Summary
Gecombineerde precursor isotopic etikettering en isobaric tagging (cPILOT) is een verbeterde monster multiplexing strategie die in staat is het verhogen van het aantal monsters die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd met de beschikbare isobaric tags. De integratie van een robotplatform heeft de experimentele doorvoer, reproduceerbaarheid en kwantitatieve nauwkeurigheid sterk verhoogd.
Abstract
We hebben een hoge doorvoer kwantitatieve proteomics workflow, gecombineerde precursor isototopische etikettering en isobaric tagging (cPILOT) geschikt voor multiplexing tot 22 of 24 monsters met tandem massa tags of isobaric N,N-dimethyl leucine isobaric tags, respectievelijk, in een enkel experiment. Deze verbeterde monster multiplexing vermindert aanzienlijk massaspectrometrie acquisitie tijden en verhoogt het nut van de dure commerciële isobarische reagentia. Het handmatige proces van monsterbehandeling en pipetting-stappen in de strategie kan echter arbeidsintensief, tijdrovend zijn en monsterverlies en kwantitatieve fouten introduceren. Deze beperkingen kunnen worden overwonnen door de integratie van automatisering. Hier hebben we het handmatige cPILOT-protocol overgebracht naar een geautomatiseerd vloeistofverwerkingsapparaat dat grote monsternummers (d.w.z. 96 monsters) parallel kan voorbereiden. Over het geheel genomen verhoogt automatisering de haalbaarheid en reproduceerbaarheid van de CPILOT en maakt het een breed gebruik mogelijk door andere onderzoekers met vergelijkbare automatiseringsapparaten.
Introduction
Massaspectrometrie (MS)-gebaseerde proteomics is een onmisbaar onderzoeksinstrument bij het identificeren van ziektespecifieke biomarkers, het begrijpen van ziekteprogressie en het creëren van leads voor therapeutische ontwikkeling. Dit kan worden bereikt uit een reeks ziektegerelateerde klinische monsters, zoals bloedserum/plasma, proximale vloeistoffen en weefsels1,2. Proteomics biomarker ontdekking en validatie hebben onlangs opgedaan aanzienlijke aandacht als gevolg van de kracht van monster multiplexing strategieën3,4. Monster multiplexing is een techniek die gelijktijdige vergelijking en kwantificering van twee of meer monsteromstandigheden binnen één MS-injectie5,6mogelijkmaakt . Monster multiplexing wordt bereikt door het barcoding peptiden of eiwitten uit meerdere monsters met chemische, enzymatische of metabole tags en het verkrijgen van MS-informatie uit alle monsters in een enkel MS of MS / MS experiment. Onder de beschikbare isobaric tags zijn isobaric tagging reagentia (iTRAQ), commerciële tandem massa tags (TMT), en in huis gesynthetiseerd isobaric N,N-dimethyl leucine (DiLeu) reagentia met mogelijkheden tot 16-plex7 en 21-plex8, respectievelijk.
Gecombineerde precursor isotopic etikettering en isobaric tagging (cPILOT) is een verbeterde sample multiplexing technologie. cPILOT combineert isotopen van peptide N-termini met licht [−(CH3)2] en zware [−(13C2H3)2] isotopen bij lage pH (∼2,5), waardoor het lysineresidu beschikbaar blijft voor latere hoge pH(8,5) isobarische etikettering met behulp van TMT, DiLeu, of iTRAQ tagging3,9,10,11,12,13,14. Het dual labeling schema van de cPILOT strategie is afgebeeld in supplementaire figuur 1 met twee monsters met behulp van een voorbeeld peptide. De nauwkeurigheid en precisie van de op TMT gebaseerde kwantificering op MS2-niveau kunnen in het gedrang komen als gevolg van de aanwezigheid van vervuilende co-geïsoleerde en co-gefragmenteerde ionen die als interferentie-effect15worden genoemd . Deze beperking in onnauwkeurige reporter ion ratio's kan worden overwonnen met behulp van tribrid Orbitrap massaspectrometers. Het interferentie-effect kan bijvoorbeeld worden overwonnen door een piek in een dimethylated paar op MS1-niveau in de massaspectrometer te isoleren, de lichte of zware piek te onderwerpen aan MS2-fragmentatie in de lineaire ionenval en vervolgens het meest intense MS2-fragment voor HCD-MS3 te onderwerpen om kwantitatieve informatie te verkrijgen. Om de kans op het selecteren van de peptiden zonder lysine amines beschikbaar voor het genereren van reporter ionen te verhogen, kan ook een selectieve MS3-acquisitie op basis van het y-1-fragment worden gebruikt en is het een aanpak die kan resulteren in een hoger percentage peptiden kwantificeerbaar met cPILOT9. De combinatie van lichte en zware etikettering verhoogt de multiplexingmogelijkheden van het monster met een factor 2x tot die van individuele isobarische tags. We hebben onlangs gebruik gemaakt van cPILOT te combineren tot 24 monsters in een enkel experiment met DiLeu reagentia16. Daarnaast is cPILOT gebruikt om oxidatieve post-translationele wijzigingen14 te bestuderen, waaronder eiwitnitrantie17, andere globale proteomen9, en heeft toepassingen aangetoond voor meerdere weefselmonsters in een alzheimermuismodel11.
Robuuste monstervoorbereiding is een kritieke stap in een cPILOT-experiment en kan tijdrovend, omslachtig en uitgebreid zijn. Verbeterde monster multiplexing vereist uitgebreide pipetting en hoogopgeleide laboratorium personeel, en er zijn verschillende factoren die sterk kunnen invloed hebben op de reproduceerbaarheid van het experiment. Zo is een zorgvuldige behandeling van monsters noodzakelijk om voor alle monsters vergelijkbare reactietijden te garanderen en om de juiste bufferpH voor lichte en zware dimethylated monsters te behouden. Bovendien kan handmatige bereiding van tientallen tot honderden monsters leiden tot een hoge experimentele fout. Daarom hebben we een geautomatiseerde cPILOT-workflow ontwikkeld om de variabiliteit van de monstervoorbereiding te verminderen, de kwantitatieve nauwkeurigheid te verbeteren en de experimentele doorvoer te verhogen. Automatisering wordt bereikt met behulp van een robotachtige vloeistofbehandelingsapparaat dat vele aspecten van de workflow kan voltooien(figuur 1). Monsterpreparaat van eiwitkwantificering tot peptide-etikettering werd uitgevoerd op een geautomatiseerde vloeistofhandler. De automatische vloeistofafhandelaar is geïntegreerd met een positief drukapparaat (PPA) voor bufferuitwisselingen tussen de solid-phase extraction (SPE) platen, orbitale shaker en een verwarmings-/koelapparaat. Het robotplatform bevat 28 deklocaties voor platen en buffers. Er zijn twee pods met een grijper om de platen binnen de deklocaties over te brengen: een 96-kanaals vaste volumepipettingkop (5-1100 μL) en 8-kanaals variabele volumesondes (1-1000 μL). Het robotplatform wordt aangestuurd met behulp van een software. De gebruiker moet professioneel worden opgeleid voordat de robotvloeistofhandler wordt gebruikt. De huidige studie richt zich op het automatiseren van de handmatige cPILOT workflow, die arbeidsintensief kan zijn voor de verwerking van meer dan 12 monsters in een enkele batch. Om de doorvoer van de cPILOT-aanpak11te verhogen, hebben we het cPILOT-protocol overgebracht naar een robotvloeistofhandler om meer dan 10 monsters parallel te verwerken. De automatisering maakt het ook mogelijk soortgelijke reacties voor elk monster parallel tijdens verschillende stappen van het monster voorbereidingsproces, die hoog opgeleide gebruikers nodig om te bereiken tijdens handmatige cPILOT. Dit protocol richt zich op de implementatie van het geautomatiseerde vloeistofbehandelingsapparaat voor het uitvoeren van cPILOT. De huidige studie beschrijft het protocol voor het gebruik van dit geautomatiseerde systeem en toont de prestaties met behulp van een 22-plex "proof-of-concept" analyse van muis lever homogenaten.
Protocol
Alle dierenprotocollen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Pittsburgh. Een mannelijke controle muis (C57/BLJ) werd commercieel gekocht en gehuisvest in de afdeling Van Laboratorium Dierlijke Hulpbronnen aan de Universiteit van Pittsburgh. Muizen werden gevoed standaard knaagdier laboratorium chow ad libitum en bewaard in een 12 uur licht / donker cyclus. Leverweefsel werd geoogst en opgeslagen bij −80 °C.
1. Eiwitextractie
OPMERKING: Deze stappen worden handmatig uitgevoerd.
- Was muislever (100 mg) met zout en homogenaat met 500 μL van 8 M ureum met behulp van een mechanische homogenisator met behulp van lysing matrix Een kralen voor 4 m/s voor 20 s.
OPMERKING: In deze studie werden geen protease- of fosfataseremmers toegevoegd, maar kunnen indien nodig aan de buffer worden toegevoegd op basis van het experiment. Ook kunnen eiwitextractiestappen dienovereenkomstig worden aangepast voor verschillende monstersoorten. - Breng het weefselhomogenaat over naar een nieuwe microcentrifugebuis, spoel en combineer de lysingbuizen met 100-500 μL PBS met 8 M ureum.
- Centrifugeren de gehomogeniseerde weefsels (12.800 x g,4 °C en 15 min) en verzamel de supernatant.
OPMERKING: De rest van de stappen worden uitgevoerd op de robotvloeistofgeleider die beschikbaar is in het laboratorium van de gebruiker. De vloeistofafhandelaar moet in staat zijn buffers van en naar de typen van de ANCI gespecificeerde plaat te aspireren en af te geven, met minimale deelname van de exploitant. - Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een bicinchoninic zuur (BCA) test volgens de instructies van de fabrikant.
- Zet de PPA, verwarmings-/koelapparaat en de vacuümpompen aan en sluit alle accessoires aan met vloeistofafhandelaar. De vloeistof handler toont een blauw licht zodra het is aangesloten op de computer en klaar om te werken.
- Voeg voor reagensplaat 1 (96 putplaat) 30 μL van 25 mM 1,4-dithiothreitol (DTT), 25 mM 30 μL cysteïne en 25 mM 30 μL iodoacetamide (IAA) toe aan respectievelijk rijen 1, 2 en 3.
- Voeg 8 M ureum en 20 mM Tris met 10 mM CaCl2 (pH 8.2) toe aan een reservoirplaat. Voeg 500 μL van 5% mierenzuur toe aan 2 mL diepe putplaat, 20 μL trypsine aan rij 1 van trypsineplaat en plaats in de deklocatie zoals gespecificeerd door de methode.
OPMERKING: IAA en trypsine werden toegevoegd aan de 96 goed plaat voorafgaand aan het toevoegen aan het monster. - Aliquot 300 μL van het leverhomogenaat in een 500 μL buis en plaats op een 2 mL diepe putplaat en plaats op 4 °C tot het begin van het protocol. Voor dit experiment werden 22 aliquots gegenereerd uit het eenle leverhomogenaat.
OPMERKING: Voeg een interne kwaliteitscontrolenorm (bijvoorbeeld runder alfa caseïne of ander exogeen eiwit) toe met de verhouding 1 μg norm: 100 μg eiwitmonster. - Definieer het volume van de buffers dat aan de monsters moet worden toegevoegd aan de variabele namen en waarde volgens tabel 1. Voer op basis van de BCA het volume van de monster- en normalisatiebuffer (8 M ureum) in op een spreadsheet en voeg deze toe aan de software(tabel 2).
OPMERKING: Verdere verdunning met buffer kan nodig zijn als de eiwitconcentratie te hoog is. De resulterende concentraties voor monster uit het leverweefsel waren 10 μg/μL. Het volume van de buffers werd geoptimaliseerd voor 100 μg eiwit. - Verwijder monsterbuizen van 4 °C, plaats op de opgegeven deklocatie van de geautomatiseerde vloeistofafhandelaar en laat 10 minuten opwarmen.
- Open de methode en volg de instructies om de vereiste tips (1070, 90 en 230 μL) en labware in de gewenste posities te plaatsen. Zodra alle labware en tips zijn op zijn plaats, cross check met de laatste dek lay-out en klik op Volgende om het protocol voort te zetten.
OPMERKING: De begeleide set-up informeert de gebruiker om een vereist volume van buffer toe te voegen aan de specifieke labware, afhankelijk van het protocol en de dek locatie te worden bewaard.
2. Steekproefreductie, alkylation en spijsvertering
- Laad 230 μL-tips en haal 90 μL van 8 M ureum uit het reservoir en doseer aan rij 1 van de zwarte 2 mL diepe putplaat. Ontlaad de tips. Herhaal deze stap tot 8 M ureum wordt toegevoegd aan alle putten die overeenkomen met de 22 monsters.
OPMERKING: De denaturatiebuffer ontkracht de eiwit driedimensionale structuur om de primaire structuur op te leveren, zodat de trypsine effectief kan werken en het eiwit kan breken. De 8-kanaals pipet kan verschillende volumes voor de 8 kanalen aanzuigen en kan op verschillende locaties in het labware worden afgegeven. In deze stap hebben alle kanalen hetzelfde volume aangezogen als gedefinieerd in de software. - Na het toevoegen van de denaturatiebuffer, laad de 90 μL-uiteinden en het aanzuigen van 10 μL (komt overeen met 100 μg) van het muisleverhomogeen met behulp van de 8-kanaals pipet op de zwarte 2 mL diepe putplaat. Ontlaad de tips. Herhaal deze stap totdat alle 22 monsters zijn overgedragen.
- Na elke overdracht voert u een mengstap uit om 50 μL van de putinhoud driemaal op te zuipen om ervoor te zorgen dat het eiwit met de buffer wordt gemengd om een 1:1-verhouding te vertonen.
LET OP: Verwijder het monster van het homogenaat op voorraad en plaats in -80 °C. - Om de gedenatureerde eiwitten te verminderen, laadt u één rij van 90 μL-uiteinden en 3 μL DTT uit de reagensplaat 1. Geef DTT af aan rijen 1 en 2 van de zwarte 2 mL diepe putplaat en ontlaad de uiteinden.
OPMERKING: Het eiwit: DTT molaire ratio wordt gehandhaafd op 1:40 voor vermindering van disulfide bindingen. De berekening voor de molaire verhouding is gebaseerd op de eiwitmassa van runderserum albumine (BSA), dat is 66,5 x 103 g/mol. - Verzegel de monsterplaat met aluminiumfolie en incubeer bij 37 °C voor 600 s bij 300 tpm.
- Voeg 30 μL van 0,25 M IAM toe aan rij 3 van reagensplaat 1 vlak voor gebruik en plaats op het dek. Maak de monsterplaat los en keer terug naar het dek.
LET OP: IAM is lichtgevoelig. - Laad één rij van 90 μL-tips, haal 6 μL IAM van de reagensplaat 1 bij rij 3 en doseer aan rij 1 van de monsterplaat. Ontlaad de tips.
OPMERKING: Het eiwit: IAM molaire verhouding wordt gehandhaafd op 1:80 voor elk monster. Deze reactie moet in het donker gebeuren. - Sluit de monsterplaat en de incubaat gedurende 30 minuten bij 300 tpm op het verwarmings-/koelapparaat af bij 4 °C.
OPMERKING: Het afdichten van de plaat wordt uitgevoerd om te voorkomen dat het monster licht, verdamping en morsen uit de put. - Maak de monsterplaat los en laad één rij 90 μL-tips en haal 5 μL cysteïne uit de reagensplaat 1 bij rij 2. Doe af op rijen 1 en 2 van de monsterplaat en los de tips uit. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Het eiwit: L-cysteïne molar ratio wordt gehandhaafd op 1:40. - Plaats de monsterplaat op de orbitale shaker om een getimede shake van 1800 rpm gedurende 30 minuten uit te voeren.
- Voeg 800 μL van 20 mM Tris buffer met 10 mM CaCl2 (pH 8.2) toe aan elke put van de monsterplaat om de ureumconcentratie te verdunnen tot 2 M. Ontlaad de uiteinden.
OPMERKING: Trypsine activiteit wordt belemmerd bij hogere ureumconcentraties en dus moet worden teruggebracht tot minder dan 2 M. Deze studie werd uitgevoerd met een eiwit om de kiesverhouding van 50 te trypsin: 1 op 14 uur. - Voeg 20 μL trypsine toe aan rij 1, kolom 1-12 van een 96 putplaat en plaats op een bepaalde locatie op het dek.
- Laad één rij van 90 μL-tips, aspirate 2 μL trypsine uit de trypsineplaatrij 1 en doseer aan rijen 1 en 2 van de monsterplaat. Ontlaad de tips.
- Sluit de plaat af en sluit de plaat 14 uur bij 37 °C bij 600 tpm af op het verwarmings-/koelapparaat.
- Na incubatie, ontzegelen van de monsterplaat en voeg 5% mierenzuur aan rij 3, kolom 1-12 van een diepe put collectie plaat en plaats deze op het opgegeven dek.
- Stop de spijsvertering door 150 μL van 5% mierenzuur toe te voegen van rij 3 van de mierenzuurplaat en doseer af aan monsterplaat bij rijen 1 en 2. Ontlaad de tips.
3. Desalting stap 1
- Desalt de peptiden met SPE plaat met 20 mg Targa C-18 materiaal. Bevestig het volume voor elke bufferuitwisseling als 600 μL en bevestig de druk op 100 mbar.
- Laad 1070 μL-tips en aspiraat 600 μL acetonitril en doseer aan rijen 1 en 2 van SPE-plaat. Plaats de SPE-plaat op PPA en druk uit te oefenen.
- Met dezelfde tips, aspirate 600 μL acetonitril en afzien aan rijen 1 en 2 van SPE plaat. Plaats de SPE-plaat op PPA en druk uit te oefenen.
LET OP: De doorstroom kan worden afgevoerd naar afval met behulp van een zuigpomp. - Laad 1070 μL-tips en draag 600 μL buffer A (100 % water in 0,1 % mierenzuur) en doseer aan de rijen 1 en 2 van de SPE-plaat. Plaats de SPE-plaat op PPA en druk uit te oefenen.
OPMERKING: Als het volume van de buffer niet aanzienlijk vermindert, probeer dan de druk of tijd te verhogen. - Laad 2 rijen van 1070 μL-tips, aspirate 534 μL verteerde monsters en doseer aan rijen 1 en 2 van SPE-plaat. Plaats de SPE-plaat op PPA en druk uit te oefenen. Herhaal deze stap totdat alle monsters zijn geladen.
OPMERKING: Aangezien het totale volume na het toevoegen van mierenzuur 1068 μL zal zijn en de monsters in twee passen zijn toegevoegd. - Laad 2 rijen gebruikte 1070 μL-tips, aspirate 600 μL buffer A en doseer aan rijen 1 en 2 van SPE-plaat. Plaats de SPE-plaat op PPA en druk uit te oefenen.
- Herhaal de bovenstaande stap een keer om het monster schoon te maken.
- Laad 1 rij van 1070 μL-tips, aspirate 600 μL ACN: Water (60:40) en doseer aan rijen 1 en 2 van SPE-plaat. Leg de SPE-plaat op een verzamelplaat om de peptiden met PPA te ontwijken en druk uit te oefenen.
- Herhaal de bovenstaande stap om de peptiden in de verzamelplaat te ontwijken. Droog de afhaalplaat droog en bewaar op -80°C tot verdere verwerking.
4. Dimethylation Labeling (peptide N-termini)
- Plaats de gewenste tips (1070, 90 en 230 μL) en labware in de gewenste posities in de software. Zodra alle labware en tips zijn op zijn plaats, cross check met de laatste dek lay-out en klik op Volgende om het protocol voort te zetten.
- Voeg voor reagensplaat 2 450 μL azijnzuur, 50 μL lichtformaldehyde (CH2O), 50 μL zware formaldehyde(13CD2O) en 150 μL mierenzuur toe aan respectievelijk rijen 1, 2, 3 en 4.
- Voeg aan reagensplaat 3 50 μL licht CB, 50 μL zware CB, toe aan rijen 1 en 2 en 50 μL ammoniak aan rij 3 en 4.
- Laad 2 rijen van 230 μL-tips en loker 100 μL van 1% azijnzuur uit rij 1 van reagensplaat 2 en doseer aan de gedroogde peptiden in monsterplaat 2 (verzamelplaat van de desalting step) rijen 1 en 2 en voer een getimede schudden gedurende 5 min bij 1800 rpm uit.
- Laad 90 μL-tips en aanzuig 16 μL van 60 mM (4%) CH2O (37% wt/v) van rij 2 van reagensplaat 2 en af te zien aan rij 1 van de monsterplaat. Ontlaad de tips.
- Laad 1 rij van 90 μL-tips en aanzuig 16 μL van 60 mM (4%) 13. CD2O (20% wt/v) van rij 3 van reagensplaat 2 en af te zien aan rij 2 van de monsterplaat. Ontlaad de tips.
OPMERKING: In deze studie rij 1 komt overeen met licht en rij 2 komt overeen met zware dimethylated monsters (zie figuur 1). - Laad 2 rijen van 90 μL-uiteinden en draag 16 μL van 24 mM NaBH3CN en 24 mM NaBD3CN uit rij 1 en 2 van reagensplaat 3 en geef af aan respectievelijk rijen 1 en 2 van de monsterplaat.
- Ontlaad de uiteinden en voer een getimede shake gedurende 15 minuten bij 1800 rpm uit met behulp van de orbitale shaker.
OPMERKING: Het toevoegen van natriumcyanoborohydride initieert de reactie dus om de variabiliteit tussen experimenten te verminderen deze stap eenmaal per batch wordt uitgevoerd. - Laad 2 rij van 90 μL-tips en draag 32 μL ammoniak (~28-30% v/v) uit rijen 3 en 4 van reagensplaat 3 en doseer plaats aan rijen 1 en 2 respectievelijk van de monsterplaat 2. Ontlaad de tips.
OPMERKING: Het toevoegen van ammoniak stopt de reactie dus om de variabiliteit tussen experimenten te verminderen deze stap wordt eenmaal per batch uitgevoerd. - Combineer gelijke volumes licht en zwaar (1:1) dimethylated peptiden tot een nieuwe 2 mL diepe putplaat voor ontzilting.
OPMERKING: In dit onderzoek werd 90 μL van de putinhoud van rij 1 gecombineerd met 90 μL rij 2 van monsterplaat 2 tot een nieuwe 2 mL-verzamelplaat (Monsterplaat 3). De verhouding van licht: zware menging is afhankelijk van het experimentele protocol, in deze studie werd een 1:1 verhouding gebruikt. - Laad 2 rijen van 230 μL-tips en zuig 32 μL van 5% mierenzuur aan de gecombineerde monsters en voer een getimede schudden voor 30 s bij 1800 rpm uit.
OPMERKING: De dimethyleratie-efficiëntie is afhankelijk van de pH van het reactiemengsel en elke verandering in buffer pH zal resulteren in onvolledige etikettering van de peptide N-termini. Dimethylation efficiëntie moet groter zijn dan 97% bij zoekopdrachten als dynamische wijziging op het peptide N-termini. In deze studie was de etiketteringsefficiëntie van lichte en zware peptiden respectievelijk 99,7% en 99,5%.
5. Desalting stap 2
- Voer monsterdesalting uit dat vergelijkbaar is met stap 1 van de desalt voor de gecombineerde monsters.
- Droog de monsters in de monsterplaat met behulp van een snelheid vac en bewaar op -80 °C tot verdere verwerking.
6. Isobarische tagging (Lys residuen)
- Volg de begeleide labware-installatie en plaats de benodigde tips (1070, 90 en 230 μL), met de juiste buffers. Zodra alle labware en tips zijn op zijn plaats, cross check met de laatste dek lay-out en klik op Volgende om het protocol voort te zetten.
- Voeg 250 μL van 100 m triethyl ammoniumbicarbonaat (TEAB), 30 μL hydroxylamine (10% w/v) toe aan rijen 1 en 2 reagensplaat 4. Plaats de TMT-buizen op de 2 mL deep-well plaat volgens de spreadsheet in tabel 3.
- Bewaar een lege buis van 1,5 mL in een tube rackhouder voor het bundelen van de getagde peptiden. Plaats de gedroogde monsterplaat op P9 en TMT-verwerkingsplaat op P14.
- Om de peptiden te reconstrueren, laad je 230 μL-tips en draag je 100 μL van 100 m triethyl ammoniumbicarbonaat (TEAB) buffer (pH ~8.5) uit rij 1 op DE TEAB-plaat en doseer je af aan de gedroogde peptiden in rij 3 van monsterplaat 3. Plaats de plaat op de orbitale shaker voor 30 s bij 1800 rpm.
OPMERKING: Reconstitute 100 μg dimethylated peptiden bij een concentratie van 1 μg/μL. - Laad 90 μL-tips en aspiraat 10 μL watervrije acetonitril van H12 van de TMT-plaat en doseer in elk van de gedroogde TMT-buizen.
- Verwijder de TMT buizen, vortex, en snel draai de buizen en terug te keren naar het dek in diepe put plaat.
- Laad 1 rij van 90 μL-tips en aspiraat 12,5 μL van de gecombineerde dimethylated peptiden en doseer aan de rij 1 van de TMT-verwerkingsplaat. Ontlaad de tips.
OPMERKING: De TMT: peptide ratio werd gehandhaafd op 1:8 voor dit experiment. - Laad 1 rij van 90 μL-tips en aspiraat 10 μL TMT en doseer aan de rij 1 van de TMT-verwerkingsplaat. Ontlaad de tips, voer een getimede shake uit gedurende 1 uur bij 1800 rpm.
- Laad 1 rij van 90 μL-tips en aspiraat 8 μL hydroxylamine (10% w/v) van rij 2 op TEAB-plaat en doseer aan rij 1 van de TMT-verwerkingsplaat. Ontlaad de tips, voer een getimede schudden voor 15 min bij 1800 rpm.
- Combineer 30,5 μL van de TMT gelabelde peptiden van TMT-verwerkingsplaat tot 1,5 mL buis. Ontlaad de tips na elke overdracht.
- Verwijder de buis met de gepoolde monsters en droog om de acetonitril te verdampen. Reconstitute peptiden in 0,2 mL water in 0,1 % mierenzuur en keer terug naar het dek.
OPMERKING: De etiketteringsefficiëntie van isobaric tagging is ook pH-specifiek en de etiketteringsefficiëntie moet meer dan 98% bedragen per instructies van de fabrikant. In deze studie was de TMT labeling efficiëntie van de lysine beëindigd licht en zware peptiden respectievelijk 99,4% en 99,5%.
7. Desalting stap
- Voer monsterdesalting uit dat vergelijkbaar is met de desalt 1 voor één monster.
- Droog de monsters en bewaar in -80 °C tot de analyse.
8. Vloeibare chromatografie–tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) en MS3
- Reconstrueren van de peptiden in MS-kwaliteit water met 0,1% FA om ~1 μg/μL-concentratie te verkrijgen. Filtermonsters met microcentrifugebuizen met een filter van 0,65 μm. Centrifuge peptiden op 12.000 x g gedurende 3 minuten en plaats de stroom door in een auto-sampler flacon.
LET OP: De peptideconcentratie kan in dit stadium indien gewenst worden bevestigd. De peptiden zou moeten worden gereconstitueerd in LC-MS grade water en onderworpen aan een BCA peptide test. In deze studie werd de peptide BCA-test niet uitgevoerd en werden alle peptidehoeveelheden gebaseerd op de eerste eiwit BCA-test. - Bereid de mobiele fasebuffers als volgt voor: 100% (v/v) water met 0,1% FA (A) en 100% ACN met 0,1% FA (B).
- Injecteer 1 μL monster op een valkolom vol met 2 cm C18-materiaal (3 μm, 100 Å poriegrootte).
LET OP: Monster reiniging op de val is als volgt: 10 min, 100% A; 2 μL/min met behulp van een 2D vloeibaar chromatografiesysteem. - Voer de analytische scheidingsmethode uit. Gebruik een 100 μm i.d. x 26 cm laser pulled-tip gesmolten silica capillaire kolom verpakt met C18 materiaal (2,5 μm, 100 Å). Het verloop is: 0-10 min, 10% B; 10-30 min, 10-15% B; 30-75 min, 15-30% B; 75-88 min, 30-60% B; 88-92 min, 60-90% B; 92-99 min, 90% B; 99-100 min, 90-10% B, 100-120 min, 10% B; 300 nL/min, 120 min.
- Voer de gegevensverwerving uit voor de massaspectrometer terwijl de analytische scheidingsmethode wordt uitgevoerd.
- Gebruik de volgende parameters voor de MS-enquête: 375-1.500 m/z,120.000 resolutie, Cyclustijd 3 s (topsnelheid), automatische gain control (AGC) doel 4.0e5, maximale injectietijd 50 ms.
- Gebruik de volgende parameters voor CID-MS/MS met ionenval: dataafhankelijke acquisitiescans per resultaat, 2 m/z isolatiebreedte, 35% genormaliseerde botsenergie (NCE), 0,25 activering q, 10 ms activeringstijd, 1.0e4 AGC, 100 ms maximale injectietijd.
- Gebruik de volgende parameters voor HCD–MS3 SPS 10: Scanbereik 100-400 m/z, aantal afhankelijke scans 10, AGC 5.0e4, maximale injectietijd 118 ms, HCD-botsingsenergie 55%, MS2 isolatievenster 2.
9. Gegevensanalyse
- Zoek gegenereerde RAW-bestanden voor de lijst van eiwitten en peptiden met behulp van een eiwitanalyse software tegen een geschikte database.
OPMERKING: De RAW-bestanden die in dit onderzoek zijn gegenereerd, zijn doorzocht op een Uniprot-database met de muis. - Aangezien er zowel lichte als zware etikettering in één RAW-bestand zit, zoekt u elk bestand met twee workflows naar lichte en zware dimethylated peptiden.
- Zoek de RAW-bestanden tegen muis Uniprot database (07/13/2019) met 53035 sequentie met de volgende parameters: trypsin decolleté met maximaal twee gemiste decolletés, peptide met minimaal 6 aminozuren lengte, 15 ppm oudermassatolerantie, 1 Da fragmentatietolerantie Statische modificaties: lichte dimethylation (+28.031, peptide N-terminus) of zware dimethylation (+36.076 Da, peptide N-terminus), carbamidomethyl (+57.021 Da, C), Dynamische modificaties: oxidatie (+15.995 Da, M), 11-plex isobaric tag (229.163 Da, K), 1% FDR, reporter ion quantification with 30 ppm peak integration tolerance, most confident centroid for integration method.
OPMERKING: De zware dimethylated piek bevat ook een andere wijziging die ~ 7 Da (+35.069 Da, peptide N-terminus) van het licht dimethylated piek en dus een ander zoekknooppunt moet worden opgenomen om deze wijziging ook op te nemen. - Voer reporter ion kwantificering op basis van de intensiteit, 65% SPS massa match, gemiddelde S / N ratio 10, isotopencorrectie, normalisatie en schaling werden niet uitgevoerd.
OPMERKING: Normalisatie en schaling kunnen worden uitgevoerd op basis van de totale hoeveelheid peptide of een specifiek eiwit dat aan het monster is toegevoegd. QC-monsters kunnen ook worden opgenomen in de kanalen voor inter-batch- of intra-batchnormalisatie op basis van een interne referentieschaal18met twee staarten . De isotopenverontreinigingen van verschillende TMT-kanalen werden niet aan de zoekopdracht verstrekt, gebruikers wordt geadviseerd om de isotopenverontreiniging van verschillende reporter-ionen toe te voegen.
Representative Results
Figuur 2 toont representatieve MS-gegevens van een peptide dat is geïdentificeerd in alle 22 reporter ionkanalen van een 22-plex cPILOT-experiment, inclusief workflowreplicaties. Figuur 2 (boven) toont een dubbel geladen piekpaar gescheiden door 4 Da m / z afstand met vermelding van een enkele dimethyl groep opgenomen in het peptide. De lichte en zware dimethylated piekparen werden geïsoleerd en onafhankelijk gefragmenteerd om de opeenvolging van het peptide op te leveren. De volgorde van het peptide is G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) en komt overeen met het eiwit Betaïne-homocysteïne S-methyl transferase. De meest intense fragmentionen voor zowel de lichte als de zware dimethylated pieken(niet getoond) werden verder geïsoleerd voor MS3 fragmentatie en de reporter ionen(m/z 126-131) worden weergegeven in figuur 2 (onder). De reporter ion intensiteiten zijn direct evenredig aan de peptide overvloed in de steekproef. De peptide overvloed van de monsters impliceert de pipetting vermogen van de robot platform is vrij uniform over de 22 monsters. In totaal resulteerde dit 22-plex cPILOT experiment in 1326 (1209-light/1181-heavy) eiwitten identificaties als gevolg van 3098 (6137-light/5872-heavy) peptiden (Tabel 4). Figuur 3 toont de doos plot van log10 overvloed ten opzichte van de totale reporter ion intensiteiten over alle 22 kanalen met mindere inter-well / inter-sample variabiliteit. Evaluatie van de totale automatisering werd gedaan door het onderzoeken van de fout in reporter ion overvloed over elk eiwit in de 22 monsters. Figuur 4 laat zien dat monsterverwerking met het robotplatform heeft geleid tot zeer lage CV-waarden. Specifiek, over de 3098 peptiden geïdentificeerd de gemiddelde CV in reporter ion overvloed was 12,36 % en 15,03 % voor lichte en zware dimethylated peptiden, respectievelijk. Onder deze peptiden 2032 van deze peptiden had reporter ion signaal boven de minimumdrempel en werden geacht kwantificeerbaar.
Figuur 1. Experimentele workflow om 22 monsters parallel met een geautomatiseerd cPILOT-protocol te verwerken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Kwantificering van peptiden over 22 monsters. Voorbeeld MS (boven) en MS3 (bodem) spectra van het peptide G(dimethyl)AAELMQQK(TMT-11plex) gekwantificeerd in 22-plex geautomatiseerd cPILOT experiment voor licht dimethylated (linksonder) en zware dimethylated (rechtsonder) pieken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Box plot van de totale reporter ion intensiteiten versus log10 overvloed van 22 monsters met behulp van proteome discoverer 2.3. Het RAW-bestand werd twee keer gezocht naar lichte en zware peptiden, eiwitten-id's afzonderlijk met TMT als dynamische modificatie, licht (+28.031 Da) en zwaar (+36.076 & +35.069 Da) dimethylation bij peptide N-termini als statische modificatie. Een gecombineerde zoekopdracht met alle bovenstaande wijzigingen werd uitgevoerd met behulp van Proteome Discover 2.3 om de Log 10 Overvloed aan peptide intensiteiten over alle kanalen te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Viool percelen van co-efficiënte van variatie van peptide overvloed van samengevat reporter ion intensiteiten over kanalen 126-131 m/z. Het peptide werd gekwantificeerd met een gemiddelde CV-waarde van 12,36 en 15,03 voor licht (2373) en zware (2533) kwantificeerbare peptiden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1. Illustratie van cPILOT met één enkel peptide. Met de isotopenetikettering van twee verschillende monsters en isobarische tagging met TMT126werd het resulterende mengsel voor LC-MS3geïnjecteerd in MS. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Variabele naam | Waarde | Beschrijving |
| DesaltSamp1 | 1065 | Volume dat moet worden gebruikt voor desalt stap 1 |
| DesaltSamp2 | 392 | Volume dat moet worden gebruikt voor desalt stap 2 |
| DesaltSamp3 | 100 | Volume dat moet worden gebruikt voor desalt stap 3 |
| Devmode | Valse | Valse zal de incubatietijden tot 30sec verminderen- True zal de incubatietijd in het protocol volgen. |
| DTTVol (DTTVol) | 3 | Volume of DTT |
| Filterplaat | Targa | Plaat die voor desalting wordt gebruikt |
| FilterplateVol | 600 | Volume voor ontzilting |
| HAWaterWashes HAWaterWashes | Valse | Aantal waterwassingen op de SPE-plaat |
| IAMVol IAMVol | 2 | Volume iodoacetamide |
| PeptideTMTVol PeptideTMTVol | 12.5 | Volume peptide voor TMT-etikettering |
| Druk | 100 | mbardruk bij PPA |
| TempOffSet TempOffSet | 1 | Temperatuurverandering |
| TMTVol TMTVol | 10 | Te toevoegen isobaric-tagvolume |
| TrisVol | 800 | Volume om het monster te verdunnen voorafgaand aan de spijsvertering |
| TrypsinVol | 2 | Volume trypsine |
| PopTimer gebruiken | Waar | True geeft de opties weer om druk op de plaat toe te passen indien nodig |
Tabel 1. Lijst van variabelen die worden gebruikt in het geautomatiseerde cPILOT-protocol.
| DilSource DilSource | DilWell DilWell | Dest | DestWell DestWell | DilVolume DilVolume | Voorraadbron | Stockwell | SampleVol | VoorbeeldID |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 1 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 2 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A3 A3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 3 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A4 A4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 4 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A5 A5 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 5 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A6 A6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 6 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 7 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A8 A8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 8 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A9 A9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 9 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 10 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 11 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | A12 A12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 12 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B1 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 13 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B2 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 14 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B3 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 15 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B4 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 16 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B5 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 17 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B6 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 18 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B7 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 19 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B8 B8 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 20 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B9 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 21 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B10 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 22 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B11 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 23 |
| 8M_Urea | 1 | Monsters | B12 B12 | 90 | Stock_Samples | A1 | 10 | 24 |
Tabel 2. Volume van muisleverhomogeen en 8 M ureum.
| SourceWell | BronWell2 | Verslaggever Ion | DestWell1 DestWell1 | DestWell2 DestWell2 | Volume | VoorbeeldID |
| A1 | C1 | 126 | A1 | E1 E1 | 10 | 1 |
| A3 A3 | C3 | 127N | A2 | E2 | 10 | 2 |
| A5 A5 | C5 C5 | 127C | A3 A3 | E3 E3 | 10 | 3 |
| A7 | C7 C7 | 128N | A4 A4 | E4 E4 | 10 | 4 |
| A9 A9 | C9 C9 | 128C | A5 A5 | E5 E5 | 10 | 5 |
| A11 | C11 | 129N | A6 A6 | E6 E6 | 10 | 6 |
| B2 | D2 | 129C | A7 | E7 E7 | 10 | 7 |
| B4 | D4 | 130N | A8 A8 | E8 E8 | 10 | 8 |
| B6 | D6. | 130C | A9 A9 | E9 E9 | 10 | 9 |
| B8 B8 | D8 | 131N | A10 | E10 E10 | 10 | 10 |
| B10 | D10 | 131C | A11 | E11 E11 | 10 | 11 |
Tabel 3. Totaal aantal peptiden, eiwitten en peptide spectrale lucifers (PSM's).
| Geautomatiseerde cPILOT | ||
| Licht | Zware | |
| Eiwitten | 1209 | 1181 |
| Peptides | 6137 | 5872 |
| PSM's | 14948 | 16762 |
Tabel 4. Barcoding de isobarische tags met de lichte en zware gelabelde monsters.
Discussion
cPILOT is een verbeterde multiplexing strategie die tot 24 monsters in een enkel experiment kan analyseren. De multiplexingcapaciteit is afhankelijk van het aantal beschikbare isotopen- en isobarische tagging-combinaties. De introductie van de TMTpro7, die in staat is om 16 monsters in één experiment te taggen, kan de grenzen van de CPILOT verleggen tot 32-plex. cPILOT bestaat uit meerdere pipetting stappen en vereist uitgebreide zorg en gebruikersvaardigheden om monstervoorbereiding uit te voeren. Zelfs met een deskundige gebruiker, handmatige fouten zijn onvermijdelijk, die het gebruik van robotplatforms uitnodigt om monsters te verwerken in de cPILOT-strategie. Aangezien cPILOT pH-afhankelijke tagging van de peptiden gebruikt, moet de pH worden gehandhaafd voor het licht en de zware dimethylated set monsters. Licht zuur-basis pH kan resulteren in dimethylation van zowel N-termini en lysine residuen. Een voordeel van cPILOT is dat het slechts de helft van de isobarische tags vereist, omdat peptide N-termini bezet zijn met de dimethylgroepen. Dit biedt een groter aantal monsters te worden geëtiketteerd tegen de helft van de kosten. Voor het hanteren van grotere steekproefnummers moeten de blootstellingstijden van reagens vergelijkbaar zijn voor het eerste en het laatste monster in een batch. Een pipetdispenser die plaats biedt aan maximaal 32 monsters parallel kan het best worden bereikt met behulp van robotvloeistofbehandelingsapparaten.
Om meerdere monsters per cPILOT te verwerken, werd de handmatige workflow aangepast om automatisering op te nemen. De robot vloeistof handler gebruikt in deze studie heeft twee pods met 96-kanaals en 8-kanaals pipetting vaardigheden, met een grijper om de platen te plaatsen in de beschikbare 28 dek locaties. De vloeistof handler is geïntegreerd met een positieve druk apparaat, orbitale shaker, en een apparaat om te verwarmen / afkoelen monsters in de 96 put plaat. Het positieve drukapparaat helpt bij het uitvoeren van bufferuitwisselingen in de SPE-platen tijdens het opruimen, terwijl de orbitale shaker helpt om de monsters te wervelen/mengen. Het robotplatform was geprogrammeerd om buffers en monsters op te zuipen en af te geven aan 96-putplaten, incubeer, vortexmonsters en overdrachtsplaten. Vloeistoffen met verschillende viscositeiten, zoals acetonitril en water, vereisen specifieke pipetting overwegingen die ook kunnen worden geprogrammeerd in de methode.
De cPILOT-workflow, vanaf eiwitkwantificering door BCA tot het labelen van de peptiden met isobaric tags (d.w.z. TMT), werd uitgevoerd op het vloeistofhandlersysteem. Het volledige protocol werd geschaald om 96 diepe putplaten te gebruiken die 2 mL per put kunnen bevatten. De buffers werden vóór het begin van het experiment voorbereid en toegevoegd aan de 96 putplaat om parallelle monsterverwerking mogelijk te maken. In deze studie, 22 workflow replica's van muis lever homogenaat werden toegevoegd aan de diepe put platen en genomen door middel van de cPILOT protocol. Ten slotte werd een enkel monster, bestaande uit de 22-plex equimolar muis lever gelabelde peptiden geïnjecteerd naar de massaspectrometer. Reporter ion intensiteiten die overeenkomen met peptide overvloed in de monsters aangetoond dat monsters verwerkt met de vloeibare handler hebben lagere cv's dan de handmatige protocol(gegevens niet getoond). Het robotplatform heeft ook de reproduceerbaarheid van monsterverwerking aanzienlijk verbeterd. Reproduceerbaarheid en robuustheid zijn zeer belangrijke factoren bij de verwerking van grote aantallen monsters. Pipetting fouten kan leiden tot volledige verkeerde interpretatie van de gegevens en hier de robot platform verstrekt lage inter-sample variatie. Ook het gebruik van het robotplatform voor de CPILOT heeft de tijd die nodig is om monsters te bereiden verminderd. Bijvoorbeeld, na het ontwikkelen van de geautomatiseerde methode, het vereiste 2,5 uur om 22 monsters te verwerken in vergelijking met 7,5 uur voor handmatige cPILOT. In ons laboratorium worden experimenten gedaan om vergelijkingen van de handmatige en geautomatiseerde cPILOT-workflows verder te evalueren. Op basis van eerdere rapporten uit ons laboratorium, de CV%'s van eiwit reporter ion intensiteiten in de handmatige cPILOT waren gemiddeld 20% met een aantal uitschieters boven deze waarde12.
cPILOT is een chemische afleidingsstrategie op peptideniveau, die kan worden gebruikt voor elk monstertype zoals cellen, weefsels en lichaamsvloeistoffen. cPILOT biedt verbeterde monster multiplexing en met de integratie van automatisering kan high-throughput monster multiplexing in proteomics vergemakkelijken. Deze doorvoer is nodig om ziekte en biologisch begrip en biomarkerontdekking verder te bevorderen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Vanderbilt University Start-up Funds en NIH award (R01GM117191) aan RASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
| 2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Acetonitrile - MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
| C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
| Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
| Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
| Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
| Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
| Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Water - MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
References
- Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
- Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).
- Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Shiio, Y., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Thompson, A., et al. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
- Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Robinson, R. A., Evans, A. R. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406 (2017).
- King, C. D., Robinson, R. A. S. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
- Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).
- Gu, L., Robinson, R. A. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227 (2020).
