Summary
Denna artikel presenterar ett protokoll för att undersöka effekten av enskilda mygga tarmbakterier, inklusive isolering och identifiering av mygga midgut cultivable mikrober, antibiotika utarmning av mygga tarmbakterier, och återinföra en specifik bakterie arter.
Abstract
Mygga midgut hamnar en mycket dynamisk mikrobiomet som påverkar värdmetabolism, reproduktion, fitness och vektorkompetens. Studier har utförts för att undersöka effekten av gut mikrober som helhet; olika mikrober kunde dock utöva tydliga effekter mot värden. Denna artikel ger metodiken för att studera effekten av varje specifik mygga gut mikrob och den potentiella mekanismen.
Det här protokollet innehåller två delar. Den första delen introducerar hur man dissekerar mygga midgut, isolera cultivable bakterier kolonier, och identifiera bakterier arter. Den andra delen ger förfarandet för att generera antibiotikabehandlade myggor och återinföra en specifik bakterieart.
Introduction
Myggor anses vara de viktigaste vektorerna av mänskliga patogena sjukdomar, som överför över hundra patogener inklusive Zika virus, Denguevirus, och Plasmodium parasiter1. När myggor tar en blodmåltid för att förvärva näringsämnen för oviposition, kan de oavsiktligt inta patogener från en infekterad värd via matsmältningskanalen2. Viktigt, mygga midgut, som spelar en central roll i både blod måltid matsmältning och patogen entré, hamnar en mycket dynamisk mikrobiom3.
Flera studier har karakteriserat lab-uppfödda och fältuppsamlade mygga mikrobiota med antingen en odlingsberoende metod eller en bakterier sekvensering assay4,5,6. Arter inklusive Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, och Enterococcus är vanligen isolerade från myggor i olikastudier 5,7,8,9. Intressant nog mygga gut mikrobiota fluktuerar dynamiskt i både samhället mångfald och mängden bakterier arter, påverkas av utvecklingsstadiet, arter, geografiskt ursprung, och utfodring beteende4. Studier visar att blodmatning dramatiskt ökar den totala bakteriebelastningen med snabb expansion av arter från Enterobacteriaceae och en minskning av den totala mångfalden10,11. Dessutom utrotas myggeminfektionsflovanta av larvstadiet vanligtvis när insekten genomgår metamorfos under pupation och eclosion; således, nyuppträdda vuxna myggor måste återbefolka sin mikrobiota4.
Gut mikrobiota modulerar insekt fysiologi i olika aspekter, inklusive näringsämne absorption, immunitet, utveckling, reproduktion, och vektor kompetens12. Axenic mygglarver misslyckas med att utvecklas bortom den första instar medan en bakterie oral leverans räddar utvecklingen, vilket tyder på att mygga tarmmikroben är avgörande för larvutveckling13,14. Förutom, utarmning av tarmbakterier retards blod måltid matsmältning och näringsämne absorption, påverkar oocyte mognad, och minskar oviposition15. Dessutom mygg med gut mikroflora framkalla högre immunsvar jämfört med antibiotikabehandlade myggor, med ständigt förhöjda antimikrobiella peptiduttryck mot andra patogener att infektera16. Antibiotika är vanligtvis oralt administreras för att ta bort pan gut bakterier i dessa studier, och sedan experiment utförs för att jämföra skillnaden mellan axenic myggor och myggor med commensal mikrober. Men mygga midgut hyser en mångsidig gemenskap av mikrober, och varje bakterie art kan utöva en tydlig effekt mot värden fysiologi.
Myggfloran reglerar vektorkompetens med divergerande effekter. Kolonisering av Proteus isolerad från fält-härledda myggor av denguefeber-endemiska områden ger upregulated antimikrobiell peptid uttryck och resistens mot denguevirusinfektion16. Den entomopathogenic svampen Beauveria bassiana aktiverar Toll och JAK-STAT immun väg mot arbovirus infektion17. Däremot svampen Talaromyces isolerade från Aedes aegypti midgut underlättar denguevirusinfektion genom modulering gut trypsin aktivitet18. Dessutom, Serratia marcescens främjar arbovirus överföring genom en sekretorisk protein som kallas SmEnhancin, som smälter mucin lagret på tarmepitelet av myggor19.
