Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة لهضم العينين بالكامل في تعليق خلية واحدة لغرض تحليل cytometric تدفق متعدد المعلمة من أجل تحديد مجموعات ب والدمغة أحادية النواة العينية المحددة، بما في ذلك أحادية الخلايا، microglia، الضامة، والخلايا المتجّنة.
Abstract
يلعب الجهاز المناعي الفطري أدوارًا مهمة في الفيزيولوجيا المرضية العينية بما في ذلك التهاب القزحي واعتلال الشبكية السكري والتنكس البقعي المرتبط بالعمر. الخلايا المناعية الفطرية، على وجه التحديد البلعات أحادية النوى، تعبر عن علامات سطح الخلايا المتداخلة، مما يجعل تحديد هذه التجمعات السكانية تحدياً. متعدد المعلمة تدفق cytometry يسمح للتحليل المتزامن، الكمي لعلامات سطح الخلية متعددة من أجل التفريق أحادية، الضامة، microglia، والخلايا التشعب في عيون الماوس. يصف هذا البروتوكول enucleation عيون الماوس كله، تشريح العين، والهضم في تعليق خلية واحدة، وتلطيخ تعليق خلية واحدة لعلامات الخلية النخاعية. بالإضافة إلى ذلك، نحن شرح الطرق المناسبة لتحديد الفولتية باستخدام ضوابط لون واحد ولضبط البوابات الإيجابية باستخدام الفلوريسنس ناقص ضوابط واحدة. القيد الرئيسي للتدفق متعدد المعلمة هو عدم وجود بنية الأنسجة. ويمكن التغلب على هذا القيد من خلال متعدد المعلمة تدفق قياس الخلايا من مقصورات العين الفردية أو لطخة المناعة المجانية. ومع ذلك، فإن الفلوروس المناعي محدود بسبب افتقاره إلى التحليل الكمي والعدد المخفض من الفلوروفورات على معظم المجاهر. نحن نصف استخدام المناظير الخلوية التدفق متعدد الحساسية لتوفير تحليل كمي للغاية من البلعات أحادية النوى في neovascularization المشيمية التي يسببها الليزر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام قياس تدفق متعدد المعلمة لتحديد مجموعات فرعية للغة الضامة، ورسم خرائط للمصير، وفرز الخلايا للدراسات النسخية أو البروتيومية.
Introduction
يتضمن الجهاز المناعي الفطري أنواع خلايا متعددة تحفز التنشيط والالتهاب. وتشمل الخلايا المناعية الفطرية الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والخلايا الصاري ، والبصلات ، واليوزنوفيليات ، والعدلات ، والبلعات أحادية النوى. وقد تورطت في الفعات أحادية النوى، والتي تتكون من أحادية الخلايا، الضامة، والخلايا التشعبية، في الفيزيولوجيا المرضية من حالات العيون متعددة بما في ذلك التهاب القزحية، اعتلال الشبكية السكري، والضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)1. في هذا البروتوكول، وسوف نركز على تحديد البلعات أحادية النواة باستخدام تحليل cytometric تدفق متعددة المعلمة في نموذج الماوس من أيه أمد neovascular2. هذا البروتوكول قابل للتكيف مع نماذج الماوس من اعتلال الشبكية السكري و / أو التهاب القزحية ، ولكن من المستحسن تشريح العين أكثر شمولا بسبب الطبيعة الجهازية لهذه الأمراض.
تعبر البالعات أحادية النوى عن علامات سطح الخلية المتداخلة. خلايا الضامة المقيمة الأنسجة طويلة الأمد وmicroglia تنشأ من صفار ساك المستمدة من السلف 3 erythromyeloid3، في حين إعادة تدوير الضامة والخلايا التشعبة التمييز من النخاع العظمي التكخير الخلايا التكهنة4. علامات سطح الخلية الماوس المشتركة monocytes، الضامة، وخلايا التشعب تشمل CD45، CD11b5،F4/806،Cx3cr17،وعلامة Iba18داخل الخلية. من أجل التغلب على هذا التحدي ، تحليل النسخ من الضامة ، monocytes ، والخلايا التشعب من أنسجة متعددة يعرف CD64 باعتبارها علامة سطح الخلية الضامة الخاصة6. وقد وصفت الضامة في القزحية، المشيمية، الجسم الهدّاج، والعصب البصري في عيون صحية3. وبدلاً من ذلك، فإن تحديد هوية الخلية التشعبية أكثر صعوبة؛ الأسلوب الأكثر تحديدا لتحديد الخلية dendritic يتطلب رسم خرائط مصير باستخدام Zbtb46-GFP مراسل الماوس9. مستقلة عن هذا الخط مراسل، والتعبير عن CD11c وMHCII بالتزامن مع عدم وجود CD64 يمكن تحديد الخلايا التشجر المحتملة6،10. وقد تم تحديد الخلايا التشعبية في القرنية، الملتحمة، القزحية، والمشيمية في عيون طبيعية11. Microglia هي الضامة المتخصصة الموجودة في شبكية العين، محمية من قبل حاجز الدم الشبكية، ومستمدة من صفار كيس الخلايا السلف12. ونتيجة لذلك، يمكن تمييز ميكروجليا الشبكية من الضامة المشتقة من أحادية الخلايا من خلال مستوياتها الخافتة من التعبير CD4513 ومستويات عالية من Tmem119، والذي يتوفر كآلية مضادة مضادة للتدفق14. على microglia التنشيط ، ومع ذلك ، يمكن أن يكون CD45 حتى المنظمة15 و Tmem119 قد تكون أسفل المنظمة3، مما يدل على تعقيد البيولوجيا microglia وهذا من المرجح أن تكون ذات الصلة في كل من AMD ونموذج الماوس. وأخيراً، يمكن تقسيم أحاديات إلى نوعين فرعيين على الأقل، بما في ذلك الكلاسيكية وغير الكلاسيكية. الكلاسيكية monocytes عرض CCR2+Ly6CعاليةCX3CR1 التعبيرالمنخفض، وغير الكلاسيكية monocytes شرح CCR2-Ly6CمنخفضةCX3CR1 علاماتعالية 5.
نظرا لضرورة التحليل الكمي للتعبير علامة، أي، مستويات عالية مقابل منخفضة / خافتة، multi-parameter تدفق قياس الخلايا هو الطريقة المثلى للتمييز بين monocytes، الضامة، microglia، والخلايا التشعب في العين والأنسجة الأخرى. وتشمل المزايا الإضافية تحديد مجموعات فرعية، والقدرة على استخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) لفرز مجموعات الخلايا لتحليل النسخ أو البروتيوم، ورسم خرائط المصير. العيب الرئيسي للتدفق متعدد المعلمة هو عدم وجود بنية الأنسجة. ويمكن التغلب على هذا عن طريق تشريح العيون في مختلف subcompartmentments العين: القرنية، الملتحمة، قزحية العين، العدسة، شبكية العين، ومجمع المشيمية Sclera. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تصوير المناعة الواعنية، ولكن محدود بعدد العلامات وعدم وجود كمية قوية.
وقد ربطت دراسات الرابطة واسعة الجينوم الجينات تكمل متعددة مع AMD16. تنشيط مكمل يؤدي إلى إنتاج الحساسية, تجنيد الكريات البيض, والتهاب الناتجة. في مستقبلات مكملة ناقص الفئران، إصابة الليزر يقلل من أحادية النوى الفيتويتي تجنيد وneovascularization المشيمية التي يسببها الليزر (CNV) منطقة17. وبالمثل، فإن C-C chemokine مستقبلات 2 (CCR2) ماوس بالضربة القاضية، والذي هو نقص في التوظيف أحادية إلى الأنسجة، ويوضح كلا من تجنيد البليغسيت أحادية النواة وأشعة الليزر التي يسببها CNV المنطقة18. هذه البيانات وصلة تكملة ومونية البلعومات مع CNV التجريبية وربما NEOVASCULAR AMD. دعما لهذا الارتباط، و dysregulated مستقبلات تكملة على monocytes الدم الطرفية في المرضى الذين يعانون من أيه ام دي neovascular19،20. وتبين هذه البيانات وجود ارتباط قوي بين AMD والبلعات أحادية النوى.
