Summary
Dit artikel presenteert een protocol om het effect van individuele muggendarmbacteriën te onderzoeken, inclusief isolatie en identificatie van muggenmuisculivable microben, uitputting van muggendarmen en herintroduceren van een specifieke bacteriesoort.
Abstract
De mug midgut herbergt een zeer dynamisch microbioom dat het metabolisme van de gastheer, reproductie, fitness en vectorcompetentie beïnvloedt. Er zijn studies uitgevoerd om het effect van darmmicroben als geheel te onderzoeken; verschillende microben kunnen echter verschillende effecten op de host uitoefenen. Dit artikel biedt de methodologie om het effect van elke specifieke mug gut microbe en het potentiële mechanisme te bestuderen.
Dit protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel introduceert hoe de mug midgut te ontleden, cultivable bacteriën kolonies te isoleren, en bacteriën soorten te identificeren. Het tweede deel biedt de procedure om met antibiotica behandelde muggen te genereren en één specifieke bacteriesoort opnieuw in te voeren.
Introduction
Muggen worden beschouwd als de belangrijkste vectoren van menselijke pathogene ziekten, die meer dan honderd ziekteverwekkers overbrengen, waaronder het Zika-virus, het Dengue-virus en Plasmodium-parasieten 1. Wanneer muggen een bloedmaaltijd nemen om voedingsstoffen te verkrijgen voor ovipositie, kunnen ze per ongeluk ziekteverwekkers van een geïnfecteerde gastheer binnenkrijgen via het spijsverteringskanaal2. Belangrijk is dat de mug midgut, die een centrale rol speelt in zowel bloedmeel spijsvertering en pathogene ingang, herbergt een zeer dynamische microbioom3.
Verschillende studies hebben gekenmerkt lab-gefokte en veld-verzamelde mug microbiota met behulp van een cultuur-afhankelijke methode of een bacteriën sequencing test4,5,6. Soorten zoals Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaen Enterococcus worden vaak geïsoleerd van muggen in verschillende studies5,7,8,9. Interessant is dat muggendarmmicrobiota dynamisch fluctueert in zowel de diversiteit van de gemeenschap als de hoeveelheid bacteriesoorten, beïnvloed door het ontwikkelingsstadium, soorten, geografische oorsprong en voedingsgedrag4. Studies tonen aan dat bloedvoeding de totale bacteriële belasting drastisch verhoogt met een snelle expansie van soorten uit Enterobacteriaceae en een vermindering van de totale diversiteit10,11. Bovendien wordt muggenonderbuismicrobiota van het larvestadium meestal uitgeroeid wanneer het insect een metamorfose ondergaat tijdens verpopping en eclosie; dus, nieuw opgedoken volwassen muggen moeten hun microbiota4opnieuw bevolken .
Gut microbiota moduleert insectenfysiologie in verschillende aspecten, waaronder opname van voedingsstoffen, immuniteit, ontwikkeling, voortplanting en vectorcompetentie12. Axenic mug larven niet te ontwikkelen dan de eerste instar, terwijl een bacterie orale aanbod redt ontwikkeling, wat aangeeft dat de mug gut microbe is essentieel voor larve ontwikkeling13,14. Bovendien vertraagt uitputting van darmbacteriën de spijsvertering van de bloedmaaltijd en de opname van voedingsstoffen, beïnvloedt de rijping van de eicel en vermindert de ovipositie15. Bovendien lokken muggen met darmmicroflora hogere immuunresponsen uit in vergelijking met met antibiotica behandelde muggen, met voortdurend verhoogde antimicrobiële peptide-expressie tegen andere ziekteverwekkers om16te infecteren. Antibiotica worden meestal oraal toegediend om pan gut bacteriën te verwijderen in deze studies, en vervolgens experimenten worden uitgevoerd om het verschil tussen axenic muggen en muggen te vergelijken met commensale microben. Echter, de mug midgut herbergt een diverse gemeenschap van microben, en elke bacterie soort kan een duidelijk effect uitoefenen op de gastheer fysiologie.
Mosquito microbiota reguleert vector competentie met uiteenlopende effecten. Kolonisatie door Proteus geïsoleerd van veld-afgeleide muggen van dengue-endemische gebieden verleent upregulated antimicrobiële peptide expressie en resistentie tegen dengue virus infectie16. De entomopathogene schimmel Beauveria bassiana activeert de Toll en JAK-STAT immuunroute tegen arbovirusinfectie17. Daarentegen, de schimmel Talaromyces geïsoleerd van Aedes aegypti midgut vergemakkelijkt dengue virus infectie door moduleren gut trypsine activiteit18. Bovendien bevordert Serratia marcescens de overdracht van arbovirus via een secretoir eiwit genaamd SmEnhancin, dat de mucinlaag op het darmeptheel van muggen vertelt19.
