Summary
Este artigo apresenta um protocolo para investigar o efeito de bactérias intestinais individuais do mosquito, incluindo isolamento e identificação de micróbios cultivados de mosquitos midgut, esgotamento de antibióticos de bactérias intestinais de mosquitos e reintroduzir uma espécie específica de bactérias.
Abstract
O mosquito midgut abriga um microbioma altamente dinâmico que afeta o metabolismo hospedeiro, reprodução, aptidão e competência vetorial. Estudos têm sido realizados para investigar o efeito de micróbios intestinais como um todo; no entanto, diferentes micróbios poderiam exercer efeitos distintos em relação ao hospedeiro. Este artigo fornece a metodologia para estudar o efeito de cada micróbio intestinal específico do mosquito e o mecanismo potencial.
Este protocolo contém duas partes. A primeira parte introduz como dissecar o mosquito midgut, isolar colônias de bactérias cultivaveles e identificar espécies de bactérias. A segunda parte fornece o procedimento para gerar mosquitos tratados com antibióticos e reintroduzir uma espécie específica de bactérias.
Introduction
Os mosquitos são considerados os vetores mais importantes das doenças patogênicas humanas, transmitindo mais de cem patógenos, incluindo o vírus Zika, o vírus da dengue e os parasitas do Plasmodium 1. Quando os mosquitos fazem uma refeição sanguínea para adquirir nutrientes para oviposição, eles podem acidentalmente ingerir patógenos de um hospedeiro infectado através do trato digestivo2. É importante ressaltar que o mosquito midgut, que desempenha um papel fundamental tanto na digestão da refeição sanguínea quanto na entrada do patógeno, abriga um microbioma altamente dinâmico3.
Vários estudos caracterizaram microbiota de mosquitos criados em laboratório e coletados em campo usando um método dependente da cultura ou um ensaio de sequenciamento de bactérias4,,5,,6. Espécies como Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiae Enterococcus são comumente isoladas de mosquitos em diversos estudos5,,7,,8,9. Curiosamente, a microbiota intestinal do mosquito flutua dinamicamente tanto na diversidade comunitária quanto na quantidade de espécies de bactérias, afetadas pelo estágio de desenvolvimento, espécies, origem geográfica e comportamento alimentar4. Estudos mostram que a alimentação sanguínea aumenta drasticamente a carga bacteriana total com rápida expansão de espécies de Enterobacteriaceae e redução da diversidade global10,11. Além disso, a microbiota intestinal do mosquito do estágio larval é geralmente erradicada quando o inseto sofre metamorfose durante a pupação e a eclosão; assim, os mosquitos adultos recém-emergidos precisam repovoar sua microbiota4.
Microbiota intestinal modula a fisiologia de insetos em vários aspectos, incluindo absorção de nutrientes, imunidade, desenvolvimento, reprodução e competência vetorial12. As larvas de mosquitos axenic não se desenvolvem além da primeira instar enquanto uma bactéria de suprimento oral resgata o desenvolvimento, indicando que o micróbio intestinal do mosquito é essencial para o desenvolvimento larval13,14. Além disso, o esgotamento das bactérias intestinais retarda a digestão da farinha de sangue e a absorção de nutrientes, afeta a maturação do oócito e diminui a oviposição15. Além disso, mosquitos com microflora intestinal provocam maiores respostas imunes em comparação com mosquitos tratados com antibióticos, com expressão de peptídeo antimicrobiano constantemente elevada contra outros patógenos para infectar16. Antibióticos são geralmente administrados oralmente para remover bactérias intestinais pan nesses estudos, e então experimentos são realizados para comparar a diferença entre mosquitos machados e mosquitos com micróbios commensais. No entanto, o mosquito midgut abriga uma comunidade diversificada de micróbios, e cada espécie de bactéria poderia exercer um efeito distinto em relação à fisiologia hospedeira.
Microbiota de mosquitos regula a competência vetorial com efeitos divergentes. Colonização por Proteus isolada de mosquitos derivados de campo de áreas endêmicas da dengue confere expressão de peptídeo antimicrobiano regulamentada e resistência contra a infecção pelo vírus da dengue16. O fungo entomopatômico Beauveria bassiana ativa a via imunológica Toll e JAK-STAT contra a infecção por arboviroses17. Em contrapartida, o fungo Talaromyces isolado do Aedes aegypti midgut facilita a infecção pelo vírus da dengue através da modulação da atividade de trippsina intestinal18. Além disso, Serratia marcescens promove a transmissão de arboviroses através de uma proteína secreta chamada SmEnhancin, que digere a camada de mucina no epitélio intestinal dos mosquitos19.,
Este procedimento fornece um método sistemático e intuitivo para dissecção do mosquito midgut, isolamento de colônias de bactérias cultivavel, identificação das espécies de bactérias e reintrodução via alimentação oral. Fornece resultados representativos de alimentação sanguínea com uma bactéria commensal, Chryseobacterium meningosepticum,no desenvolvimento do ovário do mosquito e oviposição.
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Protocol
1. Dissecção midgut e isolamento de bactérias cultivais
- Prepare o mosquito para dissecção.
- Recolher os mosquitos de 7 a 9 dias após o surgimento com um aspirador. Anestesiar os mosquitos coletados submetendo-os a uma temperatura de 4 °C por 3-5 min e manter os mosquitos anestesiados em uma placa de Petri gelada até a dissecção.
- Esterilizar instrumentos de laboratório e a superfície do mosquito.
- Esterilize o banco de experimentos, dissecando microscópio, fórceps e lâmina de vidro pulverizando 75% de etanol para evitar contaminação por bactérias do ambiente.
- Prepare uma placa de Petri estéril contendo 75% de etanol e duas placas de Petri contendo salina tamponada de fosfato estéril de 1x (1x PBS).
- Esterilize a superfície do mosquito mergulhando e sacudindo-os em 75% de etanol por 3 minutos, e enxágue duas vezes com 1x de tampão PBS no caso de o etanol afetar a flora intestinal dissecada.
- Dissecar o mosquito midgut.
- Transfira o mosquito esterilizado pela superfície para a lâmina de vidro com uma gota de tampão PBS 1x estéril. Disseca sob o microscópio dissecando.
- Sob a ampliação inferior do microscópio dissecando, remova cuidadosamente as pernas, asas e a cabeça do mosquito para evitar a fuga. Remova o último somite do mosquito cortando diretamente, em vez de puxá-lo, para evitar que o trato digestivo quebre.
- Aperte o tórax do mosquito e a extremidade do abdômen com fórceps. Puxe suavemente o trato digestivo do mosquito. O trato digestivo adquirido geralmente contém a cultura, foregut, midgut, hindgut, e os tubos malpighianos.
- Ajuste o microscópio de dissecação para uma ampliação maior. Remova a cultura, o foregut, o hindgut e os tubos malpighianos do trato digestivo dissecado para obter o midgut do mosquito.
- Tome cuidado ao remover a cultura, pois a cultura infla e se assemelha ao midgut depois que o mosquito toma uma refeição de açúcar. Os tubos malpighianos, um grupo de tubos excretórios longos e finos, estão localizados na fronteira entre o midgut e o hindgut.
- Isolar bactérias intestinais.
- Transfira o midgut dissecado para um tubo estéril de 1,5 mL com 200 μL de tampão PBS estéril de 1x.
- Triture o midgut em um banco estéril completamente com um pilão estéril para permitir a liberação completa de bactérias intestinais no tampão.
- Diluir a homogeneizar para três diluições de 10 vezes. Adicione 50 μL de cada diluição à placa de ágar LB (caldo de Luria) e, em seguida, espalhe-a na placa. Se o midgut contém uma alta concentração de flora intestinal, é essencial fazer mais diluições seriais para escolher colônias individuais.
- Incubar a placa a 37 °C por 1-2 dias até que colônias únicas sejam visíveis.
- Identificação de espécies
- Escolha colônias únicas e inocula-as respectivamente em um frasco cônico de 150 mL contendo 50 mL de meio de caldo LB.
- Agite as bactérias a 37 °C durante a noite.
- Extrair DNA total por kit de extração de DNA genômico bacteriano. Amplie o RDNA 16S por reação em cadeia de polimerase (PCR).
NOTA: Existem vários segmentos em 16S rDNA que são conservados. Com base nessas regiões conservadas, primers universais para bactérias podem ser projetados para amplificar fragmentos de rDNA 16S de todas as bactérias. Estes primers são específicos para bactérias, e a diferença na região variável de 16S rDNA pode ser usada para distinguir diferentes bactérias. Portanto, o 16S rDNA é amplamente utilizado para identificação bacteriana. - Recuperar e purificar fragmentos de DNA de produtos PCR por eletroforese de gel agarose e um kit comercial de recuperação de gel.
- Realize o sequenciamento de DNA nos fragmentos de DNA purificados para obter sequências genéticas bacterianas.
- Compare a sequência genética de rRNA 16S com a sequência bacteriana disponível no GenBank. Selecione o banco de dados Bactérias e Archaea.
NOTA: A identificação ao nível da espécie foi definida como ≥99% 16S rDNA sequência similaridade com a entrada genbank mais próxima. O isolado foi atribuído ao gênero correspondente quando sua similaridade de sequência de rDNA 16S foi <99% e ≥95%.
2. Tratamento de antibióticos e reintrodução de bactérias
- Prepare a solução antibiótica.
- Pese a quantidade necessária de sacarose, penicilina e estreptomicina para preparar uma solução de 10% de sacarose, incluindo 20 unidades de penicilina e 20 μg de estreptomicina por mL.
- Alimente mosquitos com a solução antibiótica.
- Anestesiar os mosquitos em 4 °C por 3-5 min. Transfira os mosquitos para um copo de papel. Cubra a parte superior com gaze e enwind a gaze com fita adesiva para evitar que os mosquitos escapem.
- Mergulhe bolas de algodão estéreis na solução antibiótica e coloque-as cuidadosamente no copo de mosquito. Esprema as bolas de algodão antes de usar para evitar que os mosquitos se afoguem nas bolas de algodão pingando.
- Cubra as bolas de algodão com uma placa de Petri de 10 cm para evitar a evaporação da umidade. Substitua as bolas de algodão duas vezes por dia por três dias consecutivos.
- Confirme a eficácia do tratamento com antibióticos.
- De acordo com o método acima, dissecar o midgut de mosquitos tratados com antibióticos.
- Transfira os meio-médios dissecados para um tubo estéril de 1,5 mL com 200 μL de tampão PBS estéril de 1x.
- Triture os meio-médios em um banco estéril completamente com um pilão estéril para permitir a liberação completa de bactérias intestinais no tampão.
- Extrair o DNA microbiano intestinal pelo kit de extração de DNA genômico bacteriano.
- Realize a quantitação bacteriana por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) no DNA genômico usando primers de eubacteria universal (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT e R: GGACTACCAGGGTAATCCTGTT).
- Preparação de suspensão bacteriana
- Meça a solução bacteriana com um espectotômetro. Adicione 1 OD (OD600) suspensão bacteriana em um tubo de 1 mL. Centrifugar a suspensão a 5.000 x g por 5 min a 4 °C.
- Descarte o supernasciente e adicione 1 mL de tampão PBS estéril a tubo de 1,5 mL para precipitação de suspensão.
- Centrifugar a 5.000 x g para 5 min a 4 °C; descartar o supernante.
- Repetir as etapas 2.4.2 e 2.4.3.
- Adicione 200 μL de tampão PBS estéril 1x à precipitação bacteriana.
- Adicione 600 μL de solução de sacarose de 10%, 200 μL de ATP de 10 mm (que atua como fagostimulante) e 200 μL de suspensão bacteriana em um tubo estéril de 1,5 mL. Misture por vórtice. Alternativamente, suspender a pelota bacteriana em sangue inativado pelo calor.
- Preparação de sangue inativado pelo calor
- Coletar sangue fresco com um tubo anticoagulante.
- Tome 2-3 mL de sangue fresco. Centrífuga a 1.000 x g por 10 min a 4 °C para separar plasma e células sanguíneas. Note que o sangue será perdido durante o processo de centrifugação e lavagem; há a necessidade de calcular o uso com antecedência.
- Colete o plasma em um novo tubo de 1,5 mL e inativar a calor a 56 °C por 1h.
- Adicione 500 μL de tampão PBS estéril a tubo de 1,5 mL para suspensão de células sanguíneas. Centrifugar a 1.000 x g por 10 min a 4 °C e, em seguida, descartar o supernaspe.
- Repita o passo 2.4.7.4 duas vezes.
- Resuspend células sanguíneas com plasma inativado pelo calor para obter sangue inativado pelo calor.
- Siga os passos 2.4.1 a 2.4.4 para obter 1 pellet bacteriano OD.
- Resuspenque as bactérias com 1 mL de sangue inativado pelo calor.
- Alimente o mosquito com suspensão de bactérias.
- Passe a fome os mosquitos por 24 horas, permitindo que os antibióticos metabolizem antes de alimentar as bactérias.
- Monte o sistema de alimentação de membrana.
- Sele a unidade alimentador esterilizada com um parafilm, alternativamente uma membrana de colágeno.
- Coloque um anel de plástico e fixe-o com parafilm para evitar quebrar devido ao atrito durante a alimentação.
- Adicione lentamente a solução bacteriana preparada à unidade alimentador. Observe que apenas um poço da unidade alimentador de dois poços pode ser preenchido com a solução e cobrir a unidade alimentador apenas a partir do lado de queda do reagente.
- Conecte a unidade alimentador a um sistema de alimentação pré-aquecido a 37 °C, que simula a temperatura humana para atrair mosquitos. Coloque o dispositivo de alimentação em um copo de papel cheio de mosquitos e alimente por 90 minutos.
- Após a alimentação, anestesia os mosquitos submetendo-os a uma temperatura de 4 °C por 3-5 min e mantenha os mosquitos anestesiados em uma placa de Petri gelada.
- Escolha os mosquitos totalmente engorgados para mais estudos.
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Representative Results
Os midguts de mosquitos tratados com antibióticos e sem antibióticos foram retirados para extração de DNA, e qPCR foi realizado com primers bacterianos universais. A Figura 1 mostra a expressão de rRNA bacteriana 16S no grupo controle e grupo de tratamento de antibióticos. Os resultados mostram que cerca de 98% das bactérias intestinais foram removidas, e a esterilização intestinal de penicilina e estreptomicina foi bem sucedida.
Com os métodos descritos, as cepas de bactérias foram isoladas e identificadas. C. meningosepticum é um bacilo aeróbico aeróbico não-oxidase-positivo gram-negativo, pertencente à Criseobacterium. A Figura 2 mostra o ovo médio colocado por mosquito após a alimentação sanguínea de mosquitos tratados com antibióticos com C. meningosséptico. A Figura 3 mostra a expressão dos genes relacionados ao desenvolvimento ovariano 24 h após a refeição sanguínea contendo C. meningosséptico. Uma visão geral dos genes relacionados ao desenvolvimento ovariano e sequências de primer estão listadas na Tabela 1.
A cepa isolada de bactérias intestinais das quais as bactérias intestinais foram removidas e, em seguida, os mosquitos totalmente engorgados foram divididos em três grupos. Cinco fêmeas do primeiro grupo e do segundo grupo foram utilizadas para contar a quantidade de desova, e 10 fêmeas do terceiro grupo foram utilizadas para detectar a expressão genética relacionada ao desenvolvimento ovariano após 24 horas de cada mosquito fêmea após a alimentação, respectivamente. Os resultados mostram que não há mudança significativa na produção de ovos do grupo controle e do grupo de alimentação.
Figura 1: Expressão de 16S rRNA após tratamento com antibióticos. Os mosquitos com antibióticos não tratados serviram como grupo controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito do micróbio intestinal na oviposição do mosquito. As bactérias indicadas foram misturadas com sangue e alimentadas com mosquitos tratados com antibióticos. Os mosquitos com micróbios commensais não tratados serviram como grupo controle. Os dados são apresentados como média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expressão de genes relacionados à reprodução após a alimentação sanguínea. Expressão de Cathepsin B(A),inibidor mitocondrial ATPase(B),brix de proteína de biogênese ribosa(C),e quinase da proteína serina/threonina rio2(D)após alimentação sanguínea de mosquitos tratados com antibióticos por 24 h com as cepas de bactérias indicadas. Os mosquitos com micróbios commensais não tratados serviram como grupo controle. Cada ponto representa um mosquito e cada linha representa o valor médio do grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | número genético | sequência de primer |
| Cathepsina B | AAEL009642 | Primer-GAGGGAAAAGTTCGATGTGGA |
| Primer reverso-AATCCCACATCCACCCAGTA | ||
| Inibidor mitocondrial ATPase | AAEL004284 | Primer forward-CAACTGCACAAGCTGAAGGAGA |
| Primer reverso-ACGTGCGATAGCTTCTTCGT | ||
| Brix de proteína de biogênese ribososome | AAEL001917 | Primer forward-GAACAGCACAAGCGAATGAA |
| Primer reverso-TTGGCCTTGAGAGTCGTCTTTT | ||
| Quinase de proteína de serina/threonina rio2 | AAEL011114 | Primer-GAGGAGAAAGCAGCACAACC |
| Primer reverso-TCGAATGGCTTTTCCATTTC |
Tabela 1: Genes relacionados ao desenvolvimento ovariano e sequências de primer.
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Discussion
Pesquisas sobre interações hospedeiras-micróbios descobriram que diferentes micróbios intestinais afetam sua fisiologia hospedeira através de mecanismos divergentes. Este artigo introduz o método para investigar o respectivo papel do micróbio intestinal do mosquito, incluindo dissecação de mosquito midgut, cultivo de bactérias intestinais cultivable, tratamento antibiótico e reintrodução das bactérias de interesse.
Para o tratamento com antibióticos bem-sucedido, os seguintes detalhes devem ser considerados na condução do experimento. Neste protocolo, os mosquitos foram tratados utilizando bolas de algodão umedecidas com uma solução de 10% de sacarose, incluindo 20 unidades de penicilina e 20 μg de estreptomicina por mL durante 3 dias11,16. A penicilina serviu como um antibiótico de amplo espectro contra bactérias gram-positivas, e a estreptomicina serviu como um antibiótico de amplo espectro contra bactérias gram-negativas20. A preservação adequada dos antibióticos é vital para um tratamento antibiótico eficiente21. Quando armazenado a -18 °C, a estabilidade da penicilina G é de pelo menos 3 m. A estreptomicina é estável por pelo menos 12 m quando armazenada a 4 °C22. Embora as diferenças na marca de antibióticos ou no tempo de armazenamento possam causar pequenas diferenças no desembaraço microbiano, é necessário verificar a eficiência após cada tratamento com antibióticos. Além do qPCR, a difusão da placa ou o uso de PCR são comumente utilizados para avaliar a eficiência do tratamento antibiótico23,24. Além disso, para evitar que os mosquitos sejam contaminados com outras bactérias após o tratamento com antibióticos, o ensaio alimentar precisa ser realizado com equipamentos esterilizados montados sob um banco super limpo.
Antes da alimentação oral bacteriana, os mosquitos devem ficar famintos por 24h para permitir que os antibióticos sejam metabolizados25. Isso não só ajuda os mosquitos a ingerir líquido de bactérias, mas também evita que os antibióticos matem as bactérias.
É certo que este protocolo é principalmente para investigar o efeito de bactérias cultivares. Para estudar a microbiota intestinal do hospedeiro vertebrado e invertebrado, a reintrodução de bactérias cultivantes ao hospedeiro tratado com antibióticos é comumente utilizada em pesquisas recentes8,,26,27. Além disso, a identificação inicial de bactérias intestinais cultivadas é geralmente baseada nas características do tamanho da colônia, forma, cor, borda, opacidade, altura e consistência28. Para bactérias não culturais, abordagens metagenômicas baseadas em sequenciamento de alto rendimento provavelmente fornecerão informações abrangentes sobre a composição total da microbiota midgut29,30,31. No entanto, a interação entre bactérias não culturais e o hospedeiro permanece em grande parte inexplorada.
Este artigo oferece duas opções alternativas para estudar o efeito do micróbio intestinal na oviposição do mosquito, misturar as bactérias com sangue inativado pelo calor ou implantação das bactérias através da alimentação de açúcar seguida de alimentação sanguínea. Os resultados representativos deste manuscrito adotaram a primeira opção, enquanto este último método gerou resultados semelhantes. Vários estudos poderiam ser realizados após a alimentação oral com uma cepa específica de bactérias. O ensaio subsequente poderia ser usado para investigar como o fator microbiano modula o comportamento locomotor do mosquito. O ensaio de quantificação de proteínas poderia ser seguido para estudar os efeitos de diferentes bactérias na digestão. Com pequenas modificações, este método poderia ser usado para estudar os respectivos efeitos de vários micróbios em relação à fisiologia do mosquito, incluindo absorção de nutrientes, imunidade, desenvolvimento, reprodução e competência vetorial.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant No. 81902094, 81600497), e pelo Projeto do Plano de Ciência e Tecnologia da Província de Hunan (2019RS1036).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
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