Detta förfarande ger en systematisk och intuitiv metod för dissekering av mygga midgut, isolering av cultivable bakterier kolonier, identifiering av bakterien arter, och återintroduktion via oral utfodring. Det ger representativa resultat av blod utfodring med en commensal bakterie, Chryseobacterium meningosepticum, på mygga äggstocken utveckling och oviposition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Midgut dissekering och cultivable bakterier isolering
- Förbered myggan för dissektion.
- Samla myggorna 7–9 dagar efter uppkomsten med en aspirator. Söva de insamlade myggorna genom att utsätta dem för en temperatur på 4 °C i 3–5 min och håll myggorna sövda i en iskall Petriskål fram till dissekering.
- Sterilisera laboratorieinstrument och myggytan.
- Sterilisera experimentbänken, dissekera mikroskop, tång, och glas slide genom att spruta 75% etanol för att undvika kontaminering av bakterier från miljön.
- Tillaga en steril petriskål som innehåller 75% etanol och två petriskålar som innehåller steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS).
- Ytsterilisera myggan genom att doppa och skaka dem i 75% etanol i 3 min, och skölj två gånger med 1x PBS-buffert ifall etanolen påverkar den dissekerade tarmfloran.
- Dissekera mygga midgut.
- Överför den ytsteriliserade myggan på glasglaset med en droppe steril 1x PBS-buffert. Dissekera under dissekering mikroskop.
- Under den lägre förstoringen av dissekera mikroskop, försiktigt bort benen, vingarna och huvudet av myggan för att förhindra flykt. Ta bort myggans sista somite genom att skära direkt, snarare än att dra den, för att förhindra att matsmältningsorganet bryter.
- Kläm fast myggans bröstkorg och slutet av buken med t eftersomkningar. Dra försiktigt ut myggans matsmältningskanal. Den förvärvade mag-tarmkanalen innehåller vanligtvis grödan, foregut, midgut, hindgut, och malpighian rören.
- Justera dissekerande mikroskopet till en högre förstoring. Ta bort grödan, foregut, hindgut och malpighiska rören från dissekerade matsmältningskanalen för att få myggans midgut.
- Var försiktig medan du tar bort grödan, eftersom grödan blåses upp och liknar midgut efter att myggan tar en sockermåltid. De malpighiska rören, en grupp långa och tunna utsöndringsrör, ligger vid gränsen mellan midgut och hindgut.
- Isolera tarmbakterier.
- Överför den dissekerade midguten till ett sterilt 1,5 mL-rör med 200 μL steril 1x PBS-buffert.
- Mala midgut på en steril bänk noggrant med en steril mortelstöt för att möjliggöra fullständig frisläpning av tarmbakterier till bufferten.
- Seriell späd homogenatet till tre 10-faldiga utspädningar. Tillsätt 50 μL av varje spädning till LB (Luria buljong) agar plattan, och sedan sprida den på plattan. Om midgut innehåller en hög koncentration av tarmfloran, är det viktigt att göra mer seriella utspädningar att plocka ut enskilda kolonier.
- Inkubera plattan vid 37 °C i 1–2 dagar tills enstaka kolonier är synliga.
- Identifiering av arter
- Plocka enstaka kolonier och inokulera dem respektive i en 150 mL konisk kolv som innehåller 50 mL LB-buljongmedium.
- Skaka bakterierna vid 37 °C över natten.
- Extrahera totalt DNA genom bakteriell genomisk DNA extraktionssats. Förstärka 16S rDNA genom polymeras kedjereaktion (PCR).
OBS: Det finns flera segment i 16S rDNA som bevaras. Baserat på dessa bevarade regioner, universella primers för bakterier kan utformas för att förstärka 16S rDNA fragment av alla bakterier. Dessa primers är specifika för bakterier, och skillnaden i variabeln regionen 16S rDNA kan användas för att skilja olika bakterier. Därför används 16S rDNA allmänt för bakteriell identifiering. - Återhämta och rena DNA-fragment från PCR-produkter genom agarosgelelektrofores och ett kommersiellt gelåtervinningskit.
- Utför DNA-sekvensering på de renade DNA-fragmenten för att få bakteriella gensekvenser.
- Jämför 16S rRNA-gensekvensen med den bakteriesekvens som finns i GenBank. Välj databasen Bakterier och Archaea.
OBS: Identifiering till artnivån definierades som ≥99% 16S rDNA sekvens likhet med närmaste GenBank posten. Isolatet tilldelades motsvarande släkte när dess 16S rDNA sekvens likhet var <99% och ≥95%.
2. Antibiotikabehandling och återinsättning av bakterien
- Förbered antibiotikalösningen.
- Väg den erforderliga mängden sackaros, penicillin och streptomycin för att förbereda en 10% sackaroslösning inklusive 20 enheter penicillin och 20 μg streptomycin per mL.
- Mata myggor med antibiotikalösningen.
- Söva myggen i 4 °C i 3–5 min. Överför myggorna till en pappersmugg. Täck toppen med gasväv och invind gasväv med tejp för att förhindra myggor från att fly.
- Doppa sterila bomullstussar i antibiotikalösningen och placera dem försiktigt på myggkoppen. Pressa bomullstussarna före användning för att förhindra att myggor drunknar i de droppande bomullstussarna.
- Täck bomullstussarna med en 10 cm Petriskål för att förhindra fuktavdunstning. Byt ut bomullstussarna två gånger om dagen i tre dagar i följd.
- Bekräfta effektiviteten av antibiotikabehandlingen.
- Enligt ovanstående metod dissekera midgut av antibiotikabehandlade myggor.
- Överför de dissekerade midguterna till ett sterilt 1,5 mL-rör med 200 μL steril 1x PBS-buffert.
- Grind midguts i en steril bänk noggrant med en steril mortelstöt för att möjliggöra fullständig frisättning av tarmbakterier till bufferten.
- Extrahera tarmmikrobiellt DNA genom bakteriellt genomiskt DNA extraktionskit.
- Utför bakteriekvantisering genom realtid kvantitativ PCR (qPCR) på genomic DNA med hjälp av universella eubacteria primers (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT och R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT).
- Beredning av bakteriell suspension
- Mät bakterielösningen med en spektrofotometer. Lägg till 1 OD (OD600) bakterie suspension i ett 1 mL-rör. Centrifugera suspensionen vid 5 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och tillsätt 1 mL steril 1x PBS-buffert till 1,5 mL-rör för suspensionsutfällning.
- Centrifugera vid 5 000 x g i 5 min vid 4 °C; kassera supernatanten.
- Upprepa steg 2.4.2 och 2.4.3.
- Tillsätt 200 μL steril 1x PBS buffert till bakterienedningen.
- Tillsätt 600 μL av 10% sackaroslösning, 200 μL av 10 mm ATP (som fungerar som en phagostimulant), och 200 μL bakteriell suspension i ett sterilt 1,5 mL rör. Blanda genom att virvel. Alternativt, suspendera bakteriell pelleterad i värme-inaktiverat blod.
- Beredning av värmeoaktiverat blod
- Samla färskt blod med ett blodförtunningsrör.
- Ta 2–3 mL färskt blod. Centrifugera vid 1 000 x g i 10 min vid 4 °C för att separera plasma och blodceller. Observera att blodet kommer att gå förlorat under centrifugeringen och tvättprocessen; finns ett behov av att beräkna användningen i förväg.
- Samla in plasman i ett nytt 1,5 mL-rör och värme-inaktivera vid 56 °C i 1 h.
- Tillsätt 500 μL steril 1x PBS buffert till 1,5 mL rör för suspension av blodkroppar. Centrifugera vid 1 000 x g i 10 min vid 4 °C och kassera sedan supernatanten.
- Upprepa steg 2.4.7.4 två gånger.
- Resuspend blodkroppar med värme-inaktiverad plasma för att erhålla värme-inaktiverat blod.
- Följ steg 2.4.1 till 2.4.4 för att få 1 OD bakteriell pelleterade.
- Resuspend bakterierna pelleterade med 1 mL värme-inaktiverat blod.
- Mata myggan med bakterieupphängning.
- Svält myggorna i 24 h, vilket gör att antibiotika metaboliserar innan de matar bakterier.
- Sätt ihop membranmatningssystemet.
- Försegla den steriliserade matarenheten med en parafilm, alternativt ett kollagenmembran.
- Sätt på en plastring och fixa den med parafilm för att undvika att bryta på grund av friktion under utfodring.
- Tillsätt långsamt den beredda bakterielösningen till matarenheten. Observera att endast en brunn av två-brunnsmatarenheten kan fyllas med lösningen och täcka matarenheten endast från reagensd tappa sidan.
- Anslut matarenheten till ett matningssystem som förvärmts till 37 °C, vilket simulerar människans temperatur för att locka myggor. Placera utfodring enheten på ett papper kopp fylld med myggor och foder i 90 min.
- Efter utfodring, bedöva myggorna genom att utsätta dem för en temperatur på 4 °C för 3–5 min och hålla myggorna sövda i en iskall petriskål.
- Välj de helt engorged myggorna för vidare studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Midguts av myggor behandlas med antibiotika och utan antibiotika togs ut för DNA extraktion, och qPCR utfördes med universella bakteriella primers. Figur 1 visar uttrycket av bakteriell 16S rRNA i kontrollgruppen och antibiotikabehandling gruppen. Resultaten visar att cirka 98% av tarmbakterierna har tagits bort, och tarmsterilisering av penicillin och streptomycin var framgångsrik.
Med de beskrivna metoderna isolerades och identifierades bakteriestammar. C. meningosepticum är en nonfermenting, oxidas-positiva gramnegativa aerob bacillus, som tillhör Chryseobacterium. Figur 2 visar det genomsnittliga ägg som läggs per mygga efter blodmatning av antibiotikabehandlade myggor med C. meningosepticum. Figur 3 visar uttrycket av äggstocksutveckling relaterade gener 24 h efter blod måltid som innehåller C. meningosepticum. En översikt över de ovarieutvecklingsrelaterade generna och primersekvenserna finns uppräknade i tabell 1.
Stammen isolerad från tarmbakterier från vilka tarmbakterier avlägsnades och sedan delades de helt instade myggorna i tre grupper. Fem honor i den första gruppen och den andra gruppen användes för att räkna lekmängden, och 10 honor i den tredje gruppen användes för att upptäcka genuttrycket relaterat till äggstocksutveckling efter 24 h av varje kvinnlig mygga efter utfodring, respektive. Resultaten visar att det inte sker någon betydande förändring i kontrollgruppens och utfodringsgruppens äggproduktion.
Figur 1: Uttryck för 16S rRNA efter antibiotikabehandling. Myggorna med obehandlade antibiotika fungerade som kontrollgrupp. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Effekten av tarmmikrob på myggoviposition. De angivna bakteriestammarna blandades med blod och matades till antibiotikabehandlade myggor. Myggorna med obehandlade tarmstämmmikrober fungerade som kontrollgrupp. Uppgifterna presenteras som medelvärde ± SEM. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Uttryck för reproduktionsrelaterade gener efter blodmatning. Expression av Cathepsin B (A), Mitokondriell ATPas inhibitor (B), Ribosome biogenes protein brix (C), och Serine/Treonin-proteinkinas rio2 (D) efter blodmatning av antibiotikabehandlade myggor i 24 h med de indikerade bakteriestammarna. Myggorna med obehandlad gut commensal mikrob fungerade som kontrollgrupp. Varje punkt representerar en mygga och varje linje representerar gruppens medianvärde. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Namn | gennummer | primer sekvens |
| Cathepsin B | AAEL009642 | Framåt primer-GAGGGAAAGTTCGATGTGGA |
| Omvänd primer-AATCCCACATCCACCCAGTA | ||
| Mitokondriell ATPas inhibitor | AAEL004284 | Framåt primer-CAACTGCACAAGCTGAAGGA |
| Omvänd primer-ACGTGCGATAGCTTCTTCGT | ||
| Ribosomen biogenes protein brix | AAEL001917 | Framåt primer-GAACAGCACAAGCGAATGAA |
| Omvänd primer-TTGGCCTTGAGTCGTCTT | ||
| Serine/Treonin-proteinkinas rio2 | AAEL011114 | Framåt primer-GAGGAGAAAGCAGCACAACC |
| Omvänd primer-TCGAATGGCTTTTTTCCATTTC |
Tabell 1: Ovarieutveckling relaterade gener och primersekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskning om värd-mikrob interaktioner har funnit att olika gut mikrober påverkar deras värd fysiologi via olika mekanismer. Denna artikel introducerar metoden för att undersöka respektive roll mygga gut mikrob, inklusive dissekera mygga midgut, culturing cultivable tarmbakterier, antibiotikabehandling, och återinföra bakterier av intresse.
För framgångsrik antibiotikabehandling måste följande detaljer beaktas vid genomförandet av experimentet. I detta protokoll behandlades myggor med hjälp av bomullstussar fuktade med en 10% sackaroslösning inklusive 20 enheter penicillin och 20 μg streptomycin per mL i 3 dagar11,16. Penicillin fungerade som ett brett spektrum antibiotikum mot grampositiva bakterier, och streptomycin fungerade som ett brett spektrum antibiotika mot gramnegativa bakterier20. Korrekt bevarande av antibiotika är avgörande för effektiv antibiotikabehandling21. Vid förvaring vid -18 °C är stabiliteten hos penicillin G minst 3 m. Streptomycin är stabilt i minst 12 m vid förvaring vid 4 °C22. Medan skillnader i antibiotikamärke eller lagringstid kan orsaka små skillnader i mikrobiell clearance, är det nödvändigt att verifiera effektiviteten efter varje antibiotikabehandling. Förutom den qPCR, sprida plattan eller använda PCR används vanligen för att utvärdera effektiviteten av antibiotikabehandling23,24. Dessutom, för att förhindra myggor från att förorenas med andra bakterier efter antibiotikabehandling, måste utfodring analysen utföras med steriliserad utrustning monteras under en super ren bänk.
Före bakteriell oral utfodring ska myggorna svältas i 24 h för att antibiotikan ska kunna metaboliseras25. Detta hjälper inte bara myggorna intar bakterier vätska, men också hindrar antibiotika från att döda bakterierna.
Visserligen är detta protokoll främst för att undersöka effekten av cultivable bakterier. För att studera tarmfloran av ryggradsdjur och ryggradslösa värden, återinförande av odlingsbara bakterier till antibiotikabehandlade värd används vanligen i nyareforskningar 8,26,27. Dessutom är den första identifieringen av odlade tarmbakterier i allmänhet baserat på egenskaperna hos kolonistorlek, form, färg, kant, opacitet, höjd och konsistens28. För icke-odlingsbara bakterier, hög genomströmning sekvensering-baserade metagenomiska metoder kommer sannolikt att ge omfattande information om den totala sammansättningen av midgut mikrobiota29,30,31. Men samspelet mellan icke-odlingsbara bakterier och värden är fortfarande i stort sett outforskat.
Denna artikel erbjuder två alternativa alternativ för att studera effekten av tarmmikrob på myggoviposition, blanda bakterierna med värme-inaktiverat blod eller implantation av bakterierna via socker utfodring följt av blod utfodring. Representanten resulterar i detta manuskript adopterade det första alternativet, medan den senare metoden genererade liknande resultat. Olika studier skulle kunna genomföras efter oral utfodring med en specifik bakterie stam. Efterföljande analys kan användas för att undersöka hur mikrobiell faktor modulerar mygga locomotor beteende. Protein kvantifiering assay kunde följas för att studera effekterna av olika bakterier på matsmältningen. Med mindre ändringar, denna metod skulle kunna användas för att studera respektive effekter av olika mikrober mot myggfysiologi, inklusive näringsämne absorption, immunitet, utveckling, reproduktion, och vektor kompetens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), och Science and Technology Plan Project of Hunan-provinsen (2019RS1036).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), New York, N.Y. 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
