Summary
本文提出了一个协议，研究单个蚊子肠道细菌的影响，包括隔离和识别蚊子中生可培养微生物，抗生素消耗蚊子肠道细菌，并重新引入一个特定的细菌物种。
Abstract
蚊子中游人具有高度动态的微生物群，影响宿主的新陈代谢、繁殖、健身和病媒能力。已开展研究，以调查肠道微生物作为一个整体的影响;然而，不同的微生物会对宿主产生不同的影响。本文提供了研究每种特定蚊帐微生物作用和潜在机理的方法。
该协议包含两个部分。第一部分介绍如何解剖蚊子中，分离可培养的细菌菌落，并识别细菌物种。第二部分提供了产生抗生素处理的蚊子的程序，并重新引入一种特定的细菌物种。
Introduction
蚊子被认为是人类致病疾病最重要的媒介，传播超过一百种病原体，包括寨卡病毒、登革热病毒和疟原虫1。当蚊子采取血餐来获得营养细胞，他们可以意外地从受感染的宿主通过消化道2摄入病原体。重要的是，在血粉消化和病原体入口中起着关键作用的蚊子中游，它蕴藏着高度动态的微生物群3。
几项研究已经确定实验室饲养和现场收集的蚊子微生物群使用培养依赖方法或细菌测序测定4，5，6。,5,6在各种研究中，包括潘5,7,8,托亚、塞拉蒂亚、克莱布西拉、Elizabethkingia伊丽莎白金氏菌和Enterococcus肠球菌在内的物种通常与蚊子分离。有趣的是，受发育阶段、物种、地理来源和喂养行为的影响，蚊子肠道微生物群在社区多样性和细菌种类中波动剧烈。研究表明，随着肠杆菌物种的迅速扩张和整体多样性的减少，供血Enterobacteriaceae量显著增加,了细菌总负荷。此外，幼虫阶段的蚊子肠道微生物群通常在昆虫在繁殖和闭合过程中发生变质时被根除;因此，新出现的成年蚊子需要重新填充其微生物群4。
古特微生物群在营养吸收、免疫、发育、繁殖和载体能力等各个方面调节昆虫生理学。斧头蚊子幼虫未能发育超过第一星，而细菌口服供应抢救发展，表明蚊子肠道微生物是幼虫发育的关键13，14。,14此外，肠道细菌的耗竭会延缓血餐消化和营养吸收，影响卵母细胞成熟，减少卵巢15。此外，与抗生素治疗的蚊子相比，具有肠道微生物群的蚊子具有更高的免疫反应，与其他病原体的抗菌肽表达不断升高，感染16。在这些研究中，通常口服抗生素来去除泛肠道细菌，然后进行实验，以比较斧头蚊子和蚊子与共生微生物的区别。然而，蚊子中古人蕴藏着各种各样的微生物群落，每种细菌物种对宿主生理机能产生明显的影响。
蚊子微生物群调节病媒能力，具有不同的效应。从登革热流行地区的外地蚊子中分离出的Proteus的殖民化，可产生对登革热病毒感染的增强抗菌肽表达和抵抗力。致病真菌博韦里亚巴西亚纳激活收费和JAK-STAT免疫途径对阿尔博病毒感染17。相比之下，从伊蚊中分离出的真菌Talaromyces通过调节肠道尝试素活性18促进登革热病毒感染。 Aedes aegypti此外，Serratia Marcescens通过一种叫做Sm Enhancin的分Sm泌蛋白促进arbo病毒的传播，这种蛋白质消化蚊子肠道上皮上的粘液层。
该程序为解剖蚊子中口、分离可培养细菌菌落、鉴定细菌种类和通过口服喂养重新引入提供了系统、直观的方法。它提供了具有代表性的用共体细菌、菊花 菌、蚊子卵巢发育和卵巢的供血结果。
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Protocol
1. 中古解剖和可培养细菌分离
- 准备蚊子解剖。
- 用吸气器在出现7~9天后收集蚊子。麻醉收集的蚊子，让它们在4°C的温度下3~5分钟，并保持蚊子在冰冷的培养皿中麻醉，直到解剖。
- 对实验室仪器和蚊子表面进行消毒。
- 通过喷洒 75% 乙醇对实验台进行消毒，解剖显微镜、钳子和玻璃幻灯片，以避免被环境中的细菌污染。
- 准备一个无菌的培养皿，含有75%乙醇和两个含有无菌1x磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）的培养皿。
- 通过浸渍和摇动蚊子在75%乙醇中3分钟，并用1倍PBS缓冲液冲洗两次，以防乙醇影响解剖的肠道菌群，对蚊子进行表面消毒。
- 解灭蚊子中。
- 用一滴无菌的 1x PBS 缓冲液将表面消毒的蚊子转移到玻璃幻灯片上。解剖显微镜下解剖。
- 在解剖显微镜的下放大镜下，小心地取出蚊子的腿、翅膀和头部，防止逃跑。直接切割而不是拉蚊，以防止消化道破裂，从而去除蚊子的最后一块虫。
- 用钳子夹住蚊子的胸部和腹部的端部。轻轻拉出蚊子的消化道。获得的消化道通常含有作物，前脑，中，后，和马尔皮吉安管。
- 将解剖显微镜调整到更高的放大倍率。从解剖的消化道上取出作物、前肢、后肢和马尔皮吉安管，以得到蚊子的中分。
- 当作物膨胀，像蚊子吃糖饭后，中长毛花一样，在去除作物时小心。马尔皮吉安管，一组长而薄的排泄管，位于中长管和后管之间的边界。
- 隔离肠道细菌。
- 将解剖的中结转移到无菌 1.5 mL 管中，并配有 200 μL 的无菌 1x PBS 缓冲液。
- 用无菌的害虫彻底研磨无菌长凳上的中肠，使肠道细菌完全释放到缓冲液中。
- 串行稀释均质至三个 10 倍稀释。将每次稀释的50μL加入LB（Luria汤）的加糖板，然后将其摊在盘子上。如果中肠菌群含有高浓度的肠道菌群，则必须进行更多的连续稀释，以挑出单菌落。
- 在37°C下孵育板1~2天，直到可见单个菌落。
- 物种识别
- 挑选单个菌落，并分别接种到含有50 ml LB肉汤介质的150 mL圆锥形烧瓶中。
- 在37°C下摇动细菌过夜。
- 通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。通过聚合酶链反应（PCR）放大16S rDNA。
注：16S rDNA 中有多个段是保守的。基于这些保护区，细菌的通用底剂可以设计为放大所有细菌的16S rDNA片段。这些底法是细菌特有的，16S rDNA的可变区域的差异可用于区分不同的细菌。因此，16S rDNA被广泛用于细菌鉴定。 - 通过阿加糖凝胶电泳和商业凝胶回收套件，从 PCR 产品中回收和纯化 DNA 片段。
- 对纯化的DNA片段进行DNA测序，获取细菌基因序列。
- 将 16S rRNA 基因序列与 GenBank 中可用的细菌序列进行比较。选择细菌和考古学数据库。
注：对物种水平的识别被定义为+99%16S rDNA序列相似性，最接近GenBank条目。当分离物的16S rDNA序列相似性为<99%和+95%时，该分离物被分配给相应的属。
2. 抗生素治疗和细菌再引入
- 准备抗生素溶液。
- 称量所需的蔗糖、青霉素和链霉素，制备 10% 蔗糖溶液，包括 20 单位青霉素和 20 μg 链霉素每 mL。
- 用抗生素溶液喂养蚊子。
- 在4°C中对蚊子进行麻醉3~5分钟。把蚊子转移到纸杯上。用纱布盖住顶部，用胶带包住纱布，防止蚊子逃跑。
- 将无菌棉球浸入抗生素溶液中，小心地放在蚊杯上。使用前挤压棉球，防止蚊子溺死在滴水的棉球中。
- 用 10 厘米培养皿盖住棉球，以防止水分蒸发。连续三天每天更换两次棉球。
- 确认抗生素治疗的有效性。
- 根据上述方法，解剖抗生素治疗的蚊子的中端。
- 将解剖的中结转移到无菌的 1.5 mL 管中，并配有 200 μL 的无菌 1x PBS 缓冲液。
- 在无菌的长凳中彻底研磨中牙，用无菌的害虫，使肠道细菌完全释放到缓冲液中。
- 通过细菌基因组DNA提取试剂盒提取肠道微生物DNA。
- 使用通用细菌源剂（16S rRNA F：TCCTACGGAGGCAGGT和R：GGACTACCAGTATATATTT）对基因组DNA进行实时定量PCR（qPCR）进行细菌定量。
- 细菌悬浮的准备
- 使用分光光度计测量细菌溶液。将 1 OD （OD600） 细菌悬浮液加入 1 mL 管中。在 4 °C 下以 5，000 x g 离 心 悬架 5 分钟。
