Summary
פרוטוקול זה קובע ספיגת שיווי משקל, עומק חדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל עבור נשאי פפטיד cationic בסחוס. אפיון של מאפייני תחבורה הוא קריטי להבטחת תגובה ביולוגית יעילה. שיטות אלה ניתן להחיל על עיצוב נושאות סמים טעונות בצורה אופטימלית עבור מיקוד רקמות טעונות שלילית.
Abstract
מספר רקמות טעונות שלילית בגוף, כמו סחוס, להציג מחסום לאספקת סמים ממוקדת בשל הצפיפות הגבוהה שלהם של aggrecans טעונים שלילית, ולכן, דורשים שיטות פילוח משופרות כדי להגדיל את התגובה הטיפולית שלהם. בגלל סחוס יש צפיפות תשלום קבועה שלילית גבוהה, תרופות ניתן לשנות עם נשאי סמים טעונים חיובית כדי לנצל אינטראקציות אלקטרוסטטיות, המאפשר תחבורה משופרת תוך סחוס סמים. לימוד ההובלה של נושאות סמים הוא, אם כן, חיוני לחיזוי היעילות של תרופות בגימת תגובה ביולוגית. אנו מראים את העיצוב של שלושה ניסויים אשר יכול לכמת את ספיגת שיווי המשקל, עומק החדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל של נשאי פפטיד cationic בהסברי סחוס. ניסויי ספיגת שיווי משקל מספקים מדד של ריכוז הבדידות בתוך הסחוס בהשוואה לאמבטיה שמסביבה, אשר שימושי לחיזוי הפוטנציאל של נשא סמים בשיפור הריכוז הטיפולי של תרופות בסחוס. עומק מחקרי החדירה באמצעות מיקרוסקופית confocal לאפשר ייצוג חזותי של דיפוזיה 1D solute מן האזור שטחי עד עמוק של סחוס, אשר חשוב להעריך אם solutes להגיע מטריצה שלהם ואתרי היעד הסלולרי. מחקרי שיעור דיפוזיה ללא שיווי משקל באמצעות תא הובלה מותאם אישית מאפשר מדידה של חוזק של אינטראקציות מחייבות עם מטריצת הרקמה על ידי אפיון שיעורי דיפוזיה של solutes פלואורסצנטי על פני הרקמה; זה מועיל לעיצוב נשאים של כוח מחייב אופטימלי עם סחוס. יחד, התוצאות שהתקבלו משלושת ניסויי התחבורה מספקות קו מנחה לעיצוב נושאות תרופות טעונות בצורה אופטימלית המנצלות אינטראקציות טעינה חלשות והפיות עבור יישומים לאספקת תרופות. שיטות ניסיוניות אלה ניתן ליישם גם כדי להעריך את ההובלה של תרופות ותרופות סמים התייחדות. יתר על כן, שיטות אלה ניתן להתאים לשימוש מיקוד רקמות טעונות שלילית אחרים כגון מניסקוס, קרנית ואת ההומור זגוגית.
Introduction
משלוח סמים לרקמות טעונות שלילית בגוף נשאר אתגר בשל חוסר היכולת של תרופות לחדור עמוק לתוך הרקמה כדי להגיע לאתרי היעד תאמטריקס 1. חלק מרקמות אלה כוללות אגרקנים צפופים, טעונים בשלילה אשר יוצרים צפיפות תשלום קבועה שלילית גבוהה (FCD)2 בתוך הרקמה ולפעול כמחסום למסירה של רוב מקרומולקולות3,,4. עם זאת, בסיוע של נושאות סמים טעונות חיובית, מחסום רקמות זה טעון שלילית למעשה ניתן להמיר למחסן סמים באמצעות אינטראקציות תשלום אלקטרוסטטי עבור משלוח סמיםממושך 1,,5,,6,7(איור 1).
איור 1: תשלום משלוח מבוסס תוך סחוס של CPCs. הזרקה תוך-מפרקים של CPCs לחלל מפרק הברך. אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין CPCs טעונים חיובית וקבוצות aggrecan טעונות שלילית לאפשר חדירה מהירה ועומק מלא באמצעות סחוס. נתון זה שונה מ- Vedadghavami et al4. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
לאחרונה, ספקי פפטיד cationic באורך קצר (CPCs) תוכננו במטרה ליצור תחומים cationic קטנים מסוגל לשאת טיפולים גדולים יותר בגודל למסירה סחוסטעון שלילית 4. עבור משלוח תרופות יעיל לסחוס לטיפולנפוץ 8,9 ומחלותניווניות כגון דלקת מפרקים ניוונית (OA)10,זה קריטי כי ריכוזים טיפוליים של תרופות לחדור עמוק בתוך הרקמה, שם רוב תאי הסחוס (chondrocytes)לשקר 11. למרות שיש מספר מחלות פוטנציאליות שינוי תרופות זמינות, אף אחד לא קיבל אישור ה-FDA כי אלה אינם מסוגלים למקד ביעילות את הסחוס12,13. לכן, הערכה של מאפייני התחבורה של נושאות סמים היא הכרחית לחיזוי היעילות של תרופות בגימת תגובה טיפולית. כאן, עיצבנו שלושה ניסויים נפרדים שניתן לנצל להערכת ספיגת שיווי המשקל, עומק החדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל של CPCs4.
כדי להבטיח כי יש ריכוז תרופתי מספיק בתוך הסחוס שיכול לספק תגובה טיפולית אופטימלית, ניסויי ספיגה תוכננו לכמת שיווי משקל CPC ריכוז בסחוס4. בעיצוב זה, בעקבות שיווי משקל בין הסחוס לבין האמבטיה שמסביבו, ניתן לקבוע את הכמות הכוללת של הבדידות בתוך הסחוס (המאוגד למטריצה או בחינם) באמצעות יחס ספיגה. יחס זה מחושב על ידי נרמול הריכוז של solutes בתוך הסחוס לזה של אמבט שיווי המשקל. באופן עקרוני, solutes נייטרלי, אשר דיפוזיה דרך הסחוס אינו נעזר על ידי אינטראקציות תשלום, יהיה יחס ספיגה של פחות מ 1. לעומת זאת, solutes cationic, אשר תחבורה משופרת באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות, להראות יחס ספיגה גדול מ 1. עם זאת, כפי שהראה עם CPCs, שימוש בטען חיובי אופטימלי יכול לגרום ליחס ספיגה גבוה בהרבה (גדול מ- 300)4.
למרות ריכוז גבוה של סמים בתוך הסחוס חשוב להשגת תועלת טיפולית, זה גם קריטי כי תרופות לפזר דרך העובי המלא של הסחוס. לכן, מחקרים המראים את עומק החדירה נדרשים כדי להבטיח כי תרופות להגיע עמוק בתוך הסחוס, כך מטריקס ואתרי היעד הסלולרי ניתן להגיע, ובכך לספק טיפול יעיל יותר. ניסוי זה נועד להעריך את דיפוזיה חד-דרךית של solutes באמצעות סחוס, המדמה דיפוזיה של תרופות לתוך סחוס בעקבות הזרקת תוך-מתוך-פרקים ב vivo. הדמיית פלואורסץ באמצעות מיקרוסקופית confocal מאפשרת הערכה של עומק חדירה לתוך סחוס. טעינת חלקיק נטו ממלאת תפקיד מרכזי במתינות האופן שבו סמים עמוקים יכולים לפזר דרך המטריצה. טעינה נטו אופטימלית המבוססת על FCD רקמה נדרש כדי לאפשר אינטראקציות מחייבות הפיך חלש בין חלקיקים cationic מטריצת רקמות אניון. משמעות הדבר היא כי כל אינטראקציה היא חלשה מספיק, כך חלקיקים יכולים להתנתק מהמטריקס אבל הפיך בטבע, כך שהוא יכול להיקשר לאתר אחר מחייב מטריקס עמוק יותרבתוך הרקמה 4. לעומת זאת, תשלום נטו חיובי מוגזם של חלקיק יכול להיות מזיק כלפי דיפוזיה, כמו איגוד מטריצה חזק מדי מונע ניתוק של חלקיקים מאתר האיגוד הראשוני באזור שטחי של סחוס. כתוצאה מכך תגובה ביולוגית לא מספקת כמו רוב אתרי היעד לשקר עמוק בתוך הרקמה11.
כדי לכמת עוד יותר את הכוח של אינטראקציות מחייבות, ניתוח של שיעורי דיפוזיה סמים באמצעות סחוס הוא יתרון. מחקרי דיפוזיה ללא שיווי משקל מאפשרים השוואה של שיעורי דיפוזיה בזמן אמת בין solutes שונים. כמו סמים מפוזרים דרך שטחי, אמצע ועמוק אזורים של סחוס, הנוכחות של אינטראקציות מחייבות יכול לשנות מאוד את שיעורי דיפוזיה. כאשר קיימות אינטראקציות מחייבות בין תרופות למטריצת הסחוס, היא מוגדרת כדיספוסיביות יעילה (DEFF). במקרה זה, לאחר שכל האתרים המחייבים נכבשו, שיעור דיפוזיה של תרופות נשלט על ידי דיפוזיה מצב יציב (DSS). השוואה בין DEFF של solute שונה קובעת את עוצמת האיגוד היחסי של solutes עם המטריצה. עבור solute נתון, אם DEFF ו- DSS הם באותו סדר גודל, זה מרמז כי יש כריכה מינימלית נוכח בין התרופה למטריצה במהלך דיפוזיה. עם זאת, אם DEFF גדול מ- DSS, קיים איגוד משמעותי של חלקיקים למטריקס.
הניסויים שתוכננו מאפשרים בנפרד אפיון של הובלה סולט באמצעות הסחוס, עם זאת, ניתוח הוליסטי הכולל את כל התוצאות נדרש לעיצוב נשא סמים טעון בצורה אופטימלית. האופי החלש וההפיך של אינטראקציות טעינה שולט בקצב דיפוזיה חלקיקים ומאפשר ספיגת שיווי משקל גבוהה וחדירה מהירה לעומק מלא באמצעות סחוס. באמצעות ניסויי ספיגת שיווי משקל, עלינו לחפש נשאים שמופעי ספיגה גבוהה כתוצאה מאינטראקציות טעינה שניתן לאמת באמצעות מחקרים ללא שיווי משקל קצב דיפוזיה. עם זאת, אינטראקציות מחייבות אלה צריכות להיות חלשות הפיכות בטבע כדי לאפשר חדירה בעובי מלא של הבדידות באמצעות סחוס. מוביל סמים אידיאלי יהיה בעל תשלום אופטימלי המאפשר חזק מספיק מחייב לספיגה וריכוזי סמים תוך סחוס גבוה, אבל לא חזק מדי כדי לסתר דיפוזיהבעובי מלא 4. הניסויים שהוצגו יסייעו במאפייני העיצוב של רקמה מבוססת תשלום המתמקדת בנשאי סמים. פרוטוקולים אלה שימשו לאפיון הובלת CPC באמצעות סחוס4,עם זאת, אלה יכולים להיות מיושמים גם על מגוון רחב של תרופות ונשאים סמים באמצעות סחוס ורקמות טעונות שלילית אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אישורים באוניברסיטה הושגו לביצוע הניסויים עם רקמות מתות. מפרקים של בקרים הושגו מסחרית מבית מטבחיים.
1. חילוץ הסבר סחוס
- באמצעות אזמל (#10), לחתוך ולהסיר שומן, שרירים, רצועות, גידים וכל רקמת חיבור אחרים כדי לחשוף את הסחוס מן גרוב הירך של מפרקים הברך בקר.
- בעזרת אגרופים עוריים של 3 מ"מ ו-6 מ"מ, הפוך אגרופים בניצב לתוך הסחוס כדי לחלץ תקעים גליליים. מיד למקם את התקעים בארות בודדות של צלחת 48-באר המכילה 500 μL של 1x פוספט חוצץ תמיסת מלח (PBS) בתוספת 1% v / v אנטיביוטי אנטיביוטי אנטיביוטי.
- מניחים את הצד שטחי של תקע סחוס פונה כלפי מטה לתוך באר במתקן חיתוך(איור 2). באמצעות סכין גילוח, חותכים את התקע לאורך פני השטח של מתקן החיתוך כדי להשיג סחוס בעובי 1 מ"מ הכולל את האזור השטחי. חזור על הפעולה עבור כל תקע סחוס.
- לאחסן extilage experts בנפרד בצינורות פוליפרופילן המכיל 500 μL של 1x PBS בתוספת עם מעכבי פרוטאז (PBS-PI, 1 PI מיני לוח לכל 50 מ"ל 1x PBS) ב -20 °C.
- לפני ביצוע כל אחד מניסוואת התחבורה הבאה, להפשיר את הבקבוקונים המכילים את ההסבר במשך 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
איור 2: מתקן חיתוך מותאם אישית. פרמטרי עיצוב של מתקן חיתוך נירוסטה המשמש לחיתוך extilage explants של 3 ו 6 מ"מ קוטר. תוספות פלסטיק בעובי שונה הונחו בתוך בארות כדי להתאים את עובי ההסברים הפרוסים. פין גלילי נירוסטה של <1 מ"מ קוטר שימש לדחוף explant מתוך מתקן. כל הערכים המספריים מוצגים במ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
2. ספיגת שיווי משקל של CPCs בסחוס
- בעדינות לטבול explants סחוס (3 מ"מ dia. X 1 מ"מ עבה.) עם מחיקת משימה עדינה כדי להסיר PBS 1x עודף מפני השטח explant. באמצעות איזון, במהירות להקליט את המשקל הרטוב של כל explant ולאחר מכן מיד למקם באמבט PBS 1x כדי למנוע התייבשות.
- הכן פתרונות μM של 30 μM (300 μL לכל הסבר) של CPCs המסויגים בנתון פלורסנט ב- PBS-PI אחד. השתמש בצינורות פוליפרופילן ללא RNase לצורך איסוף מחדש.
- בצלחת 96-באר, פיפטה 300 μL של כל 30 μM CPC פתרון לתוך בארות נפרדות. הימנע משימוש בארות ליד קצה הצלחת כדי למנוע אידוי. באמצעות מרית, להעביר כל explant לפתרון המכיל בארות.
- ממלאים את בארות הסובבות ב-300 μL של PBS אחד ומכסים את צלחת הבאר במכסה. אטמו את קצות הצלחת עם סרט גמיש כדי למזער את האידוי.
- בתוך אינקובטור 37 °C, מניחים את הצלחת על שייקר צלחת כדי להגביל את משקע החלקיקים. דגירה במשך 24 שעות תחת סיבוב עדין (50 סל"ד עם מסלול של 15 מ"מ) כדי לאפשר ספיגת שיווי משקל של CPCsבסחוס (איור 3).
- צור עקומה סטנדרטית עבור מתאם של פלואורסנס ריכוז CPC
- הכן דילול סדרתי של פתרונות CPC מ- 30 μM – 0 μM (10 דילול כפול כפול) ב- PBS-PI אחד בצינורות פוליפרופילן. ודא כי לפחות 500 μL של כל דילול קיים.
- להוסיף 200 μL של כל דילול בארות רצופות בצלחת שחור 96-באר. שכפול בשורה אחרת כדי להגדיל את גודל המדגם.
- השג קריאות פלואורסצנטיות של כל מדגם באמצעות קורא לוחות באורכי הגל של העירור והפליטה של תווית הפלורסנט באמצעות קורא לוחות.
- קריאת פלואורסנצט של העלילה לעומת ריכוז CPC והפיק משוואה עבור החלק ליניארי של העקומה.
הערה: כדי להגביל את השונות בקריאות פלואורסצנטיות, דגירה פתרון המניות CPC באותם תנאים כמו לוח המדגם לפני יצירת העקומה הסטנדרטית.
- לאחר 24 שעות של דגירה, לאסוף את אמבט שיווי המשקל מכל באר בצינורות פוליפרופילן נפרדים.
- להעביר 200 μL של כל פתרון לתוך בארות נפרדות של צלחת 96-באר שחור. השג קריאות פלואורסצנטיות של כל מדגם תחת אותן הגדרות פלורסנט כמו עבור העקומה הסטנדרטית. במידת הצורך, תדלל את הדגימה ב- PBS-PI אחד כדי להבטיח שהקריאות ייפלו בחלק הליניארי של העקומה הסטנדרטית.
איור 3: סכמטי של ניסויי ספיגת שיווי משקל. Extilage explants (3 מ"מ dia. x 1 מ"מ עבה) הונחו בארות יחידים בצלחת 96-באר המכיל פתרון CPC מתויג פלורסנט. לאחר 24 שעות CPCs נכבשו על ידי הסחוס, ובכך להפחית את הפלואורסצסצנציה של האמבטיה שמסביב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
3. עומק החדירה של CPCs בסחוס
- הכן פתרונות μM של 30 μM (300 μL לכל הסבר) של CPCs המסויגים בנתון פלורסנט ב- PBS-PI אחד. השתמש בצינורות פוליפרופילן ללא RNase לצורך איסוף מחדש.
- באמצעות אזמל, פרוסות סחוס לחתוך (6 מ"מ קוטר x 1 מ"מ עובי) במחצית כדי להפוך חצי דיסקים. שמור את ההסבר לח עם שכבה של PBS-PI 1 תוך כדי חיתוך.
- הדבקת חצי דיסק לאמצע באר אחת של תא תעבורה חד-ממדי שתוכנן בהתאמה אישית באמצעות אפוקסי(איור 4, איור 5). ודא אפוקסי מוחל על הצד ההיקף (מעוקל) של explant. הסר דבק עודף מהבאר כדי למנוע מגע עם שטח פני השטח של הסחוס וציין את הצד השטחי של ההסבר.
- הוסף 80 μL של 1x PBS-PI לשני צידי ההסבר. פיפטה הנוזל למעלה ולרדת מצד אחד של explant כדי לבדוק דליפה לצד השני. אם מתרחשת דליפה, תקן מחדש את השתל ולהחיל אפוקסי במידת הצורך.
- החלף את ה-PBS-PI 1 מהצד הפונה למשטח השטחי של הסחוס (במעלה הזרם) בפתרון CPC של 80 μL של 30 μM. לשמור על 80 μL של 1x PBS-PI בצד מול האזור העמוק של סחוס (במורד הזרם).
- מקם בזהירות את תא ההובלה במיכל סודי. כסה את בסיס המכל בשכבה 1x PBS כדי למנוע אידוי פתרונות. ודא שאין קשר ישיר בין פתרונות מתאי במעלה הזרם ובמורד הזרם.
- מניחים את המיכל המכוסה על שייקר צלחת כדי להגביל את מום החלקיקים. דגירה עבור 4 או 24 שעות בטמפרטורת החדר תחת סיבוב עדין (50 סל"ד עם מסלול 15 מ"מ).
- לאחר הדגירה, הסר את ההסבר מהתא וחתכו כ-100 μm פרוסה ממרכז ההסבר.
הערה: חתך רוחב זה כולל את האזורים שטחיים, בינוניים ועמוקים של סחוס. - מניחים את הפרוסה בין מגלשת זכוכית לתסם מכסה. מורטים את הפרוסה בשכבה של PBS-PI 1.
- בהגדלה של פי 10, תמונה דרך העובי המלא של הפרוסה כדי להשיג z-stack של תמונות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ confocal.
- שימוש ב- ImageJ מקרין את העוצמה הממוצעת של התמונות בתוך z-stack כדי לקבוע את עומק החדירה של CPCs בסחוס.
- פתח את מחסנית התמונה על-ידי לחיצה על קובץ | פתח את .
- לחץ על 'תמונה' בשורת המשימות ולחץ על תמונה | ערימות | Z Project מהתפריט הנפתח.
- מספרי פרוסת קלט מ- 1 לפרוסה הסופית. בחר 'עוצמה ממוצעת' תחת סוג הקרנה. לחץ על'אישור.'
איור 4: תא הובלה דו-מיו-ד שתוכנן בהתאמה אישית. פרמטרי עיצוב של תא תעבורה 1D PMMA עם 6 בארות בודדות. כל הערכים המספריים מוצגים במ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: סכמטי של עומק מחקרי חדירה. Explants סחוס (6 מ"מ קוטר x 1 מ"מ עובי) נחתכו לשניים קבוע למרכז של בארות תחבורה 1-D מפוזר. פתרון CPC מתויג פלורסנטית נוספה לצד הבאר במגע עם האזור שטחי (SZ) של סחוס. 1x PBS-PI נוספה לצד הבאר במגע עם האזור העמוק (DZ) של סחוס. לאחר דיפוזיה, חתך רוחב של סחוס (3 מ"מ x 1 מ"מ) צולם באמצעות מיקרוסקופית confocal. נתון זה שונה מ Vedadghavami ואח'. 3Please click here to view a larger version of this figure.
4. שיעור דיפוזיה ללא שיווי משקל של CPCs בסחוס
- הביאו את שני החצאים של תא ההובלה המעוצב בהתאמה אישית (איור 6) יחד כדי להרכיב ולסגור את התא. השתמשו בדושות, אגוזים וברגים כדי לסגור בחוזקה את התא עם מפתח ברגים.
הערה: תא התובלה חייב להיות שקוף כדי לא להפריע לקריאות פלורסנט. תאי התעבורה המשמשים בפרוטוקול זה עשויים מפולימתילמטצ'רילט (PMMA). - ציפוי החלל הפנימי של התא עם 0.5% w / v חלב בשר לא שומן תמיסה 1x PBS (2 מ"ל עבור כל תא) במשך 15 דקות כדי למנוע איגוד לא ספציפי של CPCs לקירות תא. לאחר מכן לשטוף את התא עם 1x PBS (2 מ"ל עבור כל תא).
- באמצעות מתקן חיתוך מותאם אישית(איור 2) וסכין גילוח,חותכים את פרוסת סחוס בקוטר 6 מ"מ (מישור רוחבי) לעובי של 500-800 μm, כולל האזור שטחי. שמור את ההסבר לח עם PBS 1x.
- בעזרת אגרופים מונעי פטיש ובדרמליים, צור אטמים מדפי גומי כפי שפוקד באות 7.
- להרכיב כל תא תובלה חצי לכלול 1 אטם גומי גדול, 1 PMMA להוסיף 1 אטם גומי קטן כל אחד. מקם את ההסבר בארות של תוסף הפלסטיק, כאשר האזור שטחי פונה לתא במעלה הזרם. כריך שני חצאים יחד כדי להשלים את ההרכבה בורג בחוזקה באמצעות מפתח ברגים(איור 7).
- מלא את התא במעלה הזרם עם 2 מ"ל של 1x PBS-PI ולצפות בתא במורד הזרם לדליפת נוזלים מהתא במעלה הזרם. אם קיימת דליפה, תכינו מחדש את התא, כוונו את תמומת האטם ואת הלחץ של הברגים. אם אין דליפה, למלא את התא במורד הזרם עם 2 mL 1x PBS-PI גם כן.
- מוסיפים מיני-מערבבים לתאים במעלה ובמורד הזרם ומנום את התא על צלחת ערבוב. יישר את התא כך שהלייזר מהספקטרופוטומטר יתמקד לכיוון מרכז התא במורד הזרם. מקם את חלק מקלט האות של ספקטרופוטומטר מאחורי התא במורד הזרם(איור 8).
הערה: הלייזר והמקלט של ספקטרופוטומטר חייבים להיות מצוידים במסננים המתאימים כדי לרגש, לפלוט ולשדר אותות מהחלבון המסומן בפלורסנט. הגן על תא ההובלה מפני אור באמצעות קופסה שחורה במהלך ניסויים כדי למנוע הפרעה באות פלואורסנטי. עדיף לאטום את הפתחים על גבי החדר עם סרט גמיש כדי למנוע אידוי. - אסוף קריאות פליטת פלואורסץ בזמן אמת במורד הזרם והבטח אות יציב למשך 5 דקות לפחות.
הערה: ניתן להשיג את Aliquots מהתא במורד הזרם ולהעריך פלואורסצנטיות באמצעות קורא לוחות אם ספקטרופוטומטר או תא הובלה שקוף בהתאמה אישית אינו זמין. - פיפטה נפח מחושב מראש של תמיסת מניות של CPCs מתויג פלורסנטית לתוך התא במעלה הזרם כדי להבטיח ריכוז סופי של 3 μM בתוך התא במעלה הזרם. שים לב לאות הפלואורסצנס במורד הזרם ואפשר לתחבורה סוליה להגיע לעלייה מתמדת במדרון.
הערה: הסבר סחוס עבה יותר ידרוש זמן רב יותר כדי להגיע למצב יציב. - לאחר שהגענו למצב יציב, לקחת 20 μL מהתא במעלה הזרם ולהוסיף לתא במורד הזרם ("מבחן ספייק").
הערה: תיבחן עלייה חדה בפלואורסץ במורד הזרם. זה יאפשר מתאם בין קריאות פלורסנס וריכוז CPC. - אסוף קריאות פלואורססence בזמן אמת במורד הזרם.
איור 6: תא הובלה לא שיווי משקל שתוכנן בהתאמה אישית. פרמטרי עיצוב של תא תעבורה לא שיווי משקל PMMA. על התא להיות שקוף כדי לא להפריע לקריאות פלואורסצנטיות. תא התובלה המלא כלל שני חצאים זהים של המתקן המוצג. שני סיכות גליליות מפלדת אל-חלד (קוטר של כ-2.94 מ"מ, כ-18 מ"מ) נדרשו כדי להבטיח יישור וסגירה מלאה של חצאי התא. ארבעה חריצים זהים עבור ברגי חוט 6-32 נעשו בכל פינה של התא עבור מכלול בורג הדוק. כל הערכים המספריים מוצגים במילימטרים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: הרכבה של תא הובלה לא שיווי משקל. פרמטרי עיצוב של (A) PMMA שחור מוסיף ו - (ב) אטמי גומי גדולים וקטנים. עובי אטמי גומי הותאם כדי להבטיח סגירה הדוקה של התא. כל הערכים המספריים מוצגים במ"מ.(ג)סכמטי המציג את סדר ההרכבה עבור שני חצאים של תא הובלה עם הסבר סחוס ממוקם במרכז. SZ מצביע על אזור שטחי של סחוס שהיה מול התא במעלה הזרם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: סכמטי של ניסויי דיפוזיה ללא שיווי משקל. תפוצת סחוס (6 מ"מ קוטר x 1 מ"מ עובי) הונחו במרכז תא התחבורה עם פני השטח השטחי מול התא במעלה הזרם. שני צידי המעלה והמורד של התא היו מלאים ב-PBS-PI אחד ומעורבבים באמצעות מיני בר. עם לייזר מכוון לכיוון התא במורד הזרם כדי לאסוף קריאות פלורסנט, פתרון CPC מתויג פלורסנט נוסף לתא במעלה הזרם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר ספיגת שיווי המשקל של CPCs על ידי סחוס, פלואורסצסצנציה אמבטיה פוחתת כאשר solute כבר נכבש על ידי הרקמה. עם זאת, אם ערך הפלואורסצנס של האמבטיה הסופית נשאר דומה להתחלה, הוא מציין כי אין / ספיגת solute מינימלית. אישור נוסף של ספיגת solute הוא אם הרקמה שינתה באופן ניכר צבע לצבע של צבע פלורסנט. הספיגה הכמותית של solutes בסחוס נקבעה באמצעות יחס ספיגה (RU)לאחר ערכי הפלואורסץ הומרו לריכוז באמצעות העקומה הסטנדרטית. באמצעות ריכוז האמבטיה הראשוני (CBath,i)וריכוז אמבט שיווי המשקל (CBath),ריכוז הבדידות בתוך הסחוס (Cסחוס)חושב כדלקמן היכן VBath=300 μL:
באמצעות Cסחוס ו- CBath, יחס הספיגה נקבע באמצעות המשוואה שלהלן.
ערכים >>1 מציינים ספיגה משופרת עקב אינטראקציות טעינה, בעוד שערכים <1 מציינים ספיגה נמוכה. לדוגמה, solutes גדול יותר, נייטרלי כגון Neutravidin (60 kDa, pI 7) הראו RU<1 עקב הפרעה סטרית עם מטריצתהסחוס 1, בעוד solutes קטן יותר, נייטרלי צפויים להראות RU~ 1, כפי שהם מסוגלים לפזר לתוך הסחוס, להגיע שיווי משקל. לעומת זאת, אבידין (pI 10.5), המקביל הטעון בחיוב של Neutravidin, הראה RU~ 180 בסחוס1. יתר על כן, CPCs בגודל קטן (~ 2.5-4 kDa) להראותR U עד 4004. כפיצג על-ידי איור 9, יחסי ספיגה הראו תגובה התלויה בתשלום4.
איור 9: תוצאות מייצגות של ספיגת שיווי משקל של CPCs בסחוס. CPCs של טעינה נטו משתנה (+8, +14 ו- +20) ויחס הספיגה שלהם בסחוס גילו כי הספיגה אינה גדלה באופן מונוטוני עם חיוב גובר. איור זה שונה מ- Vedadghavami ואח '4 אנא לחץכאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
במקרה הפלואורסצנטיות של האמבטיה גדל לאחר שהגיע שיווי משקל, זה מצביע על כך ריכוז האמבטיה הראשונית של solute מתויג פלורסנט היה גבוה מדי. פעולה זו תגרום לפליטה להיות לכודה בתוך הפתרון לאחר העירה באמצעות קורא צלחות. כדי לפתור בעיה זו, הנמך את ריכוז האמבטיה הראשוני.
בעקבות הדמיה confocal, ערימה של תמונות הופק עם כל תמונה מראה את עומק החדירה של CPCs מתויג פלורסנט בשכבות שונות של סחוס. התמונה שהתקבלה ממרכז ההסבר הסחוס הראתה את עומק החדירה הרחוק ביותר בהשוואה לכל תמונה אחרת לאורך עובי ההסבר. באמצעות תוכנה כמו ImageJ, ערימת התמונות היה כיסוי כדי לייצר תמונה אחת המציגה את העוצמה הממוצעת של חדירה CPC. תמונות אלה בהן ניתן למצוא את ההשוואה הטובה ביותר של עומק החדירה הכולל בין נושאות סמים טעונות שונות. תגובה התלויה באישום נצפתה עבור CPCs בתוך הרקמה (איור 10). ספקים טעונים באופן נייטרלי גדול (למשל, Neutravidin) לא לחדור הרבה יותר רחוק מאשר האזור שטחי כפי שהם חסרי את היכולת להשתמש אינטראקציות תשלום כדי לגרום איגוד עםמטריקס 1. באופן דומה, טעינה חיובית גבוהה מדי תוגבל לאזור שטחי (כפי שהוצג על-ידי CPC+20 גם לאחר 24 שעות)4,עם זאת, זוהי תוצאה של כך שהספק קשור חזק מדי למטריצה; הם אינם יכולים להתבטל מהמטרה הראשונית שלהם. נשא סמים טעון בצורה אופטימלית, עם זאת, יוכל לחדור דרך לאזורים העמוקים של סחוס כפי שהוא יכול לנצל את האופי החלש וההפיך של אינטראקציות אלקטרוסטטיות (כפי שמוצג על ידי CPC + 14)4. זה מאפשר למנשא להיקשר למטרה הראשונית שלו, לא מחייב לנוע עמוק יותר דרך המטריצה, ולאחר מכן לאגד שוב מטרות נוספות בתוך הרקמה. לדוגמה, Avidin (~ 7 ננומטר קוטר, 66 kDa, pI 10.5) מחייב עם גליקוסאמינוגליקנים מטריצה טעונה שלילית (GAGs) יש קבוע דיסוציאציה (KD) של 150 μM, אשר נחשב חלש מספיק כדי לאפשר את הכריכה הפיך הדרושלחדירה בעובי מלא 1. למרות הכריכה החלשה, Avidin הראה שמירה גבוהה וספיגה בסחוס בשל הנוכחות של צפיפות גבוהה של GAGs טעונים שלילית (צפיפותמחייבת N T = 2900 μM)1. יתר על כן, כפי שהראה CPC + 8, חדירה בעובי מלא היה גלוי בתוך 4 שעות, בעוד CPC + 14 נדרש 24 שעות כדי להגיע לעומקמלא 4. לכן, נקודות זמן מרובות יש לבחור כדי להשוות ביעילות את קצב solutes שונים בעובי רקמות חודר. להבנה כמותית יותר של עומק החדירה, את העוצמות היחסיות של solutes לאורך עובי הרקמה ניתן להשיג באמצעות ImageJ.
איור 10: תוצאות מייצגות של עומק מחקרי חדירה בסחוס. CPCs של טעינה נטו משתנה (+8, +14 ו -20) ועומק החדירה שלהם בהתאמה באמצעות סחוס חשפו כריכה הפיך חלש כפי שניתן לראות על ידי CPC + 8 ו CPC + 14 הוא המפתח לחדירה לעומק מלא. עם זאת, כריכה חזקה מדי כפי שניתן לראות עבור CPC + 20 חדירה עובי מלא. איור זה שונה מ- Vedadghavami ואח '4 אנא לחץכאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
אם לא נצפה אות פלורסנט בתוך הסחוס במהלך ההדמיה, ניתן למצוא שתי בעיות; או ששטח הפנים של דיפוזיה נחסם על ידי האפוקסי, או שריכוז האמבטיה הראשוני היה נמוך מדי כדי לייצר אות פלורסנט. כדי לפתור בעיות אלה, להסיר אפוקסי עודף ממשטחי הסחוס ולהגדיל את ריכוז solute.
ניסויי תחבורת דיפוזיה ללא שיווי משקל גרמו לעקומה כפי שהראה באות 11. החלק הראשוני של העקומה מייצג דיפוזיה דרך סחוס כמו אינטראקציות מחייבות של מטריצת solute מתרחשות. עם טעינה מוגברת של המוביל, אירעה כריכת מטריצה חזקה יותר שתסתיים יגיעו לתא במורד הזרם. ברגע שslutes חדר דרך עומק הסחוס והגיע לתא במורד הזרם, עלייה במדרון של העקומה נצפתה כמו קריאת פלואורסץ גדל לאורך זמן. חלק שני זה של העקומה הגיע למדרון יציב, המייצג דיפוזיה במצב יציב. קו משיק צויר במדרון מצב יציב כדי לקבוע את הזמן שלוקח להגיע לפיזור מצב יציב (τLag), המסומןעל-ידי יירוט ה-x. המפזרות האפקטיבית (DEFF), קצבההתפלגות של CPCs כאשר קיימות אינטראקציות מחייבות בסחוס, חושבהבאמצעות השהיה ועובי ההשתילה (L) כדלקמן:
לאחר העברה של 20 μL של פתרון מהזרם במעלה הזרם לתא במורד הזרם, נצפתה עלייה בפלואורסץ; עוצמת הפלואורסצסצ'ן המייצבת שנוצרה שימשה לקורלציה לריכוז. הריכוז של CPCs במורד הזרם (CD)מנורמל לריכוז במעלה הזרם (CU)היה אז זומם נגד הזמן. השיפוע של עקומה זו שימש להערכת קצב דיפוזיה במצב יציב כאשר כל אתרי האיגוד בסחוס מאוכלסים (DSS)כפי שמדבר להלן. ערך זה היה כולל את מקדם החלוקה למחיצות. כאן, באופן כללי, VD ו- A מייצגים נקבוביות סחוס (~ 0.8), נפח תא במורד הזרם (2 מ"ל) וחוצה חתך של סחוס (0.1257 ס"מ2),בהתאמה. בטבלה 1 ניתן למצוא ערכי DEFF ו- DSS המחושבים מניסווני תעבורה שאינם שיווי משקל עבור CPCs.
איור 11: תוצאות מייצגות של מחקרי דיפוזיה שאינם שיווי משקל באמצעות סחוס. עקומת דיפוזיה CPC+8, המתווה כריכוז במורד הזרם (CD)מנורמל לריכוז במעלה הזרם (CU),כנגד הזמן. קו משיק הנמשך במדרון במצב יציב (כחול) חוצה את ציר ה- x ב- τLag, ששימש לחישוב DEFF. השיפוע של המשיק שימש לחישוב DSS. בדיקת ספייק (אפור) מייצג את הריכוז המיוצב בתא במורד הזרם לאחר העברה של 20 μL CPC פתרון מהמעלה למורד הזרם, משמש לנרמול ריכוז במורד הזרם. איור זה שונה מ- Vedadghavami ואח '4 אנא לחץכאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
אם הפלואורסצנטיות במורד הזרם לא מצליחה להתייצב לפני הוספת פפטיד מתויג פלורסנטית לתא במעלה הזרם, סביר להניח שיש שאריות solute תקוע על הקירות מניסוי קודם. במקרה זה, לפרק את התא ולשטוף עם סבון וsonicate. אם יש עלייה בפלואורסצנטיות במורד הזרם מיד לאחר התוספת של פפטיד מתויג פלורסנטית לתא במעלה הזרם, זה יכול להצביע על כך דליפה קיימת. זה ידרוש התעברות מחדש של תא התעבורה ובדיקה מחדש של דליפות. אם אות הפלואורסץ במורד הזרם מגיע לרמה בניגוד לעלייה במצב יציב, הוא מצביע על אובדן אפשרי של ריכוז בתא במעלה הזרם, שנגרם ככל הנראה על ידי סולוטות הנדבקות לקירות התא. תוספת של 0.005% w / v סרום חזיר אלבומין (BSA) לתא במעלה הזרם יכול לעזור למנוע דבק.
| CPC (CPC) | DEFF (ס"מ 2/s) | DSS (ס"מ 2/s) |
| CPC+8 | 1.7 ± 0.4 x 10-7 | 5.8 ± 0.0 x 10-5 |
| CPC+14 | 9.8 ± 0.2 x 10-8 | 2.6 ± 1.2 x 10-5 |
| CPC+20 | 4.7 ± 0.1 x 10-8 | 1.4 ± 0.9 x 10-5 |
טבלה 1: ערכי נציג DEFF ו- D SS עבור תעבורת CPC באמצעות סחוס. טבלה זו שונתה מ- Vedadghavami ואח'4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות והפרוטוקולים המתוארים כאן משמעותיים לתחום של אספקת סמים ממוקדת לרקמות טעונות באופן שלילי. בשל הצפיפות הגבוהה של aggrecans טעונים שלילית נוכח ברקמות אלה, נוצר מחסום, ובכך למנוע תרופות מלהגיע לאתרי היעד הסלולרי שלהם אשר נמצאים עמוק בתוך המטריצה. כדי להתמודד עם האתגר הבולט הזה, ניתן לשנות תרופות כדי לשלב נשאי סמים טעונים חיובית אשר יכול לשפר את קצב ההובלה, ספיגה וכריכה שלתרופות בתוך רקמה 1,,3,,4,,14,,15,,16,17,18,,19. כפי שמוצג כאן עם השיטות המפותחות, התחבורה של נשאי סמים טעונים חיובית יכולה להיות מאופיינת כדי לקבוע את ספיגת שיווי המשקל, עומק החדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל. עיצבנו בהצלחה שלוש הגדרות ניסיוניות נפרדות שניתן לנצלן להערכת ההובלה באמצעות תפוצת סחוס.
לאפיון מוצלח של תעבורה, יש לעקוב אחר שלבים קריטיים בהליך. השימוש מעכבי פרוטאז (PIs) בכל הפתרונות הוא קריטי לאפיון מדויק של הובלה תוך סחוס של CPCs באמצעות סחוס כפי שהם מתפקדים כדי למנוע עיכול אנזימטי של חלבוניםברקמה 20. לכן, אם לא נעשה שימוש, רכיבי מטריצת סחוס כגון אגרקנים קולגן יכולים להתחיל להשפיל ולהפרש לתוך האמבטיה שמסביב במהלך ניסויים. זה יכול מאוד להוריד את FCD של סחוס, הפחתת מספר אתרי איגוד מבוססי תשלום במטריקס הסחוס. הרקמה שנוצרה כבר לא תהיה נציגה של סחוס בריא. לעומת זאת, הניסויים שהוצגו יכולים לשמש גם כדי להעריך את ההובלה של CPCs באמצעות סחוס דלקת פרקים שבו התוכן aggrecan הוא הרבה יותר נמוך כפי שניתן לראות ב OA20. באמצעות טפטפסין או Chondroitinase ABC לעכל extilage explants, צפיפות aggrecan ניתן לשלוט, ובכך לאפשר הערכה של תחבורה ואספקת סמים במצב מחלה. במקרה זה, איגוד מבוסס תשלום עלול להיות בסכנה, בעוד סוגים אחרים של אינטראקציות כגון קשרי מימן ואינטראקציות הידרופוביות סינרגטית לשפר תוך סחוס איגודושמירה 4.
שמירה על לחות של explant הסחוס הוא המפתח במהלך הכנת מדגם וניסויים. התייבשות באמצעות חשיפה לאוויר במשך יותר מ 6 דקות כבר הראו לגרום נזק בלתי הפיך סחוס מתוך21. כתוצאה מכך, מתרחשים שינויים בלתי צפויים בהובלה של CPCs. באופן דומה, אידוי של אמבטיות CPC יכול לגרום להתייבשות explant; ניתן למנוע זאת על ידי איטום עם סרט גמיש. עם זאת, אידוי אמבטיה לא רק יכול לגרום להתייבשות explant, אבל זה יכול גם לגרום לשינוי בריכוז האמבטיה CPC, וכתוצאה מכך קריאות פלורסנט שווא. עוד חשוב לציין כי עומק מחקרי חדירה דורשים חתך רוחב דק (~ 100 μM) של סחוס כדי להיות בתמונה. זוהי טכניקה הדורשת תרגול כך שניתן יהיה להשיג פרוסות של עובי אחיד. זה גם קריטי עבור ניסויים דיפוזיה שאינה שיווי משקל, כי תא התחבורה להיות שקוף כך מדידות פלורסנט בזמן אמת ניתן להשיג עם ספקטרופוטומטר מעוצב בהתאמה אישית. עם זאת, כחלופה, aliquots מהתא במורד הזרם ניתן להשיג ולהעריך עבור פלואורסצסצנציה באמצעות קורא צלחת או קורא ספקטרופוטומטרי אחר.
השיטות המוצגות כאן הן בעלי משמעות רבה כאשר הן מספקות שיטה בקנה מידה ספסל לאפיון הובלת נושאות סמים דרך הסחוס על מנת לחזות טוב יותר את שימור תרופות vivo ויעילות ביולוגית לטווח ארוך. לאחרונה, מסגרת אלמנט סופית לדינמיקת נוזלים חישוביים יושמה למדידת הובלה סולט באמצעות מדיה נקבובית22. Arbabi ואח ' השתמשו בניתוח אלמנט סופי בשילוב עם נתונים ניסיוניים שהתקבלו הדמיית מיקרו CT כדי למדוד שיעורי דיפוזיה של סוכן ניגוד טעון שלילית, ioxaglateבסחוס 23,24. יתר על כן, באמצעות רב-אזור, מודל רב-phasic, מקדמי דיפוזיה של ioxaglate באזורים שונים של סחוס נמדדו יחד עם FCD של כל אזור. בעוד הדמיית מיקרו-CT יכול לשמש רק עם סוכני ניגוד, ההתקנה הניסיונית שלנו מאפשרת אפיון של הובלה של כל התרופות ונשאי סמים שניתן לתייג פלואורסצנט. עם זאת, מידול החישוב המתקדם המשמש את Arbabi ואח' מספק ניתוח מקיף יותר של התנהגות התחבורה solute, ניתן להחיל על שיטותניסיוניות שלנו 13,24.
מגבלה של השיטה המוצגת היא כי ההתקנה הניסיונית עבור כל ניסוי הובלה solute אינו מקיף באופן מלא את סביבת vivo. תגובות ביולוגיות וכוחות מכניים ודינמיים המתרחשים בתוך המפרק הטבעי אינם מדומים כאן. כדי לשלב כוחות אלה, ניתן לשנות את תא ההובלה עם בוכנה כדי לדמות דפוסי זרימה קפולטיביים המתרחשים במהלך פעילויות כהליכה וריצה. עם זאת, בעוד זרימה קנובית יכולה להגדיל את ספיגה על ידי 2-פי, ספיגה עקב אינטראקציות אלקטרוסטטיות יכול להגדיל 100-400x. לפיכך, התענוונים הניסיוניים המוצגים כאן מספקים הערכה טובה להובלה וספיגהעל בסיס תשלום 25. יתר על כן, מאז מפרק הברך מכיל באופן טבעי נוזל synovial, זה יכול לשמש בפתרונות אמבטיה עבור ניסויי תחבורה במקום 1x PBS-PI. ההערכה היא כי הספיגה של נשאים cationic בסחוס תפחת נוזל synovial לעומת 1x PBS בשל הנוכחות של רשתות hyaluronan עם קבוצות carboxyl טעונות שלילית בנוזל synovial. ייתכן כי נושאות cationic באופן תחרותי לקשור עם שרשראות hyaluronan של נוזל synovial בנוסף GAGs של סחוס. עם זאת, הצפיפות של קבוצות טעונות שלילית גבוהה משמעותית בסחוס בהשוואה לנוזל סינוביאלי, בשל הנוכחות של שתי רשתות היאלורונאן carboxylated טעונות שלילית וGAGs sulfatedבסחוס 15. לכן, למרות הספיגה בסחוס בנוכחות נוזל synovial יהיה נמוך יותר מאשר 1x PBS, הוא עדיין צפוי לשמור על ספיגה תוך סחוס גבוהה. ב vivo, Avidin הראה ספיגה תוך סחוס גבוהה הן חולדה סחוס ארנב בנוכחות נוזל synovial16,26. יתר על כן, Avidin הראה ספיגה גבוהה ושמירה בסחוס עד 2 שבועות לאחר הזרקת תוך-פרקים בטרנס-רצועה צולבת קדמית ארנבמודל 27.
השימוש בסחוס בקר במערכת זו מאפשר ייצוג מדויק יותר של חדירה לסמים באמצעות סחוס בשל הדמיון שלה לסחוס אנושי במונחים של עובי (~ 1.5-2 מ"מ)28,,29. הובלה של solutes דרך הסחוס יכול להשתנות עם עובי; נושאות סמים עשויות לדרוש פחות אינטראקציות מחייבות כדי לחדור באופן מלא דרך עכברים או סחוס חולדה שהם הרבה יותר דקים, עם זאת ניתן לעכב באופן משמעותי חודר עמוק יותר בסחוס אנושיעבה יותר 1. יתר על כן, למרות ניסויים אלה נועדו לאפיין תחבורה solute בתוך הסחוס, שיטות אלה ניתן לשנות ולהישם על רקמות טעונות שלילית אחרים כגון מניסקוס, קרנית והומור זגוגית של העין, ואת פולפוס גרעין של דיסקים בין חוליות. המתודולוגיות של ניסויים שתוכננו כאן הן יתרון כמו הממדים של גופי ותאי תחבורה ניתן להתאים על פי גודל ומינים של רקמה. ההשפעה של שיטות אלה היא נפוצה, מוגבלת לא רק לנשאים סמים אלא גם להערכה של הובלה של תרופות ותרופות נושאות סמים בהתייחדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי משרד ההגנה של ארצות הברית באמצעות תוכניות מחקר רפואי בהכוונון הקונגרס (CDMRP) תחת חוזה W81XWH-17-1-0085, והמכון הלאומי לבריאות R03 EB025903-1. AV מומן על ידי המכללה להנדסה דיקן מלגות באוניברסיטת נורת'איסטרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18x18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
References
- Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
- Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, Pt 2 335-347 (1976).
- Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
- Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
- Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238 (2019).
- Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898 (2020).
- Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
- Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
- Martel-Pelletier, J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
- Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).
- Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. Progress in intra-articular therapy. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).
- He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
- Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
- Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882 (2020).
- Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
- Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
- Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
- Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
- Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
- Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).
- Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).
