Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا للتحقيق في تأثير بكتيريا الأمعاء الفردية للبعوض ، بما في ذلك عزل وتحديد الميكروبات القابلة للزراعة في منتصف البعوض ، واستنزاف المضادات الحيوية لبكتيريا الأمعاء البعوض ، وإعادة إدخال نوع واحد محدد من البكتيريا.
Abstract
البعوض منتصف الموانئ الموانئ ميكروبيوم ديناميكية للغاية التي تؤثر على التمثيل الغذائي المضيف، والتكاثر، واللياقة البدنية، والكفاءة ناقلات. وقد أجريت دراسات لدراسة تأثير ميكروبات الأمعاء ككل؛ ومع ذلك، يمكن أن الميكروبات المختلفة تمارس آثار متميزة نحو المضيف. توفر هذه المقالة منهجية لدراسة تأثير كل ميكروب أمعاء البعوض المحدد والآلية المحتملة.
يحتوي هذا البروتوكول على جزأين. الجزء الأول يقدم كيفية تشريح البعوض منتصف، عزل مستعمرات البكتيريا التي يمكن تكاثرها، وتحديد أنواع البكتيريا. يوفر الجزء الثاني الإجراء الخاص بتوليد البعوض المعالج بالمضادات الحيوية وإعادة إدخال نوع واحد من البكتيريا المحددة.
Introduction
ويعتبر البعوض أن تكون أهم ناقلات الأمراض المسببة للأمراض البشرية، ونقل أكثر من مائة مسببات الأمراض بما في ذلك فيروس زيكا، فيروس حمى الضنك، والطفيليات Plasmodium 1. عندما يأخذ البعوض وجبة دم للحصول على العناصر الغذائية للوَفَس، فإنها يمكن أن تبتلع مسببات الأمراض عن طريق الخطأ من مضيف مصاب عن طريق الجهاز الهضمي2. الأهم من ذلك، فإن البعوض midgut، الذي يلعب دورا محوريا في كل من هضم وجبة الدم ومدخل الممرض، ويأوي الميكروبيوم ديناميكية للغاية3.
وقد تميزت العديد من الدراسات المختبرية التي تم تربيتها والحقول التي جمعت البعوض الميكروبية باستخدام إما طريقة تعتمد على الثقافة أو البكتيريا تسلسل المقايسة4,5,6. الأنواع بما في ذلك البانتوا، Serratia، Klebsiella، Elizabethkingia، و Enterococcus يتم عزلها عادة من البعوض في مختلف الدراسات5،7،8،9. ومن المثير للاهتمام، يتقلب ميكروبيوتا الأمعاء البعوض بشكل حيوي في كل من تنوع المجتمع وكمية أنواع البكتيريا، تتأثر بمرحلة التنمية، والأنواع، والأصل الجغرافي، وسلوك التغذية4. تشير الدراسات إلى أن تغذية الدم تزيد بشكل كبير من إجمالي الحمل البكتيري مع التوسع السريع للأنواع من Enterobacteriaceae وانخفاض في التنوع العام10،11. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما يتم القضاء على ميكروبيوتا الأمعاء البعوض من مرحلة اليرقات عندما تخضع الحشرة للتحول أثناء ال pupation و eclosion ؛ وهكذا ، ظهرت حديثا البعوض البالغ بحاجة إلى إعادة إسكان الجراثيم4.
الأمعاء الميكروبية تعدل علم وظائف الأعضاء الحشرات في مختلف الجوانب، بما في ذلك امتصاص المغذيات، والمناعة، والتنمية، والتكاثر، والكفاءة ناقلات12. يرقات البعوض أكسينيك تفشل في التطور وراء أول إنستار في حين أن البكتيريا عن طريق الفم إنقاذ التنمية الإمدادات، مشيرا إلى أن ميكروب الأمعاء البعوض ضروري لتطوير اليرقات13,14. الى جانب ذلك، استنزاف البكتيريا الأمعاء يؤخر هضم وجبة الدم وامتصاص المغذيات، ويؤثر على نضوج البويضات، ويقلل من oviposition15. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البعوض الذي يُصاب بصغر الأمعاء يثير استجابات مناعية أعلى مقارنة بالبعوض المعالج بالمضادات الحيوية ، مع تعبير ببتيد مضاد للميكروبات مرتفع باستمرار ضد مسببات الأمراض الأخرى لتصيب16. عادة ما يتم إعطاء المضادات الحيوية عن طريق الفم لإزالة بكتيريا الأمعاء في هذه الدراسات ، ثم يتم إجراء تجارب لمقارنة الفرق بين البعوض الفأس والبعوض مع الميكروبات commensal. ومع ذلك ، فإن البعوض في منتصف الغور يضم مجتمعًا متنوعًا من الميكروبات ، ويمكن لكل نوع من أنواع البكتيريا أن يمارس تأثيرًا متميزًا تجاه علم وظائف الأعضاء المضيف.
