Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Бактериальная устная кормление с помощью антибиотико-обработанных комаров

Published: September 12, 2020 doi: 10.3791/61341
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Intestinal Function and Regulation, College of Life Science, Hunan Normal University, 2State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish, Hunan Provincial Key Laboratory for Microbial Molecular Biology, College of Life Science, Hunan Normal University, 3Department of Infectious Diseases, the Second Xiangya Hospital, Central South University

Summary

В этой статье представлен протокол для исследования влияния отдельных бактерий комаров кишечника, в том числе изоляции и выявления комаров midgut культивирования микробов, антибиотик истощения бактерий кишечника комаров, и вновь ввести один конкретный вид бактерий.

Abstract

Комар midgut гавани высоко динамичный микробиом, который влияет на метаболизм хозяина, размножение, фитнес, и вектор компетенции. Были проведены исследования для исследования влияния кишечных микробов в целом; однако, различные микробы могут оказывать различные эффекты по отношению к хозяину. В данной статье приводится методология изучения влияния каждого конкретного микроба кишечника комаров и потенциального механизма.

Этот протокол содержит две части. Первая часть вводит, как вскрыть комаров midgut, изолировать сорта бактерий колоний, и определить виды бактерий. Вторая часть предусматривает процедуру генерации обработанных антибиотиками комаров и повторного введения одного конкретного вида бактерий.

Introduction

Комары считаются наиболее важными переносчиками патогенных заболеваний человека, передающих более ста патогенных микроорганизмов, включая вирус Зика, вирус Денге и паразиты Plasmodium 1. Когда комары принимают пищу крови, чтобы приобрести питательные вещества для овипозиции, они могут случайно ingest патогенов из инфицированного хозяина через пищеварительныйтракт 2. Важно отметить, что комаров midgut, который играет ключевую роль в обоих пищеварения еды крови и патогенных входов, гавани очень динамичный микробиом3.

Несколько исследований характеризовали лабораторных и полевых собранных микробиот комаров с использованием либо культурозависимый метод или бактерии секвенированияанализа 4,5,6. Виды, включая Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, и Enterococcus обычно изолированы от комаров вразличных исследованиях 5,7,8,9. Интересно, что микробиота кишечника комаров динамически колеблется как в разнообразии сообщества, так и в количестве видов бактерий, затронутых стадией развития, видом, географическим происхождением иповедением кормления 4. Исследования показывают, что кормление крови резко увеличивает общую бактериальную нагрузку с быстрым расширением видов из Enterobacteriaceae и сокращениеобщего разнообразия 10,11. Кроме того, микробиота кишечника комаров личиновидной стадии обычно искореняется, когда насекомое подвергается метаморфозе во время окукливания и эклоции; таким образом, вновь возникшие взрослые комары должны заселить свою микробиоту4.

Микробиота кишки модулирует физиологию насекомых в различных аспектах, включая усвоение питательных веществ, иммунитет, развитие, размножение и векторнуюкомпетентность 12. Axenic личинки комаров не в состоянии развиваться за пределами первой instar в то время как бактерии устные поставки спасает развитие, указывая, что комаров кишечника микроб имеет важное значениедля развития личинки 13,14. Кроме того, истощение кишечных бактерий замедляет пищеварение пищи в крови и усвоение питательных веществ, влияет на созревание яйцеклеток и уменьшает овипозицию15. Кроме того, комары с микрофлорой кишечника вызывают более высокие иммунные реакции по сравнению с обработанными антибиотиками комарами, с постоянно повышенным экспрессией антимикробных пептидов противдругих патогенов, чтобы заразить 16. Антибиотики, как правило, устно вводят для удаления бактерий пан кишечника в этих исследованиях, а затем эксперименты проводятся, чтобы сравнить разницу между топором комаров и комаров с commensal микробов. Тем не менее, комар midgut гавани разнообразное сообщество микробов, и каждый вид бактерий может оказать явное влияние на физиологию хозяина.

Микробиота комаров регулирует векторную компетентность с различными эффектами. Колонизация Proteus изолированы от полевых комаров денге эндемичных районах придает до регулируется антимикробных пептид экспрессии и устойчивость к инфекции вирусаденге 16. Энтомопатогенный гриб Beauveria bassiana активирует иммунный путь Toll и JAK-STAT против арбовирусной инфекции17. В отличие от этого, гриб Talaromyces изолированы от Aedes aegypti midgut облегчает вирус денге инфекции путем модуляции кишечника трипсинадеятельности 18. Кроме того, Serratia marcescens способствует передаче арбовируса через секреторный белок под названием SmEnhancin ,который переваривает слой муцина на кишечном эпителиикомаров 19.

Эта процедура обеспечивает систематический и интуитивный метод для вскрытия комаров мидгут, изоляция обетуемых колоний бактерий, выявление видов бактерий, и реинтродукции через устное кормление. Он обеспечивает репрезентативные результаты кормления крови с commensal бактерии, Chryseobacterium менингосептикум, на комаров яичников развития и овипозиции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Мидгут рассечение и культивирование бактерий изоляции

  1. Приготовьте комара к вскрытию.
    1. Соберите комаров через 7-9 дней после появления с аспиратором. Обезболить собранных комаров, подвергая их температуре 4 градусов по Цельсию в течение 3-5 минут и держать комаров анестезии в ледяной чашке Петри до вскрытия.
  2. Стерилизовать лабораторные приборы и поверхность комаров.
    1. Стерилизовать экспериментальную скамейку, рассекая микроскоп, миппы и стеклянную горку, распыляя 75% этанола, чтобы избежать загрязнения бактериями окружающей среды.
    2. Приготовьте стерильную чашку Петри, содержащую 75% этанола и две чашки Петри, содержащие стерильный 1x фосфат буферный солевой раствор (1x PBS).
    3. Поверхностная стерилизация комаров путем погружения и встряхивания их в 75% этанола в течение 3 мин, и промыть дважды с 1x PBS буфера в случае, если этанол влияет на расчлененную флору кишечника.
  3. Вскрыть комаров midgut.
    1. Перенесите поверхностно стерилизованных комаров на стеклянную горку с каплей стерильного буфера 1x PBS. Рассекаете под рассечением микроскопа.
    2. Под нижним увеличением рассечения микроскопа, тщательно удалить ноги, крылья и голову комара, чтобы предотвратить побег. Удалите последний somite комара путем резки непосредственно, а не потянув его, чтобы предотвратить пищеварительного тракта от разрушения.
    3. Зажим грудной клетки комара и конца живота с типсами. Аккуратно вытащите пищеварительный тракт комара. Приобретенный пищеварительный тракт обычно содержит урожай, foregut, midgut, hindgut, и malpighian пробки.
    4. Отрегулируйте рассечение микроскопа до более высокого увеличения. Удалите урожай, foregut, hindgut, и malpighian труб из вскрытого пищеварительного тракта, чтобы получить midgut комара.
    5. Позаботьтесь при удалении урожая, так как урожай надувается и напоминает мидгут после того, как комар принимает сахарную муку. Мальпигийские трубы, группа длинных и тонких выделительных трубок, расположены на границе между мидгутом и задней частью.
  4. Изолировать кишечные бактерии.
    1. Перенесите расчлененный мидгут в стерильную трубку 1,5 мл с 200 МКЛ стерильного буфера 1x PBS.
    2. Измельчить midgut на стерильной скамейке тщательно с стерильной пестик, чтобы обеспечить полное освобождение кишечника бактерий в буфер.
    3. Серийный разбавить гомогенат до трех 10-кратных разбавлений. Добавьте 50 л каждого разбавления в агарную тарелку LB (бульон Лурия), а затем выложить на тарелку. Если midgut содержит высокую концентрацию кишечной флоры, важно сделать более серийные разбавления, чтобы выделить одиночные колонии.
    4. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в течение 1-2 дней, пока не будут видны одиночные колонии.
  5. Идентификация видов
    1. Выберите одиночные колонии и прививайте их соответственно в коническую колбу 150 мл, содержащую 50 мл бульона LB среды.
    2. Встряхните бактерии при 37 градусов по Цельсию на ночь.
    3. Извлекайте общую ДНК с помощью бактериального геномного набора для извлечения ДНК. Усиление 16S rDNA полимеразной цепной реакцией (ПЦР).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько сегментов в 16S rDNA, которые сохранены. На основе этих сохраненных регионов, универсальные грунтовки для бактерий могут быть разработаны для усиления 16S rDNA фрагменты всех бактерий. Эти грунтовки специфичны для бактерий, и разница в переменной области 16S rDNA может быть использована для различения различных бактерий. Таким образом, 16S rDNA широко используется для бактериальной идентификации.
    4. Восстановление и очистка фрагментов ДНК из продуктов ПЦР с помощью электрофореза агарозного геля и коммерческого комплекта для восстановления геля.
    5. Выполните секвенирование ДНК на очищенных фрагментах ДНК для получения бактериальных последовательностей генов.
    6. Сравните последовательность генов 16S rRNA с бактериальной последовательностью, доступной в GenBank. Выберите базу данных Бактерий и Археи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификация к уровню вида была определена как 99% 16S rDNA последовательность сходства с ближайшим GenBank вступления. Изолят был назначен соответствующему роду, когда его сходство последовательности 16S rDNA было lt;99% и 95%.

2. Лечение антибиотиками и реинтродукция бактерий

  1. Подготовь решение для антибиотиков.
    1. Взвесить необходимое количество сахарозы, пенициллина и стрептомицина, чтобы подготовить 10% раствор сахарозы, включая 20 единиц пенициллина и 20 мкг стрептомицина на мл.
  2. Кормите комаров раствором антибиотиков.
    1. Обезболивать комаров при 4 градусах Цельсия в течение 3-5 мин. Перенесите комаров в бумажный стакан. Обложка верхней части с марлей и enwind марлю с лентой, чтобы предотвратить комаров от побега.
    2. Опустите стерильные ватные шарики в раствор антибиотиков и аккуратно поместите их на чашку комара. Сожмите ватные шарики перед использованием, чтобы предотвратить комаров от утопления в капающих ватных шариках.
    3. Обложка ватные шарики с 10 см Петри блюдо для предотвращения испарения влаги. Замените ватные шарики два раза в день в течение трех дней подряд.
  3. Подтвердите эффективность лечения антибиотиками.
    1. Согласно вышеупомянутому методу, вскрыть мидгут обработанных антибиотиками комаров.
    2. Перенесите вскрытые мидгуты в стерильную трубку 1,5 мл с 200 МКЛ стерильного буфера 1x PBS.
    3. Измельчить midguts в стерильной скамейке тщательно с стерильной пестик, чтобы обеспечить полное высвобождение кишечных бактерий в буфер.
    4. Извлекайте ДНК кишечных микробов с помощью бактериального геномного набора для извлечения ДНК.
    5. Выполните бактериальную квантитацию количественным ПЦР в режиме реального времени (qPCR) на геномной ДНК с использованием универсальных праймеров эвбактерий (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGGAGCAGCAGT и R: GGACTACCAGGGGTACTACTGTT).
  4. Подготовка бактериальной суспензии
    1. Измерьте бактериальный раствор с помощью спектрофотометра. Добавьте 1 OD (OD600) бактериальную суспензию в трубку 1 мл. Центрифуга подвески при 5000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
    2. Отбросьте супернатант и добавьте 1 мл стерильного буфера 1x PBS до 1,5 мл трубки для суспензии осадков.
    3. Центрифуга при 5000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия; отказаться от супернатанта.
    4. Повторите шаги 2.4.2 и 2.4.3.
    5. Добавьте 200 йл стерильного буфера 1x PBS к бактериальным осадкам.
    6. Добавьте 600 МКЛ 10% раствора сахарозы, 200 МКЛ 10 мм АТФ (который действует как фагостимулятор) и 200 мл бактериальной суспензии в стерильную трубку 1,5 мл. Смешайте вихрем. Кроме того, приостановить бактериальные гранулы в тепло-инактивированной крови.
    7. Подготовка тепловой инактивированной крови
      1. Соберите свежую кровь с антикоагулянтной трубкой.
      2. Возьмите 2-3 мл свежей крови. Центрифуга при 1000 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию, чтобы отделить плазму и клетки крови. Обратите внимание, что кровь будет потеряна во время центрифугации и мытья; необходимо заранее рассчитать использование.
      3. Соберите плазму в новую трубку 1,5 мл и нагревай-инактивировать при температуре 56 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
      4. Добавьте 500 мкл стерильного буфера 1x PBS в трубку 1,5 мл для суспензии клеток крови. Центрифуга при 1000 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию, а затем отказаться от супернатанта.
      5. Повторите шаг 2.4.7.4 дважды.
      6. Resuspend клеток крови с тепло-инактивированной плазмы для получения тепловой инактивированной крови.
      7. Следуйте шагам 2.4.1 до 2.4.4, чтобы получить 1 OD бактериальных гранул.
      8. Resuspend бактерий гранулированные с 1 мл тепловой инактивированной крови.
  5. Кормите комаров с бактериями подвески.
    1. Голодают комары в течение 24 ч, что позволяет антибиотикам усваивать перед кормлением бактерий.
    2. Соберите мембранную систему кормления.
    3. Печать стерилизованного фидерного блока с парафильмом, в качестве альтернативы коллагеновой мембраны.
    4. Положите на пластиковое кольцо и исправить его с парафильмом, чтобы избежать нарушения из-за трения во время кормления.
    5. Медленно добавьте подготовленный бактериальный раствор в кормушки. Обратите внимание, что только один колодец из двух хорошо подачи единицы могут быть заполнены с раствором и покрыть фидер единицы только от реагента снижается стороны.
    6. Подключите кормушки к системе кормления, разогретой до 37 градусов по Цельсию, которая имитирует температуру человека для привлечения комаров. Поместите кормующее устройство на бумажный стакан, наполненный комарами, и кормите в течение 90 минут.
    7. После кормления, анестезировать комаров, подвергая их температуре 4 градусов по Цельсию в течение 3-5 минут и держать комаров анестезии в ледяной чашки Петри.
    8. Выберите полностью engorged комаров для дальнейших исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для извлечения ДНК были вывезены мидгуты комаров, обработанных антибиотиками и без антибиотиков, а qPCR выполнялся с помощью универсальных бактериальных грунтовок. На рисунке 1 показано выражение бактериальной 16S rRNA в контрольной группе и группе лечения антибиотиками. Результаты показывают, что около 98% кишечных бактерий были удалены, и стерилизация кишечника пенициллина и стрептомицина была успешной.

С описанными методами, штаммы бактерий были изолированы и определены. C. meningosepticum является неферментации, оксидазы-положительные грам-отрицательные аэробные бациллы, принадлежащие к Chryseobacterium. Рисунок 2 показывает среднее яйцо, положенное на комара после кормления крови обработанных антибиотиками комаров с менингосептиком C. Рисунок 3 показывает экспрессию генов, связанных с развитием яичников 24 ч после еды крови, содержащей C. meningosepticum. Обзор генов, связанных с развитием яичников, и последовательностей грунтовки перечислены в таблице 1.

Штамм, изолированный от кишечных бактерий, из которых были удалены кишечные бактерии, а затем полностью разореченные комары были разделены на три группы. Пять самок в первой и второй группах были использованы для подсчета количества нереста, и 10 самок в третьей группе были использованы для обнаружения экспрессии генов, связанных с развитием яичников после 24 ч каждого женского комара после кормления, соответственно. Результаты показывают, что нет никаких существенных изменений в производстве яиц контрольной группы и группы кормления.

Figure 1
Рисунок 1: Выражение 16S rRNA после лечения антибиотиками. Комары с необработанными антибиотиками служили контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Влияние микроба кишечника на овипозицию комаров. Указанные штаммы бактерий смешивались с кровью и питались обработанными антибиотиками комарами. Комары с необработанными кишечными микробами служили контрольной группой. Данные представлены как среднее й SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Выражение генов, связанных с размножением после кормления крови. Выражение катепсина B (A), Митохондриальный ингибитор ATPase(B), Рибосома биогенез белкаbrix( C ), и Серин / Threonine-белок киназы rio2 (D) после кормления крови антибиотиков обработанных комаров в течение 24 ч с указанными штаммами бактерий. Комары с необработанными кишечника commensal микроб служил в качестве контрольной группы. Каждая точка представляет собой комара, и каждая строка представляет среднее значение группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Имя номер гена грунтовка последовательность
Катепсин B AAEL009642 Форвард праймер-GAGGGAAAGTTCGATGTGGA
Обратный грунт-AATCCCACATCCACCCAGTA
Митохондриальный ингибитор ATPase AAEL004284 Форвард праймер-CAACTGCACAAGCTGAAGGA
Обратный грунт-ACGTGCGATAGCTTCTTCGT
Рибосомный биогенез протеиновый брикс AAEL001917 Форвард праймер-ГААКАГКАКААГКГААТГАА
Обратная грунтовка-TTGGCCTTGAGAGTCGTCTT
Серин/Трионин-белок киназы rio2 AAEL011114 Форвард праймер-GAGGAGAAAGCAGCACAACC
Обратная грунтовка-TCGAATGGCTTTTCCATTTC

Таблица 1: Гены, связанные с развитием яичников, и последовательности грунтовки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Исследования взаимодействия хост-микробов показали, что различные кишечные микробы влияют на физиологию хозяина с помощью различных механизмов. Эта статья вводит метод для того чтобы исследовать соответственно роль микроба кишки москита, включая вскрывать midgut москита, культивировать обетуемые бактерии кишки, обработку антибиотика, и reintroducing бактерии интереса.

Для успешного лечения антибиотиками, следующие детали должны быть рассмотрены при проведении эксперимента. В этом протоколе, комары были обработаны с помощью ватных шариков увлажненной с 10% раствор сахарозы в том числе 20 единиц пенициллина и 20 мкг стрептомицина на мл в течение 3дней 11,16. Пенициллин служил антибиотиком широкого спектра действия против грамположительных бактерий, а стрептомицин служил антибиотиком широкого спектра действия против грамотрицательныхбактерий 20. Правильное сохранение антибиотиков имеет жизненно важное значение для эффективноголечения антибиотиками 21. При хране при -18 градусов по Цельсию, стабильность пенициллина G составляет не менее 3 м. Стрептомицин стабилен, по крайней мере 12 м при хране при 4 кк22. Хотя различия в бренде антибиотиков или времени хранения могут вызвать незначительные различия в микробном освидетельствовании, необходимо проверить эффективность после каждого лечения антибиотиками. В дополнение к qPCR, распространение пластины или с помощью ПЦР обычно используются для оценки эффективностилечения антибиотиками 23,24. Кроме того, для предотвращения комаров от загрязнений другими бактериями после лечения антибиотиками, кормления анализ должен быть выполнен с стерилизованным оборудованием, собранным под супер чистой скамейке.

Перед бактериальным пероральным кормлением, комары должны голодать в течение 24 ч, чтобы антибиотики метаболизируются25. Это не только помогает комарам ingest бактерий жидкости, но и предотвращает антибиотики от убийства бактерий.

Правда, этот протокол в основном для изучения влияния обываемых бактерий. Для изучения кишечной микробиоты позвоночных и беспозвоночных хозяина, реинтродукция возродимых бактерий в антибиотико-обработанных хост обычноиспользуется в последних исследованиях 8,26,27. Кроме того, первоначальная идентификация культурных кишечных бактерий, как правило, основана на характеристиках размера колонии, формы, цвета, края, непрозрачности, высоты иконсистенции 28. Для неразготовляемых бактерий, высокая пропускная способность секвенирования основе метагеномных подходов, вероятно, предоставить всеобъемлющую информацию об общем составе микробиоты midgut29,30,31. Тем не менее, взаимодействие между необученными бактериями и хозяином остается в значительной степени неизведанным.

Эта статья предлагает два альтернативных варианта для изучения влияния кишечника микроб на комаров овипозиции, смешать бактерии с тепло-инактивированной крови или имплантации бактерий через кормление сахаром следуют кормления крови. Репрезентативные результаты в этой рукописи приняли первый вариант, в то время как последний метод генерировал аналогичные результаты. Различные исследования могут быть проведены после устного кормления с одним конкретным штаммом бактерий. Последующий анализ может быть использован для исследования того, как микробный фактор модулирует поведение комаров-локомотивов. Анализ количественной оценки белка может быть продолжен для изучения влияния различных бактерий на пищеварение. При незначительных изменениях этот метод может быть использован для изучения соответствующих воздействий различных микробов на физиологию комаров, включая усвоение питательных веществ, иммунитет, развитие, размножение и компетентность переносчиков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, чтобы раскрыть.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (Грант No 81902094, 81600497) и Научно-технический план проекта провинции Хунань (2019RS1036).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383 Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions
Aedes aegypti Female mosquitoes
Anticoagulant tube BD Vacutainer 363095 Collect fresh blood
Centrifuge tube Sangon Biotech F601620-0010 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile
Cotton balls
Disposable Tissue Grinding Pestle Sangon Biotech F619072-0001 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile
Ethanol absolute Paini Dilute it to 75% ethanol
Forceps RWD F11029 Dissection
Hemotek Membrane Feeding System Hemotek Components of the feeding system, including  Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled.
Incubator shaker ZQZY-78AN
Inoculation Loops Sangon Biotech F619312-0001 10 μl, Yellow
LB Agar Powder Sangon Biotech A507003 Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g, Agar 15.0 g.
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002 Tryptone 10.0 g, Yeast Extract 5.0 g, NaCl 10.0 g.
Microscope Zeiss Stemi508
Paper cup Place mosquito
Parafilm Sangon Biotech F104002 4 inx 125 ft
Petri dish Sangon Biotech F611203
Penicillin G procaine salt hydrate Sangon Biotech A606248 White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol
Single Channal Pipettor Gilson
Streptomycin sulfate Sangon Biotech A610494 Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins.
Sucrose Sangon Biotech A502792 Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine.
TIANamp Bacteria DNA Kit TIANGEN DP302 Extract DNA 
Utility Fabric-Mosquito Netting White
Vortex mixer Scintic Industries S1-0246
1.5ml EP tube Sangon Biotech F600620
10X PBS buffer Sangon Biotech E607016 This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
  2. Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
  3. Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
  4. Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
  5. Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
  6. Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
  7. Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
  8. Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
  9. Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
  10. Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
  11. Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
  12. Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
  13. Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
  14. Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
  15. de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
  16. Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
  17. Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
  18. Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
  19. Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
  20. Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
  21. Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
  22. Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
  23. Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
  24. Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
  25. Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
  26. Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
  27. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), New York, N.Y. 249-252 (2011).
  28. Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
  29. Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
  30. Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
  31. Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).

Tags

Биология Выпуск 163 комар мидгут микробиота кишечные бактерии антибиотики кормление сахаром кормление крови Aedes aegypti
Бактериальная устная кормление с помощью антибиотико-обработанных комаров
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, X., Wu, S., Li, W., Zhang, M.,… More

Liu, X., Wu, S., Li, W., Zhang, M., Wu, Y., Zhou, N., Wu, P. A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes. J. Vis. Exp. (163), e61341, doi:10.3791/61341 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter