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Chemistry

संयुक्त अग्रदूत आइसोटोपिक लेबलिंग और आइसोबाइक टैगिंग (cPILOT) का उपयोग करके स्वचालित नमूना मल्टीप्लेक्सिंग

Published: December 18, 2020 doi: 10.3791/61342

Summary

संयुक्त अग्रदूत आइसोटोपिक लेबलिंग और आइसोबोरिक टैगिंग (सीपीपाइट) एक बढ़ी हुई नमूना मल्टीप्लेक्सिंग रणनीति है जो नमूनों की संख्या बढ़ाने में सक्षम है जिसका एक साथ उपलब्ध आइसोकरिक टैग के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। रोबोटिक प्लेटफॉर्म के समावेश ने प्रयोगात्मक थ्रूपुट, प्रजनन क्षमता और मात्रात्मक सटीकता में काफी वृद्धि की है।

Abstract

हमने एक उच्च थ्रूपुट क्वांटिटेटिव प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो, संयुक्त अग्रदूत आइसोटोपिक लेबलिंग और आइसोकरिक टैगिंग (सीपीआईएलटी) को एक ही प्रयोग में क्रमशः टैंडेम मास टैग या आइसोकरिक एन, एन-डिमेथाइल ल्यूकिन आइसोबोरिक टैग्स के साथ 22 या 24 नमूनों तक मल्टीप्लेक्सिंग करने में सक्षम पेश किया है। यह बढ़ाया नमूना मल्टीप्लेक्सिंग बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री अधिग्रहण समय को कम करता है और महंगे वाणिज्यिक आइसोबेटर रिएजेंट्स की उपयोगिता को बढ़ाता है। हालांकि, रणनीति में नमूना हैंडलिंग और पाइपिंग चरणों की मैनुअल प्रक्रिया श्रम गहन, समय लेने वाली हो सकती है, और नमूना हानि और मात्रात्मक त्रुटि पेश कर सकती है। इन सीमाओं को स्वचालन के समावेश के माध्यम से दूर किया जा सकता है। यहां हमने मैनुअल cPILOT प्रोटोकॉल को एक स्वचालित तरल हैंडलिंग डिवाइस में स्थानांतरित कर दिया जो समानांतर रूप से बड़े नमूना संख्या (यानी, 96 नमूने) तैयार कर सकता है। कुल मिलाकर, स्वचालन सीपीआईलॉट की व्यवहार्यता और प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है और तुलनीय स्वचालन उपकरणों के साथ अन्य शोधकर्ताओं द्वारा व्यापक उपयोग की अनुमति देता है।

Introduction

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित प्रोटेओमिक्स रोग विशिष्ट बायोमार्कर की पहचान करने, रोग प्रगति को समझने और चिकित्सीय विकास के लिए लीड बनाने में एक अनिवार्य अनुसंधान उपकरण है। यह रोग से संबंधित नैदानिक नमूनों जैसे रक्त सीरम/प्लाज्मा, समीपस्थ तरल पदार्थ, और ऊतकों1, 2की एक श्रृंखला से प्राप्त किया जासकताहै । नमूना मल्टीप्लेक्सिंग रणनीतियों की शक्ति के कारण प्रोटेओमिक्स बायोमार्कर खोज और सत्यापन को हाल ही में महत्वपूर्ण रूप से ध्यान में रखा गया है3,4. नमूना मल्टीप्लेक्सिंग एक ऐसी तकनीक है जो एक एमएस इंजेक्शन5,6के भीतर दो या अधिक नमूना स्थितियों की एक साथ तुलना और मात्राकरण को सक्षम बनाती है । नमूना मल्टीप्लेक्सिंग को रासायनिक, एंजाइमेटिक या मेटाबोलिक टैग के साथ कई नमूनों से पेप्टाइड्स या प्रोटीन को बार्कोडिंग करके प्राप्त किया जाता है और एक ही एमएस या एमएस/एमएस प्रयोग में सभी नमूनों से एमएस जानकारी प्राप्त की जाती है । उपलब्ध आइसोकरिक टैग में आइसोकरिक टैगिंग रिएजेंट्स (iTRAQ), वाणिज्यिक टैंडेम मास टैग (टीएमटी), और घर संश्लेषित आइसोकरिक एन, एन-डिमेथाइल ल्यूसिन (DiLeu) क्रमशः 16-प्लेक्स7 और 21-प्लेक्स8तक की क्षमताओं के साथ रिएजेंट हैं।

संयुक्त अग्रदूत आइसोटोपिक लेबलिंग और आइसोबोरिक टैगिंग (cPILOT) एक उन्नत नमूना मल्टीप्लेक्सिंग तकनीक है। CPILOT पेप्टाइड एन-टर्मिनी के आइसोटोपिक लेबलिंग को प्रकाश [−(सीएच3)2]और भारी [−13 सी2एच3)2]कम पीएच (∼2.5) परआइसोटोप के साथ जोड़ती है, जो बाद में उच्च पीएच (8.5) के लिए lysine अवशेष उपलब्ध रखती है, टीएमटी का उपयोग कर रही है। DiLeu, या iTRAQ टैगिंग3,9,10,11,12,13,14। सीपीपायलट रणनीति की दोहरी लेबलिंग योजना को पूरक चित्रा 1 में दर्शाया गया है जिसमें एक उदाहरण पेप्टाइड का उपयोग करके दो नमूने हैं। एमएस2 स्तर पर टीएमटी आधारित मात्राकरण की सटीकता और सटीकता को दूषित सह-पृथक और सह-खंडित आयनों की उपस्थिति के कारण समझौता किया जा सकता है जिसे हस्तक्षेप प्रभाव15कहा जाता है। गलत रिपोर्टर आयन अनुपात में इस सीमा को ट्राइब्रिड ऑर्बिटरप मास स्पेक्ट्रोमीटर की मदद से दूर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर में एमएस1 स्तर पर एक डाइमेथाइलेटेड जोड़ी में एक चोटी को अलग करके हस्तक्षेप प्रभाव को दूर किया जा सकता है, जो प्रकाश या भारी चोटी को रैखिक आयन जाल में एमएस2 विखंडन के अधीन करता है और फिर मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए एचसीडी-एमएस3 के लिए सबसे तीव्र एमएस2 टुकड़ा को अधीन करता है। रिपोर्टर आयनों को उत्पन्न करने के लिए उपलब्ध lysine अमीनों के बिना पेप्टाइड्स का चयन करने की संभावना को बढ़ाने के लिए, वाई-1 टुकड़े के आधार पर एक चयनात्मक एमएस 3अधिग्रहण का भी उपयोग किया जा सकता है और यह एक दृष्टिकोण है जिसके परिणामस्वरूप सीपीपाइट9के साथ पेप्टाइड्स क्वांटिटिफायर का उच्च प्रतिशत हो सकता है। प्रकाश और भारी लेबलिंग के संयोजन से नमूना मल्टीप्लेक्सिंग क्षमताओं को 2x के कारक द्वारा बढ़ाया जाता है जो व्यक्तिगत आइसोकरिक टैग के साथ हासिल किया जाता है। हमने हाल ही में16DiLeu reagents के साथ एक ही प्रयोग में 24 नमूनों को मिलाने के लिए cPILOT का इस्तेमाल किया है । इसके अतिरिक्त cPILOT का उपयोग प्रोटीन नाइट्रेट17, अन्य वैश्विक प्रोटेक्स9सहित ऑक्सीडेटिव पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का अध्ययन करने के लिए किया गया है, औरअल्जाइमररोग माउस मॉडल11में कई ऊतक नमूनों में अनुप्रयोगों का प्रदर्शन किया गया है।

मजबूत नमूना तैयारी एक cPILOT प्रयोग में एक महत्वपूर्ण कदम है और समय लेने वाली, श्रमसाध्य, और व्यापक हो सकता है। उन्नत नमूना मल्टीप्लेक्सिंग के लिए व्यापक पाइपिंग और अत्यधिक कुशल प्रयोगशाला कर्मियों की आवश्यकता होती है, और ऐसे कई कारक हैं जो प्रयोग की प्रजनन क्षमता को भारी प्रभावित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, नमूनों की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग सभी नमूनों के लिए समान प्रतिक्रिया समय सुनिश्चित करने और प्रकाश और भारी डाइमेथाइलेटेड नमूनों के लिए उपयुक्त बफर पीएच बनाए रखने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, सैकड़ों नमूनों के लिए दसियों की मैनुअल तैयारी उच्च प्रयोगात्मक त्रुटि शुरू कर सकते हैं । इसलिए, नमूना तैयारी परिवर्तनशीलता को कम करने, मात्रात्मक सटीकता में सुधार करने और प्रयोगात्मक थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए, हमने एक स्वचालित cPILOT कार्यप्रवाह विकसित किया। ऑटोमेशन एक रोबोट लिक्विड हैंडलिंग डिवाइस का उपयोग करके हासिल किया जाता है जो वर्कफ़्लो(चित्रा 1)के कई पहलुओं को पूरा कर सकता है। प्रोटीन क्वांटिफिकेशन से पेप्टाइड लेबलिंग तक सैंपल तैयार करने का काम एक ऑटोमेटेड लिक्विड हैंडलर पर किया गया था । स्वचालित तरल हैंडलर ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) प्लेटें, कक्षीय शेखर, और एक हीटिंग/कूलिंग डिवाइस के बीच बफर एक्सचेंजों के लिए एक सकारात्मक दबाव उपकरण (पीपीए) के साथ एकीकृत है । रोबोटिक प्लेटफॉर्म में प्लेटों और बफ़र्स को समायोजित करने के लिए 28 डेक स्थान शामिल हैं। डेक स्थानों के भीतर प्लेटों को स्थानांतरित करने के लिए एक तवे के साथ दो फली हैं: एक 96-चैनल फिक्स्ड वॉल्यूम पाइपटिंग हेड (5-1100 माइक्रोएल) और 8 चैनल वेरिएबल वॉल्यूम प्रोब्स (1-1000 माइक्रोन)। रोबोटिक प्लेटफॉर्म को एक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके नियंत्रित किया जाता है। रोबोट लिक्विड हैंडलर का उपयोग करने से पहले उपयोगकर्ता को पेशेवर रूप से प्रशिक्षित करने की आवश्यकता है। वर्तमान अध्ययन मैनुअल cPILOT कार्यप्रवाह को स्वचालित करने पर केंद्रित है, जो एक ही बैच में 12 से अधिक नमूनों को संसाधित करने के लिए श्रम गहन हो सकता है। cPILOT दृष्टिकोण 11 के थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए, हमने समानांतर में10से अधिक नमूनों को संसाधित करने के लिए एक रोबोट तरल हैंडलर को cPILOT प्रोटोकॉल स्थानांतरित कर दिया। स्वचालन नमूना तैयारी प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के दौरान समानांतर में प्रत्येक नमूने के लिए समान प्रतिक्रियाओं की भी अनुमति देता है, जिसके लिए मैनुअल cPILOT के दौरान उच्च प्रशिक्षित उपयोगकर्ताओं को प्राप्त करने की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल cPILOT को पूरा करने के लिए स्वचालित तरल हैंडलिंग डिवाइस के कार्यान्वयन पर केंद्रित है। वर्तमान अध्ययन इस स्वचालित प्रणाली का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और माउस लिवर होममोजेनेट के 22-प्लेक्स "प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट" विश्लेषण का उपयोग करके इसके प्रदर्शन को दर्शाता है।

Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । एक पुरुष नियंत्रण माउस (C57/BLJ) व्यावसायिक रूप से खरीदा गया था और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु संसाधनों के प्रभाग में रखे । चूहों को मानक कृंतक प्रयोगशाला चाउ विज्ञापन लिबिटम खिलाया गया और 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र में रखा गया । लिवर टिश्यू को काटा गया और −80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया गया।

1. प्रोटीन निष्कर्षण

नोट: ये चरण मैन्युअल रूप से किए जाते हैं।

  1. 20 एस के लिए 4 मीटर के लिए lysing मैट्रिक्स ए मोतियों का उपयोग करके एक यांत्रिक होमोजेनाइजर का उपयोग करके 8 एम यूरिया के 500 माइक्रोन के साथ खारा और समरूप के साथ माउस जिगर (100 मिलीग्राम) धोएं।
    नोट: इस अध्ययन में, प्रोटीज या फॉस्फेट अवरोधकों को नहीं जोड़ा गया था, लेकिन प्रयोग के आधार पर यदि आवश्यक हो तो बफर में जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटीन निष्कर्षण चरणों को विभिन्न नमूना प्रकारों के लिए तदनुसार समायोजित किया जा सकता है।
  2. ऊतक समरूप को एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, 8 एम यूरिया के साथ पीबीएस के 100-500 माइक्रोन के साथ lysing ट्यूबों को कुल्ला और संयोजित करें।
  3. अपकेंद्रित्र समरूप ऊतकों (12,800 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस, और 15 मिनट) और सुपरनैंट इकट्ठा।
    नोट: बाकी कदम उपयोगकर्ता की प्रयोगशाला में उपलब्ध रोबोटिक लिक्विड हैंडलर पर किए जाते हैं। तरल हैंडलर को न्यूनतम ऑपरेटर भागीदारी के साथ, एएनसीआई निर्दिष्ट प्लेट के प्रकारों से और बफ़र्स को अनिवार्य करने और वितरित करने में सक्षम होना चाहिए।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक बाइसिनकोनिक एसिड (बीसीए) परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें।
  5. पीपीए, हीटिंग/कूलिंग डिवाइस और वैक्यूम पंप चालू करें और सभी एक्सेसरीज को लिक्विड हैंडलर से कनेक्ट करें । तरल हैंडलर एक नीली रोशनी से पता चलता है एक बार यह कंप्यूटर से जुड़ा हुआ है और काम करने के लिए तैयार है ।
  6. प्लेट 1 (96 वेल प्लेट) को फिर से बनाना, क्रमशः 25 एमएमएम 1, 4-डिथिओथ्रेइटोल (डीटीटी), 25 एमएम 30 माइक्रोन सिस्टीन और 25 एमएम 30 माइक्रोन ऑफ आयोडोसेटामाइड (आईएए) को क्रमशः पंक्तियों में जोड़ें।
  7. एक जलाशय प्लेट में 10 mm CaCl 2 (पीएच8.2) के साथ 8 मीटर यूरिया और 20 एमएमएम ट्रिज़ जोड़ें। 2 एमएलए डीप वेल प्लेट में 5% फोर्मिक एसिड के 500 माइक्रोन जोड़ें, ट्राइप्सिन प्लेट की पंक्ति 1 में ट्राइप्सिन के 20 माइक्रोन जोड़ें और विधि द्वारा निर्दिष्ट डेक स्थान में रखें।
    नोट: आईएए और ट्रिप्सिन को नमूने में जोड़ने से पहले 96 अच्छी तरह से प्लेट में जोड़ा गया था।
  8. एलिकोट लिवर के 300 माइक्रोन को 500 माइक्रोन ट्यूब में और प्रोटोकॉल की शुरुआत तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 एमएल डीप वेल प्लेट पर रखें और रखें। इस प्रयोग के लिए सिंगल लिवर होमोजेनेट से 22 एलिजिबेट्स जेनरेट किए गए थे।
    नोट: अनुपात 1 माइक्रोग्राम मानक: 100 माइक्रोग्राम प्रोटीन नमूना के साथ एक आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण मानक (उदाहरण के लिए, गोजातीय अल्फा कैसिन या अन्य एक्सोजेनस प्रोटीन) जोड़ें।
  9. तालिका 1के अनुसार परिवर्तनीय नाम और मूल्य द्वारा नमूनों में जोड़े जाने वाले बफ़र्स की मात्रा को परिभाषित करें। बीसीए के आधार पर, एक स्प्रेडशीट पर नमूना और सामान्यीकरण बफर (8 एम यूरिया) की मात्रा दर्ज करें और सॉफ्टवेयर(तालिका 2)से संलग्न करें।
    नोट: यदि प्रोटीन एकाग्रता बहुत अधिक है तो बफर के साथ आगे कमजोर पड़ना आवश्यक हो सकता है। जिगर के ऊतकों से नमूना के लिए जिसके परिणामस्वरूप सांद्रता 10 μg/μL था । बफ़र्स की मात्रा 100 माइक्रोग्राम प्रोटीन के लिए अनुकूलित की गई थी।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस से नमूना ट्यूब निकालें, स्वचालित तरल हैंडलर के निर्दिष्ट डेक स्थान पर रखें, और 10 मिनट के लिए गर्म करने की अनुमति दें।
  11. विधि खोलें और आवश्यक सुझावों (1070, 90, और 230 माइक्रोन) को रखने के निर्देशों का पालन करें, और वांछित पदों में लेवेयर करें। एक बार जब सभी लैबवेयर और टिप्स मौजूद होते हैं, तो अंतिम डेक लेआउट के साथ क्रॉस चेक करें और प्रोटोकॉल जारी रखने के लिए आगे क्लिक करें।
    नोट: निर्देशित सेट अप उपयोगकर्ता को प्रोटोकॉल और डेक स्थान के आधार पर विशिष्ट लैबवेयर में बफर की एक आवश्यक मात्रा जोड़ने के लिए सूचित करता है।

2. नमूना कमी, एल्किलेशन और पाचन

  1. जलाशय से 8 मीटर यूरिया के 90 माइक्रोन लोड करें और ब्लैक 2 एमएल डीप वेल प्लेट की पंक्ति 1 को वितरित करें। टिप्स उतारें। इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि 22 नमूनों के अनुरूप सभी कुओं में 8 मीटर यूरिया न जोड़ा जाए।
    नोट: डेनैचेशन बफर प्रोटीन त्रि-आयामी संरचना को प्राथमिक संरचना को उपज देने के लिए अनविंड्स करता है ताकि ट्राइप्सिन प्रोटीन को प्रभावी ढंग से कार्य और तोड़ सके। 8-चैनल पिपेट 8 चैनलों के लिए विभिन्न खंडों को एस्पिरेट कर सकता है और लैबवेयर में विभिन्न स्थानों पर बांट सकता है। इस चरण में सभी चैनलों ने सॉफ्टवेयर में परिभाषित समान मात्रा को एस्पिर किया।
  2. डेनैचुरेशन बफर जोड़ने के बाद, 90 माइक्रोन टिप्स लोड करें और 8-चैनल पिपेट का उपयोग करके माउस लिवर समरूप के 10 माइक्रोन (100 माइक्रोन से मेल खाती है) को ब्लैक 2 एमएल डीप वेल प्लेट में लोड करें। टिप्स उतारें। इस कदम को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी 22 नमूनों का तबादला न हो जाए।
  3. प्रत्येक हस्तांतरण के बाद, 1:1 अनुपात प्रदर्शित करने के लिए बफर के साथ प्रोटीन के मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए तीन बार अच्छी सामग्री के 50 माइक्रोन को एस्पिरेट और वितरित करने के लिए एक मिश्रण कदम करें।
    नोट: स्टॉक समरूप नमूना निकालें और -80 डिग्री सेल्सियस में रखें।
  4. विकृत प्रोटीन को कम करने के लिए, 90 माइक्रोन युक्तियों की एक पंक्ति लोड करें और रिएजेंट प्लेट 1 से डीटीटी के 3 माइक्रोन को एस्पिरेट करें। काले 2 एमएल डीप वेल प्लेट की पंक्तियों 1 और 2 को डीटीटी वितरित करें और युक्तियों को उतार दें।
    नोट: प्रोटीन: डिफाइड बांड की कमी के लिए डीटीटी मोलर अनुपात 1:40 पर बनाए रखा जाता है । मोलर अनुपात के लिए गणना गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के प्रोटीन द्रव्यमान को आधारित है, जो 66.5 x 103 ग्राम/मोल है।
  5. 300 आरपीएम पर 600 एस के लिए एल्यूमीनियम फॉयल और इनक्यूबेट के साथ सैंपल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर सील करें।
  6. उपयोग से ठीक पहले 1 अभिकर्मक प्लेट के 3 पंक्ति में 0.25 एम आईएएम का 30 माइक्रोल जोड़ें और डेक पर रखें। नमूना प्लेट को अनसील करें और डेक पर लौटें।
    नोट: आईएएम प्रकाश संवेदनशील है।
  7. 90 माइक्रोल युक्तियों की एक पंक्ति लोड करें, पंक्ति 3 पर रिएजेंट प्लेट 1 से आईएएम के 6 माइक्रोन को एस्पिरेट करें, और नमूना प्लेट की पंक्ति 1 को वितरित करें। टिप्स उतारें।
    नोट: प्रोटीन: आईएएम मोलर अनुपात प्रत्येक नमूने के लिए 1:80 पर बनाए रखा जाता है। यह प्रतिक्रिया अंधेरे में किया जाना चाहिए।
  8. हीटिंग/कूलिंग डिवाइस पर 300 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए सैंपल प्लेट और इनक्यूबेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर सील करें ।
    नोट: प्लेट को सील करने के लिए प्रकाश, वाष्पीकरण और कुएं से फैल से नमूना को रोकने के लिए किया जाता है।
  9. नमूना प्लेट को अनसील करें और 90 माइक्रोन टिप्स की एक पंक्ति लोड करें और पंक्ति 2 पर रिएजेंट प्लेट 1 से सिस्टीन के 5 माइक्रोन को एस्पिरेट करें। नमूना प्लेट की पंक्तियों 1 और 2 को बांटना और सुझावों को अनलोड करें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    नोट: प्रोटीन: एल-सिस्टीन मोलर अनुपात 1:40 पर बनाए रखा जाता है।
  10. 30 मिनट के लिए 1800 आरपीएम का समय पर शेक करने के लिए नमूना प्लेट को कक्षीय शेखर पर रखें।
  11. यूरिया एकाग्रता को पतला करने के लिए नमूना प्लेट के प्रत्येक कुएं में 10 m M CaCl2 (पीएच 8.2) के साथ 20 m M Tris बफर के 800 μL जोड़ें।
    नोट: ट्रिप्सिन गतिविधि उच्च यूरिया सांद्रता में बाधित होती है और इसलिए इसे 2 मीटर से कम किया जाना चाहिए। यह अध्ययन 50 के ट्राइपसिन मोलर अनुपात के लिए प्रोटीन के साथ किया गया था: 14 घंटे के लिए 1।
  12. पंक्ति 1 में ट्राइपसिन के 20 माइक्रोन जोड़ें, 96 अच्छी प्लेट का कॉलम 1-12 और डेक पर एक निर्दिष्ट स्थान पर रखें।
  13. 90 माइक्रोल युक्तियों की एक पंक्ति लोड करें, ट्राइपसिन प्लेट पंक्ति 1 से ट्राइपसिन के 2 माइक्रोन को एस्पिरेट करें, और नमूना प्लेट की पंक्तियों 1 और 2 को वितरित करें। टिप्स उतारें।
  14. हीटिंग/कूलिंग डिवाइस पर 600 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 14 घंटे के लिए प्लेट और इनक्यूबेट को सील करें।
  15. इनक्यूबेशन के बाद, नमूना प्लेट को अनसील करें और पंक्ति 3 में 5% बैक्मिक एसिड जोड़ें, एक गहरी अच्छी तरह से संग्रह प्लेट के कॉलम 1-12 और इसे निर्दिष्ट डेक पर रखें।
  16. फोर्मिक एसिड प्लेट की पंक्ति 3 से 5% फोर्मिक एसिड के 150 माइक्रोन जोड़कर पाचन को रोकें और पंक्तियों 1 और 2 पर नमूना प्लेट में वितरित करें। टिप्स उतारें।

3. डेसाल्टिंग चरण 1

  1. स्पीप प्लेट के साथ पेप्टाइड्स को 20 मिलीग्राम टार्गा सी-18 सामग्री युक्त करें। 600 माइक्रोन के रूप में हर बफर एक्सचेंज के लिए मात्रा तय करें और 100 mbar करने के लिए दबाव को ठीक करें।
  2. लोड 1070 μL सुझावों और एसीटोनीट्रिल के 600 μL एस्पारेट और SPE प्लेट के 1 और 2 पंक्तियों को बांटना। पीपीए पर एसपीई प्लेट रखें और दबाव लागू करें।
  3. एक ही सुझाव का उपयोग करना, एसीटोनीट्रिल के 600 माइक्रोन को एस्पिट करें और एसपीई प्लेट की पंक्तियों 1 और 2 को वितरित करें। पीपीए पर एसपीई प्लेट रखें और दबाव लागू करें।
    नोट: प्रवाह के माध्यम से एक सक्शन पंप का उपयोग कर बर्बाद करने के लिए सूखा जा सकता है ।
  4. लोड 1070 माइक्रोल टिप्स और बफर ए के 600 माइक्रोन (0.1% फोर्मिक एसिड में 100% पानी) लोड करें और एसपीई प्लेट की पंक्तियों 1 और 2 को वितरित करें। पीपीए पर एसपीई प्लेट रखें और दबाव लागू करें।
    नोट: यदि बफर की मात्रा काफी कम दबाव या समय बढ़ाने की कोशिश नहीं करता है ।
  5. लोड 1070 μL सुझावों की 2 पंक्तियां, पचा नमूनों के 534 μL aspirate, और SPE प्लेट की पंक्तियों 1 और 2 को बांटना। पीपीए पर एसपीई प्लेट रखें और दबाव लागू करें। इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी नमूने लोड न हो जाएं।
    नोट: चूंकि फॉर्मिक एसिड जोड़ने के बाद कुल मात्रा 1068 माइक्रोन होगी और नमूनों को दो पास में जोड़ा गया था।
  6. इस्तेमाल किया 1070 μL सुझावों की 2 पंक्तियों लोड, बफर ए के 600 μL aspirate, और SPE प्लेट की पंक्तियों 1 और 2 को बांटना। पीपीए पर एसपीई प्लेट रखें और दबाव लागू करें।
  7. नमूना साफ करने के लिए एक बार उपरोक्त चरण दोहराएं।
  8. लोड 1070 μL सुझावों की 1 पंक्ति, ACN के 600 μL aspirate: पानी (60:40) और पंक्तियों के लिए बांटना 1 और SPE प्लेट के 2. पीपीए का उपयोग करके पेप्टाइड्स को एल्यूट करने और दबाव लागू करने के लिए एक संग्रह प्लेट के शीर्ष पर एसपीई प्लेट रखें।
  9. संग्रह प्लेट में पेप्टाइड्स को elute करने के लिए उपरोक्त कदम दोहराएं। संग्रह प्लेट को सूखापन में सुखाएं और आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. डाइमेथाइलेशन लेबलिंग (पेप्टाइड एन-टर्मिनी)

  1. आवश्यक सुझाव (1070, 90, और 230 μL) रखें, और सॉफ्टवेयर में वांछित पदों में लैबवेयर रखें। एक बार जब सभी लैबवेयर और टिप्स मौजूद होते हैं, तो अंतिम डेक लेआउट के साथ क्रॉस चेक करें और प्रोटोकॉल जारी रखने के लिए आगे क्लिक करें।
  2. प्लेट 2 को फिर से तैयार करने के लिए, 1% एसिटिक एसिड के 450 माइक्रोन, 50 माइक्रोन लाइट फॉर्मेल्डिहाइड (सीएच2ओ), भारी फॉर्मेल्डिहाइड(13सीडी2ओ) के 50 माइक्रोन और क्रमशः 1, 2, 3 और 4 पंक्तियों में फॉर्मिक एसिड के 150 माइक्रोन जोड़ें।
  3. प्लेट 3 को फिर से बनाना है, जिसमें 50 माइक्रोन लाइट सीबी, 50 माइक्रोन भारी सीबी, पंक्तियों 1 और 2 और अमोनिया के 50 माइक्रोन को पंक्ति 3 और 4 में जोड़ें।
  4. 230 माइक्रोन टिप्स की 2 पंक्तियां लोड करें और 1% एसिटिक एसिड के 100 माइक्रोन को रिएजेंट प्लेट 2 की पंक्ति से उठाएं और नमूना प्लेट 2 (डिसाल्टिंग स्टेप से संग्रह प्लेट) पंक्तियों में सूखे पेप्टाइड्स को वितरित करें और 1800 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए एक समय पर मिलाते हुए प्रदर्शन करें।
  5. लोड 90 माइक्रोल टिप्स और 60 mm (4%) सीएच2ओ (37% wt/v) रिएजेंट प्लेट 2 की पंक्ति 2 से और नमूना प्लेट की पंक्ति 1 को बांटना। टिप्स उतारें।
  6. लोड 1 पंक्ति 90 माइक्रोल टिप्स और एस्पिरेट 16 माइक्रोन 60 mm (4%) 13 सीडी2O (20% wt/v) रिएजेंट प्लेट 2 की पंक्ति 3 से और नमूना प्लेट की पंक्ति 2 को बांटना । टिप्स उतारें।
    नोट: इस अध्ययन पंक्ति में 1 प्रकाश से मेल खाती है और पंक्ति 2 भारी डाइमेथाइलेटेड नमूनों से मेल खाती है (चित्र 1 देखें)।
  7. लोड 90 μL सुझावों की 2 पंक्तियों और 24 mM NaBH3CN और 24 mM NaBD3CN के पंक्ति 1 और 2 से reagent प्लेट 3 के 16 μL लोड और प्लेट नमूना के क्रमशः पंक्तियों 1 और 2 को बांटना ।
  8. सुझावों को उतारना और कक्षीय शेखर का उपयोग कर 1800 आरपीएम पर 15 मिनट के लिए एक समय पर हिला प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड जोड़ना प्रतिक्रिया शुरू करता है इसलिए प्रयोगों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए यह कदम प्रति बैच एक बार किया जाता है।
  9. लोड 90 μL सुझावों की 2 पंक्ति और 1% अमोनिया के 32 माइक्रोन (~ 28-30% v/v) पंक्तियों से 3 और अभिकर्मित प्लेट 3 के 4 और नमूना प्लेट 2 के क्रमशः पंक्तियों को बांटना 1 और 2। टिप्स उतारें।
    नोट: अमोनिया जोड़ना प्रतिक्रिया बंद हो जाता है इसलिए प्रयोगों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए इस कदम को प्रति बैच एक बार किया जाता है ।
  10. डेसाल्टिंग के लिए एक नई 2 एमएल डीप वेल प्लेट में हल्के और भारी (1:1) डाइमेथाइलेटेड पेप्टाइड्स की बराबर मात्रा को मिलाएं।
    नोट: इस अध्ययन में पंक्ति 1 से अच्छी तरह से सामग्री के 90 माइक्रोन को नमूना प्लेट 2 से 90 माइक्रोन के साथ एक नई 2 एमएल संग्रह प्लेट (नमूना प्लेट 3) में जोड़ा गया था। प्रकाश का अनुपात: भारी मिश्रण प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, इस अध्ययन में 1:1 अनुपात का उपयोग किया गया था।
  11. 230 माइक्रोन टिप्स की 2 पंक्तियां लोड करें और संयुक्त नमूनों में 5% फोर्मिक एसिड के 32 माइक्रोन को बढ़ाएं और 1800 आरपीएम पर 30 एस के लिए समय पर मिलाते हुए प्रदर्शन करें।
    नोट: डाइमेथाइलेशन दक्षता प्रतिक्रिया मिश्रण के पीएच पर निर्भर करती है और बफर पीएच में किसी भी परिवर्तन के परिणामस्वरूप पेप्टाइड एन-टर्मिनी की अधूरी लेबलिंग होगी। पेप्टाइड एन-टर्मिनी में गतिशील संशोधन के रूप में खोजे जाने पर डाइमेथाइलेशन दक्षता 97% से अधिक होनी चाहिए। इस अध्ययन में प्रकाश और भारी पेप्टाइड्स की लेबलिंग दक्षता क्रमशः 99.7% और 99.5% थी।

5. डेसाल्टिंग स्टेप 2

  1. संयुक्त नमूनों के लिए डेसाल्ट चरण 1 के समान नमूना डीसल्टिंग करें।
  2. एक गति vac का उपयोग कर नमूना प्लेट में नमूनों को सुखाएं और आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. आइसोकरिक टैगिंग (Lys अवशेष)

  1. निर्देशित लैबवेयर सेटअप का पालन करें और उचित बफ़र्स के साथ आवश्यक सुझावों (1070, 90, और 230 माइक्रोन) रखें। एक बार जब सभी लैबवेयर और टिप्स मौजूद होते हैं, तो अंतिम डेक लेआउट के साथ क्रॉस चेक करें और प्रोटोकॉल जारी रखने के लिए आगे क्लिक करें।
  2. 100 एमएम ट्राइथिल अमोनियम बाइकार्बोनेट (टीबीबी), 30 माइक्रोन हाइड्रोक्सिलामाइन (10% डब्ल्यू/वी) को पंक्तियों में 1, और 2 रिएजेंट प्लेट 4 के 250 माइक्रोल जोड़ें। टेबल 3में स्प्रेडशीट के अनुसार टीएमटी ट्यूब को 2 एमएल डीप-वेल प्लेट पर रखें ।
  3. टैग पेप्टाइड्स पूलिंग के लिए एक ट्यूब रैक धारक में एक खाली 1.5 एमएल ट्यूब रखें। P14 पर P9 और टीएमटी प्रोसेसिंग प्लेट में सूखे नीचे नमूना प्लेट रखें।
  4. पेप्टाइड्स का पुनर्गठन करने के लिए, 230 माइक्रोल टिप्स लोड करें और 100 एमएम ट्राइथिल अमोनियम बाइकार्बोनेट (टीबी) बफर (पीएच ~ 8.5) के 100 माइक्रोन को टीबी प्लेट पर पंक्ति 1 से लोड करें और नमूना प्लेट 3 की पंक्ति 3 पर सूखे पेप्साइड्स को वितरित करें। 1800 आरपीएम पर 30 एस के लिए कक्षीय शेखर पर प्लेट रखें।
    नोट: 1 माइक्रोन/माइक्रोन की एकाग्रता पर 100 माइक्रोन डिमेथाइलेटेड पेप्टाइड्स का पुनर्गठन करें।
  5. टीएमटी प्लेट के एच12 से 90 माइक्रोन टिप्स लोड करें और 10 माइक्रोन को निर्जल एसीटोनीट्रिल करें और प्रत्येक सूखे टीएमटी ट्यूब में वितरित करें।
  6. टीएमटी ट्यूब, भंवर निकालें, और जल्दी से ट्यूबों स्पिन और गहरी अच्छी तरह से थाली में डेक पर लौटने।
  7. 90 माइक्रोन टिप्स की 1 पंक्ति लोड करें और संयुक्त डाइमेथाइलेटेड पेप्टाइड्स के 12.5 माइक्रोन को लोड करें और टीएमटी प्रोसेसिंग प्लेट की पंक्ति 1 को वितरित करें। टिप्स उतारें।
    नोट: टीएमटी: पेप्टाइड अनुपात इस प्रयोग के लिए 1:8 पर बनाए रखा गया था ।
  8. 90 माइक्रोन टिप्स की 1 पंक्ति लोड करें और टीएमटी के 10 माइक्रोन को एस्पिरेट करें और टीएमटी प्रोसेसिंग प्लेट की पंक्ति 1 को वितरित करें। टिप्स उतारें, 1800 आरपीएम पर 1 घंटे के लिए टाइम शेक करें।
  9. 90 माइक्रोन टिप्स की 1 पंक्ति लोड करें और टीबी प्लेट में पंक्ति 2 से हाइड्रोक्सीलमाइन (10% w/v) के 8 माइक्रोन को बढ़ाएं और टीएमटी प्रोसेसिंग प्लेट की पंक्ति 1 को वितरित करें। टिप्स उतारें, 1800 आरपीएम पर 15 मिनट के लिए एक समय पर मिलाते हुए प्रदर्शन करें।
  10. टीएमटी प्रोसेसिंग प्लेट से 1.5 एमएल ट्यूब पर टीएमटी लेबल वाले पेप्टाइड्स के 30.5 माइक्रोन को मिलाएं। प्रत्येक स्थानांतरण के बाद सुझावों को उतारना।
  11. पूल किए गए नमूनों के साथ ट्यूब निकालें और एसीटोनिट्रिल को वाष्पित करने के लिए सूखें। 0.1% फॉर्मिक एसिड में 0.2 मिलील पानी में पेप्टाइड्स का पुनर्गठन करें और डेक पर लौटें।
    नोट: आइसोकरिक टैगिंग की लेबलिंग दक्षता भी पीएच विशिष्ट है और लेबलिंग दक्षता निर्माता के निर्देशों के अनुसार 98% से ऊपर होनी चाहिए। इस अध्ययन में lysine समाप्त प्रकाश और भारी पेप्टाइड्स की टीएमटी लेबलिंग दक्षता क्रमशः 99.4% और 99.5% थी।

7. डेसाल्टिंग कदम

  1. एक नमूने के लिए डेसाल्ट 1 के समान नमूना डीसल्टिंग करें।
  2. नमूनों को सुखाएं और विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें।

8. लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) और एमएस3

  1. ~ 1 μg/μL एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 0.1% एफए के साथ एमएस ग्रेड पानी में पेप्टाइड्स का पुनर्गठन करें। 0.65 माइक्रोन फिल्टर युक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के साथ नमूनों को फ़िल्टर करें। 3 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज पेप्टाइड्स और प्रवाह को ऑटो-पारखी शीशी में रखें।
    नोट: पेप्टाइड एकाग्रता इस स्तर पर पुष्टि की जा सकती है अगर वांछित । पेप्टाइड्स को एलसी-एमएस ग्रेड वॉटर में पुनर्गठित करने और बीसीए पेप्टाइड परख के अधीन करने की आवश्यकता होगी । इस अध्ययन में, पेप्टाइड बीसीए परख का प्रदर्शन नहीं किया गया था और सभी पेप्टाइड मात्रा प्रारंभिक प्रोटीन बीसीए परख पर आधारित थी।
  2. मोबाइल चरण बफ़र्स को इस प्रकार तैयार करें: 0.1% एफए (ए) के साथ 100% (v/v) पानी और 0.1% एफए (बी) के साथ 100% एसीएन।
  3. सी18 सामग्री (3 माइक्रोन, 100 Å pore आकार) के 2 सेमी के साथ पैक एक जाल कॉलम पर नमूना के 1 μL इंजेक्ट करें।
    नोट: जाल पर नमूना सफाई इस प्रकार है: 10 मिनट, 100% ए; 2डी लिक्विड क्रोमेटोग्राफी सिस्टम का उपयोग करके 2 माइक्रोन/मिनट।
  4. विश्लेषणात्मक सेपरेशन विधि चलाएं। सी 18 सामग्री (2.5 माइक्रोन, 100 Å) के साथ पैक 100 माइक्रोन एक्स एक्स26 सेमी लेजर खींचा-टिप फ्यूज्ड सिलिका केशिका कॉलम का उपयोग करें। ढाल है: 0-10 मिनट, 10% बी; 10-30 मिनट, 10-15% बी; 30-75 मिनट, 15-30% बी; 75-88 मिनट, 30-60% बी; 88-92 मिनट, 60-90% बी; 92-99 मिनट, 90% बी; 99-100 मिनट, 90-10% बी, 100-120 मिनट, 10% बी; 300 एनएल/न्यूनतम, 120 मिनट।
  5. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए डेटा अधिग्रहण चलाएं, जबकि विश्लेषणात्मक जुदाई विधि चल रही है।
    1. एमएस सर्वेक्षण स्कैन के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: 375-1,500 मीटर/जेड,120,000 संकल्प, साइकिल समय 3 एस (शीर्ष गति), स्वचालित लाभ नियंत्रण (AGC) लक्ष्य 4.0e5, अधिकतम इंजेक्शन समय 50 एमएस।
    2. आयन ट्रैप के साथ सीआईडी-एमएस/एमएस के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: डेटा निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) प्रति परिणाम स्कैन, 2 m/z अलगाव चौड़ाई, ३५% सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा (NCE), ०.२५ सक्रियण क्यू, 10 एमएस सक्रियण समय, १.०e4 AGC, १०० एमएस अधिकतम इंजेक्शन समय ।
    3. एचसीडी-एमएस3 एसपीएस 10 के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: स्कैन रेंज 100-400 मीटर/जेड,आश्रित स्कैन की संख्या 10, एजीसी 5.0e4, अधिकतम इंजेक्शन समय 118 एमएस, एचसीडी टकराव ऊर्जा 55%, एमएस 2 आइसोलेशन विंडो2।

9. डेटा विश्लेषण

  1. एक उपयुक्त डेटाबेस के खिलाफ प्रोटीन विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रोटीन और पेप्टाइड्स की सूची के लिए उत्पन्न कच्ची फ़ाइलों को खोजें।
    नोट: इस अध्ययन में उत्पन्न कच्ची फाइलों को माउस यूनिप्रोट डेटाबेस के खिलाफ खोजा गया था।
  2. चूंकि एक रॉ फाइल में लाइट और हैवी लेबलिंग दोनों होती है, इसलिए प्रत्येक फाइल को लाइट और हैवी डाइमेथिलेटेड पेप्टाइड्स के लिए दो वर्कफ्लो के साथ सर्च करें ।
  3. निम्नलिखित मापदंडों के साथ 53035 अनुक्रम के साथ माउस यूनिप्रोट डेटाबेस (07/13/2019) के खिलाफ रॉ फ़ाइलों को खोजें: अधिकतम दो छूटे हुए दरार के साथ ट्राइपसिन क्लीवेज, पेप्टाइड न्यूनतम 6 अमीनो एसिड लंबाई के साथ, 15 पीपीएम पैरेंट मास टॉलरेंस, 1 दा विखंडन सहिष्णुता स्थिर संशोधन: प्रकाश डाइमेथिलेशन (+28.031, पेप्टाइड एन-टर्मिनस) या भारी डाइमेथाइलेशन (+36.076 डीए, पेप्टाइड एन-टर्मिनस), कार्बामिनोमेथाइल (+57.021 डीए, डीए, सी), गतिशील संशोधन: ऑक्सीकरण (+15.995 डीए, एम), 11-प्लेक्स आइसोकरिक टैग (229.163 डीए, के), 1% एफडीआर, रिपोर्टर आयन क्वांटिफिकेशन 30 पीपीएम पीक इंटीग्रेशन सहिष्णुता के साथ, एकीकरण विधि के लिए सबसे अधिक आत्मविश्वासी सेंट्रोइड।
    नोट: भारी डाइमेथाइलेटेड चोटी में एक और संशोधन भी शामिल है जो प्रकाश डाइमेथाइलेटेड चोटी से ~ 7 डीए (+35.069 डीए, पेप्टाइड एन-टर्मिनस) है और इसलिए इस संशोधन को भी शामिल करने के लिए एक और खोज नोड शामिल किया जाना चाहिए।
  4. तीव्रता के आधार पर रिपोर्टर आयन क्वांटिफिकेशन, 65% एसपीएस मास मैच, एवरेज एस/एन रेशियो 10, आइसोटोपिक करेक्शन, नॉर्मलाइजेशन और स्केलिंग का प्रदर्शन नहीं किया गया।
    नोट: सामान्यीकरण और स्केलिंग कुल पेप्टाइड राशि या नमूने में जोड़े गए एक विशिष्ट प्रोटीन के आधार पर किया जा सकता है। क्यूसी नमूनों को दो पूंछ वाले आंतरिक संदर्भ स्केलिंग18के आधार पर अंतर-बैच या इंट्रा-बैच सामान्यीकरण के लिए चैनलों में भी शामिल किया जा सकता है। विभिन्न टीएमटी चैनलों के आइसोटोपिक संदूषण खोज के लिए प्रदान नहीं किए गए थे, उपयोगकर्ताओं को विभिन्न रिपोर्टर आयनों के आइसोटोप संदूषण को जोड़ने की सलाह दी जाती है।

Representative Results

चित्रा 2 एक 22-plex cPILOT प्रयोग से सभी 22 रिपोर्टर आयन चैनलों में पहचाने गए पेप्टाइड के प्रतिनिधि एमएस डेटा दिखाता है, जिसमें वर्कफ्लो प्रतिकृति शामिल है । चित्रा 2 (शीर्ष) एक दोगुना चार्ज पीक जोड़ी 4 डीए एम/जेड अंतर से अलग एक भी डिमेथाइल पेप्टाइड में शामिल एक डिमेथाइल समूह का संकेत दर्शाया गया है । पेप्टाइड के अनुक्रम को उत्पीड करने के लिए हल्के और भारी डाइमेथाइलेटेड चोटी के जोड़े को अलग-थलग और स्वतंत्र रूप से खंडित किया गया था। पेप्टाइड का अनुक्रम जी (डाइमिथाइल) AAELMQQQK (टीएमटी-11प्लेक्स) है और प्रोटीन बीटाइन-होमोसिस्टीन एस-मिथाइल ट्रांसफरेज से मेल खाती है। दोनों प्रकाश और भारी मंदक चोटियों के लिए सबसे तीव्र टुकड़ा आयनों(नहीं दिखाया)आगे एमएस3 विखंडन के लिए अलग थे और रिपोर्टर आयनों(m/z 126-131) चित्रा 2 (नीचे) में दिखाया गया है । रिपोर्टर आयन तीव्रता सीधे नमूने में पेप्टाइड बहुतायत के अनुपात में हैं। नमूनों की पेप्टाइड बहुतायत का तात्पर्य है कि रोबोटिक प्लेटफॉर्म की पाइपिंग क्षमता 22 नमूनों में काफी समान है। कुल मिलाकर, इस 22-plex cPILOT प्रयोग १३२६ (१२०९-प्रकाश/1181-भारी) प्रोटीन ३०९८ (६१३७-प्रकाश/5872-भारी) पेप्टाइड्स(तालिका 4)के परिणामस्वरूप पहचान में हुई । चित्रा 3 सभी 22 चैनलों में Log10 बहुतायत बनाम कुल रिपोर्टर आयन तीव्रता के बॉक्स प्लॉट से पता चलता है कम अंतर अच्छी तरह से/ कुल स्वचालन का मूल्यांकन 22 नमूनों में प्रत्येक प्रोटीन में रिपोर्टर आयन बहुतायत में त्रुटि की जांच करके किया गया था । चित्रा 4 से पता चलता है कि रोबोट मंच के साथ नमूना प्रसंस्करण के परिणामस्वरूप बहुत कम सीवी मूल्य थे। विशेष रूप से, 3098 पेप्टाइड्स में रिपोर्टर आयन बहुतायत में औसत सीवी की पहचान क्रमशः प्रकाश और भारी डाइमेथाइलेटेड पेप्टाइड्स के लिए 12.36% और 15.03% थी। इन पेप्टाइड्स 2032 में से पेप्टाइड्स में न्यूनतम सीमा से ऊपर रिपोर्टर आयन सिग्नल था और उन्हें मात्रात्मक समझा गया था।

Figure 1
चित्रा 1. एक स्वचालित cPILOT प्रोटोकॉल के साथ समानांतर में 22 नमूनों को संसाधित करने के लिए प्रायोगिक कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। 22 नमूनों में पेप्टाइड्स का मात्राकरण। उदाहरण एमएस (ऊपर) और एमएस3 (नीचे) पेप्टाइड जी (डाइमेथिल) AAELMQQK (TMT-11plex) के स्पेक्ट्रा 22-प्लेक्स स्वचालित cPILOT प्रयोग में प्रकाश डाइमेथाइलेटेड (नीचे बाएं) और भारी डाइमेथाइलेटेड (नीचे दाएं) चोटियों के लिए मात्रा निर्धारित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। प्रोटेम डिस्कवरर 2.3 का उपयोग कर 22 नमूनों की log10 बहुतायत बनाम कुल रिपोर्टर आयन तीव्रता के बॉक्स प्लॉट। रॉ फ़ाइल को दो बार प्रकाश और भारी पेप्टाइड्स, प्रोटीन आईडी के साथ अलग से टीएमटी के साथ गतिशील संशोधन, प्रकाश (+28.031 डीए) और भारी (+36.076 और +35.069 डीए) के रूप में टाइप्टाइड एन-टर्मिनी में स्थिर संशोधन के रूप में खोजा गया था। उपरोक्त सभी संशोधनों के साथ एक संयुक्त खोज प्रोटेम डिस्कवर 2.3 का उपयोग करके सभी चैनलों में पेप्टाइड तीव्रता के लॉग 10 बहुतायत प्राप्त करने के लिए चलाई गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4. चैनलों में अभिव्यक्त रिपोर्टर आयन तीव्रता से पेप्टाइड बहुतायत की भिन्नता के सह कुशल के वायलिन भूखंड 126-131 मीटर/z पेप्टाइड को प्रकाश (2373) और भारी (2533) मात्रात्मक पेप्टाइड्स के लिए 12.36 और 15.03 के औसत सीवी मूल्य के साथ निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1. एक पेप्टाइड के साथ cPILOT का चित्रण। टीएमटी126के साथ दो अलग-अलग नमूनों और आइसोकरिक टैगिंग की आइसोटोपिक लेबलिंग को दिखाते हुए, परिणामस्वरूप मिश्रण को एलसी-एमएस3के लिए एमएस को इंजेक्ट किया गया था। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वेरिएबल नाम मान या क़िस्‍म
DesaltSamp1 1065 वॉल्यूम का उपयोग डीसाल्ट चरण 1 के लिए किया जाएगा
DesaltSamp2 392 वॉल्यूम का उपयोग डीसाल्ट चरण 2 के लिए किया जाएगा
DesaltSamp3 100 वॉल्यूम का उपयोग डीसाल्ट चरण 3 के लिए किया जाएगा
देवमोड गलत झूठी कटौती करेगा नीचे इनक्यूबेशन बार 30sec करने के लिए-सच प्रोटोकॉल में इनक्यूबेशन समय का पालन करेंगे ।
डीटीटीवोल 3 डीटीटी की मात्रा
फ़िल्टरप्लेट तरगा डिसल्टिंग के लिए उपयोग की जाने वाला प्लेट
फ़िल्टरप्लेटवॉल 600 डीसल्टिंग के लिए वॉल्यूम
हैवाटरवॉश्स गलत एसपीई प्लेट पर पानी की धोती की संख्या
आईअम्वोल 2 इओडोएस्टाटामाइड की मात्रा
पेप्टिडेटएमटीक्वोल 12.5 टीएमटी लेबलिंग के लिए पेप्टाइड की मात्रा
परेशानी 100 पीपीए पर एमबार दबाव
टेम्पऑफसेट 1 तापमान में बदलाव
टीएमटीवोल 10 आइसोकरिक टैग वॉल्यूम जोड़ा जाएगा
ट्रिसवॉल 800 पाचन से पहले नमूने को पतला करने के लिए मात्रा
ट्रिप्सिनवॉल 2 ट्राइपसिन की मात्रा
इस्तेमाल करें पॉपटाइमर सच यह सच है कि यदि आवश्यक हो तो प्लेट पर दबाव लागू करने के विकल्प प्रदर्शित करता है

तालिका 1. स्वचालित cPILOT प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले चरों की सूची।

दिलसोर्स दिलवेल लक्ष्य डेस्टवेल दिलवाले स्टॉकसोर्स स्टॉकवेल सैंपलवोल नमूनाआईडी
8M_Urea 1 नमूने A1 90 Stock_Samples A1 10 1
8M_Urea 1 नमूने A2 90 Stock_Samples A1 10 2
8M_Urea 1 नमूने A3 90 Stock_Samples A1 10 3
8M_Urea 1 नमूने A4 90 Stock_Samples A1 10 4
8M_Urea 1 नमूने A5 90 Stock_Samples A1 10 5
8M_Urea 1 नमूने A6 90 Stock_Samples A1 10 6
8M_Urea 1 नमूने A7 90 Stock_Samples A1 10 7
8M_Urea 1 नमूने A8 90 Stock_Samples A1 10 8
8M_Urea 1 नमूने A9 90 Stock_Samples A1 10 9
8M_Urea 1 नमूने A10 90 Stock_Samples A1 10 10
8M_Urea 1 नमूने A11 90 Stock_Samples A1 10 11
8M_Urea 1 नमूने A12 90 Stock_Samples A1 10 12
8M_Urea 1 नमूने B1 90 Stock_Samples A1 10 13
8M_Urea 1 नमूने B2 90 Stock_Samples A1 10 14
8M_Urea 1 नमूने B3 90 Stock_Samples A1 10 15
8M_Urea 1 नमूने B4 90 Stock_Samples A1 10 16
8M_Urea 1 नमूने B5 90 Stock_Samples A1 10 17
8M_Urea 1 नमूने B6 90 Stock_Samples A1 10 18
8M_Urea 1 नमूने B7 90 Stock_Samples A1 10 19
8M_Urea 1 नमूने B8 90 Stock_Samples A1 10 20
8M_Urea 1 नमूने B9 90 Stock_Samples A1 10 21
8M_Urea 1 नमूने B10 90 Stock_Samples A1 10 22
8M_Urea 1 नमूने B11 90 Stock_Samples A1 10 23
8M_Urea 1 नमूने B12 90 Stock_Samples A1 10 24

तालिका 2. माउस लिवर समरूप और 8 मीटर यूरिया की मात्रा।

सोर्सवेल SourceWell2 रिपोर्टर आयन डेस्टवेल1 DestWell2 आयतन नमूनाआईडी
A1 C1 126 A1 E1 10 1
A3 C3 127N A2 E2 10 2
A5 C5 127C A3 E3 10 3
A7 C7 128N A4 E4 10 4
A9 C9 128C A5 E5 10 5
A11 C11 129N A6 E6 10 6
B2 D2 129C A7 E7 10 7
B4 D4 130N A8 ई 8 10 8
B6 D6 130C A9 E9 10 9
B8 डी8 131N A10 E10 10 10
B10 D10 131C A11 E11 10 11

तालिका 3. पेप्टाइड्स, प्रोटीन और पेप्टाइड स्पेक्ट्रल मैचों (पीएसएम) की कुल संख्या।

स्वचालित cPILOT
प्रकाश भारी
प्रोटीन 1209 1181
पेप्टाइड्स 6137 5872
पीएसएम 14948 16762

तालिका 4. प्रकाश और भारी लेबल नमूनों के साथ आइसोकरिक टैग बार्कोडिंग।

Discussion

cPILOT एक बढ़ी हुई मल्टीप्लेक्सिंग रणनीति है जो एक ही प्रयोग में 24 नमूनों का विश्लेषण कर सकती है। मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता उपलब्ध आइसोटोपिक और आइसोबाइक टैगिंग संयोजनों की संख्या पर निर्भर करती है। टीएमटीपीआरओ7का परिचय, जो एकल प्रयोग में 16 नमूनों को टैग करने में सक्षम है, cPILOT की सीमा को 32-प्लेक्स तक धकेल सकता है। cPILOT में कई पाइपिंग चरण होते हैं और नमूना तैयारी करने के लिए व्यापक देखभाल और उपयोगकर्ता कौशल की आवश्यकता होती है। यहां तक कि एक विशेषज्ञ उपयोगकर्ता के साथ, मैनुअल त्रुटियां अपरिहार्य हैं, जो cPILOT रणनीति में नमूनों को संसाधित करने के लिए रोबोट प्लेटफार्मों के उपयोग को आमंत्रित करती हैं। चूंकि सीपीआईएलटी पेप्टाइड्स की पीएच निर्भर टैगिंग का उपयोग करता है, इसलिए पीएच को प्रकाश और नमूनों के भारी डाइमेथाइलेटेड सेट के लिए बनाए रखने की आवश्यकता होती है। हल्का अम्लीय-बुनियादी पीएच दोनों एन-टर्मिनी और lysine अवशेषों के डाइमेथिलेशन में परिणाम कर सकते हैं । CPILOT का एक लाभ यह है कि इसके लिए केवल आधे आइसोआरिक टैग की आवश्यकता होती है क्योंकि पेप्टाइड एन-टर्मिनी डिमेथिल समूहों के साथ कब्जा कर लिया जाता है। यह आधी लागत पर लेबल किए जाने वाले नमूनों की एक बड़ी संख्या प्रदान करता है । बड़े नमूना संख्या को संभालने के लिए आवश्यक है कि अभिकर् ता जोखिम समय एक बैच में पहले और अंतिम नमूने के लिए समान हैं। एक पिपेट डिस्पेंसर जो समानांतर में 32 नमूनों को समायोजित कर सकता है, रोबोट तरल हैंडलिंग उपकरणों के उपयोग के साथ सबसे अच्छा प्राप्त किया जा सकता है।

CPILOT द्वारा कई नमूनों को संसाधित करने के लिए, स्वचालन को शामिल करने के लिए मैनुअल वर्कफ्लो में संशोधन किया गया था। इस अध्ययन में इस्तेमाल किया रोबोट तरल हैंडलर ९६ चैनल और 8 चैनल pipetting क्षमताओं के साथ दो फली है, एक तवे के साथ उपलब्ध 28 डेक स्थानों में प्लेटों जगह है । तरल हैंडलर एक सकारात्मक दबाव उपकरण, कक्षीय शेखर, और ९६ अच्छी तरह से थाली में गर्मी/शांत नमूनों के लिए एक उपकरण के साथ एकीकृत है । सकारात्मक दबाव तंत्र सफाई के दौरान एसपीई प्लेटों में बफर एक्सचेंजों को करने में मदद करता है, जबकि कक्षीय शेखर नमूनों को भंवर/मिश्रण करने में मदद करता है । रोबोटिक प्लेटफॉर्म को ९६-अच्छी प्लेटों, इनक्यूबेट, भंवर के नमूनों और ट्रांसफर प्लेटों के लिए बफ़र्स और नमूनों को एस्पिरेट और बांटने के लिए प्रोग्राम किया गया था । विभिन्न चिपचिपाहट वाले तरल पदार्थ, जैसे एसीटोनीट्रिल और पानी, विशिष्ट पाइपिंग विचारों की आवश्यकता होती है जिन्हें विधि में प्रोग्राम भी किया जा सकता है।

पीसीपायलट वर्कफ्लो, बीसीए द्वारा प्रोटीन क्वांटिफिकेशन से शुरू होकर आइसोकर्क टैग (यानी टीएमटी) के साथ पेप्टाइड्स को लेबल करने के लिए लिक्विड हैंडलर सिस्टम पर किया गया था । पूर्ण प्रोटोकॉल को 96 गहरी अच्छी प्लेटों का उपयोग करने के लिए बढ़ाया गया था जो प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल पकड़ सकते हैं। बफर को प्रयोग की शुरुआत से पहले तैयार किया गया था और 96 अच्छी प्लेट में जोड़ा गया था ताकि समानांतर नमूना प्रसंस्करण की अनुमति दी जा सके। वर्तमान अध्ययन में, माउस लिवर समरूप के 22 कार्यप्रवाह प्रतिकृति गहरी अच्छी तरह से प्लेटों में जोड़े गए और सीपीएएलटी प्रोटोकॉल के माध्यम से लिया गया। अंत में, 22-प्लेक्स इक्विमोलर माउस लिवर टैग पेप्टाइड्स से मिलकर एक नमूना मास स्पेक्ट्रोमीटर को इंजेक्ट किया गया था। नमूनों में पेप्टाइड बहुतायत के अनुरूप रिपोर्टर आयन तीव्रता से पता चला है कि तरल हैंडलर के साथ संसाधित नमूनों में मैनुअल प्रोटोकॉल(डेटा नहीं दिखाए गए)की तुलना में कम सीवी होते हैं। रोबोटिक प्लेटफॉर्म ने नमूना प्रसंस्करण की प्रजनन क्षमता में भी काफी सुधार किया। बड़ी संख्या में नमूनों को संसाधित करते समय प्रजनन क्षमता और मजबूती बहुत महत्वपूर्ण कारक हैं। पाइपिंग त्रुटियों से डेटा की गलत व्याख्या पूरी हो सकती है और यहां रोबोटिक प्लेटफॉर्म ने कम अंतर-नमूना भिन्नता प्रदान की है। इसके अलावा cPILOT के लिए रोबोट मंच का उपयोग नमूने तैयार करने के लिए आवश्यक समय कम । उदाहरण के लिए, स्वचालित विधि विकसित करने के बाद, मैनुअल cPILOT के लिए 7.5 घंटे की तुलना में 22 नमूनों को संसाधित करने के लिए 2.5 घंटे की आवश्यकता होती है। मैनुअल और स्वचालित cPILOT कार्यप्रवाह की तुलना का मूल्यांकन करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग चल रहे हैं। हमारी प्रयोगशाला से पिछली रिपोर्टों के आधार पर, मैनुअल cPILOT में प्रोटीन रिपोर्टर आयन तीव्रता के सीवी% इस मूल्य 12 से अधिक कुछ outliers के साथऔसतन 20%थे ।

cPILOT पेप्टाइड स्तर पर एक रासायनिक व्युत्पन्न रणनीति है, जिसका उपयोग कोशिकाओं, ऊतकों और शरीर के तरल पदार्थ जैसे किसी भी नमूना प्रकार के लिए किया जा सकता है। CPILOT बढ़ाया नमूना मल्टीप्लेक्सिंग प्रदान करता है और स्वचालन के समावेश के साथ प्रोटेओमिक्स में उच्च थ्रूपुट नमूना मल्टीप्लेक्सिंग की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। यह थ्रूपुट रोग और जैविक समझ और बायोमार्कर खोज को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक वैंडरबिल्ट विश्वविद्यालय स्टार्ट-अप फंड और एनआईएच पुरस्कार (R01GM117191) को आरएएसआर को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-120 Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units EMD Millipore UFC30DV00
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-129 Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
2 ml black deep well plate Analytical Sales and Services, Inc. 59623-23BKGC Any brand of black 96-well plate is sufficient
2 ml clear deep well plate VWR 75870-796
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01
Acetonitrile - MS Grade Fisher Scientific A955-4 4 L quantity is not necessary
Agilent 500µL plate Agilent 203942-100 Reagent plate for adding buffers
Ammonium formate Acros Organics 208-753-9
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) Sigma Aldrich 320145-500ML
Analytical balance Mettler Toledo AL54
BCA protein assay kit Pierce Thermo Fisher Scientific 23227
Biomek i7 hybrid Beckmann Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) Bruker This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
Centrifuge with plate rotor Thermo Scientific 69720
Micro 21R Centrifuge Sorval 5437
Dionex 3000 UHPLC Thermo Scientific This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
Dithiothreiotol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C Sigma Aldrich, Chemistry 596388-1G
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O Sigma Aldrich, Life Science F8775-25ML
Formic Acid Fluka Analytical 94318-250ML-F
Fusion Lumos Mass Spectrometer Thermo Scientific This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Hydroxylamine hydrochloride Sigma Aldrich, Chemistry 255580-100G
Iodoacetamide (IAM) Acros Organics 144-48-9
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) Thermo Fisher Scientific 90061
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich, Life Science T1426-100MG
L-Cysteine Sigma Aldrich, Chemistry 168149-25G
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) MP Biomedicals 116005500
pH 10 buffer Fisher Scientific 06-664-261 Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer Fisher Scientific 06-664-260 Any brand pH buffer 7 is sufficient
pH meter (Tris compatiable) Fisher Scientific (Accumet) 13-620-183 Any brand of a pH meter is sufficient
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) Thermo Scientific
Reservior plate 200ml Agilent 204017-100
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP Sigma Aldrich, Chemistry 190020-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% Sigma Aldrich 156159-10G
Speed-vac Thermo Scientific SPD1010 any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient
Stir plate VWR 12365-382 Any brand of stir plates are sufficient
Targa 20 mg SPE plates Nest Group, Inc. HNS S18V These are C18 cartridges
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer Sigma Aldrich, Life Science T7408-100ML
Tris Biorad 161-0716
Biomek 24-Place Tube Rack Holder Beckmann 373661
Urea Biorad 161-0731
Water - MS Grade Fisher Scientific W6-4 4 L quantity is not necessary

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References

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केमिस्ट्री अंक 166 हाई-थ्रूपुट प्रोटेओमिक्स डिमेथाइलेशन सीपीआईएलओ रोबोटिक लिक्विड हैंडलर ऑटोमेशन आइसोकरिक टैग
संयुक्त अग्रदूत आइसोटोपिक लेबलिंग और आइसोबाइक टैगिंग (cPILOT) का उपयोग करके स्वचालित नमूना मल्टीप्लेक्सिंग
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Arul, A. B., Robinson, R. A. S.More

Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (166), e61342, doi:10.3791/61342 (2020).

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