Summary
Detta protokoll bestämmer jämvikt upptag, djup av penetration och icke-jämvikt diffusion hastighet för katjoniska peptid bärare i brosk. Karakterisering av transportegenskaper är avgörande för att säkerställa en effektiv biologisk respons. Dessa metoder kan tillämpas för att utforma en optimalt laddade läkemedelsbärare för inriktning negativt laddade vävnader.
Abstract
Flera negativt laddade vävnader i kroppen, som brosk, utgör ett hinder för den riktade läkemedelsleveransen på grund av deras höga densitet av negativt laddade aggrecans och kräver därför förbättrade inriktningsmetoder för att öka deras terapeutiska svar. Eftersom brosk har en hög negativ fast laddningstäthet, läkemedel kan modifieras med positivt laddade läkemedelsbärare att dra nytta av elektrostatiska interaktioner, vilket möjliggör förbättrad intra-brosk läkemedelstransport. Att studera transport av läkemedelsbärare är därför avgörande för att förutsäga effekten av läkemedel för att inducera ett biologiskt svar. Vi visar utformningen av tre experiment som kan kvantifiera jämvikt upptag, djup penetration och icke-jämvikt diffusion hastighet av katjonska peptid bärare i brosk explants. Jämviktsupptag experiment ger ett mått på den solute koncentrationen inom brosket jämfört med dess omgivande bad, vilket är användbart för att förutsäga potentialen hos en läkemedelsbärare för att förbättra terapeutisk koncentration av läkemedel i brosk. Djup av penetrationsstudier med hjälp av konfokalmikroskopi möjliggör visuell representation av 1D-solute diffusion från den ytliga till djupa zonen av brosk, vilket är viktigt för att bedöma om solutes når sin matris och cellulära mål platser. Icke-jämviktsdiffusionshastighetsstudier med användning av en specialdesignad transportkammare möjliggör mätning av styrkan i bindningsinteraktioner med vävnadsmatrisen genom att karakterisera diffusionshastigheterna för fluorescerande märkta solutes över vävnaden; detta är fördelaktigt för att utforma bärare av optimal bindningsstyrka med brosk. Tillsammans ger de resultat som erhållits från de tre transportexperimenten en riktlinje för att utforma optimalt laddade läkemedelsbärare som utnyttjar svaga och reversibla laddningsinteraktioner för läkemedelsleveransapplikationer. Dessa experimentella metoder kan också tillämpas för att utvärdera transport av narkotika och drug-drug carrier konjugater. Vidare kan dessa metoder anpassas för användning i inriktning andra negativt laddade vävnader såsom menisk, hornhinnan och glasaktig humor.
Introduction
Drug-leverans till negativt laddade vävnader i kroppen är fortfarande en utmaning på grund av oförmåga läkemedel att tränga djupt in i vävnaden för att nå cell och matris mål platser1. Flera av dessa vävnader består av tätt packade, negativt laddade aggrecans som skapar en hög negativ fast laddningstäthet (FCD)2 inom vävnaden och fungerar som en barriär för leverans av de flesta makromolekyler3,4. Men med hjälp av positivt laddade läkemedelsbärare kan denna negativt laddade vävnadsbarriär faktiskt omvandlas till en läkemedelsdepå via elektrostatiska laddningsinteraktioner för ihållandeläkemedelsleverans 1,5,6,7( Figur1).
Bild 1: Avgiftsbaserad intrabroskleverans av CPC. Intra-artikulära injektion av CPCs i knäleden utrymme. Elektrostatiska interaktioner mellan positivt laddade CPCs och negativt laddade aggrecan grupper möjliggör snabb och full djup penetration genom brosk. Denna siffra har modifierats från Vedadghavami et al4. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Nyligen, kort längd katjoniska peptid bärare (CPCs) utformades med målet att skapa små katjonska domäner som kan bära större storlek therapeutics för leverans till negativt laddade brosk4. För effektiv läkemedelstillförsel till brosket för behandling av förhärskande8,9 och degenerativa sjukdomar som artros (OA)10, är det kritiskt att terapeutiska koncentrationer av läkemedel tränger djupt inne i vävnaden, där en majoritet av broskcellerna (chondrocytes) ligger11. Även om det finns flera potentiella sjukdom modifiera läkemedel tillgängliga, ingen har fått FDA godkännande eftersom dessa inte kan effektivt rikta brosk12,13. Därför är utvärdering av läkemedelsbärares transportegenskaper nödvändig för att förutsäga effektiviteten av läkemedel för att inducera ett terapeutiskt svar. Här har vi utformat tre separata experiment som kan utnyttjas för bedömning av jämviktsupptag, djup av penetration och icke-jämvikt diffusion hastigheten av CPCs4.
För att säkerställa att det finns en tillräcklig läkemedelskoncentration inom brosket som kan ge ett optimalt terapeutiskt svar, var upptagsexperiment utformade för att kvantifiera jämvikt CPC-koncentration i brosk4. I denna utformning, efter en jämvikt mellan brosket och dess omgivande bad, kan den totala mängden solute inuti brosket (antingen bunden till matrisen eller gratis) bestämmas med hjälp av ett upptagsförhållande. Detta förhållande beräknas genom att normalisera koncentrationen av solutes inuti brosket till det i jämviktsbadet. I princip skulle neutrala solutes, vars diffusion genom brosket inte bistås av laddningsinteraktioner, ha ett upptagsförhållande på mindre än 1. Omvänt visar katjoniska solutes, vars transport förstärks via elektrostatiska interaktioner, ett upptagsförhållande som är större än 1. Som visas med CPCs kan dock användning av en optimal positiv laddning resultera i mycket högre upptagskvoter (större än 300)4.
Även om hög läkemedelskoncentration inom brosket är viktigt för att uppnå terapeutisk nytta, är det också kritiskt att läkemedel diffusa genom full tjocklek av brosket. Därför krävs studier som visar inträngningsdjupet för att säkerställa att läkemedel når djupt inom brosket så att matrisen och cellulära målställen kan nås, och därigenom ge en mer effektiv terapi. Detta experiment var utformad för att bedöma enkelriktad diffusion av solutes genom brosk, simulera diffusion av läkemedel i brosk efter intra-artikulära injektion in vivo. Fluorescens imaging med hjälp av confocal mikroskopi möjliggör utvärdering av djup av penetration i brosk. Nettopartikelladdning spelar en nyckelroll i moderering hur djupa droger kan sprida sig genom matrisen. En optimal nettoladdning baserad på en vävnad FCD krävs för att möjliggöra svag-reversibla bindande interaktioner mellan katjonpartiklar och den anjoniska vävnadsmatrisen. Detta innebär att all interaktion är tillräckligt svag så att partiklar kan ta avstånd från matrisen men reversibla i naturen så att den kan binda till en annan matrisbindningsplats djupare inomvävnaden 4. Omvänt kan överdriven positiv nettoladdning av en partikel vara skadlig mot diffusion, eftersom för stark matrisbindning förhindrar avlossning av partiklar från det initiala bindningsstället i broskens ytliga zon. Detta skulle resultera i en otillräcklig biologisk reaktion eftersom en majoritet av målplatserna ligger djupt inne i vävnaden11.
För att ytterligare kvantifiera styrkan i de bindande interaktionerna är analys av läkemedelsdiffusionshastigheter genom brosk fördelaktig. Icke-jämviktsdiffusionsstudier möjliggör jämförelse av spridningshastigheter i realtid mellan olika solutes. Som läkemedel diffusa genom de ytliga, mellersta och djupa zoner av brosk, kan förekomsten av bindande interaktioner kraftigt förändra diffusion priser. När bindningsinteraktioner förekommer mellan läkemedel och broskmatrisen definieras den som den effektiva diffusiviteten (DEFF). I detta fall, när alla bindningsställen har ockuperats, styrs diffusionshastigheten av droger av den stadiga-statliga diffusionen (DSS). Jämförelse mellan DEFF av olika solute bestämmer den relativa bindningsstyrkan för solutes med matrisen. För en given solute, om DEFF och DSS är inom samma storleksordning, innebär det att det finns minimal bindning närvarande mellan läkemedlet och matrisen under diffusion. Men om DEFF är större än DSS, betydande bindning av partiklar till matris finns.
De utformade experimenten möjliggör individuellt karakterisering av solute transport genom brosket, men en holistisk analys inklusive alla resultat krävs för att utforma en optimalt laddad drogbärare. Den svaga och reversibla karaktären av laddningsinteraktioner styr partikeldifningshastigheten och möjliggör hög jämviktsupptag och snabb fulldjupspenetration genom brosk. Genom jämviktsupptagsexperiment bör vi leta efter bärare som visar högt upptag som ett resultat av laddningsinteraktioner som kan verifieras med hjälp av icke-jämviktsdiffusionshastighetsstudier. Dessa bindande interaktioner bör dock vara svaga och reversibla i naturen för att möjliggöra full-tjocklek penetration av solute genom brosk. En idealisk läkemedelsbärare skulle ha en optimal laddning som möjliggör tillräckligt stark bindning för upptag och höga intrabrosk läkemedelskoncentrationer, men inte för stark för att hindra full-tjocklek diffusion4. De presenterade experimenten kommer att bistå i konstruktionsegenskaperna för laddningsbaserad vävnad som riktar sig mot läkemedelsbärare. Dessa protokoll användes för att karakterisera CPC transport genom brosk4, men dessa kan också tillämpas på en mängd olika läkemedel och bärare läkemedel genom brosk och andra negativt laddade vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Universitetsgodkännanden erhölls för att utföra experimenten med döda vävnader. Fogar för nötkreatur erhölls kommersiellt från ett slakteri.
1. Utsug av explant av brosk
- Med hjälp av en skalpell (#10 blad), klippa och ta bort fett, muskler, ligament, senor och alla andra bindväv för att exponera brosket från femoropatellar spåret av nötkreatur knäleder.
- Använd 3 mm och 6 mm dermal stansar, gör vinkelräta stansar i brosket för att extrahera cylindriska pluggar. Placera omedelbart pluggarna i enskilda brunnar av en 48-brunnsplatta innehållande 500 μL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 1% v/v antibiotika-antimykotisk.
