour la reconstitution.
- Dans une plaque de 96 puits, la pipette 300 μL de chaque solution CPC de 30 μM dans des puits séparés. Évitez d’utiliser des puits près du bord de la plaque pour éviter l’évaporation. À l’aide d’une spatule, transférer chaque explant à la solution contenant des puits.
- Remplissez les puits environnants de 300 μL de 1x PBS et couvrez la plaque de puits d’un couvercle. Sceller les bords de la plaque avec un film flexible pour minimiser l’évaporation.
- À l’intérieur d’un incubateur de 37 °C, placez la plaque sur un shaker de plaque pour limiter la sédimentation des particules. Incuber pendant 24 h en rotation douce (50 tr/min avec orbite de 15 mm) pour permettre l’absorption d’équilibre des CPC dans le cartilage (figure 3).
- Générer une courbe standard pour la corrélation entre la fluorescence et la concentration du CPC
- Préparer les dilutions en série des solutions CPC à partir de 30 μM – 0 μM (10 dilutions 2 fois) dans 1x PBS-PI dans les tubes de polypropylène. Assurez-vous qu’au moins 500 μL de chaque dilution est présente.
- Ajouter 200 μL de chaque dilution aux puits consécutifs dans une plaque noire de 96 puits. Dupliquer dans une autre ligne pour augmenter la taille de l’échantillon.
- Obtenir des lectures de fluorescence de chaque échantillon à l’aide d’un lecteur de plaques aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de l’étiquette fluorescente à l’aide d’un lecteur de plaques.
- Tracer la lecture de fluorescence par rapport à la concentration du CPC et dériver une équation pour la partie linéaire de la courbe.
REMARQUE : Pour limiter la variabilité des lectures de fluorescence, incuber la solution de stock CPC dans les mêmes conditions que la plaque d’échantillonnage avant la génération de la courbe standard.
- Après 24 h d’incubation, recueillir le bain d’équilibre de chaque puits dans des tubes de polypropylène séparés.
- Transférer 200 μL de chaque solution dans des puits séparés d’une plaque noire de 96 puits. Obtenir des lectures de fluorescence de chaque échantillon dans les mêmes paramètres fluorescents que pour la courbe standard. Si nécessaire, diluer l’échantillon en 1x PBS-PI pour s’assurer que les lectures entrent dans la partie linéaire de la courbe standard.
Figure 3 : Schéma des expériences d’absorption d’équilibre. Des explants de cartilage (3 mm dia. x 1 mm d’épaisseur) ont été placés dans des puits individuels dans une plaque de 96 puits contenant une solution CPC étiquetée fluorescentement. Après 24 h CPC ont été pris par le cartilage, réduisant ainsi la fluorescence du bain environnant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
3. Profondeur de pénétration des CPC dans le cartilage
- Préparer 30 solutions μM (300 μL par explant) de CPC fluorescents dans 1x PBS-PI. Utilisez des tubes en polypropylène sans RNase pour la reconstitution.
- À l’aide d’un scalpel, couper les explants de cartilage (6 mm de diamètre x 1 mm d’épaisseur) en deux pour faire des demi-disques. Gardez l’explant hydraté avec une couche de 1x PBS-PI pendant la coupe.
- Collez une explant à demi-disque au milieu d’un puits de la chambre de transport 1dimensionnelle conçue sur mesure à l’aide d’un époxy (figure 4, figure 5). Assurez-vous que l’époxy est appliquée sur le côté circonférentiel (incurvé) de l’explant. Enlever l’excès de colle du puits pour éviter le contact avec la surface de diffusion du cartilage et prendre note du côté superficiel de l’explant.
- Ajouter 80 μL de 1x PBS-PI aux deux côtés de l’explant. Pipette le liquide de haut en bas d’un côté de l’explant pour vérifier les fuites de l’autre côté. En cas de fuite, réajustez l’explantation et appliquez l’époxy au besoin.
- Remplacez le PBS-PI 1x du côté faisant face à la surface superficielle du cartilage (en amont) par 80 μL de solution CPC de 30 μM. Maintenir 80 μL de 1x PBS-PI sur le côté face à la zone profonde du cartilage (en aval).
- Placez soigneusement la chambre de transport dans un conteneur à couverture. Couvrez la base du récipient d’une couche 1x PBS pour éviter l’évaporation des solutions. Assurez-vous qu’il n’y a pas de contact direct entre les solutions des chambres en amont et en aval.
- Placez le récipient couvert sur un shaker de plaque pour limiter la sédimentation des particules. Incuber pour 4 ou 24 h à température ambiante sous rotation douce (50 tr/min avec orbite de 15 mm).
- Après l’incubation, retirer l’explant de la chambre et couper la tranche d’environ 100 μm du centre de l’explant.
REMARQUE : Cette section transversale comprend les zones superficielles, moyennes et profondes du cartilage. - Placez la tranche entre une lame en verre et un couvercle. Hydratez la tranche avec une couche de 1x PBS-PI.
- Au grossissement 10x, image à travers toute l’épaisseur de la tranche pour obtenir z-pile d’images fluorescentes à l’aide d’un microscope confocal.
- L’utilisation d’ImageJ projette l’intensité moyenne des images dans la pile z pour déterminer la profondeur de pénétration des CPC dans le cartilage.
- Ouvrez la pile d’images en cliquant sur Fichier | Ouvrir.
- Cliquez sur 'Image' dans la barre des tâches et cliquez sur Image | Piles | Z Project dans le menu déroulant.
- Numéros de tranche d’entrée de 1 à la tranche finale. Sélectionnez 'Intensité moyenne' sous Type de projection. Cliquez sur 'OK.'
Figure 4 : Chambre de transport 1-D conçue sur mesure. Paramètres de conception de la chambre de transport PMMA 1D avec 6 puits individuels. Toutes les valeurs numériques sont présentées en mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Schéma des études de profondeur de pénétration. Les explants de cartilage (diamètre de 6 mm x 1 mm d’épaisseur) ont été coupés en deux et fixés au centre des puits de transport diffusifs 1-D. La solution CPC étiquetée fluorescentement a été ajoutée sur le côté du puits en contact avec la zone superficielle (SZ) du cartilage. 1x PBS-PI a été ajouté sur le côté du puits en contact avec la zone profonde (DZ) du cartilage. Après diffusion, une section transversale du cartilage (3 mm x 1 mm) a été imageuse à l’aide d’une microscopie confocale. Ce chiffre a été modifié à partir de Vedadghavami et al.4 et Bajpayee et al.3Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
4. Taux de diffusion hors équilibre des CPC dans le cartilage
- Réunir les deux moitiés de la chambre de transport sur mesure (figure 6) pour assembler et fermer la chambre. Utilisez des rondelles, des écrous et des boulons pour fermer étroitement la chambre à l’aide d’une clé.
REMARQUE : La chambre de transport doit être translucide pour ne pas interférer avec les lectures fluorescentes. Les chambres de transport utilisées dans ce protocole sont fabriquées à partir de polyméthylméthacrylate (PMMA). - Enrober l’espace intérieur de la chambre d’une solution de lait bovin non grasse de 0,5 % w/v en 1x PBS (2 mL pour chaque chambre) pendant 15 min afin d’éviter la liaison non spécifique des CPC aux murs de la chambre. Rincez ensuite la chambre avec 1x PBS (2 mL pour chaque chambre).
- À l’aide de l’appareil de tranchage conçu sur mesure ( figure 2 ) etd’unelame de rasoir, trancher une explant de cartilage de 6 mm de diamètre (plan transversal) à une épaisseur de 500-800 μm, y compris la zone superficielle. Gardez l’explant hydraté avec 1x PBS.
- À l’aide de poinçons de frappes à base de marteau et de cutanées, créez des joints à partir de feuilles de caoutchouc comme le montre la figure 7.
- Assemblez chaque demi-chambre de transport pour inclure 1 grand joint en caoutchouc, 1 insert PMMA et 1 petit joint en caoutchouc chacun. Placez l’explant dans les puits de l’insert en plastique, avec la zone superficielle faisant face à la chambre en amont. Sandwich les deux moitiés ensemble pour compléter l’assemblage et visser étroitement à l’aided’uneclé ( Figure 7 ).
- Remplissez la chambre amont de 2 mL de 1x PBS-PI et observez la chambre en aval pour la fuite de liquide de la chambre en amont. En cas de fuite, réassemblez la chambre, réglez la position du joint et l’étanchéité des vis. En cas de fuite, remplissez également la chambre en aval de 2 mL 1x PBS-PI.
- Ajouter une mini-barre de remue-ménage dans les chambres en aval et placer la chambre sur une plaque à remuer. Aligner la chambre de sorte que le laser du spectrophotomètre est concentré vers le centre de la chambre en aval. Placez la partie du récepteur de signal du spectrophotomètre derrière la chambre en aval (figure 8).
REMARQUE : Le laser et le récepteur du spectrophotomètre doivent être équipés des filtres appropriés pour exciter, émettre et transmettre des signaux provenant de la protéine fluorescente. Protégez la chambre de transport de la lumière à l’aide d’une boîte noire lors de l’expérimentation afin d’éviter toute interférence dans le signal de fluorescence. Il est de pratique de sceller les ouvertures sur le dessus de la chambre avec un film flexible pour éviter l’évaporation. - Recueillir en temps réel les relevés d’émission de fluorescence en aval et assurer un signal stable pendant au moins 5 min.
REMARQUE : Les aliquots de la chambre en aval peuvent être obtenus et évalués pour la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques si un spectrophotomètre ou une chambre de transport translucide sur mesure n’est pas disponible. - Pipette un volume précalculé de solution de stock de CPC fluorescents dans la chambre en amont afin d’assurer une concentration finale de 3 μM à l’intérieur de la chambre amont. Observez le signal de fluorescence en aval et laissez le transport soluté atteindre une augmentation constante de la pente.
REMARQUE : Une explant de cartilage plus épaisse exigera plus de temps pour atteindre l’état stable. - Une fois que l’état stable a été atteint, prendre 20 μL de la chambre en amont et ajouter à la chambre en aval (« essage de pic »).
REMARQUE : On observera un pic de fluorescence en aval. Cela permettra de corrélation entre les lectures de fluorescence et la concentration de CPC. - Recueillir des lectures de fluorescence en aval en temps réel.
Figure 6 : Chambre de transport de diffusion non équilibrée conçue sur mesure. Paramètres de conception de la chambre de transport de diffusion sans équilibre PMMA. La chambre doit être translucide pour ne pas interférer avec les lectures de fluorescence. La chambre de transport complète se composait de deux moitiés identiques de l’appareil indiqué. Deux broches cylindriques en acier inoxydable (~2,94 mm de diamètre, ~18 mm de long) ont été nécessaires pour assurer l’alignement et la fermeture complète des moitiés de la chambre. Quatre fentes identiques pour 6-32 vis de fil ont été faites dans chaque coin de la chambre pour l’assemblage serré à vis. Toutes les valeurs numériques sont présentées en millimètres. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Assemblage de la chambre de transport de diffusion sans équilibre. Paramètres de conception des inserts PMMA noirs (A)et (B) de grands et petits joints en caoutchouc. L’épaisseur des joints en caoutchouc a été ajustée pour assurer une fermeture serrée de la chambre. Toutes les valeurs numériques sont présentées en mm. (C) Schéma montrant l’ordre d’assemblage pour deux moitiés de chambre de transport avec explant de cartilage placé au centre. SZ indique la zone superficielle du cartilage qui faisait face à la chambre en amont. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Schéma des expériences de diffusion sans équilibre. Des explants de cartilage (diamètre de 6 mm x 1 mm d’épaisseur) ont été placés au centre de la chambre de transport avec la surface superficielle faisant face à la chambre en amont. Les côtés en haut et en aval de la chambre étaient remplis de 1x PBS-PI et mélangés à l’aide d’une mini barre de remue-ménage. Avec un laser pointé vers la chambre en aval pour recueillir les lectures fluorescentes, la solution CPC fluorescente a été ajoutée à la chambre en amont. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Representative Results
Après l’absorption d’équilibre des CPC par le cartilage, la fluorescence de bain diminue quand le soluté a été augmenté par le tissu. Toutefois, si la valeur de fluorescence du bain final reste similaire à l’initiale, elle indique qu’il n’y a pas ou absorption minimale de soluté. Une autre confirmation de l’absorption de soluté est si le tissu a visiblement changé de couleur à la couleur du colorant fluorescent. L’absorption quantitative des solutés dans le cartilage a été déterminée à l’aide du rapport d’absorption (RU)après que les valeurs de fluorescence ont été converties en concentration à l’aide de la courbe standard. En utilisant la concentration initiale du bain (CBath,i)et la concentration de bain d’équilibre (CBath),la concentration de soluté à l’intérieur du cartilage (CCartilage)a été calculée comme suit où VBath=300 μL:
À l’aidedu cartilage C et dubainC, le rapport d’absorption a été déterminé à l’aide de l’équation ci-dessous.
Les valeurs >>1 indiquent une absorption améliorée en raison des interactions de charge, tandis que les valeurs <1 indiquent une faible absorption. Par exemple, des solutés neutres plus grands comme Neutravidin (60 kDa, pI 7) ont montré RU<1 en raison de l’entrave stérique avec la matrice de cartilage1, tandis que les solutés plus petits et neutres sont censés montrer RU~1, car ils sont capables de se propager dans le cartilage, atteignant l’équilibre. En revanche, Avidin (pI 10.5), le pendant chargé positivement de Neutravidin, a montré un RU~180 dans le cartilage1. En outre, les CPC de petite taille (~2,5-4 kDa) montrent un RU jusqu’à 4004. Comme le montre la figure 9, les ratios d’absorption ont montré une réponse dépendante de la charge4.
Figure 9 : Résultats représentatifs de l’absorption d’équilibre des CPC dans le cartilage. Les CPC de charge nette variable (+8, +14 et +20) et leurs ratios d’absorption respectifs dans le cartilage ont révélé que l’absorption n’augmente pas monotonement avec une charge croissante. Ce chiffre a été modifié à partir de Vedadghavami et al.4Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Dans le cas où la fluorescence du bain a augmenté après avoir atteint l’équilibre, cela indiquerait que la concentration initiale de bain du soluté fluorescent était trop élevée. Cela entraînerait l’émission d’être piégé dans la solution après l’excitation via le lecteur de plaque. Pour résoudre ce problème, réduisez la concentration initiale du bain.
Après l’imagerie confocale, une pile d’images a été produite avec chaque image montrant la profondeur de pénétration des CPC fluorescents marqués à différentes couches de cartilage. L’image obtenue à partir du centre de l’explant de cartilage a montré la profondeur la plus éloignée de pénétration par rapport à n’importe quelle autre image tout au long de l’épaisseur de l’explant. À l’aide d’un logiciel comme ImageJ, la pile d’images a été superposée pour produire une image affichant l’intensité moyenne de la pénétration du CPC. Ces images superposées ont fourni la meilleure comparaison de la profondeur globale de pénétration entre les transporteurs de drogue diversement chargés. Une réponse dépendante de la charge a été observée pour les CPC dans le tissu (figure 10). Les grands transporteurs à charge neutre (p. ex., Neutravidin) ne pénètreront pas beaucoup plus loin que la zone superficielle, car ils n’ont pas la capacité d’utiliser des interactions de charge pour induire la liaison avec la matrice1. De même, une charge positive trop élevée sera limitée à la zone superficielle (comme le montre CPC+20 même après 24 h)4, cependant, il s’agit d’un résultat du transport étant lié trop fortement à la matrice; ils sont incapables de se délier de leur cible initiale. Un transporteur de médicaments chargé de façon optimale serait toutefois en mesure de pénétrer jusqu’aux zones profondes du cartilage, car il peut tirer parti de la nature faible et réversible des interactions électrostatiques (comme le montre CPC+14)4. Cela permet au porteur de se lier à sa cible initiale, non contraignant de se déplacer plus profondément à travers la matrice, puis de se lier à nouveau à des cibles plus loin à l’intérieur du tissu. Par exemple, la liaison Avidin (~7 nm de diamètre, 66 kDa, pI 10.5) avec des glycosaminglycanes à matrice chargée négativement (GAGs) a une constante de dissociation (KD)de 150 μM, qui a été considérée comme suffisamment faible pour permettre la liaison réversible nécessaire pour la pénétration de l’épaisseur complète1. Malgré la faible liaison, Avidin a montré une forte rétention et l’absorption dans le cartilage en raison de la présence d’une forte densité de GAGs chargés négativement (Densité de liaison NT = 2900 μM)1. En outre, comme le montre CPC+8, la pénétration de l’épaisseur totale était visible dans les 4 h, tandis que CPC+14 a nécessité 24 h pour atteindre la pleine profondeur4. Ainsi, plusieurs points de temps devraient être choisis pour comparer efficacement le taux de différents solutés à l’épaisseur pénétrante des tissus. Pour une compréhension plus quantitative de la profondeur de pénétration, les intensités relatives des solutés le long de l’épaisseur du tissu peuvent être obtenues à l’aide de ImageJ.
Figure 10 : Résultats représentatifs des études approfondies de pénétration dans le cartilage. Les CPC dont la charge nette varie (+8, +14 et +20) et leur profondeur de pénétration respective par le cartilage ont révélé une liaison faible et réversible, comme le voient le CPC+8 et le CPC+14, sont essentiels pour une pénétration de pleine profondeur. Toutefois, une liaison trop forte, comme on l’a vu pour le CPC+20, a entravé la pénétration de l’épaisseur. Ce chiffre a été modifié à partir de Vedadghavami et al.4Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Si aucun signal fluorescent n’a été observé à l’intérieur du cartilage pendant l’imagerie, deux problèmes peuvent être présents; soit la surface de diffusion a été bloquée par l’époxy, soit la concentration initiale du bain était trop faible pour produire un signal fluorescent. Pour résoudre ces problèmes, retirez l’excès d’époxy des surfaces du cartilage et augmentez la concentration de soluté.
Les expériences de transport de diffusion hors équilibre ont donné lieu à une courbe comme le montre la figure 11. La partie initiale de la courbe représente la diffusion du soluté par le cartilage lorsque des interactions de liaison solute-matrice ont lieu. Avec une charge accrue du transporteur, une liaison matricielle plus forte s’est produite, ce qui permettra aux solutés d’atteindre la chambre en aval plus longue. Une fois que les solutés ont pénétré dans la profondeur du cartilage et ont atteint la chambre en aval, une augmentation de la pente de la courbe a été observée à mesure que la lecture de fluorescence augmentait avec le temps. Cette deuxième partie de la courbe a atteint une pente stable, représentant une diffusion à l’état stable. Une ligne tangentielle a été tracée à la pente à état stable pour déterminer le temps qu’il faut pour atteindre la diffusion à l’état stable (τLag), marquée par l’interception x. La diffusion efficace (DEFF),le taux de diffusion des CPC alors qu’il y a des interactions de liaison présentes dans le cartilage, a été calculée à l’aide dulag τ et de l’épaisseur de l’explant (L) comme suit :
Après le transfert de 20 μL de solution de la chambre en amont à la chambre aval, on a observé un pic de fluorescence; l’intensité de fluorescence stabilisée qui en a résulté a été utilisée pour la corrélation avec la concentration. La concentration de CPC en aval (CD)normalisée à la concentration en amont (CU)a ensuite été tracée par rapport au temps. La pente de cette courbe a été utilisée pour estimer le taux de diffusion à l’état stable lorsque tous les sites de liaison dans le cartilage sont occupés (DSS)comme indiqué ci-dessous. Cette valeur était incluse dans le coefficient de partitionnement. Ici, φ, VD et A représentent la porosité du cartilage (~0,8), le volume de chambre en aval (2 mL) et la zone transversale du cartilage (0,1257 cm2), respectivement. Les valeurs DEFF et DSS calculées à partir d’expériences de transport non équilibrées pour les CPC se trouvent dans le tableau 1.
Figure 11 : Résultats représentatifs d’études de diffusion hors équilibre par le cartilage. Courbe de diffusion CPC+8, tracée sous forme de concentration en aval (CD)normalisée à la concentration en amont (CU),contre le temps. Une ligne tangentielle tracée à la pente à état stable (bleu) traverse l’axe x à τLag, qui a été utilisé pour calculer DEFF. La pente de la tangente a été utilisée pour calculer DSS. L’essai de pointe (gris) représente la concentration stabilisée dans la chambre aval après le transfert de la solution CPC de 20 μL de l’amont à l’aval, utilisée pour normaliser la concentration en aval. Ce chiffre a été modifié à partir de Vedadghavami et al.4Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Si la fluorescence en aval ne se stabilise pas avant l’ajout de peptide s’étiquetant fluorescent à la chambre en amont, il est probable qu’il y ait des résidus de solutés collés sur les murs d’une expérience précédente. Dans ce cas, démonter la chambre et laver avec du savon et du sonicate. S’il y a une augmentation de la fluorescence en aval immédiatement après l’ajout de peptide fluorescent à la chambre en amont, cela pourrait indiquer que des fuites sont présentes. Cela nécessiterait un remontage de la chambre de transport et un nouveau test pour les fuites. Si le signal de fluorescence en aval atteint un plateau par opposition à une augmentation à l’état stable, il indique une perte possible de concentration dans la chambre en amont, probablement causée par des solutés collés aux parois de la chambre. L’ajout d’albumine de sérum bovin (BSA) de 0,005 % w/v (BSA) à la chambre en amont peut aider à prévenir le collage.
| Cpc | DEFF (cm2/s) | DSS (cm2/s) |
| CPC+8 | 1,7 ± 0,4 x 10-7 | 5,8 ± 0,0 x 10-5 |
| CPC+14 | 9,8 ± 0,2 x 10-8 | 2,6 ± 1,2 x 10-5 |
| CPC+20 | 4,7 ± 0,1 x 10-8 | 1,4 ± 0,9 x 10-5 |
Tableau 1 : Valeurs représentatives DEFF et DSS pour le transport du CPC par le cartilage. Ce tableau a été modifié à partir de Vedadghavami et al.4
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Discussion
Les méthodes et les protocoles décrits ici sont importants dans le domaine de l’administration ciblée de médicaments pour les tissus chargés négativement. En raison de la forte densité d’agvrecans chargés négativement présents dans ces tissus, une barrière est créée, empêchant ainsi les médicaments d’atteindre leurs sites cibles cellulaires qui se trouvent profondément dans la matrice. Pour relever ce défi en suspens, les médicaments peuvent être modifiés pour incorporer des transporteurs de médicaments chargés positivement qui peuvent améliorer le taux de transport, l’absorption et la liaison des médicaments dans les tissus1,3,4,14,15,16,17,18,19. Comme le montrent les méthodes développées, le transport des transporteurs de médicaments chargés positivement peut être caractérisé pour déterminer l’absorption de l’équilibre, la profondeur de pénétration et le taux de diffusion hors équilibre. Nous avons conçu avec succès trois configurations expérimentales distinctes qui peuvent être utilisées pour évaluer le transport par des explants de cartilage.
Pour réussir la caractérisation des transports, des étapes critiques de la procédure doivent être suivies. L’utilisation d’inhibiteurs de la protéase (IP) dans toutes les solutions est essentielle pour caractériser avec précision le transport intra-cartilage des CPC par le cartilage car ils fonctionnent pour empêcher la digestion enzymatique des protéines dans les tissus20. Par conséquent, s’ils ne sont pas utilisés, les composants de la matrice du cartilage tels que les aggercans et le collagène peuvent commencer à se dégrader et à sécréter dans le bain environnant pendant l’expérimentation. Cela peut considérablement abaisser le FCD du cartilage, réduisant le nombre de sites de liaison à base de charge dans la matrice du cartilage. Le tissu résultant ne serait plus représentatif du cartilage sain. Inversement, les expériences présentées peuvent également être utilisées pour évaluer le transport des CPC par le cartilage arthritique où la teneur en aggrecan est beaucoup plus faible comme on le voit dans OA20. En utilisant la trypsine ou la chondroitinase ABC pour digérer les explants de cartilage, la densité aggrecan peut être contrôlée, permettant ainsi l’évaluation du transport et de la livraison de drogue dans un état malade. Dans ce cas, la liaison basée sur les charges peut être compromise, tandis que d’autres types d’interactions telles que les liaisons hydrogène et les interactions hydrophobes améliorent en synergie la liaison et la rétention intra-cartilage4.
Le maintien de l’hydratation de l’explant du cartilage est la clé lors de la préparation et de l’expérimentation de l’échantillon. Il a été démontré que la déshydratation par l’exposition à l’air pendant plus de 6 minutes provoque des dommages irréversibles au cartilage articulaire21. Par conséquent, des changements inattendus peuvent se produire dans le transport des CPC. De même, l’évaporation des bains CPC peut entraîner une déshydratation explant; cela peut être évité par l’étanchéité avec un film flexible. Cependant, l’évaporation de bain peut non seulement causer la déshydratation d’explant, mais elle peut également causer un changement dans la concentration de bain de CPC, ayant pour résultat des lectures fluorescentes fausses. En outre, il est important de noter que les études de profondeur de pénétration nécessitent de fines sections transversales (~100 μM) de cartilage à imager. Il s’agit d’une technique qui nécessite la pratique afin que des tranches d’épaisseur uniforme peuvent être obtenues. Il est également essentiel pour les expériences de diffusion hors équilibre, que la chambre de transport soit translucide de sorte que les mesures de fluorescence en temps réel peuvent être obtenues avec le spectrophotomètre conçu sur mesure. Cependant, comme alternative, les aliquots de la chambre en aval peuvent être obtenus et évalués pour la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaque ou d’un autre lecteur spectrophotométrique.
Les méthodes présentées ici sont d’une grande importance car elles fournissent une méthode à l’échelle de banc pour caractériser le transport de transporteur de drogue par le cartilage afin de mieux prévoir la rétention in vivo de drogue et l’efficacité biologique à long terme. Récemment, un cadre d’élément fini pour la dynamique des fluides computationnels a été mis en œuvre pour mesurer le transport soluté à travers des supports poreux22. Arbabi et coll. ont utilisé l’analyse des éléments finis en combinaison avec des données expérimentales obtenues à partir de l’imagerie micro-CT pour mesurer les taux de diffusion de l’agent de contraste chargé négativement, l’ioxaglate dans le cartilage23,24. En outre, à l’aide d’un modèle multi-zone, multi-phasique, les coefficients de diffusion de l’ioxaglate dans différentes zones de cartilage ont été mesurés avec le FCD de chaque zone. Alors que l’imagerie micro-CT ne peut être utilisée qu’avec des agents de contraste, notre configuration expérimentale permet la caractérisation du transport de tous les médicaments et les transporteurs de médicaments qui peuvent être étiquetés fluorescentement. Cependant, la modélisation avancée du calcul utilisée par Arbabi et coll. fournit une analyse plus complète du comportement de transport soluté et peut être appliquée à nos méthodes expérimentales13,24.
Une limitation de la méthode présentée est que la configuration expérimentale pour chaque expérience de transport soluté n’englobe pas entièrement l’environnement in vivo. Les réponses biologiques et les forces mécaniques et dynamiques qui se produisent dans l’articulation naturelle ne sont pas simulées ici. Pour intégrer ces forces, la chambre de transport peut être modifiée avec un piston pour simuler les schémas de flux convectifs qui se produisent pendant les activités comme la marche et la course. Cependant, alors que le débit convectif peut augmenter l’absorption de 2 fois, l’absorption due aux interactions électrostatiques peut augmenter de 100 à 400x. Ainsi, les configurations expérimentales présentées ici fournissent une bonne estimation pour le transport basé sur les frais et l’absorption25. En outre, puisque l’articulation du genou contient naturellement du liquide synovial, il peut être utilisé dans les solutions de bain pour les expériences de transport au lieu de 1x PBS-PI. On estime que l’absorption des porteurs cationiques dans le cartilage diminuerait dans le liquide synovial par rapport à 1x PBS en raison de la présence de chaînes hyaluronan avec des groupes de carboxyles chargés négativement dans le fluide synovial. Il est possible que les porteurs cationiques se lient de façon compétitive avec les chaînes hyaluronan du liquide synovial en plus des GAGs du cartilage. Cependant, la densité des groupes chargés négativement est significativement plus élevée dans le cartilage comparé au fluide synovial, en raison de la présence des deux chaînes hyaluronans chargées négativement et des GAGs sulfated dans le cartilage15. Ainsi, bien que l’absorption dans le cartilage en présence de liquide synovial sera inférieure à celle de 1x PBS, on s’attend toujours à ce qu’elle maintienne une forte absorption intra-cartilage. In vivo, Avidin a montré une forte absorption intra-cartilage dans le cartilage de rat et de lapin en présence de liquide synovial16,26. En outre, Avidin a montré une absorption et une rétention élevées dans le cartilage jusqu’à 2 semaines après l’injection intra-articulaire dans un lapin antérieur ligament croisé transsection modèle27.
L’utilisation du cartilage bovin dans ce système permet une représentation plus précise de la pénétration des médicaments par le cartilage en raison de ses similitudes avec le cartilage humain en termes d’épaisseur (~1,5-2 mm)28,29. Le transport des solutés à travers le cartilage peut varier en fonction de l’épaisseur; les porteurs de médicaments peuvent exiger moins d’interactions de liaison pour pénétrer complètement à travers les souris ou le cartilage de rat qui sont beaucoup plus minces, mais peut être considérablement empêché de pénétrer plus profondément dans le cartilage humain plus épais1. En outre, bien que ces expériences aient été conçues pour caractériser le transport de soluté dans le cartilage, ces méthodes peuvent être modifiées et appliquées à d’autres tissus chargés négativement tels que le ménisque, la cornée et l’humour vitreux de l’oeil, et le puctosus de noyau des disques intervertébraux. Les méthodologies des expériences conçues ici sont avantageuses car les dimensions des appareils et des chambres de transport peuvent être adaptées en fonction de la taille et des espèces de tissus. L’impact de ces méthodes est généralisé, limité non seulement aux transporteurs de drogue, mais aussi à l’évaluation du transport de drogues et de trafiquants de drogues.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le département de la Défense des États-Unis par le biais des programmes de recherche médicale dirigés par le Congrès (CDMRP) dans le cadre du contrat W81XWH-17-1-0085, et le National Institute of Health R03 EB025903-1. AV a été financé par le College of Engineering Dean’s Fellowship de l’Université Northeastern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18x18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
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