في هذه المخطوطة، سوف نستخدم نموذج CNV المستحث بالليزر التجريبي لتوصيف مجموعات البلعومات أحادية النوى في عين الماوس باستخدام عملية تدفق التدفقات متعددة المعالم. بالليزر التي يسببها CNV هو نموذج الماوس القياسية من أيه امد neovascular، والتي أظهرت فعالية العلاج الحالي الخط الأول NEOVASCULAR21. هذا البروتوكول سوف يصف enucleation من عيون الماوس، تشريح العين، والهضم في تعليق خلية واحدة، وتلطيخ الأجسام المضادة، وتحديد الفولتية الليزر باستخدام ضوابط لون واحد، واستراتيجية الغاء باستخدام الفلوريسنس ناقص واحد (FMO) الضوابط. للحصول على وصف مفصل لنموذج CNV الذي يسببه الليزر، يرجى الاطلاع على منشور سابق22. باستخدام هذا البروتوكول، سوف نحدد ميكروجليا، أحادية الخلايا، الخلايا التكجرية، والسّكان الضامة. وعلاوة على ذلك، سوف نستخدم MHCII و CD11c لمزيد من تحديد مجموعات فرعية الضامة داخل نموذج CNV الليزر التي يسببها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت على جميع الإجراءات من قبل جامعة نورث وسترن لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدامها. تم إيواء الفئران C57BL/6 في منشأة حاجز في مركز الطب المقارن في جامعة نورث وسترن (شيكاغو، إلينوي). تم إيواء جميع الحيوانات في دورة 12/12 ساعة خفيفة / داكنة مع حرية الوصول إلى الطعام والماء.
1. جمع الأنسجة العينية
- التضحية 10-12 أسبوعا C57BL/6J الفئران من أي من الجنسين باستخدام الإدارة المنظمة لثاني أكسيد الكربون حتى لا يستجيب الماوس ولم يعد استنشاق. إجراء خلع عنق الرحم أو غيرها من الطرق الثانوية المعتمدة لضمان القتل الرحيم.
ملاحظة: يمكن إجراء التسريب عبر القلب لإزالة الكريات البيض المتداولة التي ليست في أنسجة العين. في هذه التجربة، لا يقلل النزف الجهازي عدد ميكروجليا، أحادية الخلايا، الضامة، أو الخلايا المتجّنة التي تم اكتشافها في عيون كاملة غير المعالجة أو الليزرية. لذلك ، تقع غالبية أنواع الخلايا هذه في الأنسجة العيونية وهذه الخطوة اختيارية. - لثني العينين، ادفعي إلى الأسفل بالقرب من مقبس العين أثناء وضع زوج من ملقط منحنية بلطف تحت العين لأنها تقف خارج المقبس. قرصة ملقط مغلقة تحت العين دون الضغط على العين الفعلية. طرد العين من الملتحمة المحيطة (يرجى الاطلاع على النشر المسبق)23.
- سحب العين بشكل متَرَكَم حتى العصب البصري هو الاتصال الوحيد المتبقي لفصل العين. غالبًا ما يقطع العصب البصري مع التوتر ، ولكن يكون المقص الصغير ضروريًا أحيانًا لقطع العصب البصري. ضع العين في محلول ملحي مؤقت من هانك 1x (HBSS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم في أنبوب ميكروسنتريفوغ 1.7 مل.
2. هضم الأنسجة العينية
- تحضير العازلة الهضم التي تحتوي على 0.1 ملغ / مل إنزيم الهضم و 0.2 ملغ / مل DNase في HBSS الباردة. إعادة تشكيل 5 ملغ إنزيم الهضم في 2 مل من الماء المعقم في البداية. إعداد تخفيف أولي من 10 ملغ / مل DNase في HBSS. لكل 10 مل من العازلة الهضم (كافية ل3 حيوانات) مزيج 9.4 مل من HBSS الباردة مع 0.4 مل من الانزيم الهضم المعاد تشكيلها و 0.2 مل من DNase المخفف I.
ملاحظة: تم تحديد هذه التركيزات تجريبياً على تجارب متعددة لتوفير المستويات المثلى من تلطيخ الأجسام المضادة للخلايا المفردة، مع تقليل موت الخلايا. وقد حاول كولاجيناز D كبديل لهضم الانزيم مع انخفاض صلاحية الخلية وانخفاض CD45+ الخلايا. يرجى الاطلاع على المناقشة لمزيد من التفاصيل حول عملية تكرارية لتحسين الهضم. - تحت المجهر تشريح في التكبير الكلي 10x، وإزالة الملتحمة المتبقية والعصب البصري باستخدام ملقط غرامة ومقص الربيع في HBSS الباردة.
- نقل عيون نظيفة إلى طبق تشريح الجافة أو قارب وزن صغير. حقن 0.15-0.20 مل / العين من العازلة الهضم عن طريق حقنة مزودة إبرة 30 G في تجويف زجاجي بعد اثنين من الجروح ثقب المحرز في العين من خلال المحور البصري و 90 درجة بعيدا عن هذا الجرح الأول للهضم عازلة الخروج.