- Placera den ytliga sidan av en broskplugg vänd nedåt i en brunn i skivningsfixturen (Bild 2). Skiva pluggen längs skivningsfixturens yta med hjälp av ett rakblad för att få en 1 mm tjock broskutplanta som är inspännd av den ytliga zonen. Upprepa för varje broskplugg.
- Förvara brosk explants individuellt i polypropylenrör som innehåller 500 μL av 1x PBS kompletterat med proteashämmare (PBS-PI, 1 PI mini-tablett per 50 mL 1x PBS) vid -20 °C.
- Innan vart och ett av följande transportexperiment utförs tina de explanthaltiga injektionsflaskan i 30 min i ett 37 °C vattenbad.
Bild 2: Specialdesignad skivningsfixtur. Konstruktionsparametrar av rostfri skivningsfixtur som används för skivning av brosk explants med 3 och 6 mm diameter. Plast skär av varierande tjocklek placerades inuti brunnar för att justera tjockleken på skivad explants. Rostfritt stål cylindriska stift av <1 mm diameter användes för att driva explant ur fixtur. Alla numeriska värden presenteras i mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
2. Jämviktsupptag av CPCs i brosk
- Badda försiktigt brosk explants (3 mm dia. X 1 mm tjock.) med en känslig uppgift torka för att avlägsna överskott 1x PBS från explant ytan. Med hjälp av en balans, registrera snabbt den våta vikten av varje explant och sedan omedelbart placera i en 1x PBS bad för att förhindra uttorkning.
- Bered 30 μM-lösningar (300 μL per explanta) av fluorescerande märkta CPC i 1x PBS-PI. Använd RNase-fria polypropylenrör för rekonstitution.
- I en 96-brunnsplatta, pipettera 300 μL av varje 30 μM CPC-lösning i separata brunnar. Undvik att använda brunnar nära kanten av plattan för att förhindra avdunstning. Med hjälp av en spatel, överför varje explant till den lösning som innehåller brunnar.
- Fyll omgivande brunnar med 300 μL av 1x PBS och täck brunnsplattan med lock. Täta plattans kanter med flexibel film för att minimera avdunstning.
- Insidan av en 37 °C inkubator, placera plattan på en tallrik shaker att begränsa partikelsedimentation. Inkubera i 24 h under skonsam rotation (50 varv/min med en 15 mm omloppsbana) för att möjliggöra jämviktsupptag av CPC i brosket (figur 3).
- Generera en standardkurva för korrelation av fluorescens till CPC-koncentration
- Förbered serieutspädningar av CPC-lösningar från 30 μM – 0 μM (10 2-faldiga spädningar) i 1x PBS-PI i polypropylenrör. Se till att minst 500 μL av varje spädning finns.
- Tillsätt 200 μL av varje spädning till på varandra följande brunnar i en svart 96-brunnsplatta. Duplicera på en annan rad för att öka samplingsstorleken.
- Erhåll fluorescensavläsningar av varje prov med hjälp av en plattläsare vid excitations- och emissionsvåglängderna i den fluorescerande etiketten med hjälp av en plattläsare.
- Rita fluorescensavläsning kontra CPC-koncentration och härleda en ekvation för den linjära delen av kurvan.
OBS: För att begränsa variabiliteten vid avläsningar av fluorescens, inkubera STAMLÖSNINGEN FÖR CPC under samma förhållanden som provplattan före generering av standardkurvan.
- Efter 24 h inkubation, samla jämviktsbadet från varje brunn i separata polypropylenrör.
- Överför 200 μL av varje lösning i separata brunnar av en svart 96-brunnsplatta. Erhåll lysrörsavläsningar av varje prov under samma fluorescerande inställningar som för standardkurvan. Späd vid behov provet i 1x PBS-PI för att säkerställa att avläsningar faller inom den linjära delen av standardkurvan.
Figur 3: Schematisk för jämviktsupptagsexperiment. Brosk explants (3 mm dia. x 1 mm tjock) placerades i individer brunnar i en 96-väl platta som innehåller fluorescerande taggade CPC lösning. Efter 24 h CPCs var uppkörd av brosket, och därigenom minska fluorescensen av det omgivande badet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
3. Djup av penetration av CPCs i brosket
- Bered 30 μM-lösningar (300 μL per explanta) av fluorescerande märkta CPC i 1x PBS-PI. Använd RNase-fria polypropylenrör för rekonstitution.
- Med hjälp av en skalpell, skär brosk explants (6 mm diameter x 1 mm tjocklek) i hälften för att göra halv-diskar. Håll explanten hydrerad med ett lager av 1x PBS-PI medan du skär.
- Limma in en halvdisk explant i mitten av en brunn av den specialdesignade 1-dimensionella transportkammaren med hjälp av en epoxi (Bild 4, Bild 5). Se epoxi appliceras på den cirkumferential (böjda) sidan av explant. Ta bort överflödigt lim från brunnen för att förhindra kontakt med broskens diffusionsyta och anteckna den ytliga sidan av explanten.
- Tillsätt 80 μL av 1x PBS-PI till båda sidor av explanten. Pipettera vätskan upp och ner från ena sidan av explant för att kontrollera läckage till den andra sidan. Om läckage uppstår, justera explant och applicera epoxi efter behov.
- Ersätt 1x PBS-PI från sidan som vetter mot den ytliga ytan av brosk (uppströms) med 80 μL av 30 μM CPC-lösning. Bibehåll 80 μL av 1x PBS-PI på den sida som är vänd mot den djupa zonen av brosk (nedströms).
- Placera försiktigt transportkammaren i en övertäckningsbar behållare. Täck behållarens bas med ett lager 1x PBS för att undvika avdunstning av lösningar. Se till att det inte finns någon direkt kontakt mellan lösningar från avdelningar uppströms och nedströms.
- Placera den täckta behållaren på en tallriksskak för att begränsa partikelsedimenteringen. Inkubera för antingen 4 eller 24 h vid rumstemperatur under skonsam rotation (50 varv/min med en bana på 15 mm).
- Efter inkubation, ta bort explant från kammaren och skär ~ 100 μm skiva från mitten av explant.
OBS: Detta tvärsnitt är inklusive de ytliga, mellersta och djupa zonerna i brosk. - Placera skivan mellan en glasrutschkana och en täckbild. Hydrera skivan med ett lager av 1x PBS-PI.
- Vid 10x förstoring, bild genom hela tjockleken på skiva för att få z-stack av fluorescerande bilder med hjälp av en confocal mikroskop.
- Använda ImageJ projektet den genomsnittliga intensiteten av bilderna inom z-stacken för att bestämma djupet av penetration av CPCs i brosk.
- Öppna bildstacken genom att klicka på Arkiv | Öppna.
- Klicka på 'Bild' på aktivitetsfältet och klicka på Bild | Staplar | Z Project från dropdown-menyn.
- Mata in segmentsiffror från 1 till den sista segmentet. Välj 'Medelintensitet' under Projektionstyp. Klicka på' OK.'
Bild 4: Specialdesignad 1-D transportkammare. Designparametrar av PMMA 1D transportkammare med 6 individuella brunnar. Alla numeriska värden presenteras i mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Schematisk för djup av penetrationsstudier. Brosk explants (6 mm diameter x 1 mm tjocklek) skars i hälften och fast i mitten av 1-D diffusiva transport brunnar. Fluorescently taggade CPC lösning lades till sidan av brunnen i kontakt med den ytliga zonen (SZ) av brosk. 1x PBS-PI lades till sidan av brunnen i kontakt med den djupa zonen (DZ) av brosk. Efter diffusion, var ett tvärsnitt av brosk (3 mm x 1 mm) avbildas med hjälp av confocal mikroskopi. Denna siffra har modifierats från Vedadghavami et al.4 och Bajpayee et al.3Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
4. Icke-jämviktsdiffusionshastighet av CPC i brosket
- För samman de två halvorna av den specialdesignade transportkammaren (Figur 6) för att montera och stänga kammaren. Använd brickor, muttrar och bultar för att tätt stänga kammaren med en skiftnyckel.
OBS: Transportkammaren måste vara genomskinlig på grund av att inte störa fluorescerande avläsningar. De transportkammare som används i detta protokoll är tillverkade av polymetylmetakrylat (PMMA). - Täck kammarens inre utrymme med 0,5 % w/v icke-fettfri bovinmjölkslösning i 1x PBS (2 mL för varje kammare) i 15 min för att förhindra icke-specifik bindning av CPCs till kammarväggar. Skölj därefter kammaren med 1x PBS (2 mL för varje kammare).
- Använd den specialdesignade skivningsfixturen (Figur 2) och ett rakblad, skiva en broskexplant med 6 mm diameter (tvärgående plan) till en tjocklek av 500-800 μm, inklusive den ytliga zonen. Håll explanten hydrerad med 1x PBS.
- Med hjälp av hammardrivna och dermala slag, skapa packningar från gummiplåtar enligt figur 7.
- Montera varje halv transportkammare för att inkludera 1 stor gummipackning, 1 PMMA-insats och 1 liten gummipackning vardera. Placera explant i brunnarna i plastinsatsen, med den ytliga zonen vänd mot den uppströms kammaren. Sandwich de två halvorna tillsammans för att slutföra monteringen och skruva tätt med hjälp av en skiftnyckel (Bild 7).
- Fyll uppströms kammaren med 2 mL av 1x PBS-PI och observera nedströms kammaren för läckage av vätska från uppströms kammaren. Om läckage finns, sätt ihop kammaren igen, justera packningsläge och täthet av skruvar. Fyll inte på läckage, fyll även nedströmskammaren med 2 mL 1x PBS-PI.
- Lägg till en mini-stir bar till både upp och nedströms kammare och placera kammaren på en omrörning tallrik. Rikta kammaren så att laser från spektrofotometern är inriktad mot mitten av nedströms kammaren. Placera signalmottagaredelen av spektrofotometern bakom nedströmskammaren (Bild 8).
OBS: Spektrofotometerns laser och mottagare måste vara utrustade med lämpliga filter för att excitera, avge och sända signaler från det fluorescerande märkta proteinet. Skydda transportkammaren mot ljus med hjälp av en svart låda under experiment för att undvika störningar i fluorescenssignal. Det är bästa praxis att täta öppningarna ovanpå kammaren med flexibel film för att undvika avdunstning. - Samla realtid nedströms fluorescens utsläpp avläsningar och säkerställa en stabil signal för minst 5 min.
OBS: Alikvoter från nedströmskammaren kan erhållas och bedömas för fluorescens med hjälp av en plattläsare om en specialdesignad spektrofotometer eller genomskinlig transportkammare inte finns tillgänglig. - Pipa en på förinställd volym stamlösning av fluorescerande taggade CPC i uppströmskammaren för att säkerställa en slutkoncentration på 3 μM inuti uppströmskammaren. Observera den nedströms fluorescenssignalen och möjliggöra en utsvävande transport för att nå en stadig ökning av lutningen.
OBS: En tjockare brosk explant kommer att kräva längre tid för att nå steady-state. - När steady state har uppnåtts, ta 20 μL från uppströms kammaren och lägg till nedströms kammaren ("spike test").
OBS: En spik i nedströms fluorescensen kommer att observeras. Detta kommer att möjliggöra korrelation mellan fluorescensvärden och CPC-koncentration. - Samla realtid nedströms fluorescens avläsningar.
Figur 6: Specialdesignad icke-jämvikts diffusionstransportkammare. Konstruktionsparametrar av PMMA icke-jämvikt diffusion transportkammare. Kammaren måste vara genomskinlig för att inte störa fluorescensvärden. Den kompletta transportkammaren bestod av två identiska halvor av fixturen som visas. Två cylindriska rostfria stift (~ 2,94 mm diameter, ~ 18 mm lång) krävdes för att säkerställa anpassning och fullständig stängning av halvorna av kammaren. Fyra identiska springor för 6-32 gängskruvar gjordes i varje hörn av kammaren för skruvtät montering. Alla numeriska värden presenteras i millimeter. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Montering av transportkammare för icke-jämviktsdiffusion. Designparametrar av (A) svarta PMMA-insatser och (B) stora och små gummipackningar. Tjocklek på gummipackningar justerades för att säkerställa tät stängning av kammaren. Alla numeriska värden presenteras i mm. (C) Schematisk visar ordning montering för två halvor av transportkammare med brosk explant placeras i centrum. SZ indikerar ytlig zon av brosk som var vänd uppströms kammaren. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 8: Schematisk för icke-jämviktsdiffusionsexperiment. Brosk explants (6 mm diameter x 1 mm tjocklek) placerades i mitten av transportkammaren med den ytliga ytan mot uppströms kammaren. Både upp och nedströms sidor av kammaren var fyllda med 1x PBS-PI och blandas med hjälp av en mini stir bar. Med en laser pekade mot nedströms kammaren för att samla fluorescerande avläsningar, fluorescerande taggade CPC lösning lades till uppströms kammaren. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter jämvikt absorption av CPCs genom brosk, badet fluorescens minskar när solute har tagits upp av vävnaden. Om det slutliga badet fluorescensvärde förblir likt initialen, tyder det dock på att det inte finns något/minimalt upptag av utskänk. En annan bekräftelse på solute upptag är om vävnaden har synligt bytt färg till färgen på fluorescerande färgämnet. Det kvantitativa upptaget av solutes i brosk bestämdes med hjälp av upptagningsförhållandet (RU) efter att fluorescensvärdena omvandlats till koncentration med hjälp av standardkurvan. Med hjälp av den initiala badkoncentrationen (CBath,i) och koncentrationen av jämviktsbad (CBath), beräknades solutekoncentrationen inuti brosk (CBrosk) på följande sätt där VBath=300 μL:
Med hjälpav C Brosk och CBathbestämdes upptagningsförhållandet med hjälp av ekvationen nedan.
Värden >>1 anger förstärkt upptagning på grund av laddningsinteraktioner, medan värden <1 anger lågt upptag. Till exempel har större, neutrala solutes som Neutravidin (60 kDa, pI 7) visat RU<1 på grund av steric hinderance med broskmatrisen1, medan mindre, neutrala solutes förväntas visa RU~ 1, eftersom de har möjlighet att sprida sig in i brosket och nå jämvikt. Däremot har Avidin (pI 10,5), den positivt laddade motsvarigheten till Neutravidin, visat en RU~ 180 i brosk1. Vidare visar småstora CPC (~ 2,5-4 kDa) en RU upp till 4004. Som framgår av figur 9visade upptagningskvoterna ett laddningsberoende svar4.
Figur 9: Representativa resultat av jämviktsupptag av CPC i brosk. CPCs av varierande nettoavgift (+8, +14 och +20) och deras respektive upptagskvoter i brosk visade att upptagningen inte ökar monotont med ökande laddning. Denna siffra har modifierats från Vedadghavami et al.4Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
I fall lysrör av badet har ökat efter att ha nått jämvikt, skulle detta indikera att den initiala bad koncentrationen av fluorescently taggade solute var för hög. Detta skulle orsaka utsläppet att fångas i lösningen efter excitation via plattan läsare. För att lösa denna fråga, sänka den initiala badkoncentrationen.
Efter confocal imaging, en bunt bilder producerades med varje bild som visar djupet av penetration av fluorescerande taggade CPCs vid olika lager av brosk. Bilden som erhållits från mitten av brosk explant visade längst djup penetration jämfört med någon annan bild i hela tjockleken på explant. Med hjälp av en programvara som ImageJ, var högen av bilder överlagrad för att producera en bild som visar den genomsnittliga intensiteten av CPC penetration. Dessa överlagrad bilder som den bästa jämförelsen av övergripande djup penetration mellan olika laddade narkotikabärare. Ett laddningsberoende svar observerades för CPC inom vävnaden (Figur 10). Stora neutralt laddade bärare (t.ex. Neutravidin) kommer inte att tränga mycket längre än den ytliga zonen eftersom de saknar förmåga att använda laddningsinteraktioner för att inducera bindningmed matrisen 1. På motsvarande sätt kommer en för hög positiv laddning att begränsas till den ytliga zonen (vilket visas av CPC+20 även efter 24 h)4, dock är detta ett resultat av att bäraren är bunden för starkt till matrisen; de inte kan ta bort från sitt ursprungliga mål. En optimalt laddad läkemedelsbärare skulle dock kunna tränga igenom till de djupa zonerna av brosk eftersom det kan dra nytta av den svaga och reversibla karaktären av elektrostatiska interaktioner (vilket framgår av CPC +14)4. Detta gör det möjligt för transportören att binda till sitt ursprungliga mål, unbind att flytta djupare genom matrisen, och sedan binda igen till mål längre inne i vävnaden. Till exempel, Avidin (~ 7 nm diameter, 66 kDa, pI 10.5) bindning med negativt laddade matris glykosaminoglykaner (GAGs) har en dissociation konstant (KD) på 150 μM, som ansågs vara tillräckligt svag för att möjliggöra den reversibel bindning som krävs för full tjocklek penetration1. Trots den svaga bindningen visade Avidin hög retention och upptag i brosk på grund av närvaron av en hög densitet av negativt laddade GAGs (Binding density NT = 2900 μM)1. Vidare, som framgår av CPC+8, var full tjocklek penetration synlig inom 4 h, medan CPC +14 krävs 24 h för att nå full djup4. Således bör flera tidpunkter väljas för att effektivt jämföra hastighet av olika solutes på genomträngande vävnad tjocklek. För en mer kvantitativ förståelse av penetrationsdjupet kan de relativa intensiteterna i solutes längs vävnadens tjocklek erhållas med hjälp av ImageJ.
Figur 10: Representativa resultat från djup av penetrationsstudier i brosk. CPCs av varierande nettoavgift (+8, +14 och +20) och deras respektive djup av penetration genom brosk visade svag-reversibel bindning som ses av CPC +8 och CPC +14 är nyckeln för full djup penetration. Men för stark bindning som sett för CPC +20 hindras full tjocklek penetration. Denna siffra har modifierats från Vedadghavami et al.4Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Om ingen fluorescerande signal har observerats inne i brosket under bildbehandling, två frågor kan vara närvarande; antingen blockerades ytan för diffusion av epoxin, eller så var den initiala badkoncentrationen för låg för att ge en fluorescerande signal. För att åtgärda dessa problem, ta bort överskott epoxi från brosk ytor och öka solute koncentration.
Icke-jämviktsdiffusionstransportexperiment resulterade i en kurva enligt figur 11. Den inledande delen av kurvan representerar solute diffusion genom brosk som solute-matrix bindande interaktioner sker. Med ökad laddning av bäraren inträffade starkare matrisbindning vilket kommer att resultera i en längre tid för att solutes skulle nå nedströms kammaren. När solutes trängde igenom djupet av brosk och nådde nedströms kammaren, en ökning av lutningen av kurvan observerades som fluorescens behandlingen ökade med tiden. Denna andra del av kurvan nådde en stadig lutning, som representerar steady-state diffusion. En tangentiell linje drogs vid steady-state lutningen för att bestämma den tid det tar att nå steady-state diffusion (τLag), märkt av x-intercept. Den effektiva diffusivityen (DEFF),diffusionen klassar av CPCs stunder som det finns bindande växelverkan förekommer i brosk, beräknades med hjälp av τLag och explant tjocklek (L) enligt följande:
Efter överföring av 20 μL lösning från uppströms till nedströms kammare, observerades en topp i fluorescens; den resulterande stabiliserade fluorescensintensiteten användes för korrelation till koncentrationen. Koncentrationen av CPCs i nedströms (CD) normaliseras till uppströms koncentrationen (CU) var sedan ritas mot tiden. Lutningen på denna kurva användes för att uppskatta steady-state diffusion hastighet när alla bindningsställen i brosk är upptagna (DSS) enligt nedan. Det här värdet var inkluderande av partitioneringskoefficienten. Här representerar φ, VD och A broskporositet (~0,8), nedströms kammarvolym (2 mL) respektive tvärsnittsarea av brosk (0,1257 cm2). Representativa DEFF- och DSS-värden som beräknas utifrån icke-jämviktstransportexperiment för CPC finns i tabell 1.
Figur 11: Representativa resultat från icke-jämviktsdiffusionsstudier genom brosk. CPC+8 diffusionskurva, ritad som koncentrationen nedströms (CD) normaliserad till koncentrationen uppströms (CU), mot tiden. En tangentiell linje dragen vid steady-state-lutningen (blå) korsar x-axeln vid τLag, som användes för att beräkna DEFF. Lutningen på tangens användes för att beräkna DSS. Spike-testet (grått) representerar den stabiliserade koncentrationen i nedströmskammaren efter överföring av 20 μL CPC-lösning från uppströms till nedströms, som används för att normalisera nedströmskoncentrationen. Denna siffra har modifierats från Vedadghavami et al.4Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Om nedströms fluorescens misslyckas med att stabilisera före tillsats av fluorescerande taggade peptid till uppströms kammaren, är det troligt att det finns solute rester fastnat på väggarna från ett tidigare experiment. I detta fall, demontera kammaren och tvätta med tvål och sonikera. Om det finns en ökning av nedströms fluorescens omedelbart efter tillsats av fluorescerande taggade peptid till uppströms kammaren, kan detta tyda på att läckage är närvarande. Detta skulle kräva återmontering av transportkammaren och omprövning för läckor. Om nedströms fluorescens signalen når en platå i motsats till en stadig-state ökning, indikerar det en möjlig förlust av koncentration i uppströms kammaren, sannolikt orsakas av solutes fastnar på väggarna i kammaren. Tillägg av 0,005% w / v bovint serum albumin (BSA) till uppströms kammaren kan bidra till att förhindra fastnar.
| Cpc | DEFF (cm2/s) | DSS (cm2/s) |
| CPC+8 | 1,7 ± 0,4 x 10-7 | 5,8 ± 0,0 × 10-5 |
| CPC+14 | 9,8 ± 0,2 x 10-8 | 2,6 ± 1,2 x 10-5 |
| CPC+20 | 4,7 ± 0,1 x 10-8 | 1,4 ± 0,9 x 10-5 |
Tabell 1: Representativa DEFF- och DSS-värden för CPC-transport genom brosk. Denna tabell har modifierats från Vedadghavami m.fl.4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder och protokoll som beskrivs här är betydande för området riktade drug delivery till negativt laddade vävnader. På grund av den höga tätheten av negativt laddade aggrecans som finns i dessa vävnader, skapas en barriär, vilket förhindrar droger från att nå sina cellulära målplatser som ligger djupt inom matrisen. För att ta itu med denna enastående utmaning, läkemedel kan ändras för att införliva positivt laddade narkotikabärare som kan förbättra transporthastigheten, upptag och bindning av läkemedel inom vävnad1,3,4,14,15,16,17,18,19. Som visas här med de utvecklade metoderna kan transporten av positivt laddade läkemedelsbärare karakteriseras för att bestämma jämviktsupptagningen, penetrationsdjupet och icke-jämviktsdiffusionshastigheten. Vi har framgångsrikt utformat tre separata experimentella uppställningar som kan utnyttjas för att bedöma transporten genom brosk explants.
För en framgångsrik karakterisering av transport, kritiska steg i förfarandet måste följas. Användningen av proteashämmare (PIs) i alla lösningar är avgörande för att exakt karakterisera intrabrosktransport av CPC genom brosk eftersom de fungerar för att förhindra enzymatisk matsmältning av proteiner i vävnad20. Därför, om den inte används, broskmatris komponenter såsom aggrecans och kollagen kan börja försämras och utsöndra i det omgivande badet under experiment. Detta kan kraftigt sänka FCD av brosk, vilket minskar antalet laddningsbaserade bindningsställen i broskmatrisen. Den resulterande vävnaden skulle inte längre vara representativ för friskt brosk. Omvänt kan de presenterade experimenten också användas för att utvärdera transporten av CPCs genom artrosbrosk där det aggrekanska innehållet är mycket lägre enligt vad som ses i OA20. Använda trypsin eller Chondroitinase ABC att smälta brosk explants, den aggrecan densitet kan kontrolleras, och därigenom möjliggör utvärdering av transport och drug delivery i ett diseased tillstånd. I detta fall kan laddningsbaserad bindning äventyras, medan andra typer av interaktioner såsom vätebindningar och hydrofoba interaktioner synergistiskt förstärker intrabroskbindning och retention4.
Att upprätthålla hydrering av brosk explant är nyckeln under provberedning och experiment. Uttorkning via exponering för luft i större än 6 minuter har visat sig framkalla irreversibla skador på ledbrosk21. Som ett resultat av detta kan oväntade förändringar i transporten av CPC:er uppstå. På samma sätt kan avdunstning av CPC-bad resultera i explant uttorkning; detta kan förhindras genom att täta med en flexibel film. Men bad avdunstning kan inte bara orsaka explant uttorkning, men det kan också orsaka en förändring i CPC bad koncentration, vilket resulterar i falska fluorescerande avläsningar. Vidare är det viktigt att notera att djup av genomträngningsstudier kräver tunna tvärsnitt (~100 μM) av brosk som ska avbildas. Detta är en teknik som kräver övning så att skivor av enhetlig tjocklek kan erhållas. Det är också kritiskt för icke-jämviktsdiffusionsexperiment, att transportkammaren är genomskinlig så att mätningar i realtid fluorescens kan erhållas med den specialdesignade spektrofotometern. Som alternativ kan dock alikvoter från nedströmskammaren erhållas och bedömas för fluorescens med hjälp av en plattläsare eller annan spektrofotometrisk läsare.
De metoder som presenteras här är av stor betydelse eftersom de ger en bench-scale metod för att karakterisera läkemedelsbärare transport genom brosket för att bättre förutsäga in vivo drogretention och långsiktig biologisk effekt. Nyligen genomfördes ett finita element ram för beräkningsvätska dynamik för mätning av solute transport genom porösa medier22. Arbabi et al. har använt finita elementanalys i kombination med experimentella data som erhållits från mikro-CT-avbildning för att mäta diffusionshastigheter av negativt laddat kontrastmedel, ioxaglate i brosk23,24. Vidare, med hjälp av en multi-zone, multifasik modell, diffusion koefficienter ioxaglate i olika zoner av brosk mättes tillsammans med FCD i varje zon. Medan mikro-CT imaging endast kan användas med kontrastmedel, vår experimentella setup möjliggör karakterisering av transport av alla läkemedel och drug bärare som kan fluorescerande märkt. Den avancerade beräkningsmodellering som används av Arbabi et al. ger dock en mer omfattande analys av transportbeteendet i Solute och kan tillämpas på våra experimentellametoder 13,24.
En begränsning av den presenterade metoden är att den experimentella uppställningen för varje transportförsök i soluten inte helt omfattar in vivo-miljön. Biologiska svar och mekaniska och dynamiska krafter som uppstår inom den naturliga leden simuleras inte här. För att införliva dessa krafter kan transportkammaren modifieras med en kolv för att simulera konvektiva flödesmönster som uppstår under aktiviteter som gång och löpning. Men medan konvektivt flöde kan öka upptaget med 2-faldigt, kan upptaget på grund av elektrostatiska interaktioner öka 100-400x. Således ger de experimentella uppställningar som presenteras här en bra uppskattning för avgiftsbaserad transport och upptag25. Vidare, eftersom knäleden naturligt innehåller ledvätska, kan den användas i badlösningarna för transportexperiment istället för 1x PBS-PI. Det uppskattas att upptaget av katjoniska bärare i brosk skulle minska i synovial vätska jämfört med i 1x PBS på grund av förekomsten av hyaluronan kedjor med negativt laddade carboxyl grupper i ledvätska. Det är möjligt att katjoniska bärare konkurrenskraftigt binder med de hyaluronan kedjor av ledvätskan utöver GAGs av brosk. Tätheten av negativt laddade grupper är dock betydligt högre i brosk jämfört med synovial vätska, på grund av förekomsten av både negativt laddade carboxylated hyaluronan kedjor och sulfaterade GAGs i brosk15. Således, även om upptaget i brosk i närvaro av synovial vätska kommer att vara lägre än i 1x PBS, det är fortfarande förväntas upprätthålla hög intra-brosk upptag. In vivo, Avidin har visat hög intra-brosk upptag i både råtta och kanin brosk i närvaro av ledvätska16,26. Vidare, Avidin har visat högt upptag och retention i brosk upp till 2 veckor efter intra-artikulär injektion i en kanin främre korsband transection modell27.
Användning av bovin brosk i detta system möjliggör en mer exakt representation av drogpenetration genom brosk på grund av dess likheter med mänskliga brosk i fråga om tjocklek (~ 1,5-2 mm)28,29. Transport av solutes genom brosket kan variera med tjocklek; läkemedelsbärare kan kräva färre bindande interaktioner för att helt tränga igenom möss eller råtta brosk som är mycket tunnare, dock kan avsevärt hindras från att tränga djupare i tjockare mänskliga brosk1. Vidare, även om dessa experiment var utformade för att karakterisera solute transport inom brosket, kan dessa metoder modifieras och tillämpas på andra negativt laddade vävnader såsom menisken, hornhinnan och glaskropp humor i ögat, och kärnan pulposus av intervertebral diskar. De metoder för experiment som utformats här är fördelaktiga då dimensionerna av fixturer och transportkammare kan anpassas efter vävnadens storlek och art. Effekterna av dessa metoder är omfattande, begränsad inte bara till narkotikabärare utan också för utvärdering av transporter av narkotika och narkotika-drug carrier konjugater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av United States Department of Defense genom Congressionally Directed Medical Research Programs (CDMRP) enligt kontrakt W81XWH-17-1-0085, och National Institute of Health R03 EB025903-1. AV finansierades av College of Engineering Dean's Fellowship vid Northeastern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18x18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
References
- Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
- Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, Pt 2 335-347 (1976).
- Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
- Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
- Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238 (2019).
- Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898 (2020).
- Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
- Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
- Martel-Pelletier, J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
- Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).
- Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. Progress in intra-articular therapy. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).
- He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
- Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
- Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882 (2020).
- Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
- Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
- Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
- Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
- Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
- Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).
- Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).
