Summary
यह लेख व्यक्तिगत मच्छर आंत बैक्टीरिया के प्रभाव की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसमें अलगाव और मच्छर मिडगट कृषि योग्य रोगाणुओं की पहचान, मच्छर आंत बैक्टीरिया की एंटीबायोटिक कमी, और एक विशिष्ट बैक्टीरिया प्रजातियों को फिर से पेश करना शामिल है।
Abstract
मच्छर मिडगुट एक अत्यधिक गतिशील माइक्रोबायोम बंदरगाहों कि मेजबान चयापचय, प्रजनन, फिटनेस, और वेक्टर क्षमता को प्रभावित करता है । पूरे पेट रोगाणुओं के प्रभाव की जांच करने के लिए अध्ययन किए गए हैं; हालांकि, विभिन्न रोगाणु मेजबान की ओर अलग प्रभाव डाल सकते हैं। यह लेख प्रत्येक विशिष्ट मच्छर आंत माइक्रोब और संभावित तंत्र के प्रभाव का अध्ययन करने की कार्यप्रणाली प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल के दो भाग होते हैं। पहला भाग मच्छर मिडगुट को विच्छेदन करने, कृषि योग्य बैक्टीरिया उपनिवेशों को अलग करने और बैक्टीरिया प्रजातियों की पहचान करने का परिचय देता है। दूसरा भाग एंटीबायोटिक-उपचारित मच्छरों को उत्पन्न करने और एक विशिष्ट बैक्टीरिया प्रजातियों को फिर से शुरू करने की प्रक्रिया प्रदान करता है।
Introduction
मच्छरों को मानव रोगजनक रोगों का सबसे महत्वपूर्ण वैक्टर माना जाता है, जो जीका वायरस, डेंगू वायरस और प्लाज्मोडियम परजीवी1सहित सौ से अधिक रोगजनकों को प्रसारित करता है। जब मच्छर अंडाशय के लिए पोषक तत्व प्राप्त करने के लिए रक्त भोजन लेते हैं, तो वे गलती से पाचन तंत्र2के माध्यम से संक्रमित मेजबान से रोगजनकों को निगल सकते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि मच्छर मिडगुट, जो रक्त भोजन पाचन और रोगजनक प्रवेश द्वार दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, एक अत्यधिक गतिशील माइक्रोबायोम3बंदरगाहों ।
कई अध्ययनों में संस्कृति पर निर्भर विधि या बैक्टीरिया अनुक्रमण परख4,,5,,6का उपयोग करके प्रयोगशाला-पाला और क्षेत्र-एकत्र मच्छर माइक्रोबायोटा की विशेषता है। 5 ,,7,,,8,9विभिन्न अध्ययनों में पेंटोइया, सेराटिया5, क्लेबसिला, एलिजाबेथकिंगियाऔर एंटोकोकस सहित प्रजातियां आमतौर पर मच्छरों से अलग हैं । दिलचस्प बात यह है कि मच्छर आंत माइक्रोबायोटा दोनों समुदाय विविधता और बैक्टीरिया प्रजातियों की मात्रा में गतिशील रूप से उतार-चढ़ाव, विकास चरण, प्रजातियों, भौगोलिक मूल, और खिला व्यवहार4से प्रभावित है । अध्ययनों से पता चलता है कि रक्त आहार से आंत्रप्रेन्योर से प्रजातियों के तेजी से विस्तार और समग्र विविधता में कमीके,साथ कुल जीवाणु भार में नाटकीय रूप से वृद्धि होतीहै। इसके अलावा, लार्वा चरण के मच्छर आंत माइक्रोबायोटा को आमतौर पर खत्म कर दिया जाता है जब कीट पिल्ला और प्रकाश के दौरान कायापलट से गुजरती है; इस प्रकार, नए उभरा वयस्क मच्छरों को अपने माइक्रोबायोटा4फिर से आबाद करने की जरूरत है .
आंत माइक्रोबायोटा विभिन्न पहलुओं में कीट शरीर विज्ञान को संशोधित करता है, जिसमें पोषक तत्व अवशोषण, प्रतिरक्षा, विकास, प्रजनन और वेक्टर क्षमता12शामिल हैं। एक्सनिक मच्छर लार्वा पहले इंस्टार से परे विकसित करने में विफल रहता है जबकि एक बैक्टीरिया मौखिक आपूर्ति विकास को बचाता है, यह दर्शाता है कि लार्वा विकास13,,14के लिए मच्छर आंत माइक्रोब आवश्यक है। इसके अलावा, आंत बैक्टीरिया की कमी रक्त भोजन पाचन और पोषक तत्व अवशोषण को कम करती है, ओसाइट परिपक्वता को प्रभावित करती है, और ओविपोजिशन15को कम करती है। इसके अलावा, आंत माइक्रोफ्लोरा वाले मच्छर एंटीबायोटिक-उपचारित मच्छरों की तुलना में उच्च प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रकाश में लेते हैं, जिसमें अन्य रोगजनकों के खिलाफ लगातार ऊंचा एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड अभिव्यक्ति16को संक्रमित करने के लिए है। एंटीबायोटिक्स आमतौर पर मौखिक रूप से इन अध्ययनों में पैन आंत बैक्टीरिया को दूर करने के लिए प्रशासित कर रहे हैं, और फिर प्रयोगों के लिए कॉमेंसल रोगाणुओं के साथ एक्सनिक मच्छरों और मच्छरों के बीच अंतर की तुलना आयोजित कर रहे हैं । हालांकि, मच्छर मिडगुट रोगाणुओं के एक विविध समुदाय को बंदरगाहों, और प्रत्येक बैक्टीरिया प्रजातियों मेजबान शरीर विज्ञान की ओर एक अलग प्रभाव डालती सकता है ।
मच्छर माइक्रोबायोटा अलग प्रभाव के साथ वेक्टर क्षमता को नियंत्रित करता है। डेंगू-स्थानिक क्षेत्रों के क्षेत्र-व्युत्पन्न मच्छरों से अलग प्रोटियस द्वारा उपनिवेशीकरण16को अनियमित एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड अभिव्यक्ति और डेंगू वायरस संक्रमण के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान करता है । एंटोमोपैथिक कवक ब्यूवेरिया बसियाना आर्बोवायरस संक्रमण17के खिलाफ टोल और जेएके-स्टेट प्रतिरक्षा मार्ग को सक्रिय करता है। इसके विपरीत, एडीज एजिप्टी मिडगट से अलग कवक तलरोमीसेस आंत ट्राइप्सिन गतिविधि18को मोडुलेट करके डेंगू वायरस संक्रमण की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, सेराटिया मार्सेसेन्स एसएमएनेवेंटिन नामक एक स्रावित प्रोटीन के माध्यम से आर्बोवायरस संचरण को बढ़ावा देताहै, जो मच्छरों के आंतों के एपिथेलियम पर म्यूसिन परत को पचाता है19।
यह प्रक्रिया मच्छर मिडगुट के विच्छेदन, कृषि योग्य बैक्टीरिया उपनिवेशों के अलगाव, बैक्टीरिया प्रजातियों की पहचान, और मौखिक भोजन के माध्यम से पुनर्परिचय के लिए एक व्यवस्थित और सहज विधि प्रदान करती है। यह मच्छर अंडाशय के विकास और अंडाशय पर एक अनुकूल जीवाणु, क्राइसोबैक्टीरियम मेनिंगोसेप्टिकम केसाथ रक्त आहार के प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करता है।
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Protocol
1. मिडगुट विच्छेदन और कृषि योग्य बैक्टीरिया अलगाव
- विच्छेदन के लिए मच्छर तैयार करें।
- एस्पिरेटर के साथ उभरने के 7-9 दिन बाद मच्छरों को इकट्ठा करें। एकत्र मच्छरों को 3-5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ले जाकर एनेस्थेटाइज करें और मच्छरों को विच्छेदन तक बर्फ-ठंडे पेट्री डिश में एनेस्थेटाइज्ड रखें।
- प्रयोगशाला उपकरणों और मच्छर की सतह को स्टरलाइज करें।
- पर्यावरण से बैक्टीरिया द्वारा संदूषण से बचने के लिए 75% इथेनॉल छिड़ककर प्रयोग पीठ, विच्छेदन माइक्रोस्कोप, संदंश और ग्लास स्लाइड को निष्फल करें।
- एक बाँझ पेट्री डिश तैयार करें जिसमें 75% इथेनॉल और बाँझ 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (1x पीबीएस) युक्त दो पेट्री व्यंजन हैं।
- सतह-3 मिनट के लिए 75% इथेनॉल में उन्हें डुबोकर और हिलाकर मच्छर को स्टरलाइज करें, और 1x पीबीएस बफर के साथ दो बार कुल्ला करें यदि इथेनॉल विच्छेदित आंत वनस्पतियों को प्रभावित करता है।
- मच्छर के मिडगुट को काटें।
- सतह-निष्फल मच्छर को बाँझ 1x पीबीएस बफर की एक बूंद के साथ ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित करें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे विच्छेदन करें।
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप के निचले आवर्धन के तहत, बचने से रोकने के लिए मच्छर के पैरों, पंखों और सिर को सावधानी से हटा दें। पाचन तंत्र को तोड़ने से रोकने के लिए, इसे खींचने के बजाय सीधे काटकर मच्छर के अंतिम सोमाइट को हटा दें।
- मच्छर के छाती और पेट के अंत को संदंश के साथ दबालें। मच्छर के पाचन तंत्र को धीरे-धीरे बाहर निकालें। अधिग्रहीत पाचन तंत्र में आमतौर पर फसल, फोरगुट, मिडगट, हिंडगट और मालपिगियन ट्यूब होते हैं।
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप को उच्च आवर्धन में समायोजित करें। मच्छर के मिडगुट प्राप्त करने के लिए विच्छेदित पाचन तंत्र से फसल, फोरेगट, हिंडगट और मालपिगियन ट्यूब निकालें।
- फसल को हटाते समय ध्यान रखें, क्योंकि मच्छर चीनी का भोजन लेने के बाद फसल फुलाती है और मिडगुट जैसा दिखता है। मालपिगियन ट्यूब, लंबी और पतली उत्सर्जक ट्यूबों का एक समूह, मिडगट और हिगट के बीच सीमा पर स्थित हैं।
- आंत बैक्टीरिया को अलग करें।
- बाँ 1x पीबीएस बफर के 200 μL के साथ एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब के लिए विच्छेदित मिडगुट स्थानांतरित करें।
- बफर को आंत बैक्टीरिया को पूरी तरह से जारी करने की अनुमति देने के लिए एक बाँझ मूसल के साथ एक बाँझ बेंच पर मिडगुट को अच्छी तरह से पीस लें।
- धारावाहिक समरूप को तीन 10 गुना कमजोर करने के लिए पतला करता है । एलबी (लुरिया शोरबा) आगर प्लेट में प्रत्येक कमजोर पड़ने का 50 μL जोड़ें, और फिर इसे प्लेट पर फैलाएं। यदि मिडगुट में आंत वनस्पतियों की उच्च एकाग्रता होती है, तो एकल उपनिवेशों को चुनने के लिए अधिक धारावाहिक कमजोर करने के लिए आवश्यक है।
- 1-2 दिनों तक प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि एकल उपनिवेश दिखाई न दें।
- प्रजातियों की पहचान
- एकल उपनिवेशों को चुनें और उन्हें क्रमशः 150 एमएल शंकुधारी फ्लास्क में टीका लगाएं जिसमें एलबी शोरबा माध्यम का 50 एमएल होता है।
- बैक्टीरिया को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं।
- बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट द्वारा कुल डीएनए निकालें। पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा 16S rDNA बढ़ाना।
नोट: 16S rDNA में कई सेगमेंट हैं जिन्हें संरक्षित किया जाता है। इन संरक्षित क्षेत्रों के आधार पर, बैक्टीरिया के लिए सार्वभौमिक प्राइमर सभी बैक्टीरिया के 16S rDNA टुकड़ों को बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है । ये प्राइमर बैक्टीरिया के लिए विशिष्ट हैं, और 16S rDNA के चर क्षेत्र में अंतर का उपयोग विभिन्न बैक्टीरिया को अलग करने के लिए किया जा सकता है। इसलिए, 16S rDNA व्यापक रूप से बैक्टीरियल पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। - एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और एक वाणिज्यिक जेल रिकवरी किट द्वारा पीसीआर उत्पादों से डीएनए के टुकड़ों को ठीक और शुद्ध करें।
- बैक्टीरियल जीन दृश्यों को प्राप्त करने के लिए शुद्ध डीएनए टुकड़ों पर डीएनए अनुक्रमण करें।
- जेनबैंक में उपलब्ध बैक्टीरियल सीक्वेंस के साथ 16S आरएनए जीन सीक्वेंस की तुलना करें । बैक्टीरिया और Archaea डेटाबेस का चयन करें।
नोट: प्रजातियों के स्तर तक पहचान निकटतम जेनबैंक प्रविष्टि के लिए 99% 16S rDNA अनुक्रम समानता के रूप में परिभाषित किया गया था। अलग-थलग इसी जीनस को सौंपा गया था जब इसकी 16S rDNA अनुक्रम समानता & 99% और ‧95% थी।
2. एंटीबायोटिक उपचार और जीवाणु पुनर्परिचय
- एंटीबायोटिक समाधान तैयार करें।
- 10% सुक्रोज समाधान तैयार करने के लिए सुक्रोज, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन की आवश्यक मात्रा का वजन करें जिसमें पेनिसिलिन की 20 इकाइयां और स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रति स्ट्रेप्टोमाइसिन का 20 माइक्रोन शामिल है।
- एंटीबायोटिक समाधान के साथ मच्छरों को खिलाएं।
- मच्छरों को 3-5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में एनेस्थेटाइज करें। मच्छरों को एक पेपर कप में स्थानांतरित करें। धुंध के साथ शीर्ष को कवर करें और मच्छरों को बचने से रोकने के लिए टेप के साथ धुंध को एनविंड करें।
- एंटीबायोटिक समाधान में बाँझ कपास गेंदों डुबकी और उन्हें ध्यान से मच्छर कप पर जगह है। टपकता कपास गेंदों में डूबने से मच्छरों को रोकने के लिए उपयोग से पहले कपास गेंदों निचोड़।
- नमी वाष्पीकरण को रोकने के लिए कपास की गेंदों को 10 सेमी पेट्री डिश से ढक दें। लगातार तीन दिनों तक दिन में दो बार कॉटन बॉल्स को बदलें।
- एंटीबायोटिक उपचार की प्रभावशीलता की पुष्टि करें।
- उपरोक्त विधि के अनुसार, एंटीबायोटिक-उपचारित मच्छरों के मिडगुट को काटें।
- बाँ 1x पीबीएस बफर के 200 μL के साथ एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब के लिए विच्छेदित मिडगट्स स्थानांतरित करें।
- बफर को आंत बैक्टीरिया की पूरी रिहाई की अनुमति देने के लिए एक बाँझ मूसल के साथ अच्छी तरह से एक बाँझ बेंच में मिडगट्स पीसें।
- बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट द्वारा आंत माइक्रोबियल डीएनए निकालें।
- सार्वभौमिक यूबैक्टीरिया प्राइमर (16S आरआरएनए एफ: TCCTACGGGGCAGCAGGT और R: GGACTACCAGGGTATCTAATCTCTT) का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए पर वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) द्वारा बैक्टीरियल क्वांटिटेशन करें।
- बैक्टीरियल सस्पेंशन की तैयारी
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से बैक्टीरियल सॉल्यूशन को मापें। 1 एमएल ट्यूब में 1 ओडी (OD600) बैक्टीरियल सस्पेंशन जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर निलंबन अपकेंद्रित्र।
- सुपरनेट को त्यागें और निलंबन वर्षा के लिए बाँझ 1x पीबीएस बफर के 1.5 एमएल ट्यूब में 1 एमएल जोड़ें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज; सुपरनेट को त्याग दें।
- चरण 2.4.2 और 2.4.3 दोहराएं।
- बैक्टीरियल वर्षा में बाँझ 1x पीबीएस बफर के 200 माइक्रोल जोड़ें।
- 10% सुक्रोज समाधान के 600 माइक्रोन, 10 मिमी एटीपी के 200 माइक्रोन (जो एक फागोस्टिमुलेंट के रूप में कार्य करता है), और बैक्टीरियल सस्पेंशन के 200 माइक्रोन को बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में जोड़ें। भंवर से मिलाएं। वैकल्पिक रूप से, गर्मी में निष्क्रिय रक्त में बैक्टीरियल पेलेट को निलंबित करें।
- गर्मी में निष्क्रिय रक्त की तैयारी
- एक एंटीकोगुलैंट ट्यूब के साथ ताजा रक्त ले लीजिए।
- ताजा रक्त का 2-3 एमएल लें। प्लाज्मा और रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। ध्यान दें कि अपकेंद्रित्र और धोने की प्रक्रिया के दौरान रक्त खो जाएगा; पहले से उपयोग की गणना करने की आवश्यकता है।
- प्लाज्मा को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें और 1 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर हीट-इनएक्टिवेट करें।
- रक्त कोशिकाओं के निलंबन के लिए बाँझ 1x पीबीएस बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें 1.5 एमएल ट्यूब में। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और फिर सुपरनैंट त्यागें।
- दो बार चरण 2.4.7.4 दोहराएं।
- गर्मी-निष्क्रिय रक्त प्राप्त करने के लिए गर्मी-निष्क्रिय प्लाज्मा के साथ रक्त कोशिकाओं को फिर से रखना।
- 1 ओडी बैक्टीरियल पेलेट प्राप्त करने के लिए चरण 2.4.1 से 2.4.4 का पालन करें।
- गर्मी में निष्क्रिय रक्त के 1 मिलील के साथ गोली बैक्टीरिया को फिर से खर्च करें।
- मच्छर को बैक्टीरिया निलंबन के साथ खिलाएं।
- मच्छरों को 24 घंटे के लिए भूखा रखना, एंटीबायोटिक दवाओं को बैक्टीरिया खिलाने से पहले चयापचय करने की अनुमति देता है।
- झिल्ली-भोजन प्रणाली को इकट्ठा करें।
- एक पैराफिल्म के साथ निष्फल फीडर इकाई को सील करें, वैकल्पिक रूप से एक कोलेजन झिल्ली।
- एक प्लास्टिक की अंगूठी पर रखो और यह पैराफिल्म के साथ तय करने के लिए खिलाने के दौरान घर्षण के कारण तोड़ने से बचने के लिए ।
- धीरे-धीरे फीडर यूनिट में तैयार बैक्टीरियल सॉल्यूशन डालें। ध्यान दें कि दो-वेल फीडर यूनिट का केवल एक कुआं समाधान से भरा जा सकता है और फीडर इकाई को केवल रिएजेंट ड्रॉपिंग साइड से कवर किया जा सकता है।
- फीडर यूनिट को 37 डिग्री सेल्सियस से पहले से गर्म एक फीडिंग सिस्टम से कनेक्ट करें, जो मच्छरों को आकर्षित करने के लिए मानव तापमान का अनुकरण करता है। मच्छरों से भरे पेपर कप पर फीडिंग डिवाइस रखें और 90 मिनट तक खिलाएं।
- खिलाने के बाद, मच्छरों को 3-5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ले जाकर एनेस्थेटाइज करें और मच्छरों को बर्फ-ठंडे पेट्री डिश में एनेस्थेटाइज्ड रखें।
- आगे के अध्ययन के लिए पूरी तरह से engorged मच्छरों उठाओ।
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Representative Results
एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज मच्छरों के मिडगिट और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना डीएनए निष्कर्षण के लिए बाहर ले जाया गया, और qPCR सार्वभौमिक जीवाणु प्राइमर के साथ किया गया था । चित्रा 1 नियंत्रण समूह और एंटीबायोटिक उपचार समूह में बैक्टीरियल 16S rRNA की अभिव्यक्ति से पता चलता है । परिणाम बताते हैं कि लगभग 98% आंत के बैक्टीरिया को हटा दिया गया है, और पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन की आंत नसबंदी सफल रही।
वर्णित तरीकों के साथ, बैक्टीरिया उपभेदों को अलग-थलग कर दिया गया था और उनकी पहचान की गई थी। सी मेनिंगोसेप्टिकम एक नॉनफेरमेंटिंग, ऑक्सीडेस-पॉजिटिव ग्राम-निगेटिव एरोबिक बेसिलस है, जो क्रिसियोबैक्टीरियमसे संबंधित है । चित्रा 2 सी मेनिंगोसेप्टिकमके साथ एंटीबायोटिक-इलाज मच्छरों के रक्त खिलाने के बाद प्रति मच्छर रखे औसत अंडे से पता चलता है । चित्र 3 में सी मेनिंगोसेप्टिकमयुक्त रक्त भोजन के बाद अंडाशय विकास से संबंधित जीन 24 घंटे की अभिव्यक्ति को दिखाया गया है । ओवेरियन विकास से संबंधित जीन और प्राइमर दृश्यों का अवलोकन तालिका 1में सूचीबद्ध हैं।
आंतों के बैक्टीरिया से अलग तनाव जिसमें से आंतों के बैक्टीरिया को हटा दिया गया था और फिर पूरी तरह से engorged मच्छरों को तीन समूहों में विभाजित किया गया था । पहले समूह में पांच महिलाओं और दूसरे समूह का उपयोग स्पॉनिंग राशि की गणना करने के लिए किया जाता था, और तीसरे समूह में 10 महिलाओं को खिलाने के बाद प्रत्येक मादा मच्छर के 24 घंटे के बाद अंडाशय के विकास से संबंधित जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । परिणाम बताते हैं कि नियंत्रण समूह और फीडिंग समूह के अंडा उत्पादन में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ है।
चित्रा 1: एंटीबायोटिक उपचार के बाद 16S rRNA की अभिव्यक्ति। अनुपचारित एंटीबायोटिक दवाओं वाले मच्छरों को नियंत्रण समूह के रूप में परोसा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2:मच्छर अंडाशय पर आंत माइक्रोब का प्रभाव। संकेत बैक्टीरिया उपभेदों रक्त के साथ मिलाया और एंटीबायोटिक इलाज मच्छरों को खिलाया गया । अनुपचारित आंत अनुकूल रोगाणुओं वाले मच्छरों को नियंत्रण समूह के रूप में कार्य किया जाता है। डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:रक्त आहार के बाद प्रजनन से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति। कैथेप्सिन बी(ए),माइटोकॉन्ड्रियल एटीपेस अवरोधक(बी),राइबोसोम बायोजेनेसिस प्रोटीन ब्रिक्स(सी),और सेरीन/थ्रेनिन-प्रोटीन किनेज़ रियो2(डी)की अभिव्यक्ति 24 घंटे के लिए एंटीबायोटिक-इलाज मच्छरों के रक्त खिलाने के बाद संकेत बैक्टीरिया उपभेदों के साथ । अनुपचारित आंत commensal माइक्रोब के साथ मच्छरों नियंत्रण समूह के रूप में सेवा की । प्रत्येक डॉट एक मच्छर का प्रतिनिधित्व करता है और प्रत्येक पंक्ति समूह के औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| नाम | जीन संख्या | प्राइमर सीक्वेंस |
| कैथेप्सिन बी | AAEL009642 | फॉरवर्ड प्राइमर-GAGGGAAAGTTCGATGGGGA |
| रिवर्स प्राइमर-AATCCCACATCCCCCCAGTA | ||
| माइटोकॉन्ड्रियल एटीपीएस अवरोधक | AAEL004284 | फॉरवर्ड प्राइमर-CAACTGCACAAGCTGAGA |
| रिवर्स प्राइमर-एसीजीटीजीसीजीएजीएजीटीसीटीसीटीसीटीटी | ||
| राइबोसोम बायोजेनेसिस प्रोटीन ब्रिक्स | AAEL001917 | फॉरवर्ड प्राइमर-GAACAGCACAAGCGAATGAA |
| रिवर्स प्राइमर-टीटीजीजीटीसीटीजीटीसीटीटीटीटी | ||
| सेरीन/थ्रेओनिन-प्रोटीन किनेज़ रियो2 | AAEL011114 | फॉरवर्ड प्राइमर-ग्गागागागेकाकाएसीसी |
| रिवर्स प्राइमर-टीसीजीएजीसीटीसीटीसी |
तालिका 1: ओवेरियन विकास से संबंधित जीन और प्राइमर दृश्य।
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Discussion
मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन पर शोध में पाया गया है कि विभिन्न आंत रोगाणु अलग तंत्र के माध्यम से अपने मेजबान शरीर विज्ञान को प्रभावित करते हैं । यह लेख मच्छर आंत माइक्रोब की संबंधित भूमिका की जांच करने की विधि का परिचय देता है, जिसमें मच्छर मिडगुट को विच्छेदन करना, कृषि योग्य आंत बैक्टीरिया को निकालना, एंटीबायोटिक उपचार और ब्याज के बैक्टीरिया को फिर से शुरू करना शामिल है।
सफल एंटीबायोटिक उपचार के लिए, प्रयोग के संचालन में निम्नलिखित विवरणों पर विचार किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, मच्छरों का इलाज 10% सुक्रोज समाधान के साथ गीले कपास गेंदों का उपयोग करके किया गया था, जिसमें पेनिसिलिन की 20 इकाइयां और 3 दिनों के लिए स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रति स्ट्रेप्टोमाइसिन का 20 माइक्रोन शामिल था11,,16। पेनिसिलिन ने ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया के खिलाफ एक व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक के रूप में कार्य किया, और स्ट्रेप्टोमाइसिन ने ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया20के खिलाफ व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक के रूप में कार्य किया। एंटीबायोटिक दवाओं का उचित संरक्षण कुशल एंटीबायोटिक उपचार के लिए महत्वपूर्ण है21. जब -18 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, तो पेनिसिलिन जी की स्थिरता कम से कम 3 मीटर होती है। स्ट्रेप्टोमाइसिन कम से कम 12 मीटर के लिए स्थिर है जब 4 डिग्री सेल्सियस22पर संग्रहीत किया जाता है। जबकि एंटीबायोटिक ब्रांड या भंडारण समय में अंतर माइक्रोबियल निकासी में मामूली अंतर पैदा कर सकता है, प्रत्येक एंटीबायोटिक उपचार के बाद दक्षता को सत्यापित करना आवश्यक है। क्यूपीसीआर के अलावा, प्लेट का प्रसार या पीसीआर का उपयोग आमतौर पर एंटीबायोटिक उपचार23, 24,की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग कियाजाताहै। इसके अलावा, एंटीबायोटिक उपचार के बाद मच्छरों को अन्य बैक्टीरिया से दूषित होने से रोकने के लिए, फीडिंग परख को एक सुपर क्लीन बेंच के तहत इकट्ठे किए गए निष्फल उपकरणों के साथ किया जाना चाहिए।
बैक्टीरियल ओरल फीडिंग से पहले, मच्छरों को 24 घंटे के लिए भूखा रखा जाना चाहिए ताकि एंटीबायोटिक दवाओं कोमेटाबोलाइज्ड 25की अनुमति दी जा सके। यह न केवल मच्छरों को बैक्टीरिया तरल निगलना में मदद करता है, बल्कि एंटीबायोटिक दवाओं को बैक्टीरिया को मारने से भी रोकता है।
बेशक, यह प्रोटोकॉल मुख्य रूप से कृषि योग्य बैक्टीरिया के प्रभाव की जांच के लिए है। कशेरुकी और अकशेरुकी मेजबान के आंतों के माइक्रोबायोटा का अध्ययन करने के लिए, एंटीबायोटिक-उपचारित मेजबान के लिए कृषि योग्य बैक्टीरिया को फिर से शुरू करने का उपयोग आमतौर पर हाल केशोधों 8,26, 27,में कियाजाताहै।, इसके अलावा, सुसंस्कृत आंतों के बैक्टीरिया की प्रारंभिक पहचान आम तौर पर कॉलोनी के आकार, आकार, रंग, किनारे, अस्पष्टता, ऊंचाई और स्थिरता28की विशेषताओं पर आधारित होती है। गैर-कृषि योग्य बैक्टीरिया के लिए, उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण आधारित मेटाजन्नोमिक,दृष्टिकोण मिडगुट माइक्रोबायोटा29,30,31की कुल संरचना के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान करने की संभावना है।, हालांकि, गैर-कृषि योग्य बैक्टीरिया और मेजबान के बीच परस्पर क्रिया काफी हद तक बेरोज़गार बनी हुई है ।
यह लेख मच्छर अंडाशय पर आंत माइक्रोब के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए दो वैकल्पिक विकल्प प्रदान करता है, बैक्टीरिया को गर्मी-निष्क्रिय रक्त या रक्त खिलाने के माध्यम से बैक्टीरिया के प्रत्यारोपण के साथ मिलाएं। इस पांडुलिपि में प्रतिनिधि परिणामों ने पहला विकल्प अपनाया, जबकि बाद की विधि ने समान परिणाम उत्पन्न किए। एक विशिष्ट बैक्टीरिया तनाव के साथ मौखिक भोजन के बाद विभिन्न अध्ययन किए जा सकते हैं। बाद में परख का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि माइक्रोबियल कारक मच्छर लोकोमोटर व्यवहार को कैसे संशोधित करता है। पाचन पर विभिन्न बैक्टीरिया के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन क्वांटिफिकेशन परख का पालन किया जा सकता है। मामूली संशोधनों के साथ, इस विधि का उपयोग मच्छर शरीर विज्ञान की ओर विभिन्न रोगाणुओं के संबंधित प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें पोषक तत्व अवशोषण, प्रतिरक्षा, विकास, प्रजनन और वेक्टर क्षमता शामिल हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नंबर 81902094, 81600497) और हुन प्रांत की साइंस एंड टेक्नोलॉजी प्लान प्रोजेक्ट (2019RS1036) ने सपोर्ट किया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
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