الميكروبيات البعوض ينظم كفاءة ناقلات مع آثار متباينة. الاستعمار من قبل بروتيوس معزولة عن البعوض المستمدة من الحقل من المناطق التي تتوطن حمى الضنك يمنح أعلى تنظيما التعبير الببتيد المضاد للميكروبات والمقاومة ضد عدوى فيروس حمى الضنك16. فطر entomopathogenic Beauveria bassiana ينشط المسار المناعي حصيلة وJAK-STAT ضد عدوى arbovirus17. وعلى النقيض من ذلك، فإن الفطريات Talaromyces معزولة عن Aedes aegypti midgut يسهل الإصابة بفيروس حمى الضنك عن طريق تحوير نشاط التربسين الأمعاء18. بالإضافة إلى ذلك ، Serratia marcescens يعزز انتقال الفيروس من خلال بروتين سيكريتوري يسمى SmEnhancin، الذي يهضم طبقة المخاطين على ظهارة الأمعاء من البعوض19.
يوفر هذا الإجراء طريقة منهجية وبديهية لتشريح البعوض منتصف، وعزل مستعمرات البكتيريا التي يمكن تكاثرها، وتحديد أنواع البكتيريا، وإعادة إدخالها عن طريق التغذية عن طريق الفم. وهو يوفر نتائج تمثيلية لتغذية الدم مع بكتيريا commensal، Chryseobacterium 100 1000 100،على تطور المبيض والبعوضة وovposition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تشريح midgut وعزلة البكتيريا التي يمكن الاستزراع عنها
- إعداد البعوضة للتشريح.
- جمع البعوض 7-9 أيام بعد ظهور مع التعرق. تخدير البعوض الذي تم جمعه عن طريق إخضاعه لدرجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 3-5 دقائق والحفاظ على تخدير البعوض في طبق بيتري بارد من الجليد حتى التشريح.
- تعقيم أدوات المختبرات وسطح البعوض.
- تعقيم مقاعد البدلاء التجربة، تشريح المجهر، ملقط، والشرائح الزجاجية عن طريق رش 75٪ الإيثانول لتجنب التلوث من البكتيريا من البيئة.
- إعداد طبق بيتري معقمة تحتوي على 75٪ الإيثانول واثنين من أطباق بيتري تحتوي على معقمة 1x الفوسفات المالحة المخزنة (1x PBS).
- سطح تعقيم البعوض عن طريق غمس وهز لهم في 75٪ الإيثانول لمدة 3 دقائق، وشطف مرتين مع 1x PBS العازلة في حالة تأثير الإيثانول على النباتات الأمعاء تشريح.
- تشريح البعوض منتصف.
- نقل البعوض المعقم السطح على الشريحة الزجاجية مع قطرة من عازلة برنامج تلفزيوني معقم 1x. تشريح تحت المجهر تشريح.
- تحت التكبير السفلي من المجهر تشريح، وإزالة بعناية الساقين والأجنحة، ورأس البعوض لمنع الهروب. إزالة somite الأخير من البعوض عن طريق قطع مباشرة، بدلا من سحبه، لمنع الجهاز الهضمي من كسر.
- المشبك الصدر البعوض ونهاية البطن مع ملقط. سحب بلطف الجهاز الهضمي للبعوضة. الجهاز الهضمي المكتسبة وعادة ما يحتوي على المحاصيل, foregut, midgut, hindgut, وأنابيب Malpighian.
- ضبط المجهر تشريح إلى التكبير أعلى. إزالة المحصول، foregut، hindgut، وأنابيب Malpighian من الجهاز الهضمي تشريح للحصول على منتصف البعوض.
- العناية أثناء إزالة المحصول، كما يتضخم المحصول ويشبه منتصف بعد البعوض يأخذ وجبة السكر. تقع أنابيب مالبيغيان، وهي مجموعة من الأنابيب المُفَجَرة الطويلة والنحيفة، عند الحدود بين منتصف الgut والهندغوت.
- عزل بكتيريا الأمعاء.
- نقل midgut تشريح إلى أنبوب معقم 1.5 مل مع 200 ميكرولتر من عازلة 1X PBS العقيمة.
- طحن منتصف على مقاعد البدلاء العقيمة تماما مع آفة معقمة للسماح الكامل الإفراج عن البكتيريا الأمعاء إلى المخزن المؤقت.
- المسلسل تمييع المتجانس إلى ثلاثة 10 أضعاف التخفيف. إضافة 50 μL من كل تخفيف إلى LB (مرق لوريا) لوحة أجار، ومن ثم نشرها على لوحة. إذا كان يحتوي على تركيز عال من النباتات الأمعاء midgut، فمن الضروري لجعل المزيد من التخفيفات التسلسلية لاختيار المستعمرات واحدة.
- احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام حتى المستعمرات واحدة مرئية.
- تحديد الأنواع
- اختيار مستعمرات واحدة وتطعيمها على التوالي في قارورة مخروطية 150 مل تحتوي على 50 مل من مرق LB المتوسطة.
- يهز البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- استخراج مجموع الحمض النووي عن طريق طقم استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري. تضخيم 16S rDNA بواسطة تفاعل البوليميراز سلسلة (PCR).
ملاحظة: هناك عدة شرائح في 16S rDNA التي يتم حفظها. واستنادا إلى هذه المناطق المحفوظة، يمكن تصميم التمهيديات العالمية للبكتيريا لتضخيم 16S شظايا rDNA من جميع البكتيريا. هذه الشعّارات هي محددة للبكتيريا، والفرق في المنطقة المتغيرة من 16S rDNA يمكن استخدامها للتمييز بين البكتيريا المختلفة. ولذلك، 16S rDNA يستخدم على نطاق واسع لتحديد البكتيريا. - استعادة وتنقية شظايا الحمض النووي من منتجات PCR بواسطة agarose هلام electrophoresis ومجموعة استرجاع هلام التجارية.
- تنفيذ تسلسل الحمض النووي على شظايا الحمض النووي المنقى للحصول على تسلسلات الجينات البكتيرية.
- قارن تسلسل جينات 16S rRNA مع التسلسل البكتيري المتوفر في GenBank. حدد قاعدة بيانات البكتيريا والآرقية.
ملاحظة: تم تعريف مستوى الأنواع على أنه ≥ 99٪ 16S rDNA تشابه تسلسل إلى أقرب دخول GenBank. تم تعيين العزلة إلى جنس المقابلة عندما كان لها 16S rDNA التشابه تسلسل < 99٪ و ≥ 95٪.
2. العلاج بالمضادات الحيوية وإعادة إدخال البكتيريا
- إعداد محلول المضادات الحيوية.
- تزن الكمية المطلوبة من السكروز، البنسلين، وstreptomycin لإعداد محلول السكروز 10٪ بما في ذلك 20 وحدة من البنسلين و 20 ميكروغرام من ستريبتومايسين لكل مل.
- تغذية البعوض مع محلول المضادات الحيوية.
- تخدير البعوض في 4 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق. نقل البعوض إلى كوب ورقة. غطي الجزء العلوي بالشاش وانزه الشاش بشريط لمنع البعوض من الهروب.
- تراجع كرات القطن العقيمة في محلول المضادات الحيوية ووضعها بعناية على كوب البعوض. الضغط على كرات القطن قبل استخدامها لمنع البعوض من الغرق في كرات القطن نازف.
- غطي كرات القطن بطبق بيتري 10 سم لمنع تبخر الرطوبة. استبدال كرات القطن مرتين في اليوم لمدة ثلاثة أيام متتالية.
- تأكيد فعالية العلاج بالمضادات الحيوية.
- وفقا للطريقة المذكورة أعلاه ، تشريح منتصف البعوض المعالجة بالمضادات الحيوية.
- نقل midguts تشريح إلى أنبوب معقم 1.5 مل مع 200 μL من عازلة 1X PBS العقيمة.
- طحن midguts في مقعد معقمة تماما مع آفة معقمة للسماح الافراج الكامل عن البكتيريا الأمعاء إلى المخزن المؤقت.
- استخراج الحمض النووي الميكروبي الأمعاء عن طريق طقم استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري.
- تنفيذ كمية البكتيريا بواسطة PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qPCR) على الحمض النووي الجينومي باستخدام الاعوام البكترية eubacteria العالمي (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT و R: GGACTAGAGGTATTATCTAACTGTT).
- إعداد تعليق بكتيري
- قياس الحل البكتيري مع مقياس الطيف. أضف 1 OD (OD600) تعليق بكتيري في أنبوب 1 مل. الطرد المركزي تعليق في 5000 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
- تجاهل عظمى وإضافة 1 مل من العقيمة 1X PBS العازلة إلى أنبوب 1.5 مل لتعليق هطول الأمطار.
- جهاز طرد مركزي عند 5000 x غم لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 4 درجة مئوية؛ تجاهل المناط.
- كرر الخطوات 2.4.2 و 2.4.3.
- إضافة 200 μL من معقم 1X PBS العازلة إلى هطول الأمطار البكتيرية.
- إضافة 600 ميكرولتر من محلول السكروز 10٪ ، 200 ميكرولتر من 10 ملم ATP (الذي يعمل بمثابة phagostimulant) ، و 200 ميكرولتر من التعليق البكتيري في أنبوب عقيم 1.5 مل. مزيج من دوامة. بدلا من ذلك، تعليق البكتيريا بيليه في الدم المعطل للحرارة.
- إعداد الدم المعطل للحرارة
- جمع الدم الطازج مع أنبوب مضاد للتخثر.
- خذ 2-3 مل من الدم الطازج. جهاز طرد مركزي عند 1000 x غم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لفصل البلازما وخلايا الدم. لاحظ أن الدم سوف تضيع أثناء عملية الطرد المركزي والغسيل; هناك حاجة لحساب الاستخدام مقدما.
- جمع البلازما في أنبوب جديد 1.5 مل والحرارة المعطلة في 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- إضافة 500 μL من معقم 1X PBS العازلة إلى 1.5 مل أنبوب لتعليق خلايا الدم. جهاز طرد مركزي في 1000 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية ثم تجاهل supernatant.
- كرر الخطوة 2.4.7.4 مرتين.
- خلايا الدم resuspend مع البلازما المعطلة للحرارة للحصول على الدم المعطل للحرارة.
- اتبع الخطوات 2.4.1 إلى 2.4.4 للحصول على 1 OD البكتيرية بيليه.
- Resuspend البكتيريا بيليه مع 1 مل من الدم المعطل للحرارة.
- تغذية البعوض مع تعليق البكتيريا.
- تجويع البعوض لمدة 24 ساعة ، مما يسمح للمضادات الحيوية بالتأيض قبل تغذية البكتيريا.
- تجميع نظام تغذية الغشاء.
- ختم وحدة التغذية معقمة مع parafilm، بدلا من ذلك غشاء الكولاجين.
- وضع على حلقة بلاستيكية وإصلاحه مع parafilm لتجنب كسر بسبب الاحتكاك أثناء التغذية.
- إضافة ببطء الحل البكتيرية المعدة إلى وحدة التغذية. لاحظ أنه يمكن ملء بئر واحد فقط من وحدة التغذية ذات البئرين بالمحل وتغطي وحدة التغذية فقط من جانب المتساقط.
- توصيل وحدة التغذية إلى نظام تغذية محمّى إلى 37 درجة مئوية، والذي يحاكي درجة حرارة الإنسان لجذب البعوض. ضع جهاز التغذية على كوب ورقي مملوء بالبعوض وتغذى لمدة 90 دقيقة.
- بعد التغذية ، يُجرن البعوض عن طريق إخضاعه لدرجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 3-5 دقائق ويُبقي البعوض مُجَنَّدًا في طبق بيتري بارد.
- اختيار البعوض المناتقن بالكامل لمزيد من الدراسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إخراج منتصف البعوض المعالج بالمضادات الحيوية وبدون مضادات حيوية لاستخراج الحمض النووي ، وتم إجراء qPCR بأوامير بكتيريا عالمية. ويبين الشكل 1 التعبير عن البكتيريا 16S rRNA في مجموعة التحكم ومجموعة العلاج بالمضادات الحيوية. وتظهر النتائج أن حوالي 98٪ من البكتيريا الأمعاء قد أزيلت، والتعقيم الأمعاء من البنسلين وstreptomycin كان ناجحا.
مع الطرق الموصوفة ، تم عزل سلالات البكتيريا وتحديدها. C. صبغة صبغية هو غير مستنتج, oxidase إيجابية الغرام سلبية عصية هوائية, التي تنتمي إلى كريسيوباكتيريوم. ويبين الشكل 2 متوسط البيض وضعت لكل بعوضة بعد التغذية بالدم من البعوض المعالجة بالمضادات الحيوية مع C. السحايا. ويبين الشكل 3 التعبير عن الجينات ذات الصلة تطور المبيض 24 ح بعد وجبة الدم التي تحتوي على C. 1. 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 C. meningosepticum يتم سرد نظرة عامة على الجينات ذات الصلة وتطور المبيض وتسلسل التمهيدي في الجدول 1.
تم تقسيم السلالة المعزولة من البكتيريا المعوية التي أزيلت منها البكتيريا المعوية ثم البعوض المتقن بالكامل إلى ثلاث مجموعات. واستخدمت خمس اناث في المجموعة الاولى والمجموعة الثانية لاحصاء كمية التفريخ، واستخدمت 10 اناث في المجموعة الثالثة للكشف عن التعبير الجيني المتعلق بتطور المبيض بعد 24 ساعة من كل بعوضة انثى بعد تغذيته على التوالي. تظهر النتائج أنه لا يوجد أي تغيير كبير في إنتاج البيض في المجموعة الخاضعة للمراقبة ومجموعة التغذية.
الشكل 1: التعبير عن 16S rRNA بعد العلاج بالمضادات الحيوية. البعوض مع المضادات الحيوية غير المعالجة بمثابة مجموعة المكافحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تأثير ميكروب الأمعاء على oviposition البعوض. تم خلط سلالات البكتيريا المشار إليها بالدم وتغذيتها بالبعوض المعالج بالمضادات الحيوية. البعوض مع الميكروبات الأمعاء غير المعالجة commensal خدم كمجموعة التحكم. يتم عرض البيانات على أنها متوسط ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التعبير عن الجينات المتعلقة بالتكاثر بعد تغذية الدم. التعبير عن Cathepsin B (A, مثبطات ATPase الميتوكوندريا (B) ، الريبوسوم بروتين التكاثر الحيوي brix (C) ، وسيرين / ثريونين البروتين كيناز ريو 2 (D) بعد تغذية الدم من البعوض المعالجة بالمضادات الحيوية لمدة 24 ساعة مع سلالات البكتيريا المشار إليها. البعوض مع ميكروب الأمعاء غير المعالجة commensal خدم كمجموعة التحكم. كل نقطة تمثل البعوض وكل خط يمثل القيمة الوسيطة للمجموعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم | عدد الجينات | تسلسل التمهيدي |
| Cathepsin B | AAEL009642 | التمهيدي إلى الأمام-GAGGGAAAGTTTTCGATGTGGA |
| عكس التمهيدي AATCCCACCACCACCACCAGTA | ||
| مثبطات ATPase الميتوكوندريا | AAEL004284 | إلى الأمام التمهيدي-CAACTGCACAAGCTGAGA |
| عكس التمهيدي -ACGTGCGATAGCTTCTTCGT | ||
| ريبوسوت بروتين الطمث الحيوي بركسل | AAEL001917 | إلى الأمام التمهيدي-GAACAACAAGCGAATGAA |
| عكس التمهيدي-TTGGCCTTGGGTCGTCTT | ||
| سيرين/ثريونين البروتين كيناسي ريو2 | AAEL011114 | إلى الأمام التمهيدي-GAGGAGAAAGCAGCACAACC |
| عكس التمهيدي-TCGAATGGCTTTTCCTC |
الجدول 1: الجينات ذات الصلة بتطور المبيض وتسلسلات التمهيدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وجدت البحوث على التفاعلات الميكروب المضيف أن الميكروبات الأمعاء المختلفة تؤثر على علم وظائف الأعضاء المضيف من خلال آليات متباينة. هذه المادة يقدم طريقة للتحقيق في دور كل من البعوض ميكروب الأمعاء، بما في ذلك تشريح البعوض منتصف، واستزراع بكتيريا الأمعاء زراعة، والعلاج بالمضادات الحيوية، وإعادة إدخال البكتيريا ذات الاهتمام.
من أجل العلاج الناجح بالمضادات الحيوية، يجب مراعاة التفاصيل التالية عند إجراء التجربة. في هذا البروتوكول، تم علاج البعوض باستخدام كرات القطن مبللة مع محلول السكروز 10٪ بما في ذلك 20 وحدة من البنسلين و 20 ميكروغرام من الستربتومايسين لكل مل لمدة 3 أيام11،16. خدم البنسلين كمضاد حيوي واسع الطيف ضد البكتيريا الإيجابية الغرام، وخدم الستربتوميسين كمضاد حيوي واسع الطيف ضد البكتيريا السالبة للجرام20. الحفظ السليم للمضادات الحيوية أمر حيوي لمعالجة فعالة للمضادات الحيوية21. عند تخزينها في -18 درجة مئوية، فإن استقرار البنسلين G لا يقل عن 3 م. ستريبتومايسين مستقر 12 م على الأقل عند تخزينها عند 4 °C22. في حين أن الاختلافات في العلامة التجارية للمضادات الحيوية أو وقت التخزين قد يسبب اختلافات طفيفة في إزالة الميكروبات، فمن الضروري التحقق من الكفاءة بعد كل علاج المضادات الحيوية. بالإضافة إلى qPCR، تنتشر لوحة أو استخدام PCR تستخدم عادة لتقييم كفاءة العلاج بالمضادات الحيوية23،24. وعلاوة على ذلك ، لمنع البعوض من التلوث بالبكتيريا الأخرى بعد العلاج بالمضادات الحيوية ، يجب إجراء فحص التغذية بمعدات معقمة يتم تجميعها تحت مقعد نظيف للغاية.
قبل التغذية عن طريق الفم البكتيرية ، يجب أن يكون البعوض جائعًا لمدة 24 ساعة للسماح بالمضادات الحيوية التي يتماستقلابها 25. وهذا لا يساعد البعوض على ابتلاع البكتيريا السائلة فحسب ، بل يمنع أيضًا المضادات الحيوية من قتل البكتيريا.
باعتراف الجميع، هذا البروتوكول هو أساسا للتحقيق في تأثير البكتيريا التي يمكن الاستزراع بها. لدراسة الميكروبات المعوية من الفقاريات واللافقاريات المضيف، وإعادة إدخال البكتيريا التي يمكن زراعةها إلى المضيف المضادات الحيوية المستخدمة عادة في الأبحاث الحديثة8,26,27. بالإضافة إلى ذلك ، يستند التحديد الأولي للبكتيريا المعوية المستزرعة بشكل عام على خصائص حجم المستعمرة والشكل واللون والحافة والعتامة والارتفاع والاتساق28. بالنسبة للبكتيريا غير القابلة للاستزراع، من المرجح أن توفر المقاربات الماجومية ذات التسلسل العالي معلومات شاملة عن التكوين الكلي للميكروبات المتوسطة29،30،31. ومع ذلك، فإن التفاعل بين البكتيريا غير القابلة للاستزراع والمضيف لا يزال غير مستكشف إلى حد كبير.
تقدم هذه المقالة خيارين بديلين لدراسة تأثير ميكروب الأمعاء على oviposition البعوض ، وخلط البكتيريا مع الدم المعطل للحرارة أو زرع البكتيريا عن طريق تغذية السكر تليها تغذية الدم. وقد اعتمد الممثل في هذه المخطوطة الخيار الأول، في حين أن الطريقة الأخيرة حققت نتائج مماثلة. ويمكن إجراء دراسات مختلفة بعد التغذية عن طريق الفم مع سلالة بكتيريا محددة واحدة. ويمكن استخدام الفحص اللاحق للتحقيق في كيفية تعديل العامل الميكروبي للسلوك الحركي للبعوض. يمكن اتباع مقايسة البروتين الكمي لدراسة آثار البكتيريا المختلفة على الهضم. مع تعديلات طفيفة، يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة الآثار الخاصة بالميكروبات المختلفة تجاه علم وظائف الأعضاء البعوض، بما في ذلك امتصاص المغذيات، والمناعة، والتنمية، والتكاثر، وكفاءة ناقلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة رقم 81902094، 81600497)، ومشروع خطة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة هونان (2019RS1036).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), New York, N.Y. 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
