Här presenterar vi ett protokoll för in vitro-isolering av flera gliacellspopulationer från ett mus-CNS. Denna metod möjliggör segregering av regionala mikroglia, oligodendrocytprekursorceller och astrocyter för att studera fenotyperna hos var och en i en mängd olika odlingssystem.
De metoder som presenteras här demonstrerar laboratorieprocedurer för dissektion av fyra olika regioner i centrala nervsystemet (CNS) från murina nyfödda för isolering av gliala subpopulationer. Syftet med förfarandet är att dissociera mikroglia, oligodendrocytstamceller (OPC) och astrocyter från kortikal, cerebellär, hjärnstam och ryggmärgsvävnad för att underlätta ytterligare in vitro-analys. CNS-regionens isoleringsförfaranden möjliggör bestämning av regional heterogenitet bland glia i flera cellodlingssystem. Snabb CNS-regionisolering utförs, följt av mekaniskt avlägsnande av meninges för att förhindra meningealcellkontaminering av glia. Detta protokoll kombinerar mild vävnadsdissociation och plätering på en specificerad matris utformad för att bevara cellintegritet och vidhäftning. Att isolera blandad glia från flera CNS-regioner ger en omfattande analys av potentiellt heterogen glia samtidigt som användningen av enskilda försöksdjur maximeras. Dessutom, efter dissociation av regional vävnad, delas blandad glia vidare in i flera celltyper inklusive mikroglia, OPC och astrocyter för användning i antingen encellstyp, cellodlingsplattinsatser eller samodlingssystem. Sammantaget ger de demonstrerade teknikerna ett omfattande protokoll med bred tillämplighet för noggrann dissektion av fyra enskilda CNS-regioner från murina nyfödda och inkluderar metoder för isolering av tre individuella gliacelltyper för att undersöka regional heterogenitet i valfritt antal in vitro-cellodlingssystem eller analyser.
Glia är nödvändiga för korrekt neuronal funktion i CNS. De består av tre stora delpopulationer, astrocyter, oligodendrocyter och mikroglia, var och en med en annan, men ändå oumbärlig roll1. Utan rätt glialcellsdiversitet och aktivitet skulle neuronal funktion påverkas allvarligt, vilket leder till CNS-försämring. Glia kan påverka neurotransmission, och varje celltyp gör det på ett unikt sätt. Gliaceller i hjärnan har kapacitet att kommunicera med varandra, liksom med neuronala celler, för att underlätta korrekt CNS-funktion2. Oligodendrocyter ökar hastigheten på elektrisk överföring genom bildandet av en myelinmantel, vilket underlättar klustringen av jonkanaler vid noderna i Ranvier, platserna för neuronal åtgärdspotential generation3. Microglia är avgörande för beskärning av synapser genom att övervaka synaptisk överföring och “omkoppla” neuronala anslutningar efter skada4. Dessutom är microglia den vanligaste bosatta immuncellen i CNS, som fungerar som den primära formen av värdförsvar mot patogener5. Astrocyter kan reglera synaptisk överföring mellan neuroner genom att modifiera koncentrationen av extracellulärt kalium6. De har också roller i att kontrollera lokalt blodflöde7, frigöra och ta upp neuromodulerande element8, och har en nyckelroll i underhåll av blod-hjärnbarriären9. Således är varje glial subtyp kritisk för CNS-funktion, eftersom defekter av vilken typ som helst länge har associerats med en mängd olika patologiska tillstånd, inklusive psykiatriska sjukdomar, epilepsi och neurodegenerativa tillstånd10.
Det största hindret i studien av CNS-patobiologi är oförmågan att undersöka mänskliga celler i samband med deras mikromiljönisch. Mänsklig biopsivävnad är mest samlad post-mortem och celler kan lätt skadas eller förloras under extraktion och bearbetning. Dessutom är det en utmaning att hålla mänskliga celler levande och livskraftiga in vitro under någon längre tid utan att härleda odödliga cellinjer från tumörer, vid vilken tidpunkt de inte längre exakt återspeglar deras normala fysiologiska egenskaper11,12. Dessutom finns det en betydande mängd regional heterogenitet bland enskilda gliacelltyper13,14,15, och att få regionala CNS-prover från enskilda patienter är nästan omöjligt. Som sådan är det nödvändigt att utveckla alternativa modeller för att studera bidraget från regional glia i specifika CNS-störningar.
Här beskriver vi ett in vitro-system med hjälp av mus CNS-regionspecifik isolering av flera gliala subpopulationer, vilket möjliggör manipulation och kvantifiering av mikroglia, oligodendrocytprekursorceller (OPC), som ger upphov till mogna oligodendrocyter och astrocyter. Varje population kan isoleras oberoende och utsättas för en mängd olika experimentella tekniker inklusive läkemedels- eller molekylbehandling, immunocytokemi, protein / RNA-extraktion och analys och andra samodlingssystem beroende på experimentell nödvändighet. Dessutom ger denna isoleringsteknik högt cellantal, vilket möjliggör karakterisering och undersökning av varje glialpopulation på ett sätt med hög genomströmning. Det möjliggör också studier av CNS-celldifferentiering, tillväxt och proliferation som svar på en mängd olika mikromiljöstimuli på ett kontrollerat sätt för att undvika förvirrande faktorer som vanligtvis finns i en in vivo-miljö. Slutligen underlättar denna cellisoleringsteknik manipuleringen av gliacellspopulationer inom olika CNS-regioner för att undersöka hur regional glia interagerar med varandra och svarar på varierande stimuli, vilket möjliggör precision och reproducerbarhet.
I detta protokoll beskriver vi isoleringen av de tre stora glialcellsunderpopulationerna från musens CNS: microglia, OPC och astrocyter. Ett stort bakslag för undersökningen av neurodegenerativa och neuroinflammatoriska CNS-sjukdomar är bristen på primära mänskliga celler och vävnader, särskilt de som är regionala och från samma patient. I de flesta fall härrör mänskliga CNS-cellinjer från transformerade, odödliga cancerceller som kanske inte är korrekta representationer av deras normala fysiologiska beteende20,21,22. Således är alternativa metoder nödvändiga för att studera CNS-cellfenotyper på ett kontrollerat sätt. Dessutom gör mångfalden av neurologiska gliacellspopulationer det nödvändigt att undersöka varje subtyp både oberoende av varandra, såväl som i samodlingsförhållanden för att rekapitulera både deras cellautonoma och icke-autonoma funktioner. Gliaceller har en mängd olika kritiska funktioner i CNS, allt från neuronalt stöd23, inlärning / kognition 24,25 och CNS immunologiska svar26. Som sådan är det nödvändigt att förstå de molekylära och cellulära funktionerna hos varje glial delpopulation i ett fysiologiskt och patologiskt sammanhang. För att göra det tillhandahåller vi här en pålitlig metod för extraktion och isolering av livskraftiga glia-subtyper. På grund av praktiska och etiska begränsningar i försökspersonernas forskning är djurmodeller för närvarande de mest relevanta surrogaten för mänsklig gliacellsbiologi. I synnerhet är möss idealiska modelldjur eftersom deras genom kan manipuleras och analyseras för att ytterligare dissekera särskilda molekylära mekanismer som ligger till grund för hälsa och sjukdom. Därför är framgångsrikt avlägsnande och separation av murina mikroglia, OPC och astrocyter ett viktigt verktyg för att undersöka gliafunktionerna under fysiologiska, neurodegenerativa eller neuroinflammatoriska tillstånd.
Detta protokoll kan optimeras för att utforska CNS-cellens regionala heterogenitet. Det blir allt tydligare att glia uppvisar regional heterogenitet i form och funktion. Astrocyter är regionalt olika och visar distinkt morfologi beroende på deras plats inom CNS27. Dessutom kan tätheten av astrocyter och deras mitotiska index definiera anatomiska regioner, vilket stöder hypotesen att regional astrocytheterogenitet kan återspegla molekylära och funktionella skillnader baserat på deras placering inom CNS28. Mikroglial regional heterogenitet är också under aktiv undersökning, även om de underliggande mekanismerna och funktionella konsekvenserna av mikrogliadiversitet i CNS-utveckling eller beteende för närvarande är oklara. Det är dock känt att vuxna mikroglia visar mångfald i cellantal, cell- och subcellulära strukturer och molekylära signaturer29. Dessutom har de senaste framstegen inom multiplexerad masscytometri ytterligare definierat den regionala heterogeniteten hos microglia, analyserat cellulär fenotyp från fem olika CNS-regioner hos nio mänskliga givare, vilket möjliggör storskalig immunofenotypning av human microglia30. För närvarande är sådana tillvägagångssätt i sina begynnande stadier, vilket gör djurstudier till en livskraftig lösning för studier av regional glia i CNS-sjukdomsutveckling. Slutligen har regional heterogenitet också nyligen beskrivits i oligodendrocyter. Encells RNA-sekvensering på 5072 enskilda celler från 10 regioner av juvenil och vuxen CNS identifierade 13 distinkta delpopulationer över olika stadier av differentiering31. Viktigt var också att det visade sig att när oligodendrocyter mognade från OPCs divergerade deras transkriptionsprofiler och deras funktionella fenotyper förändrades, vilket belyser oligodendrocyt heterogenitet inom CNS31.
Att förstå regional heterogenitet hos de olika bosatta CNS-cellerna i samband med deras olika närliggande neuroner och andra glia kan således ge viktig motivering för den framtida utvecklingen av nya terapier för att behandla neuroinflammatoriska och neurodegenerativa störningar. Medan detta protokoll fokuserar på extraktion, isolering och identifiering av gliala delpopulationer, ger det en bekväm utgångspunkt för undersökningen av deras funktion. Dessutom kan den anpassas och kombineras med transgena musmodeller för att studera genetiska mekanismer associerade med gliacellsbiologi. Det kan också användas för att undersöka glialcellernas svar på varandra i samodlingsanalyser. De skisserade stegen representerar en kostnadseffektiv och genomströmningsmetod för att extrahera och isolera olika CNS-glialpopulationer som sedan kan anpassas till en mängd olika experimentella parametrar. Det bör noteras; Men att metoden som beskrivs här använder nyfödda på grund av de lägre nivåerna av myelinering och hög densitet av prolifererande glia. Av dessa skäl är det tekniskt mer genomförbart att isolera livskraftig glia från nyfödda jämfört med vuxna djur. De fenotypiska skillnaderna i neonatal glia jämfört med vuxen glia bör därför beaktas vid experimentell design och datatolkning.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Morgan Psenicka för manuskriptredigering och diskussion och Dr. Grahame Kidd för hjälp med figurformatering. Detta arbete stöddes av NIAID K22 AI125466 (JLW).
0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |