Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En bakteriel oral fodring assay med antibiotika-behandlede myg

Published: September 12, 2020 doi: 10.3791/61341
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Intestinal Function and Regulation, College of Life Science, Hunan Normal University, 2State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish, Hunan Provincial Key Laboratory for Microbial Molecular Biology, College of Life Science, Hunan Normal University, 3Department of Infectious Diseases, the Second Xiangya Hospital, Central South University

Summary

Denne artikel præsenterer en protokol til at undersøge effekten af de enkelte myg tarmbakterier, herunder isolering og identifikation af myg midgut kultivable mikrober, antibiotika udtynding af myg tarmbakterier, og genindføre en bestemt bakterie arter.

Abstract

Myg midgut havne en meget dynamisk mikrobiom, der påvirker værten stofskifte, reproduktion, fitness, og vektor kompetence. Der er gennemført undersøgelser for at undersøge virkningen af tarmmikrober som helhed; forskellige mikrober kan dog have forskellige virkninger over for værten. Denne artikel indeholder metoden til at undersøge effekten af hver enkelt myg gut mikrobe og den potentielle mekanisme.

Denne protokol indeholder to dele. Den første del introducerer, hvordan man dissekere myg midgut, isolere kultivable bakterier kolonier, og identificere bakterier arter. Den anden del giver mulighed for at generere antibiotika-behandlede myg og genindføre en bestemt bakterie arter.

Introduction

Myg anses for at være de vigtigste vektorer af humane patogene sygdomme, overføre over hundrede patogener, herunder Zika virus, Dengue virus, og Plasmodium parasitter1. Når myg tage et blodmåltid at erhverve næringsstoffer til oviposition, de kan ved et uheld indtage patogener fra en inficeret vært via fordøjelseskanalen2. Vigtigere, myg midgut, som spiller en afgørende rolle i både blod måltid fordøjelse og patogen indgang, havne en meget dynamisk mikrobiom3.

Flere undersøgelser har karakteriseret lab-opdrættet og felt-indsamlet myg mikrobiota ved hjælp af enten en kultur-afhængig metode eller en bakterie sekventering assay4,5,6. Arter, herunder Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, og Enterococcus er almindeligvis isoleret fra myg i forskelligeundersøgelser 5,,7,,8,9. Interessant, myg gut mikrobiota svinger dynamisk i både samfundet mangfoldighed og mængden af bakterier arter, påvirket af udviklingsstadiet, arter, geografisk oprindelse, og fodring adfærd4. Undersøgelser viser, at blodfodring dramatisk øger den samlede bakteriebelastning med hurtig ekspansion af arter fra Enterobacteriaceae og en reduktion i den samledemangfoldighed 10,11. Desuden er mygge gut mikrobiota af larve fase normalt udryddet, når insektet gennemgår metamorfose under pupation og eclosion; således, nyligt opstået voksne myg nødt til at genbefolke deres mikrobiota4.

Gut mikrobiota modulerer insekt fysiologi i forskellige aspekter, herunder næringsstof absorption, immunitet, udvikling, reproduktion, og vektor kompetence12. Axenic myg larver undlader at udvikle sig ud over den første instar, mens en bakterier oral forsyning redder udvikling, hvilket indikerer, at myg tarmmikrobe er afgørende for larveudvikling 13,,14. Udover, udtynding af tarmbakterier forsinker blod måltid fordøjelse og næringsstof absorption, påvirker oocyt modning, og nedsætter oviposition15. Desuden fremkalder myg med tarmmikroflora højere immunrespons sammenlignet med antibiotikabehandlede myg, med konstant forhøjet antimikrobielt peptid udtryk mod andre patogener til at inficere16. Antibiotika er normalt oralt administreres for at fjerne pan tarmbakterier i disse undersøgelser, og derefter eksperimenter udføres for at sammenligne forskellen mellem axenic myg og myg med commensal mikrober. Men myg midgut havne et mangfoldigt fællesskab af mikrober, og hver bakterie arter kunne udøve en særskilt effekt mod værten fysiologi.

Mosquito microbiota regulerer vektor kompetence med divergerende virkninger. Kolonisering af Proteus isoleret fra felt-afledte myg af dengue-endemiske områder giver opreguleret antimikrobiel peptid udtryk og resistens over for dengue virus infektion16. Den entomopathogenic svamp Beauveria bassiana aktiverer Toll og JAK-STAT immun vej mod arbovirus infektion17. Derimod svampen Talaromyces isoleret fra Aedes aegypti midgut letter dengue virus infektion ved modulerende gut trypsin aktivitet18. Desuden, Serratia marcescens fremmer arbovirus transmission gennem en sekretorisk protein kaldet SmEnhancin, som fordøjer mucin lag på tarm epitel af myg19.

Denne procedure giver en systematisk og intuitiv metode til dissektion af myg midgut, isolering af kultivable bakterier kolonier, identifikation af bakteriearter, og genindførelse via oral fodring. Det giver repræsentative resultater af blod fodring med en commensal bakterie, Chryseobacterium meningosepticum, om myg æggesting udvikling og oviposition.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Midgut dissektion og kultivable bakterier isolering

  1. Forbered myg til dissektion.
    1. Saml myggene 7-9 dage efter fremkomsten med en aspirator. Bedøve de opsamles myg ved at udsætte dem for en temperatur på 4 °C i 3-5 min og holde myg bedøvet i en iskold petriskål indtil dissektion.
  2. Steriliser laboratorieinstrumenter og myggeoverfladen.
    1. Steriliser eksperimentbænken, dissekere mikroskop, saftræt og glasrutsjebanen ved at sprøjte 75% ethanol for at undgå forurening med bakterier fra miljøet.
    2. Der tilberedes en steril petriskål med 75 % ethanol og to petriskåle indeholdende sterilt 1x fosfat bufferet saltvand (1x PBS).
    3. Overflade-sterilisere myg ved at dyppe og ryste dem i 75% ethanol i 3 min, og skyl to gange med 1x PBS buffer i tilfælde af ethanol påvirker dissekeret tarmfloraen.
  3. Disseker myg midgut.
    1. Overfør den overfladesteriliserede myg på glasrutsjebanen med en dråbe steril 1x PBS-buffer. Dissekere under det dissekerende mikroskop.
    2. Under den nederste forstørrelse af dissekere mikroskop, forsigtigt fjerne ben, vinger, og hovedet af myg for at forhindre flugt. Fjern den sidste somit af myg ved at skære direkte, snarere end at trække det, for at forhindre fordøjelseskanalen fra at bryde.
    3. Klem myg's brystkasse og slutningen af maven med spån. Træk forsigtigt myggens fordøjelseskanalen ud. Den erhvervede fordøjelseskanalen indeholder normalt afgrøden, foregut, midgut, hindgut, og malpighianske rør.
    4. Juster det dissekerende mikroskop til en højere forstørrelse. Fjern afgrøden, foregut, hindgut, og malpighian rør fra de dissekerede fordøjelseskanalen for at få midgut af myg.
    5. Pas på, mens du fjerner afgrøden, da afgrøden puster op og ligner midgut efter myg tager et sukkermåltid. Den Malpighian rør, en gruppe af lange og tynde ekskrekering rør, er placeret på grænsen mellem midgut og baggut.
  4. Isoler tarmbakterier.
    1. Den dissekerede midgut overføres til et sterilt 1,5 ml rør med 200 μL steril 1x PBS-buffer.
    2. Grind midgut på en steril bænk grundigt med en steril støder til at tillade fuldstændig frigivelse af tarmbakterier til bufferen.
    3. Serielle fortyndes homogenatet til tre 10-fold fortyndinger. Der tilsættes 50 μL af hver fortynding til LB (Luria bouillon) agar plade, og derefter sprede det på pladen. Hvis midgut indeholder en høj koncentration af tarmfloraen, er det vigtigt at gøre mere serielle fortyndinger at udvælge enkelte kolonier.
    4. Pladen inkuberes ved 37 °C i 1-2 dage, indtil enkelte kolonier er synlige.
  5. Identifikation af arter
    1. Pluk enkelte kolonier og inokuler dem i en 150 ml konisk kolbe, der indeholder 50 ml LB bouillonmedium.
    2. Ryst bakterierne ved 37 °C natten over.
    3. Uddrag total DNA ved bakteriel genomisk DNA ekstraktion kit. Forstærke 16S rDNA ved polymerase kædereaktion (PCR).
      BEMÆRK: Der er flere segmenter i 16S rDNA, der er bevaret. Baseret på disse bevarede regioner, universelle primere for bakterier kan designes til at forstærke 16S rDNA fragmenter af alle bakterier. Disse primere er specifikke for bakterier, og forskellen i den variable region 16S rDNA kan bruges til at skelne mellem forskellige bakterier. Derfor er 16S rDNA meget udbredt til bakteriel identifikation.
    4. Genvind og rengør DNA-fragmenter fra PCR-produkter ved agarosegelelektroforese og et kommercielt gelgenvindingssæt.
    5. Udfør DNA-sekvensering på de rensede DNA-fragmenter for at opnå bakterielle gensekvenser.
    6. Sammenlign 16S rRNA-gensekvensen med den bakteriesekvens, der er tilgængelig i GenBank. Vælg databasen Bakterier og Archaea.
      BEMÆRK: Identifikationen af artsniveauet blev defineret som ≥99% 16S rDNA sekvens lighed med den nærmeste GenBank post. Isolatet blev tildelt den tilsvarende slægt, da dens 16S rDNA sekvenslighed var <99% og ≥95%.

2. Genindførelse af antibiotikabehandling og bakterie

  1. Forbered antibiotisk opløsning.
    1. Den nødvendige mængde saccharose, penicillin og streptomycin afvejes for at klargøre en 10 % saccharoseopløsning, herunder 20 enheder penicillin og 20 μg streptomycin pr. ml.
  2. Feed myg med antibiotika opløsning.
    1. Bedøve myggene i 4 °C i 3-5 min. Overfør myggene til en papirkop. Dæk toppen med gaze og vind gaze med tape for at forhindre myg i at undslippe.
    2. Dyp sterile vatkugler i antibiotisk opløsning og læg dem omhyggeligt på myg kop. Klem vatkuglerne før brug for at forhindre myg fra at drukne i dryppende vatkugler.
    3. Dæk vatkugler med en 10 cm petriskål for at forhindre fugtfordampning. Udskift vatkuglerne to gange om dagen i tre på hinanden følgende dage.
  3. Bekræft effektiviteten af antibiotikabehandlingen.
    1. Ifølge ovenstående metode, dissekere midgut af antibiotika-behandlede myg.
    2. De dissekerede midguts overføres til et sterilt 1,5 ml rør med 200 μL steril 1x PBS-buffer.
    3. Grind midguts i en steril bænk grundigt med en steril støder til at tillade fuldstændig frigivelse af tarmbakterier til bufferen.
    4. Uddrag tarmmikrobielt DNA ved bakteriel genomisk DNA-ekstraktionssæt.
    5. Udfør bakterieantydning ved real-time kvantitative PCR (qPCR) på genomisk DNA ved hjælp af universelle eubacteria primere (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT og R: GGACTACCAGGGGGTATATAATCCTGTT).
  4. Fremstilling af bakteriel suspension
    1. Mål bakterieopløsningen med et spektrofotometer. Der tilsættes 1 OD (OD600) bakteriesuspension i et 1 ml rør. Centrifuge suspensionen ved 5.000 x g i 5 min. ved 4 °C.
    2. Kassér supernatanten og tilsæt 1 ml steril 1x PBS-buffer til 1,5 ml rør til affjedring.
    3. Centrifuge ved 5.000 x g i 5 min. ved 4 °C kassere supernatanten.
    4. Trin 2.4.2 og 2.4.3 gentages.
    5. Tilsæt 200 μL steril 1x PBS buffer til bakteriefældning.
    6. Der tilsættes 600 μL 10% saccharoseopløsning, 200 μL 10 mm ATP (som fungerer som fagocymulant) og 200 μL bakteriel suspension i et sterilt 1,5 ml rør. Bland ved vortexing. Alternativt kan du suspendere bakteriel pelleteret i varmeinaktiveret blod.
    7. Fremstilling af varmeaktiveret blod
      1. Opsaml frisk blod med et antikoagulerende rør.
      2. Tag 2-3 ml frisk blod. Centrifuge ved 1.000 x g i 10 minutter ved 4 °C for at adskille plasma og blodlegemer. Bemærk, at blodet vil gå tabt under centrifugering og vask proces; der er behov for at beregne brugen på forhånd.
      3. Plasmaet opsamls i et nyt 1,5 ml rør og varmeaktiveres ved 56 °C i 1 time.
      4. Der tilsættes 500 μL steril 1x PBS-buffer til 1,5 ml rør til suspension af blodlegemer. Centrifuge ved 1.000 x g i 10 minutter ved 4 °C kasseres, hvor supernatanten kasseres.
      5. Gentag trin 2.4.7.4 to gange.
      6. Resuspenderede blodlegemer med varmeinaktiveret plasma for at opnå varmeinaktiveret blod.
      7. Følg trin 2.4.1 til 2.4.4 for at få 1 OD bakteriel pelleteret.
      8. Resuspend bakterierne pelleteret med 1 ml varmeinaktiveret blod.
  5. Fodre myg med bakterier suspension.
    1. Sult myggene i 24 timer, så antibiotika kan metabolisere før fodring bakterier.
    2. Saml membran-fodring system.
    3. Seal den steriliserede feeder enhed med en parafilm, alternativt en kollagen membran.
    4. Sæt på en plastik ring og ordne det med parafilm for at undgå at bryde på grund af friktion under fodring.
    5. Tilsæt langsomt den forberedte bakterieopløsning til fødeenheden. Bemærk, at kun én brønd af den to-brønds fødeenhed kan fyldes med opløsningen og kun dække fødeenheden fra reagensets faldside.
    6. Tilslut fødeenheden til et fodringssystem forvarmet til 37 °C, hvilket simulerer menneskers temperatur for at tiltrække myg. Anlæg fodringsanordningen på en papirkop fyldt med myg og tilspænding i 90 min.
    7. Efter fodring, bedøve myggene ved at udsætte dem for en temperatur på 4 °C i 3-5 min og holde myg bedøvet i en iskold petriskål.
    8. Vælg de fuldt engorged myg til yderligere undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Midguts af myg behandlet med antibiotika og uden antibiotika blev taget ud for DNA-ekstraktion, og qPCR blev udført med universelle bakterielle primere. Figur 1 viser ekspressionen af bakteriel 16S rRNA i kontrolgruppen og antibiotikabehandlingsgruppen. Resultaterne viser, at omkring 98% af tarmbakterierne er blevet fjernet, og tarmsterilisering af penicillin og streptomycin var en succes.

Med de beskrevne metoder blev bakteriestammer isoleret og identificeret. C. meningosepticum er en nonfermenting, oxidase-positiv gram-negativ aerob bacillus, der tilhører Chryseobacterium. Figur 2 viser det gennemsnitlige æg, der er lagt pr. myg efter blodfodring af antibiotikabehandlede myg med C. meningosepticum. Figur 3 viser ekspressionen af ovarieudviklingsrelaterede gener 24 timer efter blodmel, der indeholder C. meningosepticum. En oversigt over de ovarieudviklingsrelaterede gener og primersekvenser er anført i tabel 1.

Stammen isoleret fra tarmbakterier, hvorfra tarmbakterier blev fjernet, og derefter fuldt engorged myg blev opdelt i tre grupper. Fem hunner i den første gruppe og den anden gruppe blev brugt til at tælle gydebeløbet, og 10 hunner i den tredje gruppe blev brugt til at detektere genekspressionen relateret til ovarieudvikling efter henholdsvis 24 timer af hver kvindelig myg efter fodring. Resultaterne viser, at der ikke er nogen væsentlig ændring i kontrolgruppens og fodringsgruppens ægproduktion.

Figure 1
Figur 1: Ekspression af 16S rRNA efter behandling med antibiotika. Myggene med ubehandlet antibiotika fungerede som kontrolgruppen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Effekt af tarmmikrober på myg oviposition. De angivne bakteriestammer blev blandet med blod og fodret med antibiotikabehandlede myg. Myggene med ubehandlede tarmkommensale mikrober fungerede som kontrolgruppen. Dataene præsenteres som gennemsnitlig ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Ekspression af reproduktionsrelaterede gener efter blodfodring. Ekspression af Cathepsin B (A), Mitokondriel ATPase-hæmmer (B), Ribosom biogeneseprotein brix (C) og Serine/Threonne-protein kinase rio2 (D) efter blodfodring af antibiotikabehandlede myg i 24 timer med de angivne bakteriestammer. Myggene med ubehandlet gut commensal mikrobe tjente som kontrolgruppen. Hver prik repræsenterer en myg, og hver linje repræsenterer gruppens medianværdi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Navn gennummer primer sekvens
Cathepsin B AAEL009642 Frem primer-GAGGGAAAGTTCGATGTGGA
Omvendt primer-AATCCCACATCCACCCAGTA
Mitokondriel ATPase-hæmmer AAEL004284 Forward primer-CAACTGCACAAGCTGAAGGA
Omvendt primer-ACGTGCGATAGCTTCTTCGT
Ribosom biogeneseprotein brix AAEL001917 Fremad primer-GAACAGCACAAGCGAATGAA
Omvendt primer-TTGGCCTTGAGTCGTCTT
Serine/Threonine-protein kinase rio2 AAEL011114 Fremadrettet primer-GAGGAGAAAGCAGCACAACC
Omvendt primer-TCGAATGGCTTTTTTTC

Tabel 1: Ovarieudviklingsrelaterede gener og primersekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskning i vært-mikrobe interaktioner har vist, at forskellige tarm mikrober påvirker deres vært fysiologi via divergerende mekanismer. Denne artikel introducerer metoden til at undersøge den respektive rolle myg gut mikrobe, herunder dissekere myg midgut, dyrkekultebare tarmbakterier, antibiotikabehandling, og genindføre bakterier af interesse.

For vellykket antibiotikabehandling skal følgende detaljer overvejes ved udførelsen af forsøget. I denne protokol blev myg behandlet med vatkugler fugtet med en 10% saccharoseopløsning, herunder 20 enheder penicillin og 20 μg streptomycin pr. ml i 3 dage11,16. Penicillin tjente som et bredt spektrum antibiotika mod gram-positive bakterier, og streptomycin tjente som et bredt spektrum antibiotika mod gram-negative bakterier20. Korrekt bevarelse af antibiotika er afgørende for effektiv antibiotikabehandling21. Når penicillin G opbevares ved -18 °C, er den mindst 3 m. Streptomycin er stabil i mindst 12 m, når det opbevares ved 4 °C22. Mens forskelle i antibiotika mærke eller opbevaringstid kan forårsage små forskelle i mikrobiel clearance, er det nødvendigt at kontrollere effektiviteten efter hver antibiotikabehandling. Ud over qPCR, sprede pladen eller ved hjælp af PCR er almindeligt anvendt til at vurdere effektiviteten af antibiotikabehandling23,24. Desuden, for at forhindre myg fra at blive forurenet med andre bakterier efter antibiotikabehandling, fodring assay skal udføres med steriliseret udstyr samlet under en super ren bænk.

Før bakteriel oral fodring, myggene bør sultes i 24 timer for at tillade antibiotika, der skal metaboliseres25. Dette hjælper ikke kun myggene indtage bakterier væske, men også forhindrer antibiotika fra at dræbe bakterier.

Ganske vist, denne protokol er primært til undersøgelse af effekten af kultivable bakterier. At studere tarm mikrobiota af hvirveldyr og hvirvelløse vært, genindførelse af kultivbare bakterier til antibiotika-behandlede vært er almindeligt anvendt i de senesteundersøgelser 8,26,27. Desuden er den første identifikation af dyrkede tarmbakterier generelt baseret på egenskaberne af kolonistørrelse, form, farve, kant, opacitet, højde og konsistens28. For ikke-dyrkelige bakterier vil sequencing-baserede metagenome metoder med høj gennemløb sandsynligvis give omfattende oplysninger om den samlede sammensætning af midgutmibiota29,30,31. Samspillet mellem ikke-dyrkningsbakterier og værten er dog stort set uudforsket.

Denne artikel tilbyder to alternative muligheder for at undersøge effekten af tarmmikrobe på myg oviposition, blande bakterier med varme-inaktiveret blod eller implantation af bakterier via sukker fodring efterfulgt af blodfodring. Repræsentanten resulterede i dette manuskript, men den første metode gav lignende resultater. Forskellige undersøgelser kan udføres efter oral fodring med en bestemt bakterie stamme. Efterfølgende analyse kunne bruges til at undersøge, hvordan mikrobielle faktor modulerer myg locomotor adfærd. Protein kvantificering assay kunne følges for at undersøge virkningerne af forskellige bakterier på fordøjelsen. Med mindre ændringer, denne metode kan bruges til at studere de respektive virkninger af forskellige mikrober mod myg fysiologi, herunder næringsstof absorption, immunitet, udvikling, reproduktion, og vektor kompetence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), og Science and Technology Plan Project of Hunan Province (2019RS1036).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383 Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions
Aedes aegypti Female mosquitoes
Anticoagulant tube BD Vacutainer 363095 Collect fresh blood
Centrifuge tube Sangon Biotech F601620-0010 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile
Cotton balls
Disposable Tissue Grinding Pestle Sangon Biotech F619072-0001 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile
Ethanol absolute Paini Dilute it to 75% ethanol
Forceps RWD F11029 Dissection
Hemotek Membrane Feeding System Hemotek Components of the feeding system, including  Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.
Incubator shaker ZQZY-78AN
Inoculation Loops Sangon Biotech F619312-0001 10 μl, Yellow
LB Agar Powder Sangon Biotech A507003 Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g.
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002 Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g.
Microscope Zeiss Stemi508
Paper cup Place mosquito
Parafilm Sangon Biotech F104002 4 inx 125 ft
Petri dish Sangon Biotech F611203
Penicillin G procaine salt hydrate Sangon Biotech A606248 White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol
Single Channal Pipettor Gilson
Streptomycin sulfate Sangon Biotech A610494 Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.
Sucrose Sangon Biotech A502792 Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.
TIANamp Bacteria DNA Kit TIANGEN DP302 Extract DNA 
Utility Fabric-Mosquito Netting White
Vortex mixer Scintic Industries S1-0246
1.5ml EP tube Sangon Biotech F600620
10X PBS buffer Sangon Biotech E607016 This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
  2. Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
  3. Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
  4. Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
  5. Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
  6. Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
  7. Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
  8. Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
  9. Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
  10. Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
  11. Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
  12. Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
  13. Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
  14. Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
  15. de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
  16. Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
  17. Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
  18. Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
  19. Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
  20. Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
  21. Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
  22. Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
  23. Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
  24. Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
  25. Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
  26. Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
  27. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), New York, N.Y. 249-252 (2011).
  28. Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
  29. Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
  30. Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
  31. Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).

Tags

Biologi myg midgut mikrobiota tarmbakterier antibiotika sukker fodring blod fodring Aedes aegypti
En bakteriel oral fodring assay med antibiotika-behandlede myg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, X., Wu, S., Li, W., Zhang, M.,… More

Liu, X., Wu, S., Li, W., Zhang, M., Wu, Y., Zhou, N., Wu, P. A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes. J. Vis. Exp. (163), e61341, doi:10.3791/61341 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter