Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En bakteriell oral fôringsanalyse med antibiotikabehandlede mygg

Published: September 12, 2020 doi: 10.3791/61341
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Intestinal Function and Regulation, College of Life Science, Hunan Normal University, 2State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish, Hunan Provincial Key Laboratory for Microbial Molecular Biology, College of Life Science, Hunan Normal University, 3Department of Infectious Diseases, the Second Xiangya Hospital, Central South University

Summary

Denne artikkelen presenterer en protokoll for å undersøke effekten av individuelle myggtarmet bakterier, inkludert isolasjon og identifisering av mygg midgut kulterbare mikrober, antibiotikauttømming av myggtarmbakterier og gjeninnføre en bestemt bakterieart.

Abstract

Myggmidgut har et svært dynamisk mikrobiome som påvirker vertmetabolismen, reproduksjon, fitness og vektorkompetanse. Studier er utført for å undersøke effekten av tarmmikrober som helhet; Imidlertid kan forskjellige mikrober utøve tydelige effekter mot verten. Denne artikkelen gir metodikken for å studere effekten av hver enkelt myggtarmmibe og den potensielle mekanismen.

Denne protokollen inneholder to deler. Den første delen introduserer hvordan man dissekerer myggmidgut, isolerer kultivable bakteriekolonier og identifiserer bakteriearter. Den andre delen gir prosedyren for å generere antibiotikabehandlede mygg og gjeninnføre en bestemt bakterieart.

Introduction

Mygg anses å være de viktigste vektorene av menneskelige patogene sykdommer, overfører over hundre patogener, inkludert Zika-virus, Dengue-virus og Plasmodium parasitter1. Når mygg tar et blodmåltid for å skaffe næringsstoffer til oviposisjon, kan de ved et uhell innta patogener fra en smittet vert via fordøyelseskanalen2. Viktigere, myggmidgut, som spiller en avgjørende rolle i både blodmåltid fordøyelsen og patogen inngangen, havner en svært dynamisk mikrobiome3.

Flere studier har karakterisert lab-reared og feltsamlede myggmikrobiota ved hjelp av enten en kulturavhengig metode eller en bakteriesekvenseringsanalyse4,,5,,6. Arter som Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaog Enterococcus er vanligvis isolert fra mygg i ulikestudier 5,,7,,8,,9. Interessant, mygg tarm mikrobiota svinger dynamisk i både samfunnet mangfold og mengden av bakterier arter, påvirket av utviklingsstadiet, arter, geografisk opprinnelse, og fôring atferd4. Studier viser at blodfôring dramatisk øker den totale bakterielle belastningen med rask utvidelse av arter fra Enterobacteriaceae og en reduksjon i det totale mangfoldet10,11. I tillegg blir mygg tarmmikrobiota av larvalstadiet vanligvis utryddet når insektet gjennomgår metamorfose under pupering og eclosion; dermed må nylig dukket voksne mygg befolke mikrobiota4.

Gut microbiota modulerer insektfysiologi i ulike aspekter, inkludert næringsabsorpsjon, immunitet, utvikling, reproduksjon og vektorkompetanse12. Asniske mygglarver utvikler seg ikke utover den første instar mens en bakterie oral forsyning redder utvikling, noe som indikerer at myggtarmmikroben er avgjørende forlarvalutvikling 13,14. Dessuten, uttømming av tarmbakterier retards blod måltid fordøyelse og næringsabsorpsjon, påvirker oocyte modning, og reduserer oviposisjon15. I tillegg fremkaller mygg med tarmmikroflora høyere immunresponser sammenlignet med antibiotikabehandlede mygg, med stadig forhøyet antimikrobiell peptiduttrykk mot andre patogener for åinfisere 16. Antibiotika administreres vanligvis oralt for å fjerne pan tarmbakterier i disse studiene, og deretter utføres eksperimenter for å sammenligne forskjellen mellom asnic mygg og mygg med commensal mikrober. Myggmidgut har imidlertid et mangfoldig samfunn av mikrober, og hver bakterieart kan utøve en tydelig effekt mot vertens fysiologi.

Myggmikrobiota regulerer vektorkompetanse med divergerende effekter. Kolonisering av Proteus isolert fra feltavledede mygg av dengue-endemiske områder gir oppregulert antimikrobiell peptiduttrykk og motstand mot denguevirusinfeksjon16. Den entomopathogenic sopp Beauveria bassiana aktiverer Toll og JAK-STAT immunveien mot arbovirus infeksjon17. Derimot, sopp Talaromyces isolert fra Aedes aegypti midgut forenkler dengue virusinfeksjon ved å modulere gut trypsin aktivitet18. I tillegg fremmer Serratia marcescens arbovirusoverføring gjennom et sekretorisk protein kalt SmEnhancin, som fordøyer mucinlaget på tarmepitelet av mygg19.

Denne prosedyren gir en systematisk og intuitiv metode for disseksjon av myggmidgut, isolering av kultivable bakteriekolonier, identifisering av bakterieartene og gjeninnføring via oral fôring. Det gir representative resultater av blodfôring med en commensal bakterie, Chryseobacterium meningosepticum, på mygg eggstokkutvikling og oviposisjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Midgut disseksjon og dyrkbare bakterier isolasjon

  1. Forbered myggen for disseksjon.
    1. Samle myggene 7-9 dager etter fremveksten med en aspirator. Bedøve de oppsamlede myggene ved å utsette dem for en temperatur på 4 °C i 3–5 min og holde myggene bedøvet i en iskald petriskål til disseksjon.
  2. Steriliser laboratorieinstrumenter og myggoverflaten.
    1. Steriliser eksperimentbenken, dissekere mikroskop, tang og glasssklie ved å sprøyte 75% etanol for å unngå forurensning av bakterier fra miljøet.
    2. Forbered en steril petriskål som inneholder 75% etanol og to Petri-retter som inneholder steril 1x fosfatbufret saltvann (1x PBS).
    3. Overflatesteriliser myggen ved å dyppe og riste dem i 75% etanol i 3 min, og skyll to ganger med 1x PBS-buffer i tilfelle etanolet påvirker den dissekerte tarmfloraen.
  3. Disseker myggmidgut.
    1. Overfør den overflatesteriliserte myggen på glasslysbildet med en dråpe steril 1x PBS-buffer. Dissekere under disseksjonsmikroskopet.
    2. Under den nedre forstørrelsen av disseksjonsmikroskopet, fjern forsiktig bena, vingene og myggens hode for å forhindre rømming. Fjern myggens siste somite ved å kutte direkte, i stedet for å trekke den, for å forhindre at fordøyelseskanalen bryter.
    3. Klem myggens thorax og enden av magen med tang. Trekk forsiktig ut myggens fordøyelseskanal. Den ervervede fordøyelseskanalen inneholder vanligvis avlingen, foregut, midgut, hindgut og malpighian rørene.
    4. Juster disseksjonsmikroskopet til en høyere forstørrelse. Fjern avlingen, foregut, bakgut og malpighian rør fra dissekert fordøyelseskanalen for å få midgut av myggen.
    5. Vær forsiktig mens du fjerner avlingen, da avlingen blåses opp og ligner midgut etter at myggen tar et sukkermåltid. De malpighiske rørene, en gruppe lange og tynne ekskresjonsrør, ligger ved grensen mellom mellomgut og bakgut.
  4. Isoler tarmbakterier.
    1. Overfør den dissekerte midguten til et sterilt 1,5 ml rør med 200 μL steril 1x PBS-buffer.
    2. Grind midgut på en steril benk grundig med en steril pestle for å tillate fullstendig frigjøring av tarmbakterier til bufferen.
    3. Seriell fortynne homogenatet til tre 10-ganger fortynninger. Tilsett 50 μL av hver fortynning til LB (Luria kjøttkraft) agarplate, og spre den deretter på platen. Hvis midgut inneholder en høy konsentrasjon av tarmflora, er det viktig å lage flere seriell fortynninger for å plukke ut enkeltkolonier.
    4. Inkuber platen ved 37 °C i 1–2 dager til enkeltkolonier er synlige.
  5. Identifikasjon av arter
    1. Plukk enkeltkolonier og inokuler dem henholdsvis i en 150 ml konisk kolbe som inneholder 50 ml LB kjøttkraft medium.
    2. Rist bakteriene ved 37 °C over natten.
    3. Trekk ut totalt DNA ved bakteriell genomisk DNA-ekstraksjonssett. Forsterke 16S rDNA ved polymerasekjedereaksjon (PCR).
      MERK: Det finnes flere segmenter i 16S rDNA som er bevart. Basert på disse konserverte regionene kan universelle primere for bakterier utformes for å forsterke 16S rDNA-fragmenter av alle bakterier. Disse primerne er spesifikke for bakterier, og forskjellen i den variable regionen 16S rDNA kan brukes til å skille mellom forskjellige bakterier. Derfor er 16S rDNA mye brukt for bakteriell identifikasjon.
    4. Gjenopprett og rens DNA-fragmenter fra PCR-produkter ved agarose gel elektroforese og et kommersielt gelgjenvinningssett.
    5. Utfør DNA-sekvensering på de rensede DNA-fragmentene for å oppnå bakterielle gensekvenser.
    6. Sammenlign 16S rRNA-gensekvensen med den bakterielle sekvensen som er tilgjengelig i GenBank. Velg databasen Bakterier og Arkaea.
      MERK: Identifikasjon til artsnivået ble definert som ≥99 % 16S rDNA sekvens likhet med nærmeste GenBank-oppføring. Isolatet ble tildelt den tilsvarende slekten da 16S rDNA-sekvensen var <99 % og ≥95 %.

2. Antibiotikabehandling og bakterieinnføring

  1. Forbered antibiotikaløsningen.
    1. Vei den nødvendige mengden sukrose, penicillin og streptomycin for å forberede en 10% sukroseløsning, inkludert 20 enheter penicillin og 20 μg streptomycin per ml.
  2. Mate mygg med antibiotikaløsningen.
    1. Bedøve myggene i 4 °C i 3–5 min. Overfør myggene til en papirkopp. Dekk toppen med gasbind og vind gasbind med tape for å forhindre mygg fra å rømme.
    2. Dypp sterile bomullsballer i antibiotikaløsningen og legg dem forsiktig på myggkoppen. Klem bomullsballene før bruk for å forhindre mygg fra å drukne i de dryppende bomullsballene.
    3. Dekk bomullsballene med en 10 cm petriskål for å forhindre fuktighetsfordampning. Bytt bomullsballene to ganger om dagen i tre påfølgende dager.
  3. Bekreft effektiviteten av antibiotikabehandlingen.
    1. Ifølge ovennevnte metode dissekere midgut av antibiotikabehandlede mygg.
    2. Overfør dissekerte midguts til et sterilt 1,5 ml rør med 200 μL steril 1x PBS buffer.
    3. Grind midguts i en steril benk grundig med en steril pestle for å tillate fullstendig frigjøring av tarmbakterier til bufferen.
    4. Trekk ut tarmmikrobiell DNA ved bakteriell genomisk DNA-ekstraksjonssett.
    5. Utfør bakteriell kvantitet etter kvantitativ PCR (qPCR) i sanntid på genomisk DNA ved hjelp av universelle eubakterier primere (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGT og R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT).
  4. Tilberedning av bakteriell suspensjon
    1. Mål bakterieoppløsningen med et spektrofotometer. Tilsett 1 OD (OD600) bakteriell suspensjon i et 1 ml rør. Sentrifuger suspensjonen ved 5000 x g i 5 min ved 4 °C.
    2. Kast det supernatante og tilsett 1 ml steril 1x PBS-buffer til 1,5 ml rør for suspensjonsnedbør.
    3. Sentrifuge ved 5000 x g i 5 min ved 4 °C; kast det overnaturlige.
    4. Gjenta trinn 2.4.2 og 2.4.3.
    5. Tilsett 200 μL steril 1x PBS buffer til bakteriell nedbør.
    6. Tilsett 600 μL med 10 % sukroseoppløsning, 200 μL på 10 mm ATP (som fungerer som et phagostimulant) og 200 μL bakteriell suspensjon i et sterilt 1,5 ml rør. Bland ved vortexing. Alternativt, suspendere bakteriell pelleted i varme-inaktivert blod.
    7. Fremstilling av varmeaktivert blod
      1. Samle friskt blod med et antikoagulerende rør.
      2. Ta 2–3 ml friskt blod. Sentrifuge ved 1000 x g i 10 min ved 4 °C for å skille plasma og blodceller. Legg merke til at blodet vil gå tapt under sentrifugering og vaskeprosessen; det er behov for å beregne bruken på forhånd.
      3. Samle plasmaet i et nytt 1,5 ml rør og varme-inaktiver ved 56 °C i 1 time.
      4. Tilsett 500 μL steril 1x PBS-buffer til 1,5 ml rør for suspensjon av blodceller. Sentrifuge ved 1000 x g i 10 min ved 4 °C og kast deretter overnatanten.
      5. Gjenta trinn 2.4.7.4 to ganger.
      6. Resuspend blodceller med varmeaktivert plasma for å oppnå varmeaktivert blod.
      7. Følg trinn 2.4.1 til 2.4.4 for å få 1 OD bakteriell pelleted.
      8. Resuspend bakteriene pelleted med 1 ml varme-inaktivert blod.
  5. Mate myggen med bakterier suspensjon.
    1. Sult myggene i 24 timer, slik at antibiotika kan metabolisere før fôring av bakterier.
    2. Sett sammen membranmatesystemet.
    3. Forsegle den steriliserte materenheten med en parafilm, alternativt en kollagenmembran.
    4. Ta på deg en plastring og fest den med parafilm for å unngå å bryte på grunn av friksjon under fôring.
    5. Tilsett langsomt den tilberedte bakterieoppløsningen til materenheten. Vær oppmerksom på at bare én brønn av tobrønns materenheten kan fylles med oppløsningen og dekke materenheten bare fra reagensens slippeside.
    6. Koble materenheten til et fôringssystem forvarmet til 37 °C, som simulerer menneskelig temperatur for å tiltrekke mygg. Plasser mateenheten på en papirkopp fylt med mygg og mat i 90 min.
    7. Etter fôring, bedøve myggene ved å utsette dem for en temperatur på 4 ° C i 3-5 min og holde myggene bedøvet i en iskald petriskål.
    8. Velg de fullt engorged myggene for videre studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Midguts av mygg behandlet med antibiotika og uten antibiotika ble tatt ut for DNA ekstraksjon, og qPCR ble utført med universelle bakterielle primere. Figur 1 viser uttrykket for bakteriell 16S rRNA i kontrollgruppen og antibiotikabehandlingsgruppen. Resultatene viser at ca 98% av tarmbakteriene er fjernet, og tarmen sterilisering av penicillin og streptomycin var vellykket.

Med de beskrevne metodene ble bakteriestammer isolert og identifisert. C. meningosepticum er en ikke-fermenterende, oksidase-positiv gram-negativ aerob bacillus, som tilhører Chryseobacterium. Figur 2 viser gjennomsnittlig egg lagt per mygg etter blodfôring av antibiotikabehandlede mygg med C. meningosepticum. Figur 3 viser uttrykket av ovarieutviklingsrelaterte gener 24 timer etter blodmåltid som inneholder C. meningosepticum. En oversikt over eggstokkutviklingsrelaterte gener og primersekvenser er oppført i tabell 1.

Belastningen isolert fra tarmbakterier som tarmbakterier ble fjernet fra, og deretter ble de fullstendig engorged myggene delt inn i tre grupper. Fem kvinner i den første gruppen og den andre gruppen ble brukt til å telle gytemengden, og 10 kvinner i den tredje gruppen ble brukt til å oppdage genuttrykket knyttet til ovarieutvikling etter henholdsvis 24 timer av hver kvinnelige mygg etter fôring. Resultatene viser at det ikke er noen signifikant endring i eggproduksjonen til kontrollgruppen og fôringsgruppen.

Figure 1
Figur 1: Uttrykk for 16S rRNA etter antibiotikabehandling. Myggene med ubehandlet antibiotika fungerte som kontrollgruppen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Effekt av tarmmikrobe på myggoviposisjon. De indikerte bakteriestammene ble blandet med blod og matet til antibiotikabehandlede mygg. Myggene med ubehandlede tarm commensal mikrober fungerte som kontrollgruppen. Dataene presenteres som gjennomsnittet ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Uttrykk for reproduksjonsrelaterte gener etter blodfôring. Uttrykk for Cathepsin B (A), Mitokondrie ATPase hemmer (B), Ribosome biogenese protein brix (C), og Serine / Threonine-protein kinase rio2 (D) etter blod fôring av antibiotika-behandlet mygg i 24 timer med de angitte bakterier stammer. Myggene med ubehandlet tarm commensal mikrobe fungerte som kontrollgruppen. Hver prikk representerer en mygg og hver linje representerer medianverdien av gruppen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

navn gennummer primer sekvens
Cathepsin B AAEL009642 Fremover primer-GAGGGAAAGTTCGATGTGGA
Omvendt primer-AATCCCACATCCACCCAGTA
Mitokondrie ATPase-hemmer AAEL004284 Primer-CAACTGCACAAGCTGAAGGA FOROVER
Omvendt primer-ACGTGCGATAGCTTCTTCGT
Ribosom biogenese protein brix AAEL001917 Fremover primer-GAACAGCACAAGCGAATGAA
Omvendt primer-TTGGCCTTGAGAGTCGTCTT
Serine/Threonine-protein kinase rio2 AAEL011114 Fremover primer-GAGGAGAAAGCAGCACAACC
Omvendt primer-TCGAATGGCTTTTCCATTTC

Tabell 1: Ovarieutviklingsrelaterte gener og primersekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskning på host-mikrobe interaksjoner har funnet at ulike tarmmikrober påvirker vertens fysiologi via divergerende mekanismer. Denne artikkelen introduserer metoden for å undersøke den respektive rollen som myggtarmmikrobe, inkludert dissekering av myggmidgut, kultiverering av kultiverende tarmbakterier, antibiotikabehandling og gjeninnføring av bakteriene av interesse.

For vellykket antibiotikabehandling må følgende detaljer vurderes for å gjennomføre eksperimentet. I denne protokollen ble mygg behandlet ved hjelp av bomullsballer fuktet med en 10% sukroseløsning, inkludert 20 enheter penicillin og 20 μg streptomycin per ml i 3 dager11,,16. Penicillin fungerte som et bredspektret antibiotika mot gram-positive bakterier, og streptomycin fungerte som et bredspektret antibiotika mot gram-negative bakterier20. Riktig bevaring av antibiotika er avgjørende for effektiv antibiotikabehandling21. Ved oppbevaring ved -18 °C er stabiliteten til penicillin G minst 3 m. Streptomycin er stabil i minst 12 m når det oppbevares ved 4 °C22. Mens forskjeller i antibiotika merkevare eller lagringstid kan føre til små forskjeller i mikrobiell clearance, Er det nødvendig å verifisere effektiviteten etter hver antibiotikabehandling. I tillegg til qPCR brukes spredning av platen eller ved hjelp av PCR ofte til å evaluere effektiviteten av antibiotikabehandling23,24. Videre, for å forhindre mygg fra å bli forurenset med andre bakterier etter antibiotikabehandling, må fôringsanalysen utføres med sterilisert utstyr montert under en super ren benk.

Før bakteriell oral fôring bør myggene sultes i 24 timer for å tillate antibiotika å bli metabolisert25. Dette hjelper ikke bare myggene som innkaller bakterier væske, men forhindrer også antibiotika fra å drepe bakteriene.

Riktignok er denne protokollen hovedsakelig for å undersøke effekten av dyrkbare bakterier. For å studere tarmmikrobiota av virveldyr og virvelløse vert, brukes gjeninnføring av kultivable bakterier til antibiotikabehandlet vert ofte i nyere undersøkelser8,,26,,27. I tillegg er den første identifiseringen av kultiverte tarmbakterier generelt basert på egenskapene til kolonistørrelse, form, farge, kant, opasitet, høyde og konsistens28. For ikke-kulterbare bakterier vil høy gjennomstrømningssekvenseringsbaserte metagenomiske tilnærminger sannsynligvis gi omfattende informasjon om den totale sammensetningen av midgut mikrobiota29,,30,,31. Imidlertid forblir samspillet mellom ikke-dyrbare bakterier og verten i stor grad uutforsket.

Denne artikkelen tilbyr to alternative alternativer for å studere effekten av tarmmikrober på myggoviposisjon, bland bakteriene med varmeaktivert blod eller implantasjon av bakteriene via sukkerfôring etterfulgt av blodfôring. De representative resultatene i dette manuskriptet vedtok det første alternativet, mens sistnevnte metode genererte lignende resultater. Ulike studier kan utføres etter oral fôring med en bestemt bakteriestamme. Etterfølgende analyse kan brukes til å undersøke hvordan mikrobiell faktor modulerer mygglokomotorisk oppførsel. Protein kvantifisering analyse kan følges for å studere effekten av ulike bakterier på fordøyelsen. Med mindre modifikasjoner kan denne metoden brukes til å studere de respektive effektene av ulike mikrober mot myggfysiologi, inkludert næringsabsorpsjon, immunitet, utvikling, reproduksjon og vektorkompetanse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), og Science and Technology Plan Project of Hunan Province (2019RS1036).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383 Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions
Aedes aegypti Female mosquitoes
Anticoagulant tube BD Vacutainer 363095 Collect fresh blood
Centrifuge tube Sangon Biotech F601620-0010 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile
Cotton balls
Disposable Tissue Grinding Pestle Sangon Biotech F619072-0001 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile
Ethanol absolute Paini Dilute it to 75% ethanol
Forceps RWD F11029 Dissection
Hemotek Membrane Feeding System Hemotek Components of the feeding system, including  Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.
Incubator shaker ZQZY-78AN
Inoculation Loops Sangon Biotech F619312-0001 10 μl, Yellow
LB Agar Powder Sangon Biotech A507003 Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g.
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002 Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g.
Microscope Zeiss Stemi508
Paper cup Place mosquito
Parafilm Sangon Biotech F104002 4 inx 125 ft
Petri dish Sangon Biotech F611203
Penicillin G procaine salt hydrate Sangon Biotech A606248 White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol
Single Channal Pipettor Gilson
Streptomycin sulfate Sangon Biotech A610494 Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.
Sucrose Sangon Biotech A502792 Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.
TIANamp Bacteria DNA Kit TIANGEN DP302 Extract DNA 
Utility Fabric-Mosquito Netting White
Vortex mixer Scintic Industries S1-0246
1.5ml EP tube Sangon Biotech F600620
10X PBS buffer Sangon Biotech E607016 This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
  2. Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
  3. Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
  4. Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
  5. Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
  6. Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
  7. Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
  8. Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
  9. Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
  10. Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
  11. Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
  12. Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
  13. Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
  14. Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
  15. de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
  16. Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
  17. Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
  18. Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
  19. Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
  20. Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
  21. Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
  22. Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
  23. Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
  24. Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
  25. Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
  26. Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
  27. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), New York, N.Y. 249-252 (2011).
  28. Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
  29. Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
  30. Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
  31. Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).

Tags

Biologi Utgave 163 mygg midgut mikrobiota tarmbakterier antibiotika sukkerfôring blodfôring Aedes aegypti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, X., Wu, S., Li, W., Zhang, M.,… More

Liu, X., Wu, S., Li, W., Zhang, M., Wu, Y., Zhou, N., Wu, P. A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes. J. Vis. Exp. (163), e61341, doi:10.3791/61341 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter