Summary
Denne protokollen bestemmer likevektopptak, dybde av penetrasjon og ikke-likevekt diffusjonshastighet for kationiske peptid bærere i brusk. Karakterisering av transportegenskaper er avgjørende for å sikre en effektiv biologisk respons. Disse metodene kan brukes for å designe en optimalt ladet narkotika bærere for målretting negativt ladet vev.
Abstract
Flere negativt ladede vev i kroppen, som brusk, presenterer en barriere for målrettet legemiddellevering på grunn av deres høye tetthet av negativt ladede aggrekaner og krever derfor forbedrede målrettingsmetoder for å øke deres terapeutiske respons. Fordi brusk har en høy negativ fast ladningstetthet, kan legemidler endres med positivt ladede legemiddelbærere for å dra nytte av elektrostatiske interaksjoner, noe som åpner for forbedret intrabrusk narkotikatransport. Å studere transport av legemiddelbærere er derfor avgjørende for å forutsi effekten av legemidler for å indusere en biologisk respons. Vi viser utformingen av tre eksperimenter som kan kvantifisere likevektsopptaket, dybden av penetrasjon og ikke-likevektsdiffusjonshastighet av kationiske peptidbærere i bruskekplanter. Likevektopptakseksperimenter gir et mål på den løse konsentrasjonen i brusk i forhold til det omkringliggende badet, noe som er nyttig for å forutsi potensialet til en legemiddelbærer for å øke terapeutisk konsentrasjon av legemidler i brusk. Dybde av penetrasjonsstudier ved hjelp av konfokal mikroskopi gir mulighet for visuell representasjon av 1D-solute diffusjon fra overfladisk til dyp sone av brusk, noe som er viktig for å vurdere om solutes når sine matrise- og cellulære målsteder. Ikke-likevektsdiffusjonshastighetsstudier ved hjelp av et spesialdesignet transportkammer gjør det mulig å måle styrken av bindende interaksjoner med vevsmatrisen ved å karakterisere diffusjonshastigheten til fluorescerende merkede solutes over vevet; Dette er gunstig for å designe bærere med optimal bindingsstyrke med brusk. Sammen gir resultatene fra de tre transporteksperimentene en retningslinje for å utforme optimalt belastede legemiddelbærere som drar nytte av svake og reversible ladeinteraksjoner for søknader om legemiddellevering. Disse eksperimentelle metodene kan også brukes til å evaluere transport av narkotika og narkotika-narkotika bærer konjugater. Videre kan disse metodene tilpasses for bruk i målretting mot andre negativt ladede vev som menisk, hornhinnen og glasslegemet humor.
Introduction
Legemiddellevering til negativt ladet vev i kroppen er fortsatt en utfordring på grunn av manglende evne til narkotika å trenge dypt inn i vevet for å nå celle og matrise mål nettsteder1. Flere av disse vevene består av tettpakkede, negativt ladede aggrekaner som skaper en høy negativ fast ladningstetthet (FCD)2 i vevet og fungerer som en barriere for levering av de flestemakromolekyler 3,4. Men med hjelp av positivt ladede legemiddelbærere, kan denne negativt ladede vevsbarrieren faktisk konverteres til et legemiddeldepot via elektrostatiske ladeinteraksjoner for vedvarende legemiddellevering1,,5,,6,7( figur1).
Figur 1: Ladebasert intrabrusklevering av CPC-er. Intraartikulær injeksjon av CPC-er i kneleddet. Elektrostatiske interaksjoner mellom positivt ladede CPC-er og negativt ladede aggrekanske grupper muliggjør rask og full dybdegjennomtrengning gjennom brusk. Dette tallet er endret fra Vedadghavami et al4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Nylig ble kationiske peptidbærere (CPC) designet med sikte på å skape små kationiske domener som er i stand til å bære større størrelse terapeutiske midler for levering til negativt ladetbrusk 4. For effektiv legemiddellevering til brusk for behandling avutbredte 8,,9 og degenerative sykdommer som slitasjegikt (OA)10, er det avgjørende at terapeutiske konsentrasjoner av legemidler trenger dypt inn i vevet, hvor et flertall av bruskcellene (kondrocytter)ligger 11. Selv om det er flere potensielle sykdomsmodifiserende legemidler tilgjengelig, ingen har fått FDA godkjenning fordi disse ikke er i stand til effektivt å målrettebrusk 12,13. Derfor er evaluering av transportegenskapene til legemiddelbærere nødvendig for å forutsi effektiviteten av legemidler for å indusere en terapeutisk respons. Her har vi designet tre separate eksperimenter som kan benyttes for å vurdere likevektsopptaket, dybden av penetrasjon og ikke-likevektsdiffusjonshastighet av CPC4.
For å sikre at det er en tilstrekkelig legemiddelkonsentrasjon i brusk som kan gi en optimal terapeutisk respons, ble opptakseksperimenter designet for å kvantifisere likevekt CPC konsentrasjon ibrusk 4. I denne designen, etter en likevekt mellom brusk og det omkringliggende badet, kan den totale mengden solutgående inne i brusk (enten bundet til matrisen eller gratis) bestemmes ved hjelp av et opptaksforhold. Dette forholdet beregnes ved å normalisere konsentrasjonen av solutes inne i brusk til likevektbadet. I prinsippet ville nøytrale solutes, hvis diffusjon gjennom brusk ikke er assistert av ladeinteraksjoner, ha et opptaksforhold på mindre enn 1. Omvendt viser kationiske solutes, hvis transport er forbedret via elektrostatiske interaksjoner, et opptaksforhold som er større enn 1. Men, som vist med CPC, bruk av en optimal positiv ladning kan resultere i mye høyere opptaksforhold (større enn 300)4.
Selv om høy legemiddelkonsentrasjon i brusk er viktig for å oppnå terapeutisk nytte, er det også avgjørende at legemidler sprer seg gjennom bruskens fulle tykkelse. Derfor er studier som viser dybden av penetrasjon nødvendig for å sikre at legemidler når dypt inne i brusk slik at matrisen og cellulære målsteder kan nås, og dermed gi en mer effektiv terapi. Dette eksperimentet ble designet for å vurdere enveis diffusjon av solutes gjennom brusk, simulere diffusjon av narkotika i brusk etter intra-ledd injeksjon in vivo. Fluorescensavbildning ved hjelp av konfokal mikroskopi gjør det mulig å evaluering av dybden av penetrasjon i brusk. Netto partikkelladning spiller en nøkkelrolle i å moderere hvordan dype legemidler kan spre seg gjennom matrisen. En optimal nettoladning basert på et vev FCD er nødvendig for å tillate svake reversible bindende interaksjoner mellom kationiske partikler og anionisk vevmatrise. Dette innebærer at enhver interaksjon er svak nok slik at partikler kan kobles fra matrisen, men reversibel i naturen slik at den kan binde seg til et annet matrisebindende sted dypere ivevet 4. Omvendt kan overdreven positiv nettoladning av en partikkel være skadelig mot diffusjon, da for sterk matrisebinding forhindrer løsrivelse av partikler fra det opprinnelige bindingsstedet i brusksonen. Dette ville resultere i en utilstrekkelig biologisk respons som et flertall av målstedene ligger dypt inne ivevet 11.
For ytterligere å kvantifisere styrken av de bindende interaksjonene, er analyse av narkotikadiffusjonshastigheter gjennom brusk en fordel. Ikke-likevektsdiffusjonsstudier tillater sammenligning av sanntidsdiffusjonshastigheter mellom forskjellige solutes. Som narkotika diffuse gjennom overfladiske, midtre og dype soner av brusk, kan tilstedeværelsen av bindende interaksjoner i stor grad endre diffusjonshastigheten. Når bindende interaksjoner er tilstede mellom legemidler og bruskmatrisen, er det definert som effektiv diffusivitet (DEFF). I dette tilfellet, når alle bindende steder har blitt okkupert, er diffusjonsraten av legemidler styrt av steady-state diffusjon (DSS). Sammenligning mellom DEFF av forskjellig solute bestemmer den relative bindende styrken til solutes med matrisen. For en gitt solute, hvis DEFF og DSS er innenfor samme størrelsesorden, innebærer det at det er minimal binding tilstede mellom stoffet og matrisen under diffusjon. Men hvis DEFF er større enn DSS, finnes det betydelig binding av partikler til matrise.
De utformede eksperimentene tillater individuelt karakterisering av solute transport gjennom brusk, men en helhetlig analyse inkludert alle resultater er nødvendig for å designe en optimalt ladet legemiddelbærer. Den svake og reversible karakteren av ladeinteraksjoner styrer partikkeldiffusjonshastigheten og gir høy likevektsopptak og rask full dybdegjennomtrengning gjennom brusk. Gjennom likevektsopptakseksperimenter bør vi se etter bærere som viser høyt opptak som følge av ladeinteraksjoner som kan verifiseres ved hjelp av ikke-likevektsdiffusjonshastighetsstudier. Disse bindingsinteraksjonene bør imidlertid være svake og reversible i naturen for å tillate full tykkelsesinntrengning av det løse gjennom brusk. En ideell legemiddelbærer ville ha en optimal ladning som muliggjør sterk nok binding for opptak og høye intra-brusk narkotikakonsentrasjoner, men ikke for sterk som å hindre full tykkelse diffusjon4. De presenterte eksperimentene vil bistå i designegenskapene for ladebaserte vev rettet mot legemiddelbærere. Disse protokollene ble brukt til å karakterisere CPC transport gjennom brusk4, men disse kan også brukes på en rekke narkotika og narkotika bærere gjennom brusk og andre negativt ladet vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Universitetsgodkjenninger ble innhentet for å gjennomføre eksperimenter med dødt vev. Storfe ledd ble hentet kommersielt fra et slakteri.
1. Brusk explant ekstraksjon
- Bruk en skalpell (#10 blad), kutt og fjern fett, muskler, leddbånd, sener og alt annet bindevev for å eksponere brusk fra femoropatellar sporet av storfe kneledd.
- Bruk 3 mm og 6 mm dermal slag, gjør vinkelrett slag inn i brusk for å trekke ut sylindriske plugger. Plasser pluggene umiddelbart i individuelle brønner av en 48-brønnsplate som inneholder 500 μL 1x fosfatbufret saltvann (PBS) supplert med 1% v/ v antibiotika-antimykotisk.
- Plasser den overfladiske siden av en bruskplugg vendt ned i en brønn i skjærearmaturen (figur 2). Bruk et barberblad til å skjære pluggen langs overflaten av skjærearmaturen for å få en 1 mm tykk brusk explant som er inkludert i den overfladiske sonen. Gjenta for hver bruskplugg.
- Oppbevar brusk explants individuelt i polypropylenrør som inneholder 500 μL 1x PBS supplert med proteasehemmere (PBS-PI, 1 PI mini-tablett per 50 ml 1x PBS) ved -20 °C.
- Før du gjennomfører hvert av følgende transporteksperimenter, kan du tine de ekspanderende hetteglassene i 30 min i et 37 °C vannbad.
Figur 2: Spesialdesignet kuttingsarmatur. Design parametere av rustfritt stål kutte ligaen brukes for kutting brusk explants av 3 og 6 mm diameter. Plastinnsatser av varierende tykkelse ble plassert inne i brønner for å justere tykkelsen på skiver explants. Rustfritt stål sylindrisk pin av <1 mm diameter ble brukt til å skyve utstrømning ut av armaturen. Alle numeriske verdier presenteres i mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Likevekt opptak av CPC i brusk
- Forsiktig dab brusk explants (3 mm dia. X 1 mm tykk.) med en delikat oppgave tørk for å fjerne overflødig 1x PBS fra explant overflaten. Ved hjelp av en balanse, registrer raskt den våte vekten av hver explant og deretter umiddelbart plassere i et 1x PBS-bad for å forhindre dehydrering.
- Klargjør 30 μM-oppløsninger (300 μL per eksplant) med fluorescerende merkede CPC-er i 1x PBS-PI. Bruk RNase-frie polypropylenrør for rekonstituering.
- I en 96-brønns plate, pipette 300 μL av hver 30 μM CPC-løsning i separate brønner. Unngå å bruke brønner nær kanten av platen for å hindre fordampning. Bruk en slikkepott til å overføre hver eksekk til løsningen som inneholder brønner.
- Fyll omkringliggende brønner med 300 μL 1x PBS og dekk brønnplaten med lokk. Forsegle kantene på platen med fleksibel film for å minimere fordampning.
- Inne i en 37 °C inkubator, plasser platen på en plateshaker for å begrense partikkelsedimenteringen. Inkuber i 24 timer under skånsom rotasjon (50 o/min med en 15 mm bane) for å tillate likevektsopptak av CPC-er i brusk (figur 3).
- Generer en standardkurve for korrelasjon av fluorescens til CPC-konsentrasjon
- Forbered seriefortynnende CPC-løsninger fra 30 μM – 0 μM (10 2 ganger fortynninger) i 1x PBS-PI i polypropylenrør. Sørg for at det finnes minst 500 μL av hver fortynning.
- Tilsett 200 μL av hver fortynning til påfølgende brønner i en svart 96-brønnsplate. Dupliser i en annen rad for å øke utvalgsstørrelsen.
- Få fluorescensavlesninger av hver prøve ved hjelp av en plateleser ved eksitasjons- og utslippsbølgelengdene til den fluorescerende etiketten ved hjelp av en plateleser.
- Plot fluorescens lesing vs CPC konsentrasjon og utlede en ligning for den lineære delen av kurven.
MERK: For å begrense variasjonen i fluorescensavlesninger, inkuber CPC-lagerløsningen under samme forhold som prøveplaten før generering av standardkurven.
- Etter 24 timer inkubasjon, samle likevektbadet fra hver brønn i separate polypropylenrør.
- Overfør 200 μL av hver oppløsning til separate brønner av en svart 96-brønnsplate. Få fluorescensavlesninger av hver prøve under de samme fluorescerende innstillingene som for standardkurven. Om nødvendig må prøven i 1x PBS-PI for å sikre at avlesningene faller innenfor den lineære delen av standardkurven.
Figur 3: Skjematisk av likevektopptak eksperimenter. Brusk explants (3 mm dia. x 1 mm tykk) ble plassert i individer brønner i en 96-brønns plate som inneholder fluorescerende merket CPC løsning. Etter 24 h CPCer ble opptatt av brusk, og dermed redusere fluorescens av det omkringliggende badet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Dybde av penetrasjon av CPC i brusk
- Klargjør 30 μM-oppløsninger (300 μL per eksplant) med fluorescerende merkede CPC-er i 1x PBS-PI. Bruk RNase-frie polypropylenrør for rekonstituering.
- Bruk en skalpell til å kutte brusk explants (6 mm diameter x 1 mm tykkelse) i to for å lage halvdisker. Hold explant hydrert med et lag på 1x PBS-PI mens du kutter.
- Lim en halv disk explant inn i midten av en brønn av den spesialdesignede 1-dimensjonale transportkammeret ved hjelp av en epoxy (Figur 4, Figur 5). Sørg for at epoksy påføres den omkrets (buede) siden av eksplossen. Fjern overflødig lim fra brønnen for å hindre kontakt med diffusjonsoverflaten av brusk og noter den overfladiske siden av explant.
- Tilsett 80 μL 1x PBS-PI på begge sider av ekspensen. Pipette væsken opp og ned fra den ene siden av hellet for å se etter lekkasje til den andre siden. Hvis det oppstår lekkasje, juster uttrlektingen på nytt og påfør epoksy etter behov.
- Bytt ut 1x PBS-PI fra siden som vender mot den overfladiske overflaten av brusk (oppstrøms) med 80 μL på 30 μM CPC-oppløsning. Vedlikehold 80 μL 1x PBS-PI på siden mot den dype sonen av brusk (nedstrøms).
- Plasser transportkammeret forsiktig i en dekselbar beholder. Dekk bunnen av beholderen med et lag 1x PBS for å unngå fordampning av løsninger. Sørg for at det ikke er direkte kontakt mellom løsninger fra oppstrøms og nedstrøms kamre.
- Plasser den dekkede beholderen på en plateshaker for å begrense partikkelsedimentering. Inkuber i enten 4 eller 24 timer ved romtemperatur under mild rotasjon (50 rpm med en 15 mm bane).
- Etter inkubasjon, fjern utrenskningen fra kammeret og kutt ~ 100 μm skive fra midten av explant.
MERK: Dette tverrsnittet er inkludert de overfladiske, midtre og dype sonene av brusk. - Plasser skiven mellom et glasssklie og en dekkglass. Hydrer skiven med et lag på 1x PBS-PI.
- Ved 10x forstørrelse, bilde gjennom hele tykkelsen av stykket for å få z-stabel med fluorescerende bilder ved hjelp av et konfokal mikroskop.
- Ved hjelp av ImageJ projisere den gjennomsnittlige intensiteten av bildene i z-stakken for å bestemme dybden av penetrasjon av CPC i brusk.
- Åpne bildestakken ved å klikke på Fil | Åpne.
- Klikk på 'Bilde' på oppgavelinjen og klikk Bilde | Stabler | Z Prosjekt fra rullegardinmenyen.
- Skriv inn skivetall fra 1 til den siste biten. Velg 'Gjennomsnittlig intensitet 'under Projeksjonstype . Projection Type Klikk 'OK.'
Figur 4: Spesialdesignet 1D-transportkammer. Designparametere for PMMA 1D transportkammer med 6 individuelle brønner. Alle numeriske verdier presenteres i mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Skjematisk dybde av penetrasjonsstudier. Brusk explants (6 mm diameter x 1 mm tykkelse) ble kuttet i to og festet til sentrum av 1D diffusive transportbrønner. Fluorescerende merket CPC-løsning ble lagt til siden av brønnen i kontakt med den overfladiske sonen (SZ) av brusk. 1x PBS-PI ble lagt til siden av brønnen i kontakt med den dype sonen (DZ) av brusk. Etter diffusjon ble et tverrsnitt av brusk (3 mm x 1 mm) avbildet ved hjelp av konfokal mikroskopi. Denne figuren er endret fra Vedadghavami et al.4 og Bajpayee et al.3Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Ikke-likevektsdiffusjonshastighet for CPC-er i brusk
- Før de to halvdelene av det spesialdesignede transportkammeret (figur 6) sammen for å montere og lukke kammeret. Bruk skiver, muttere og bolter for å tett lukke kammeret med en skiftenøkkel.
MERK: Transportkammeret må være gjennomskinnelig for ikke å forstyrre fluorescerende avlesninger. Transportkamrene som brukes i denne protokollen er laget av polymetylmetakrylat (PMMA). - Coat det indre rommet av kammeret med 0,5% w / v ikke-fett storfe melk løsning i 1x PBS (2 ml for hvert kammer) i 15 min for å hindre ikke-spesifikk binding av CPC til kammervegger. Skyll deretter kammeret med 1x PBS (2 ml for hvert kammer).
- Bruk det spesialdesignede skjærearmaturen (figur 2) og et barberblad til å skjære en bruskutvinning med 6 mm diameter (tverrgående plan) til en tykkelse på 500-800 μm, inkludert den overfladiske sonen. Hold explant hydrert med 1x PBS.
- Bruk hammerdrevne og dermale slag til å lage pakninger fra gummiplater som vist i figur 7.
- Monter hvert halve transportkammer for å inkludere 1 stor gummipakning, 1 PMMA-innsats og 1 liten gummipakning hver. Plasser explant i brønnene av plastinnsatsen, med overfladisk sone vendt mot oppstrømskammeret. Smør de to halvdelene sammen for å fullføre monteringen og skru godt ved hjelp av en skiftenøkkel (figur 7).
- Fyll oppstrømskammeret med 2 ml 1x PBS-PI og følg nedstrømskammeret for lekkasje av væske fra oppstrømskammeret. Hvis det er lekkasje, monteres kammeret igjen, justerer pakningsposisjonen og skruenes tetthet. Hvis ingen lekkasje, fyll nedstrømskammeret med 2 ml 1x PBS-PI også.
- Tilsett en mini-stir bar til både opp og nedstrøms kamre og plasser kammeret på en røreplate. Juster kammeret slik at laseren fra spektrofotometeret er fokusert mot midten av nedstrømskammeret. Plasser signalmottakerdelen av spektrofotometeret bak nedstrømskammeret (figur 8).
MERK: Laseren og mottakeren av spektrofotometeret må være utstyrt med de riktige filtrene for å opphisse, avgi og overføre signaler fra det fluorescerende merkede proteinet. Beskytt transportkammeret mot lys ved hjelp av en svart boks under eksperimentering for å unngå forstyrrelser i fluorescenssignalet. Det er best praksis å forsegle åpningene på toppen av kammeret med fleksibel film for å unngå fordampning. - Samle sanntid nedstrøms fluorescens utslipp avlesninger og sikre et stabilt signal i minst 5 min.
MERK: Aliquots fra nedstrømskammeret kan fås og vurderes for fluorescens ved hjelp av en plateleser hvis et spesialdesignet spektrofotometer eller gjennomskinnelig transportkammer ikke er tilgjengelig. - Pipette et forhåndsberegnet volum av lagerløsning av fluorescerende kodede CPC-er inn i oppstrømskammeret for å sikre en endelig konsentrasjon på 3 μM inne i oppstrømskammeret. Vær oppmerksom på nedstrøms fluorescenssignalet og la det være mulig å transportere for å oppnå en jevn økning i skråningen.
MERK: En tykkere brusk explant vil kreve lengre tid for å nå steady-state. - Når steady state er nådd, ta 20 μL fra oppstrømskammeret og legg til nedstrøms kammeret ("pigg test").
MERK: En pigg i nedstrøms fluorescens vil bli observert. Dette vil tillate sammenheng mellom fluorescensmålinger og CPC-konsentrasjon. - Samle nedstrøms fluorescensmålinger i sanntid.
Figur 6: Spesialdesignet ikke-likevektsdiffusjonstransportkammer. Design parametere av PMMA ikke-likevekt diffusjon transportkammer. Kammeret må være gjennomskinnelig for ikke å forstyrre fluorescensavlesninger. Det komplette transportkammeret besto av to identiske halvdeler av armaturen som ble vist. To sylindriske pinner i rustfritt stål (~ 2,94 mm diameter, ~ 18 mm lange) var nødvendig for å sikre justering og fullstendig lukking av halvdelene av kammeret. Fire identiske spor for 6-32 trådskruer ble laget i hvert hjørne av kammeret for skruetett montering. Alle numeriske verdier presenteres i millimeter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Montering av ikke-likevektsdiffusjonstransportkammer. Designparametere for (A) svart PMMA setter inn og (B) store og små gummipakninger. Tykkelsen på gummipakninger ble justert for å sikre tett lukking av kammeret. Alle numeriske verdier presenteres i mm. (C) Skjematisk som viser rekkefølgen på monteringen for to halvdeler av transportkammeret med brusk explant plassert i midten. SZ indikerer overfladisk sone av brusk som var vendt mot oppstrømskammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Skjematisk av ikke-likevekt diffusjon eksperimenter. Brusk explants (6 mm diameter x 1 mm tykkelse) ble plassert i midten av transportkammeret med overfladisk overflate vendt mot oppstrømskammeret. Både opp og nedstrøms sider av kammeret ble fylt med 1x PBS-PI og blandet ved hjelp av en mini røre bar. Med en laser rettet mot nedstrøms kammeret for å samle fluorescerende avlesninger, fluorescerende merket CPC løsning ble lagt til oppstrøms kammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter likevektsabsorpsjon av CPC-er ved brusk, reduseres fluorescensen i badekaret når den løse har blitt påvirket av vevet. Men hvis fluorescensverdien av det endelige badet forblir lik den første, indikerer det at det ikke er noe / minimalt oppslutt opptak. En annen bekreftelse på solute opptak er hvis vevet har synlig endret farge til fargen på fluorescerende fargestoff. Det kvantitative opptaket av solutes i brusk ble bestemt ved hjelp av opptaksforholdet (RU) etter at fluorescensverdiene ble konvertert til konsentrasjon ved hjelp av standardkurven. Ved hjelp av den første badkonsentrasjonen (CBath,i) og likevektsbadkonsentrasjonen (CBath)ble den oppsnevrne konsentrasjonen i brusk (CBrusk)beregnet som følger der VBath=300 μL:
Ved hjelp av CBrusk og CBath bleopptaksforholdet bestemt ved hjelp av ligningen nedenfor.
Verdier >>1 angir forbedret opptak på grunn av ladeinteraksjoner, mens verdier <1 indikerer lavt opptak. For eksempel har større, nøytrale solutes som Neutravidin (60 kDa, pI 7) vist RU<1 på grunn av sterisk hindrer med bruskmatrisen1, mens mindre, nøytrale solutes forventes å vise RU~ 1, da de er i stand til å spre seg inn i brusk, og når likevekt. I motsetning har Avidin (pI 10,5), den positivt ladede motparten av Neutravidin, vist en RU~ 180 ibrusk 1. Videre viser små CPC-er (~ 2,5-4 kDa) en RU opp til 4004. Som vist av figur 9viste opptaksforholdene et ladeavhengig svar4.
Figur 9: Representative resultater av likevektsopptak av CPC-er i brusk. CPCer med varierende nettokostnad (+8, +14 og +20) og deres respektive opptaksforhold i brusk viste at opptaket ikke øker monotont med økende lading. Denne figuren er endret fra Vedadghavami et al.4Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I tilfelle fluorescensen av badet har økt etter å ha nådd likevekt, dette ville indikere at den første badkonsentrasjonen av fluorescerende merket solute var for høy. Dette ville føre til at utslippet blir fanget i løsningen etter eksitasjon via plateleser. For å løse dette problemet, senk den første badkonsentrasjonen.
Etter konfokal bildebehandling ble det produsert en bunke bilder med hvert bilde som viser dybden av penetrasjon av fluorescerende merkede CPC-er på forskjellige lag av brusk. Bildet hentet fra midten av brusk explant viste lengst dybde av penetrasjon i forhold til andre bilder gjennom tykkelsen av explant. Ved hjelp av en programvare som ImageJ ble bunken med bilder lagt over for å produsere ett bilde som viser den gjennomsnittlige intensiteten av CPC penetrasjon. Disse overlagte bildene ga den beste sammenligningen av generell penetrasjonsdybde mellom ulike ladede legemiddelbærere. Det ble observert en ladeavhengig respons for CPC-er i vevet (figur 10). Store nøytralt ladede bærere (f.eks. Neutravidin) vil ikke trenge mye lenger enn den overfladiske sonen, da de mangler evnen til å bruke ladeinteraksjoner for å indusere binding medmatrisen 1. Tilsvarende, for høy en positiv ladning vil være begrenset til overfladisk sone (som vist av CPC + 20 selv etter 24 h)4, men dette er et resultat av transportøren blir bundet for sterkt til matrisen; de er ikke i stand til å løsne fra sitt opprinnelige mål. En optimalt ladet narkotikabærer vil imidlertid kunne trenge gjennom til de dype sonene av brusk som det kan dra nytte av den svake og reversible natur elektrostatiske interaksjoner (som vist av CPC +14)4. Dette gjør det mulig for transportøren å binde seg til sitt opprinnelige mål, unbind å bevege seg dypere gjennom matrisen, og deretter binde igjen til mål videre inne i vevet. For eksempel har Avidin (~ 7 nm diameter, 66 kDa, pI 10,5) binding med negativt ladede matriseglykosooglykaner (GAGs) en dissosiasjonskonstant (KD) på 150 μM, som ble ansett å være svak nok til å muliggjøre reversibel binding som er nødvendig for fullpenetrasjon 1. Til tross for den svake bindingen viste Avidin høy oppbevaring og opptak i brusk på grunn av tilstedeværelsen av en høy tetthet av negativt ladede GAGs (Bindingstetthet NT = 2900 μM)1. Videre, som vist av CPC + 8, full tykkelse penetrasjon var synlig innen 4 timer, mens CPC + 14 krevde 24 h for å nå full dybde4. Dermed bør flere tidspunkter velges for å effektivt sammenligne frekvensen av forskjellige solutes ved gjennomtrengende vevtykkelse. For en mer kvantitativ forståelse av dybden av penetrasjon, kan de relative intensitetene av solutes langs tykkelsen av vev oppnås ved hjelp av ImageJ.
Figur 10: Representative resultater fra dybde av penetrasjonsstudier i brusk. CPC-er med varierende nettokostnad (+8, +14 og +20) og deres respektive dybde gjennom brusk viste svak reversibel binding sett av CPC+8 og CPC+14 er nøkkelen for full dybdepenetrasjon. Men for sterk binding sett for CPC + 20 hindrer full tykkelse penetrasjon. Denne figuren er endret fra Vedadghavami et al.4Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Hvis det ikke er observert noe fluorescerende signal inne i brusk under bildebehandling, kan det være to problemer; enten overflatearealet for diffusjon ble blokkert av epoksyen, eller den første badkonsentrasjonen var for lav til å produsere et fluorescerende signal. For å løse disse problemene, fjern overflødig epoksy fra bruskflatene og øk den løse konsentrasjonen.
Ikke-likevektsdiffusjonstransporteksperimenter resulterte i en kurve som vist i figur 11. Den første delen av kurven representerer en oppsløs diffusjon gjennom brusk etter hvert som løse matrisebindende interaksjoner finner sted. Med økt ladning av transportøren, oppstod sterkere matrisebinding som vil resultere i en lengre tid for solutes å nå nedstrøms kammeret. Når solutes penetrert gjennom dybden av brusk og nådde nedstrøms kammeret, en økning i skråningen av kurven ble observert som fluorescens lesing økt over tid. Denne andre delen av kurven nådde en jevn skråning, som representerer steady-state diffusjon. En tangential linje ble trukket i steady-state skråningen for å bestemme tiden det tar å nå steady-state diffusjon (τLag), preget av x-intercept. Den effektive diffusiviteten (DEFF),diffusjonshastigheten til CPC-er mens det er bindende interaksjoner tilstede i brusk, ble beregnet ved hjelp av τLag og explant tykkelse (L) som følger:
Etter overføring av 20 μL oppløsning fra oppstrøms til nedstrøms kammer, ble det observert en topp i fluorescens; den resulterende stabiliserte fluorescensintensiteten ble brukt til korrelasjon til konsentrasjonen. Konsentrasjonen av CPC-er i nedstrøms (CD) normalisert til oppstrømskonsentrasjonen (CU) ble deretter plottet mot tiden. Hellingen av denne kurven ble brukt til å estimere steady-state diffusjonshastigheten når alle bindingssteder i brusk er okkupert (DSS) som vist nedenfor. Denne verdien var inkludert partisjoneringskoeffisienten. Her representerer φ, VD og A brusk porøsitet (~0,8), nedstrøms kammervolum (2 ml) og tverrsnittsareal av brusk (henholdsvis 0,1257 cm2). Representative DEFF- og DSS-verdier beregnet ut fra ikke-likevektstransporteksperimenter for CPC-er finnes i tabell 1.
Figur 11: Representative resultater fra ikke-likevektsdiffusjonsstudier gjennom brusk. CPC+8 diffusjonskurve, plottet som nedstrøms konsentrasjon (CD) normalisert til oppstrøms konsentrasjonen (CU), mot tiden. En tangential linje tegnet ved steady-state skråningen (blå) krysser x-aksen på τLag, som ble brukt til å beregne DEFF. Hellingen av tangent ble brukt til å beregne DSS. Piggtesten (grå) representerer den stabiliserte konsentrasjonen i nedstrømskammeret etter overføring av 20 μL CPC-løsning fra oppstrøms til nedstrøms, som brukes til normalisering av nedstrøms konsentrasjon. Denne figuren er endret fra Vedadghavami et al.4Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Hvis nedstrøms fluorescens ikke klarer å stabilisere seg før tilsetning av fluorescerende merket peptid til oppstrømskammeret, er det sannsynlig at det er løse rester fast på veggene fra et tidligere eksperiment. I dette tilfellet demontere kammeret og vask med såpe og sonikere. Hvis det er en økning i nedstrøms fluorescens umiddelbart etter tillegg av fluorescerende merket peptid til oppstrøms kammeret, Dette kan tyde på at lekkasje er til stede. Dette ville kreve montering av transportkammeret og re-testing for lekkasjer. Hvis nedstrøms fluorescenssignalet når et platå i motsetning til en jevn tilstandsøkning, indikerer det et mulig tap av konsentrasjon i oppstrømskammeret, sannsynligvis forårsaket av solutes som stikker til veggene i kammeret. Tillegg av 0,005% w / v storfe serum albumin (BSA) til oppstrøms kammeret kan bidra til å hindre stikker.
| Cpc | DEFF (cm2/s) | DSS (cm2/s) |
| CPC+8 | 1,7 ± 0,4 x 10-7 | 5,8 ± 0,0 x 10-5 |
| CPC+14 | 9,8 ± 0,2 x 10-8 | 2,6 ± 1,2 x 10-5 |
| CPC+20 | 4,7 ± 0,1 x 10-8 | 1,4 ± 0,9 x 10-5 |
Tabell 1: Representative DEFF- og DSS-verdier for CPC-transport gjennom brusk. Denne tabellen er endret fra Vedadghavami et al.4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene og protokollene som er beskrevet her, er signifikante for feltet målrettet legemiddellevering til negativt ladet vev. På grunn av den høye tettheten av negativt ladede aggrekaner tilstede i disse vevene, opprettes det en barriere, og dermed hindrer narkotika i å nå sine cellulære målsteder som ligger dypt inne i matrisen. For å løse denne enestående utfordringen, kan narkotika endres for å innlemme positivt ladede legemiddelbærere som kan forbedre transporthastigheten, opptaket og bindingen av narkotikai vev 1,3,4,14,15,16,17,18,19. Som vist her med de utviklede metodene, kan transport av positivt ladede legemiddelbærere karakteriseres for å bestemme likevektsopptaket, dybden av penetrasjon og ikke-likevektsdiffusjonshastighet. Vi har designet tre separate eksperimentelle oppsett som kan brukes til å vurdere transporten gjennom brusk explants.
For vellykket karakterisering av transport må kritiske trinn i prosedyren følges. Bruken av proteasehemmere (PIer) i alle løsninger er avgjørende for nøyaktig karakterisering av intrabrusktransport av CPC-er gjennom brusk, da de fungerer for å forhindre enzymatisk fordøyelse av proteiner ivev 20. Derfor, hvis de ikke brukes, kan bruskmatrisekomponenter som aggrekaner og kollagen begynne å forringe og skille ut i det omkringliggende badet under eksperimentering. Dette kan i stor grad senke FCD av brusk, redusere antall ladebaserte bindingssteder i brusk matrisen. Det resulterende vevet ville ikke lenger være representativt for sunn brusk. Omvendt kan eksperimentene som presenteres også brukes til å evaluere transport av CPC-er gjennom arthritic brusk der det aggrekanske innholdet er mye lavere som sett i OA20. Ved hjelp av trypsin eller Chondroitinase ABC for å fordøye brusk explants, kan den aggrekanske tettheten kontrolleres, og dermed tillate evaluering av transport og narkotikalevering i en syk tilstand. I dette tilfellet kan ladebasert binding bli kompromittert, mens andre typer interaksjoner som hydrogenbindinger og hydrofobe interaksjoner synergistisk forbedrer intrabruskbinding og oppbevaring4.
Opprettholde hydrering av brusk explant er nøkkelen under prøve forberedelse og eksperimentering. Dehydrering via eksponering for luft i mer enn 6 minutter har vist seg å indusere irreversibel skade på leddbrusk21. Som et resultat kan uventede endringer i transport av CPC-er oppstå. På samme måte kan fordampning av CPC-bad resultere i explant dehydrering; dette kan forebygges ved å forsegle med en fleksibel film. Imidlertid kan badfordampning ikke bare forårsake explant dehydrering, men det kan også føre til en endring i CPC bad konsentrasjon, noe som resulterer i falske fluorescerende avlesninger. Videre er det viktig å merke seg at dybde av penetrasjonsstudier krever tynne tverrsnitt (~ 100 μM) brusk som skal avbildes. Dette er en teknikk som krever praksis slik at skiver av jevn tykkelse kan oppnås. Det er også avgjørende for ikke-likevektsdiffusjonseksperimenter, at transportkammeret er gjennomsiktig slik at sanntids fluorescensmålinger kan oppnås med det spesialdesignede spektrofotometeret. Men som et alternativ kan aliquots fra nedstrømskammeret oppnås og vurderes for fluorescens ved hjelp av en plateleser eller annen spektrofotometrisk leser.
Metodene som presenteres her er av stor betydning som de gir en benk-skala metode for karakterisere narkotika bærer transport gjennom brusk for å bedre forutsi in vivo narkotika oppbevaring og langsiktig biologisk effekt. Nylig ble det implementert et begrenset elementrammeverk for beregningsvæskedynamikk for måling av solute transport gjennom porøse medier22. Arbabi et al. har brukt begrenset elementanalyse i kombinasjon med eksperimentelle data hentet fra mikro-CT-bildebehandling for å måle diffusjonshastigheten til negativt ladet kontrastmiddel, ioxaglat ibrusk 23,24. Videre, ved hjelp av en multi-sone, multi-phasic modell, diffusjonskoeffisientene av ioxaglate i forskjellige soner av brusk ble målt sammen med FCD av hver sone. Mens mikro-CT-avbildning bare kan brukes med kontrastmidler, gjør vårt eksperimentelle oppsett mulighet for karakterisering av transport av alle legemidler og legemiddelbærere som kan være fluorescerende merket. Den avanserte beregningsmodelleringen som brukes av Arbabi et al. gir imidlertid en mer omfattende analyse av solute transportatferd og kan brukes på våre eksperimentellemetoder 13,24.
En begrensning av den presenterte metoden er at det eksperimentelle oppsettet for hvert løse transporteksperiment ikke fullt ut omfatter in vivo-miljøet. Biologiske reaksjoner og mekaniske og dynamiske krefter som oppstår i det naturlige leddet er ikke simulert her. For å innlemme disse kreftene kan transportkammeret endres med et stempel for å simulere konvektive strømningsmønstre som oppstår under aktiviteter som gang og løping. Men mens konvektiv strømning kan øke opptaket med 2 ganger, kan opptaket på grunn av elektrostatiske interaksjoner øke 100-400x. Dermed gir de eksperimentelle oppsettene som presenteres her et godt estimat for ladebasert transport og opptak25. Videre, siden kneleddet naturlig inneholder synovialvæske, kan den brukes i badeløsninger for transporteksperimenter i stedet for 1x PBS-PI. Det er anslått at opptaket av kationbærere i brusk vil reduseres i synovialvæske sammenlignet med i 1x PBS på grunn av tilstedeværelsen av hyaluroniske kjeder med negativt ladede karboksylgrupper i synovialvæske. Det er mulig at kationiske bærere konkurransedyktig binder seg med hyaluroniske kjeder av synovialvæsken i tillegg til GAGs av brusk. Tettheten av negativt ladede grupper er imidlertid betydelig høyere i brusk sammenlignet med synovialvæske, på grunn av tilstedeværelsen av både negativt ladede karboksylert hyaluronkjeder og sulfaterte GAGs ibrusk 15. Dermed, selv om opptaket i brusk i nærvær av synovialvæske vil være lavere enn i 1x PBS, er det fortsatt forventet å opprettholde høy intra-brusk opptak. In vivo har Avidin vist høyt intrabruskopptak i både rotte- og kaninbrusk i nærvær av synovialvæske16,26. Videre har Avidin vist høyt opptak og oppbevaring i brusk opptil 2 uker etter intraartikulær injeksjon i en kanin fremre korsbånd transeksjon modell27.
Bruk av storfe brusk i dette systemet gir en mer nøyaktig representasjon av narkotika penetrasjon gjennom brusk på grunn av sine likheter med menneskelig brusk i form av tykkelse (~ 1,5-2 mm)28,29. Transport av solutes gjennom brusk kan variere med tykkelse; legemiddelbærere kan kreve færre bindende interaksjoner for å trenge helt gjennom mus eller rottebrusk som er mye tynnere, men kan imidlertid betydelig hindres fra å trenge dypere inn i tykkere menneskeligbrusk 1. Videre, selv om disse eksperimentene ble designet for å karakterisere solute transport i brusk, kan disse metodene endres og brukes på andre negativt ladede vev som menisk, hornhinne og glasslegemet humor i øyet, og kjernen pulposus av intervertebrale disker. Metodene for eksperimenter designet her er en fordel som dimensjonene av inventar og transportkamre kan tilpasses i henhold til størrelsen og arten av vev. Virkningen av disse metodene er utbredt, begrenset ikke bare til narkotikabærere, men også for evaluering av transport av narkotika og narkotika-narkotika bærer konjugater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av USAs forsvarsdepartement gjennom Congressionally Directed Medical Research Programs (CDMRP) under kontrakt W81XWH-17-1-0085, og National Institute of Health R03 EB025903-1. AV ble finansiert av College of Engineering Dean's Fellowship ved Northeastern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18x18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
References
- Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
- Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, Pt 2 335-347 (1976).
- Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
- Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
- Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238 (2019).
- Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898 (2020).
- Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
- Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
- Martel-Pelletier, J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
- Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).
- Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. Progress in intra-articular therapy. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).
- He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
- Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
- Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882 (2020).
- Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
- Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
- Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
- Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
- Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
- Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).
- Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).