Deze procedure biedt een systematische en intuïtieve methode voor dissectie van de mug midgut, isolatie van cultivable bacteriën kolonies, identificatie van de bacteriesoorten, en herintroductie via orale voeding. Het biedt representatieve resultaten van bloedvoeding met een commensale bacterie, Chryseobacterium meningosepticum, op mug eierstokontwikkeling en ovipositie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Midgut dissectie en cultivable bacteriën isolatie
- Bereid de mug voor op dissectie.
- Verzamel de muggen 7-9 dagen na het ontstaan met een aspirator. Verdoven de verzamelde muggen door ze gedurende 3-5 min te onderwerpen aan een temperatuur van 4 °C en de muggen verdoofd te houden in een ijskoud petrischaaltje tot dissectie.
- Steriliseren laboratoriuminstrumenten en het muggenoppervlak.
- Steriliseren van het experiment bank, ontleden microscoop, tangen, en glas dia door het spuiten van 75% ethanol om besmetting door bacteriën uit het milieu te voorkomen.
- Bereid een steriele petrischaal met 75% ethanol en twee petrischaaltjes met steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS).
- Oppervlakte-steriliseren de mug door dompelen en schudden ze in 75% ethanol gedurende 3 min, en spoel twee keer met 1x PBS buffer in het geval de ethanol van invloed op de ontleed darmflora.
- Ontleden de mug midgut.
- Breng de oppervlakte-gesteriliseerde mug op de glazen glijbaan met een druppel steriele 1x PBS buffer. Ontleden onder de ontleden microscoop.
- Onder de onderste vergroting van de ontledenmicroscoop, verwijder voorzichtig de benen, vleugels en het hoofd van de mug om ontsnapping te voorkomen. Verwijder de laatste somiet van de mug door direct te snijden, in plaats van te trekken, om te voorkomen dat het spijsverteringskanaal breekt.
- Klem de thorax van de mug en het einde van de buik met tangen. Trek voorzichtig het spijsverteringskanaal van de mug eruit. Het verworven spijsverteringskanaal bevat meestal het gewas, voorgeletterd, midgut, achterdacht, en de Malpighian buizen.
- Pas de ontleedmicroscoop aan een hogere vergroting aan. Verwijder het gewas, de voorbestaande, de achterpoot en de Malpighische buizen uit het ontleede spijsverteringskanaal om de middenmoter van de mug te krijgen.
- Zorg tijdens het verwijderen van het gewas, als het gewas opblaast en lijkt op de midgut nadat de mug neemt een suikermeel. De Malpighian buizen, een groep lange en dunne uitscheidingsbuizen, bevinden zich op de grens tussen de midgut en de achtersted.
- Darmbacteriën isoleren.
- Breng de ontleede midgut over op een steriele 1,5 mL buis met 200 μL steriele 1x PBS buffer.
- Maal de midgut op een steriele bank grondig met een steriele stamper om volledige release van darmbacteriën aan de buffer mogelijk te maken.
- Seriële verdunnen het homogenaat tot drie 10-voudige verdunningen. Voeg 50 μL van elke verdunning toe aan de LB (Luria bouillon) agarplaat en verdeel deze vervolgens op de plaat. Als de midgut een hoge concentratie darmflora bevat, is het essentieel om meer seriële verdunningen te maken om enkele kolonies uit te kiezen.
- Broed de plaat 1-2 dagen in op 37 °C totdat enkele kolonies zichtbaar zijn.
- Identificatie van soorten
- Kies enkele kolonies en inenting ze respectievelijk in een 150 mL conische kolf met 50 mL LB bouillon medium.
- Schud de bacteriën 's nachts op 37 °C.
- Haal totaal DNA uit door bacteriële genomic DNA extractiekit. Versterk 16S rDNA door polymerase kettingreactie (PCR).
OPMERKING: Er zijn meerdere segmenten in 16S rDNA die behouden zijn gebleven. Op basis van deze geconserveerde regio's kunnen universele primers voor bacteriën worden ontworpen om 16S rDNA-fragmenten van alle bacteriën te versterken. Deze primers zijn specifiek voor bacteriën, en het verschil in het variabele gebied van 16S rDNA kan worden gebruikt om verschillende bacteriën te onderscheiden. Daarom wordt 16S rDNA veel gebruikt voor bacteriële identificatie. - Herstel en zuiver DNA-fragmenten uit PCR-producten door agarose gel elektroforese en een commerciële gel recovery kit.
- Voer DNA-sequencing uit op de gezuiverde DNA-fragmenten om bacteriële gensequenties te verkrijgen.
- Vergelijk de 16S rRNA-gensequentie met de bacteriële sequentie die beschikbaar is in GenBank. Selecteer de database Bacteriën en Archaea.
OPMERKING: Identificatie voor het soortenniveau werd gedefinieerd als ≥99% 16S rDNA-sequentiegelijke met de dichtstbijzijnde GenBank-vermelding. Het isolaat werd toegewezen aan het overeenkomstige geslacht toen de 16S rDNA-sequentiegelijkenis <99% en ≥95% was.
2. Behandeling met antibiotica en herintroductie van de bacterie
- Bereid de antibioticaoplossing voor.
- Weeg de vereiste hoeveelheid sacharose, penicilline en streptomycine af om een 10% sacharoseoplossing voor te bereiden, waaronder 20 eenheden penicilline en 20 μg streptomycine per mL.
- Voed muggen met de antibioticaoplossing.
- Verdoven de muggen in 4 °C gedurende 3-5 min. Breng de muggen over op een papieren beker. Bedek de bovenkant met gaas en wind het gaas met tape om te voorkomen dat muggen ontsnappen.
- Dompel steriele katoenen ballen in de antibioticaoplossing en leg ze zorgvuldig op de muggenbeker. Knijp de katoenen ballen voor gebruik om te voorkomen dat muggen verdrinken in de druipende katoenen ballen.
- Bedek de katoenen balletjes met een petrischaal van 10 cm om vochtverdamping te voorkomen. Vervang de katoenen ballen twee keer per dag gedurende drie opeenvolgende dagen.
- Bevestig de effectiviteit van de antibioticabehandeling.
- Volgens de bovenstaande methode ontleedt u de midgut van met antibiotica behandelde muggen.
- Breng de ontleede midguts over op een steriele 1,5 mL buis met 200 μL steriele 1x PBS buffer.
- Maal midguts in een steriele bank grondig met een steriele stamper om volledige afgifte van darmbacteriën aan de buffer mogelijk te maken.
- Haal het darmmicrobiële DNA eruit door bacteriële genomische DNA-extractiekit.
- Uitvoeren van bacteriële kwantificering door real-time kwantitatieve PCR (qPCR) op genomisch DNA met behulp van universele eubacteria primers (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGCAGT en R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT).
- Voorbereiding van bacteriële suspensie
- Meet de bacteriële oplossing met een spectrofotometer. Voeg 1 OD (OD600) bacteriële suspensie toe aan een buis van 1 mL. Centrifugeren de vering op 5.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Gooi de supernatant weg en voeg 1 mL steriele 1x PBS-buffer toe aan 1,5 mL buis voor suspensieneerslag.
- Centrifuge bij 5.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C; gooi de supernatant weg.
- Herhaal stap 2.4.2 en 2.4.3.
- Voeg 200 μL steriele 1x PBS buffer toe aan de bacteriële neerslag.
- Voeg 600 μL van 10% sacharoseoplossing, 200 μL van 10 mm ATP (die fungeert als een phagostimulant) en 200 μL bacteriële suspensie toe in een steriele 1,5 mL buis. Meng door vortexing. U ook bacteriële pelleted in warmte-geïnactiveerd bloed opschorten.
- Bereiding van warmte-geïnactiveerd bloed
- Verzamel vers bloed met een antistollingsbuis.
- Neem 2-3 mL vers bloed. Centrifuge bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om plasma en bloedcellen te scheiden. Merk op dat het bloed verloren zal gaan tijdens het centrifugatie- en wasproces; het gebruik moet vooraf worden berekend.
- Verzamel het plasma in een nieuwe buis van 1,5 mL en inactiveer 1 uur bij 56 °C.
- Voeg 500 μL steriele 1x PBS buffer toe aan 1,5 mL buis voor suspensie van bloedcellen. Centrifuge bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Herhaal stap 2.4.7.4 twee keer.
- Opnieuw opsplitsen van bloedcellen met warmte-geïnactiveerd plasma om warmte-geïnactiveerd bloed te verkrijgen.
- Volg stappen 2.4.1 tot 2.4.4 om 1 OD bacteriële pelleted te krijgen.
- Resuspend de bacteriën pelleted met 1 mL van warmte-geïnactiveerd bloed.
- Voer de mug met bacteriën suspensie.
- Verhonger de muggen voor 24 uur, waardoor antibiotica te metaboliseren voordat het voeden van bacteriën.
- Monteer het membraan-voersysteem.
- Verzegel de gesteriliseerde feeder unit met een parafilm, als alternatief een collageen membraan.
- Zet op een plastic ring en bevestig het met parafilm om te voorkomen dat breken als gevolg van wrijving tijdens het voeden.
- Voeg langzaam de voorbereide bacteriële oplossing toe aan de feeder unit. Houd er rekening mee dat slechts één put van de twee-put feeder unit kan worden gevuld met de oplossing en de feeder unit alleen te dekken van het reagens laten vallen kant.
- Sluit de feederunit aan op een voorverwarmd voedingssysteem tot 37 °C, dat de menselijke temperatuur simuleert om muggen aan te trekken. Plaats het voerapparaat op een papieren beker gevuld met muggen en voer gedurende 90 minuten.
- Verdoven de muggen na het voeden door ze gedurende 3-5 min te onderwerpen aan een temperatuur van 4 °C en de muggen verdoofd te houden in een ijskoud petrischaaltje.
- Kies de volledig opgeslokte muggen voor verdere studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De muggen die met antibiotica en zonder antibiotica werden behandeld, werden genomen voor DNA-extractie, en qPCR werd uitgevoerd met universele bacteriële primers. Figuur 1 toont de expressie van bacteriële 16S rRNA in de controlegroep en de behandelingsgroep voor antibiotica. De resultaten tonen aan dat ongeveer 98% van de darmbacteriën zijn verwijderd, en de darmsterilisatie van penicilline en streptomycine was succesvol.
Met de beschreven methoden werden bacteriestammen geïsoleerd en geïdentificeerd. C. meningosepticum is een non-fermenting, oxidase-positieve gram-negatieve aërobe bacillus, die behoren tot Chryseobacterium. Figuur 2 toont het gemiddelde ei dat per mug wordt gelegd na bloedvoeding van met antibiotica behandelde muggen met C. meningosepticum. Figuur 3 toont de expressie van eierstokontwikkeling gerelateerde genen 24 uur na bloedmeel met C. meningosepticum. Een overzicht van de eierstokontwikkeling gerelateerde genen en primer sequenties zijn opgenomen in tabel 1.
De stam geïsoleerd van darmbacteriën waaruit darmbacteriën werden verwijderd en vervolgens de volledig opgeslokte muggen werden verdeeld in drie groepen. Vijf vrouwtjes in de eerste groep en de tweede groep werden gebruikt om het paaibedrag te tellen, en 10 vrouwtjes in de derde groep werden gebruikt om de genexpressie met betrekking tot de ontwikkeling van de eierstokken te detecteren na respectievelijk 24 uur van elke vrouwelijke mug na het voeden. De resultaten tonen aan dat er geen significante verandering is in de eiproductie van de controlegroep en de voedingsgroep.
Figuur 1: Expressie van 16S rRNA na behandeling met antibiotica. De muggen met onbehandelde antibiotica dienden als controlegroep. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Effect van darmmicrobe op muggenipositie. De aangegeven bacteriestammen werden vermengd met bloed en aan met antibiotica behandelde muggen gevoerd. De muggen met onbehandelde darmen dienden als controlegroep. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Expressie van voortplantingsgerelateerde genen na bloedvoeding. Expressie van Cathepsin B (A), Mitochondriale ATPase remmer (B), Ribossome biogenese eiwit brix(C), en Serine / Threonine-eiwit kinase rio2(D) na bloedvoeding van antibiotica behandelde muggen voor 24 uur met de aangegeven bacteriën stammen. De muggen met onbehandelde darmen commensal microbe dienden als controlegroep. Elke stip vertegenwoordigt een mug en elke regel vertegenwoordigt de mediane waarde van de groep. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Naam | gennummer | primerreeks |
| Cathepsin B | AAEL009642 AAEL009642 | Forward primer-GAGGGAAAGTTCGATGTGGA |
| Reverse primer-AATCCCACCCACCCAGTA | ||
| Mitochondriale ATPase-remmer | AAEL004284 | Forward primer-CAACTGCACAAGCTGAAGGA |
| Reverse primer-ACGTGCGATAGCTTCTTCGT | ||
| Ribosoom biogenese eiwit brix | AAEL001917 | Forward primer-GAACAGCACAAGCGAGAATA |
| Reverse primer-TTGGCCTTGAGAGTCGTCTT | ||
| Serine/Threonine-eiwit kinase rio2 | AAEL011114 | Forward primer-GAGGAGAAAGCAGCACAACC |
| Reverse primer-TCGAATGGTTTTTCCATTTC |
Tabel 1: Eierstokkanker gerelateerde genen en primer sequenties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onderzoek naar gastheer-microbe interacties hebben aangetoond dat verschillende darmmicroben hun gastheerfysiologie beïnvloeden via uiteenlopende mechanismen. Dit artikel introduceert de methode om de respectieve rol van mug gut microbe te onderzoeken, met inbegrip van ontleden mug midgut, culturing cultivable darmbacteriën, behandeling met antibiotica, en herinvoering van de bacteriën van belang.
Voor een succesvolle behandeling met antibiotica moeten de volgende details worden overwogen bij het uitvoeren van het experiment. In dit protocol werden muggen behandeld met katoenen balletjes bevochtigd met een 10% sacharoseoplossing, waaronder 20 eenheden penicilline en 20 μg streptomycine per mL gedurende 3 dagen11,16. Penicilline diende als een breedspectrum antibioticum tegen gram-positieve bacteriën, en streptomycine diende als een breed spectrum antibioticum tegen gram-negatieve bacteriën20. Een goede bewaring van antibiotica is essentieel voor een efficiënte behandeling met antibiotica21. Bij opslag bij -18 °C bedraagt de stabiliteit van penicilline G ten minste 3 m. Streptomycine is stabiel op ten minste 12 m wanneer opgeslagen bij 4 °C22. Hoewel verschillen in antibioticamerk of opslagtijd kleine verschillen in microbiële klaring kunnen veroorzaken, is het noodzakelijk om de efficiëntie na elke antibioticabehandeling te verifiëren. Naast de qPCR wordt het verspreiden van de plaat of het gebruik van PCR vaak gebruikt om de efficiëntie van antibioticabehandeling23,24te evalueren . Bovendien, om te voorkomen dat muggen worden besmet met andere bacteriën na behandeling met antibiotica, de voeding test moet worden uitgevoerd met gesteriliseerde apparatuur gemonteerd onder een super schone bank.
Vóór bacteriële orale voeding moeten de muggen 24 uur worden uitgehongerd om de antibiotica te kunnen metaboliseerden25. Dit helpt niet alleen de muggen inname bacteriën vloeistof, maar voorkomt ook dat de antibiotica van het doden van de bacteriën.
Toegegeven, dit protocol is vooral bedoeld voor het onderzoeken van het effect van cultivable bacteriën. Om de darmmicrobiota van gewervelde en ongewervelde gastheer te bestuderen, wordt herintroductie van cultivable bacteriën tot met antibiotica behandelde gastheer vaak gebruikt in recente onderzoeken8,26,27. Bovendien is de eerste identificatie van gekweekte darmbacteriën over het algemeen gebaseerd op de kenmerken van koloniegrootte, vorm, kleur, rand, dekking, hoogte en consistentie28. Voor niet-culturable bacteriën zullen op hoge doorvoervolgordes waarschijnlijk uitgebreide informatie verschaffen over de totale samenstelling van de midgut microbiota29,30,31. Het samenspel tussen niet-culturable bacteriën en de gastheer blijft echter grotendeels onontgonnen.
Dit artikel biedt twee alternatieve opties om het effect van darmmicrobe op muggen ovipositie te bestuderen, meng de bacteriën met warmte-geïnactiveerd bloed of implantatie van de bacteriën via suiker voeding, gevolgd door bloedvoeding. De representatieve resultaten in dit manuscript keurden de eerste optie goed, terwijl de laatstgenoemde methode gelijkaardige resultaten produceerde. Verschillende studies kunnen worden uitgevoerd na orale voeding met een specifieke bacterie stam. Latere test kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe microbiële factor moduleert mug locomotorisch gedrag. Eiwitkwantificeringstest kan worden gevolgd om de effecten van verschillende bacteriën op de spijsvertering te bestuderen. Met kleine wijzigingen kan deze methode worden gebruikt om de respectieve effecten van verschillende microben op muggenfysiologie te bestuderen, waaronder nutriëntenopname, immuniteit, ontwikkeling, voortplanting en vectorcompetentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497) en het Science and Technology Plan Project van de provincie Hunan (2019RS1036).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), New York, N.Y. 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