- 丢弃上流剂，将1 mL无菌1x PBS缓冲液加入1.5 mL管中，用于悬浮沉淀。
- 在 4 °C 下以 5，000 x g 离心 5 分钟;丢弃上一杯。
- 重复步骤 2.4.2 和 2.4.3。
- 在细菌沉淀中加入200μL无菌1xPBS缓冲液。
- 将 600 μL 的 10% 蔗糖溶液、200 μL 的 10 mm ATP（用作吞咽剂）和 200 μL 的细菌悬浮液加入无菌 1.5 mL 管中。通过漩涡混合。或者，悬浮在热灭活血中的细菌颗粒。
- 热灭活血的制备
- 用抗凝剂管收集新鲜血液。
- 服用2~3 mL的新鲜血液。在 4 °C 下以 1，000 x g 离心 10 分钟，分离血浆和血细胞。请注意，在离心和洗涤过程中，血液会丢失;需要提前计算使用情况。
- 将等离子体收集到新的1.5 mL管中，在56°C下加热灭活1小时。
- 将 500 μL 无菌 1x PBS 缓冲液加入 1.5 mL 管中，用于悬浮血细胞。在 4 °C 下以 1，000 x g 离心 10 分钟，然后丢弃上一液。
- 重复步骤 2.4.7.4 两次。
- 用热灭活血浆重新吸收血细胞，以获得热灭活的血液。
- 按照步骤 2.4.1 到 2.4.4 获得 1 OD 细菌颗粒。
- 用1 mL的热灭活血重新吸收颗粒菌。
- 用细菌悬浮液喂养蚊子。
- 使蚊子饿死24小时，让抗生素在喂养细菌前代谢。
- 组装膜进料系统。
- 用副膜（或胶原胶膜）密封灭菌的进料器单元。
- 戴上塑料环，用副膜固定，以免因喂食过程中摩擦而断裂。
- 慢慢将准备好的细菌溶液添加到进料装置中。请注意，只有两井进料装置的一个井可以填充溶液，并且只能从试剂下降侧盖住进料装置。
- 将送料装置连接到预热至 37°C 的馈送系统，模拟人类温度以吸引蚊子。将喂食装置放在装满蚊子的纸杯上，喂食90分钟。
- 喂养后，对蚊子进行麻醉，让蚊子在4°C的温度下3~5分钟，让蚊子在冰冷的培养皿中麻醉。
- 挑选完全充满的蚊子作进一步研究。
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Representative Results
用抗生素治疗和没有抗生素治疗的蚊子中游被提取出来进行DNA提取，用通用细菌底剂进行qPCR。 图1 显示了对照组和抗生素治疗组中细菌16S rRNA的表达。结果表明，约98%的肠道细菌已被去除，青霉素和链霉素的肠道灭菌工作成功。
通过所述方法，分离和鉴定细菌菌株。 C. 性消化是 一种非感染性、氧化酶阳性的克阴性有氧杆菌 ，属于菊花菌。 图 2 显示了每只蚊子在用C.消化不良剂喂血后 平均产卵。 图 3 显示了卵巢发育相关基因的表达24小时后血餐含有 C.月消化不良。表1中列出了卵巢发育相关基因和底基因 序列的概述。
从肠道细菌中分离出的菌株，从肠道细菌中去除，然后完全被感染的蚊子被分成三组。第一组和第二组的5名女性用于计算产卵量，第三组10名女性分别用于检测每只雌性蚊子喂养后24小时后卵巢发育相关的基因表达。结果表明，对照组和喂养组的卵子生产无显著变化。
图1：抗生素治疗后16S rRNA的表达。 使用未经治疗的抗生素的蚊子充当对照组。 请单击此处查看此图的较大版本。
图22：肠道微生物对蚊子的繁殖作用。所示的细菌菌株与血液混合，喂给经过抗生素治疗的蚊子。蚊子与未经治疗的肠道共体微生物作为对照组。数据以平均 + Sem 显示。请单击此处查看此图的较大版本。
图33：供血后生殖相关基因的表达。在抗生素治疗的蚊子用抗生素治疗A的蚊子用指示的细菌菌株进行24小时的血液喂养后，明粒体 ATPase 抑制剂（B）、核糖体生物生成蛋白 brix （C） 和丝氨酸/Threonine-蛋白激酶 rio2 （ D ） 的表达。蚊子与未经治疗的肠道共体微生物作为对照组。每个点表示蚊子，每行表示组的中值。请单击此处查看此图的较大版本。
| 名字 | 基因编号 | 底因为序 |
| 凯德普辛 B | AAEL009642 | 前进底剂 - 加加特特加特格加 |
| 反向底面-AATCCCCCACCCAGTA | ||
| 线粒体 ATPase 抑制剂 | AAEL004284 | 前进底法-CAACTGCACAAGGGAAGGAGGA |
| 反向底流 - ACGTGCGATACTCT | ||
| 核糖体生物生成蛋白布里克斯 | AAEL001917 | 前进底奖 - 加卡卡卡格加加 |
| 反向底因 - Ttggccttgaggttt | ||
| 血清/三元蛋白激酶 rio2 | AAEL011114 | 前进底奖 - 加加加加加加卡卡卡卡克 |
| 反向底像 - tcgaatgttctttc |
表1：卵巢发育相关基因和底基因序列。
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Discussion
对宿主-微生物相互作用的研究发现，不同的肠道微生物通过不同的机制影响宿主生理。本文介绍了研究蚊子肠道微生物各自作用的方法，包括解剖蚊虫、栽培肠道细菌、抗生素治疗和重新引入感兴趣的细菌。
要成功进行抗生素治疗，在进行实验时必须考虑以下细节。在该协议中，蚊子使用湿润的棉球进行治疗，用10%蔗糖溶液，包括20单位青霉素和20μg每mL链霉素3天11，16。11,青霉素作为抗克阳性细菌的广谱抗生素，链霉素作为广谱抗生素对抗克阴性细菌20。正确保存抗生素对有效的抗生素治疗至关重要。当储存在-18°C时，青霉素G的稳定性至少为3米。链霉素在4°C 22中储存时，至少稳定12米。虽然抗生素品牌或储存时间的差异可能会导致微生物清除的轻微差异，但有必要在每次抗生素治疗后验证效率。除了qPCR，传播板或使用PCR通常用于评估抗生素治疗的效率23，24。23,此外，为了防止蚊子在抗生素处理后被其他细菌污染，需要使用组装在超级干净的长凳下进行灭菌设备进行喂养测定。
在细菌口服喂养之前，蚊子应挨饿24小时，让抗生素代谢25。这不仅有助于蚊子摄入细菌液体，而且防止抗生素杀死细菌。
无可否认，该协议主要是为了研究可培养细菌的影响。为了研究脊椎动物和无脊椎动物宿主的肠道微生物群，可培养的细菌重新引入抗生素治疗宿主，是最近研究8，26，27的常用27。8,此外，肠道细菌的初始识别一般基于菌群大小、形状、颜色、边缘、不透明度、高度和一致性的特征。对于非培养性细菌，高通量测序基的元基因组方法可能提供中古微生物群29、30、31,的总组成的综合信息。然而，非培养性细菌与宿主之间的相互作用在很大程度上仍未被探索。
本文提供了两种替代方法，用于研究肠道微生物对蚊子的致病影响，将细菌与热灭活的血液混合，或通过糖喂养和血液喂养植入细菌。本手稿中的代表性结果采用了第一个选项，而后一种方法产生了类似的结果。在用一种特定的细菌菌株口服喂养后，可以进行各种研究。随后的测定可用于研究微生物因子如何调节蚊子运动行为。可以遵循蛋白质定量测定，研究不同细菌对消化的影响。稍作修改，该方法可用于研究各种微生物对蚊子生理的各自影响，包括营养吸收、免疫力、发育、繁殖和载体能力。
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Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（第81902094号，81600497）和湖南省科技计划项目（2019RS1036）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
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