- مُمَرّع العينين بالكامل باستخدام مقص الربيع والملقط الناعم مع جميع القطع الأصغر من 0.5 مم × 0.5 مم. فصل أنسجة العدسة مع اضطراب الميكانيكية حادة عن طريق ملقط لمنع انسداد نصائح ماصة في الخطوات اللاحقة. لكل عينة، شطف ملقط ومقص مع كل 0.75 مل من عازلة الهضم في طبق صغير. استخدم طبقًا جديدًا لكل عينة.
- نقل محتويات الطبق إلى أنبوب تفكك على الجليد باستخدام P1000 ماصة مع الحرص على عدم فقدان أي مادة في نقل الماصات. شطف الطبق مع إضافية 1.5 مل من العازلة الهضم ليصل حجم إجمالي في أنبوب الانفصام إلى 3.25-3.50 مل.
- ضع أنبوب الانفصام المقلوب على الفصام الإلكتروني ودورة التشغيل "m_brain_03_01"، والتي تتكون من دوران أحادي الاتجاه بـ 1 دقيقة عند 200 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة، وهو برنامج تم تحميله مسبقًا. ضمان جميع الأنسجة في الجزء السفلي من أنبوب الانفصام في اتصال مع العازلة الهضم والدوار لهذا وجميع الخطوات المتبقية.
- ضع أنبوب الانفصام في حاضنة الهز لمدة 30 دقيقة عند 200 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
- كرر الخطوات 2.6 و 2.7 وقت إضافي واحد. بعد الثانية 30 دقيقة الحضانة تنفيذ الهضم الميكانيكية النهائية باستخدام النفص الإلكترونية كما هو الحال في الخطوة 2.6.
- وقف رد الفعل بإضافة 10 مل من تدفق الباردة العازلة ووضع أنابيب على الجليد.
3. إعداد تعليق الخلية
- لإنشاء تعليق أحادي الخلية، صب رد فعل الهضم العين توقف من خلال مرشح 40 ميكرومتر وضعت على الجزء العلوي من أنبوب أجهزة الطرد المركزي المخروطية 50 مل. باستخدام المكبس من حقنة 2.5 مل، ودفع أي قطع المتبقية من أنسجة العين غير مهضومة من خلال مرشح.
- غسل أنبوب الانفصام مع 10 مل من تدفق العازلة وشطف مرشح قبل استخدام نفس المكبس لتمرير مرة أخرى قطع أنسجة العين غير مهضومة من خلال مرشح.
- كرر الخطوة 3.2 باستخدام 5 مل من تدفق المخزن المؤقت.
- غسل أنبوب الانفصام وتصفية مع 10 مل النهائي من تدفق العازلة.
ملاحظة: إجمالي حجم الهضم وتدفق العازلة حوالي 38-40 مل لكل عينة. - الطرد المركزي أنبوب المخروطية في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. Decant الماسخ دون إزعاج بيليه الخلية.
- إعداد حل 1x lysing عن طريق إضافة حل 10x lysing إلى الماء العقيم. تفريق بيليه عن طريق الخفقان أنبوب ضد أنبوب آخر. إلى خلايا الدم الحمراء، إضافة 1 مل من 1x حل lysing لمدة 30 s مع دوامة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- وقف التفاعل مع 20 مل من تدفق العازلة.
- الطرد المركزي أنبوب المخروطية في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. Decant الماسخ دون إزعاج بيليه الخلية.
- فصل بيليه عن طريق الخفقان أنبوب ضد أنبوب آخر. إضافة 5 مل من 1x HBSS الباردة لكل أنبوب.
- أنابيب الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. اتعرق مُتطّر.
4. تلطيخ من تعليق الخلية للphagocytes أحادية النوى
- إعداد 0.5 مل من وصمة عار لايف / الميت لكل عينة عن طريق تخفيف العيش / الميت صبغة 1:5،000 في HBSS الباردة.
- إضافة وصمة عار لايف / الميت إلى كل عينة باستخدام ماصة P1000 مع التأكد من فصل بيليه تماما. نقل العينات إلى 1.2 مل أنابيب تيتر الصغرى.
- خذ aliquot صغير (10 ميكرولتر) لحساب الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا التلقائي (انظر 4.4). عينات احتضان مع وصمة عار لايف / الميت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- عد الخلايا باستخدام الأزرق Trypan لتحديد عدد الخلايا الحية لكل عينة.
ملاحظة: عادةً، تحتوي عينان من ماوس C57BL/6J من عمر 10-12 أسبوعًا على أقل من 2 × 106 خلايا حية. - غسل العينات عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من تدفق الباردة العازلة. أنابيب الطرد المركزي في رف أنبوب تيتر الصغرى عند 400 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استلهموا المُتطّر دون إزعاج خلية بيليه.
- خلايا إعادة بناء تماما في 500 ميكرولتر من تدفق الباردة العازلة. أنابيب الطرد المركزي في رف أنبوب تيتر الصغرى عند 400 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استلهموا المُتطّر دون إزعاج خلية بيليه.
- كتلة تصل إلى 5 × 106 الخلايا الحية في 50 ميكرولتر من كتلةF c (1:50 تخفيف في تدفق الباردة العازلة من الفأر المضادة للماوس 16/CD32). إذا كان أكثر من 5 × 106 خلايا حية، زيادة وحدات التخزين بشكل مناسب.
- إضافة كتلةج إلى بيليه التأكد من فصل تماما العينة. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية.
- إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة تلطيخ الحل (انظر الجدول 1 لاختيار وكمية كل الأجسام المضادة التي يتم تضمينها في الحل) لكل 5 × 106 الخلايا الحية مباشرة إلى الخلايا في كتلةF c ومزيج تماما. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: تعتمد كميات الأجسام المضادة على تكوين مقياس التدفق وينبغي أن يتم تحديدها بشكل مستقل لكل مختبر وأداة. انظر الجدول 2 للحصول على تكوين أداة من المرشحات والمرايا. للأجسام المضادة لتكميل، تبدأ مع توصية الشركة المصنعة، وحساب مؤشر تلطيخ. إجراء اختبار تشغيل تركيزات الأجسام المضادة المختلفة (سواء فوق أو تحت توصية الشركة المصنعة) واختيار أدنى تركيز للأجسام المضادة حيث يتم الحفاظ على مؤشر تلطيخ. أيضا، تأكد من أن تلطيخ إيجابي أقل إشراقا من عنصر التحكم لون واحد. استخدام الخلايا غير الملطخة لضمان أن الخلايا الملطخة سلبا على نطاق ولها ذروة في أو أقل من 1 × 102. استخدام الفلوريسنس ناقص عنصر تحكم واحد لتحديد الخلايا الملطخة بشكل إيجابي. - غسل العينات عن طريق إضافة 700 ميكرولتر من تدفق الباردة العازلة. أنابيب الطرد المركزي في رف أنبوب تيتر الصغرى عند 400 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استلهموا المُتطّر دون إزعاج خلية بيليه.
- اختياريا، بعد تلطيخ الأجسام المضادة، يمكن إصلاح العينات مع 500 ميكرولتر من 2٪ شبهفورمالدهيد في تدفق العازلة. إصلاح العينات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، قم بإجراء غسل واحد كما هو موضح في 4.10. تخزين عينات ثابتة عند 4 درجة مئوية. يجب إضافة حبات العد في يوم جمع بيانات قياس التدفق. يجب أن يتم تشغيل عينات ثابتة على جهاز قياس التدفق في 1-2 أيام.
تنبيه: Paraformaldehyde هو تآكل وخطر على الصحة. - غسل العينات مرة أخرى باستخدام 500 ميكرولتر من تدفق الباردة العازلة. أنابيب الطرد المركزي في رف أنبوب تيتر الصغرى عند 400 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. pirate نصف من افرا من دون إزعاج بيليه الخلية.
- الكريات ريسوسيبيند ونقلها إلى بئر 96، يو القاع لوحة المقايسة. لوحة الطرد المركزي عند 400 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية. لdedeantant المابير، بدوره لوحة أكثر وفي هزة واحدة قوية طرد السائل في حوض بالوعة، دون بيليه مزعجة.
- في أنبوب تيتر صغير جديد 1.2 مل، ضع 50 ميكرولتر من الخرز العد دوامة جيدا.
- الكريات ريسوسيبيند في 96 لوحة جيدا في 200 ميكرولتر من تدفق الباردة العازلة. إضافة خليط الخلية على الجزء العلوي من الخرز من الخطوة السابقة. تشغيل على تدفق الجهاز البولي في حجم إجمالي 250 ميكرولتر / ميكرو تيتر أنبوب.
5. جمع بيانات تدفق cytometry
- تشغيل وإعداد تدفق مقياس المقاييس. الإرشادات المذكورة هنا هي لأربعة ليزر معدلة cytometer (الجدول 2).
- تشغيل عينة اختبار، والتي تتضمن aliquot صغيرة من كل عينة، لضمان أن جميع الخلايا على نطاق لكل كاشف. ضبط الفولتية بحيث تكون جميع الخلايا على نطاق واسع.
- تشغيل عناصر تحكم لون واحد (SCC) لكل fluorophore المستخدمة في تلطيخ كوكتيل(الجدول 3). ضع أنبوب titer الصغير في أنبوب أكبر من البوليسترين 5 مل لوضعه على مرحلة مقياس التدفق.
ملاحظة: الفلوروفور الجذر مثل BV421 (الأزرق المحيط الهادئ)، FITC، PE، Alexa647 (APC)، و Alexa700 لا تتطلب نفس الأجسام المضادة مثل الكوكتيل (أي، CD19 PE لC64 PE). ومع ذلك، الفلوروفورات جنبا إلى جنب مثل PE-CF594، PE-Cy7، أو APC-Cy7 تتطلب نفس الأجسام المضادة لSCC كما كوكتيل بسبب تفكك المحتملة من الفلوروفورس مترافق.- إنشاء SCC لBV421 عن طريق إضافة 2 قطرات من الخرز التعويض إلى أنبوب titer 1.2 مل جنبا إلى جنب مع 1 ميكرولتر من الهامستر المضادة للماوس CD11c BV421. وتستخدم الخرز التعويض لأن CD11c BV421 هو نوع فرعي IgG لامدا بدلا من كابا كما هو موضح في 5.3.3. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. إضافة 0.2 مل من تدفق العازلة.
- إنشاء SCC للصبغة الحية / الميت عن طريق إضافة قطرة واحدة من حبات التلوين الإيجابية (الغطاء الأخضر) من الخرز التفاعلي أمين، تليها 1 ميكرولتر من العيش / صبغة الميت. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. إضافة قطرة واحدة من الخرز السلبية (قبعة بيضاء) من الخرز رد الفعل أمين. إضافة 0.2 مل من تدفق العازلة.
- إنشاء SCCs المتبقية عن طريق إضافة قطرة واحدة من حبات التلوين الإيجابية (الغطاء الأخضر) من المضادة للجرذ والهامستر Ig مجموعة الخرز، تليها كمية الأجسام المضادة المدرجة(الجدول 3)في أنبوب titer 1.2 مل. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية. إضافة قطرة واحدة من الخرز السلبية (الغطاء الأبيض) من المضادة للجرذ والهامستر Ig مجموعة الخرز. إضافة 0.2 مل من تدفق العازلة.
- دوامة جميع خلائط حبة تماما. تخزين SCCs عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.
ملاحظة: SCC ماوس مراسل الفلورسنت هو خلايا غير ملوثة. - عند تشغيل SCCs، قم بتعيين الفولتية بحيث يكون نموذج SCC ذروة أكبر من أي مضى لعينة من الخلايا في قناة الكاشف نفسه. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تعيين الفولتية بحيث يكون لدى أي SCC على الأقل 0.5 فرق السجل بين ذروة الرسم البياني في قناة الفائدة مقابل أي قناة أخرى (الشكل 1).
- تشغيل عينات على "منخفض" حفظ الأحداث / الثانية أدناه 4000. إذا كان من غير الممكن خفض معدل التدفق بشكل مناسب، قم بتخفيف العينات مع مخزن تدفق بارد إضافي. تسجيل وحدة التخزين المضافة حيث أن هذا سيكون ضروريًا لحساب العد (راجع نتائج التمثيل).
- جمع ما لا يقل عن 3 × 106 الأحداث لكل عينة. قد يكون هذا أعلى من عدد الخلايا بسبب حبيبات الصباغ والحطام عد كالأحداث على مقياس الخلايا الخاص بك.
- سجل الفلوريسنس ناقص واحد (FMO) لكل فلورية أخرى غير لايف / الميت لاستراتيجية البوابات السليمة في القسم 6.4. وFMO هي عينة التي تم ملطخة مع جميع الفلوروفوريس باستثناء واحد.
- تنظيف وإغلاق تدفق مقياس المقاييس وفقا ً لمعالجة الشركة المصنعة أو مرفق.
6. شرح تدفق البيانات cytometry
- افتح ورقة عمل جديدة باستخدام برنامج تحليل. استيراد FCS من cytometer لجميع العينات وعناصر التحكم ذات لون واحد.
- استخدم SCCs لإنشاء مصفوفة تعويض.
- تطبيق مصفوفة التعويض على العينات الملطخة الخاصة بك و FMOs.
- استخدام FMOs لتحديد تلطيخ إيجابية لرسم البوابات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أظهر الشكل 1 مدرجات التكرار غير المُؤسَّر لـ SCCs والخلايا بالليزر الأحمر: Alexa647 و Alexa700 و APC-Cy7. في الشكل 1A، يصور الخط الأرجواني ذروة SCC ل Alexa647 ، في حين أظهر الخط السماوي الفرق المقصود 0.5 Log. لاحظ أن الذروة في Alexa700 و APC-Cy7 كانت إلى اليسار (أقل إشراقا) من الخط السماوي. لاحظ أيضا أن الخلايا كانت كلها إلى يسار الخط الأرجواني. ولم يتم تعويض أي خلايا على يمين قمة المحكمة الدستورية العليا. ومن المعروف أن قنوات محددة تتسرب إلى قنوات أخرى استنادا إلى كيمياء الأصباغ الفلورية (أي. ليزر البنفسج: BV421 -> V500، ليزر أصفر أخضر: PE -> PE-CF594، ليزر أحمر: Alexa647 -> Alexa700، Alexa700 -> APC-Cy7، عبر الليزر: PE-Cy7 -> APC-Cy7). وإذا لم يتم استيفاء أي من الشروط المذكورة أعلاه، يمكن تعديل الجهد في قناة واحدة إلى أعلى بينما يمكن نقل أي قنوات انسكاب إلى الأسفل. انظر الشكل 1B والشكل 1C للحصول على أمثلة إضافية من الليزر الأحمر. مرة واحدة تم تحديد الفولتية ومن ثم سجلت، يجب أن يتم تشغيل جميع العينات مع المعلمات الجهد. معالج إعداد التعويض موجود وقد يكون مفيداً.
تعريف حبة العد ضروري لتحديد عدد الخلايا. أظهر الشكل 2A خصائص FSC-A مقابل SSC-A لجميع الأحداث التي تم تحليلها من عينين من فأر واحد. من المهم ضبط الجهد SSC للتأكد من الخرز العد الخاص مرئية كما مجموعة ضيقة جدا من SSC-Aعالية و FSC-A الأحداثالمنخفضة. تم تنظيف أعداد الخرز وتأكيدها عن طريق التآمر PE مقابل APC-Cy7 (الشكل 2B). وكانت الخرز نظيفة مجموعة ضيقة من PE+ و APC -Cy7- الأحداث.
تم التعرف على Singlets والخلايا الحية التالية من جميع الأحداث. تم تحديد singlets عن طريق التآمر FSC-H vs FSC-A. وكان العزب ترتبط إيجابيا في هذين الخصائص في حين أن الخلايا المزدوجة وثلاثية أكبر FSC-A من FSC-H(الشكل 2C). تم تحديد الخلايا الحية عن طريق التآمر لايف / الميت مقابل FSC-A. كانت الخلايا الميتة حية / ميتة إيجابية ، والخلايا تظهر أكبر FSC - A من الحطام (الشكل 2D). لاحظ أن الخرز العد كانت لايف / الميت+ وتمت إزالتها في هذه الخطوة.
ويبين الشكل 3 استراتيجية البوابات الأولية لترسيم البالعات أحادية النوى من الخلايا الحية المفردة. تم تصور singlets حية باستخدام CD45 مقابل مؤامرة CD11b(الشكل 3، اليسار). لاحظ أن CD45+CD11b- (معظمها خلايا B والخلايا التائية), CD45dimCD11b+ (microglia المفترضة), و CD45+CD11b+ الخلايا (اختراق الخلايا المناعية, زيادة مع الليزر [الشكل 3B, اليسار]) تم اختيار. عدم وجود خلايا CD45+ في CD45 FMO أكد اختيار البوابة(الشكل 3C, اليسار). بعد ذلك ، تم استبعاد العدلات ، الحمضات ، الخلايا B ، خلايا NK ، والخلايا التائية عن طريق التآمر CD45+ singlets الحية باستخدام بوابة النسب (لين: Ly6G [العدلات] ، SiglecF [يوسنوفيليات] ، B220 [B-cells] ، NK1.1 [خلايا NK] ، CD4 [T-cells] ، و CD8 [خلايا T]) vs CD1b. الزيادة في CD11b+لين- لاحظ الخلايا بين لا ليزر(الشكل 3A، الأوسط) و الليزر(الشكل 3B، الأوسط) مجموعات بسهولة. لاحظ عدم وجود CD11b+لين الخلايا في CD11b FMO(الشكل 3C، الأوسط) وعدم وجود لين+ الخلايا في لين FMO (الشكل 3C، الحق). يمكن فصل Microglia من اختراق البلعات أحادية النواة من كمية من التعبير CD4513،24. CD11b+لين- تم تصور الخلايا باستخدام مؤامرة CD11b مقابل CD45 لتحديد CD45dim putative microglia وD45عالية تسلل البلعات أحادية النواة. الزيادة النسبية في CD45عالية أحادية النوى البلعات واضحة في الماوس الليزر المعالجة(الشكل 3A, B, حق).
حدد الشكل 4 ميكروجليا، وثلاث مجموعات فرعية الضامة، ومحاديات، وخلايا التشعب. تم تحديد Microglia عن طريق التآمر CD45 خلاياخافتة على مؤامرة CD64 مقابل MHCII(الشكل 4, اللوحة اليسرى). وقد تبين Microglia أن CD64+MHCIIمنخفضة سابقا13. لم تتغير Microglia نسبيا مع الليزر وغياب في CD64 FMO(الشكل 4A, C اليسار). تم رسمها الخلاياعالية CD45 المقبل على نفس الرسم البياني CD64 مقابل MHCII. CD64+MHCII- الضامة (MHCII- أجهزة ماكينتوش)، CD64-MHCII- وحيدات، وMHCII+ تم تحديد الخلايا (الشكل 4A، B، وسط اليسار). لاحظ غياب خلايا MHCII+ في MHCII FMO (الشكل 4C، يسار الوسط). تم التمييزأيضاً في خلايا MHCII + باستخدام CD64 وD11c. CD64+CD11c- الضامة (CD11c- Macs) ، CD64+CD11c+ الضامة (CD11c+ Macs) ، و CD64-CD11c+ الخلايا التشجرية (DCs) تم تعريفها(الشكل 4A ، B، يمين وسط). لاحظ غياب خلايا CD11c+ في CD11c FMO (الشكل 4C، وسط اليمين). تم تصنيفها فرعية أحادية كما الكلاسيكية Ly6C+ أو غير الكلاسيكية Ly6C- monocytes(الشكل 4، والحق). لاحظ غياب Ly6C+ monocytes في FMO Ly6C (الشكل 4C، حق).
تم حساب عدد الخلايا لكل ماوس (أو لكل عينين) بالمعادلة التالية:
باستخدام وحدات التخزين في هذا الأسلوب، المعادلة هي:
عدد الخلايا وعدد حبة تكون محددة لكل عينة. تركيز الخرز هو محدد لكل الكثير من الخرز العد والتي تقدمها الشركة المصنعة على كل قارورة.
الضامة التسلل المشيمية بعد إصابة الليزر25، واستنفاد الضامة يقلل من منطقة CNV18. تعتمد هذه الدراسات القديمة على تصوير الفلورات المناعية، والتي لا يمكن أن تميز بشكل موثوق البلعومات أحادية النوى، أو علامات تدفق cytometric أقل لتحديد الضامة. التغايرية الضامة هو مفهوم ناشئ في علم المناعة الفطرية، حيث الضامة قادرة على أداء وظائف متعددة اعتمادا على أصلها والأنسجة microenvironment12،26. قمنا بإجراء عملية استئصال الخلايا متعددة المعلمة على عيون الماوس غير المعالجة والليزر المعالجة في اليوم الثالث بعد إصابة الليزر لتحديد البلعومات أحادية النواة وعدم تجانس الضامة. زيادة العلاج بالليزر MHCII-، CD11c-، وC11c+ الضامة بنسبة 7.0-25.6 ، 2.8-7.2 ، و 3.9-8.2 أضعاف على التوالي(الشكل 5A ، C). كما تم تعداد الخلايا التشعبية حتى- تنظيم 4.5-4.7-fold بواسطة الليزر (الشكل 5F). لم تتأثر Microglia والعد monocyte من العلاج بالليزر (الشكل 5D, E). لم يتم الكشف عن اختلافات كبيرة مع أو بدون الضخ الجهازي قبل التلقيح. هذه النتائج تظهر زيادة مجموعات الضامة والخلايا المتجذّر بعد إصابة الليزر دون أي تغيير على ميكروجليا أو أحادية. وعلاوة على ذلك، تبرز هذه البيانات كيف يمكن لعاملات تدفق الخواص المتعددة أن تكتشف تجانس الجزيئات الضامة.
| الأجسام المضادة أو المخزن المؤقت | فلووفور | استنساخ | المبلغ لكل عينة (نانوغرام) |
| الفئران المضادة للماوس Ly6C | FITC | AL-21 | 15 |
| الماوس المضادة للماوس CD64 | Pe | X54-5/7.1 | 40 |
| الفئران المضادة للفأرة Tim4 | أليكسافلور 647 | RMT4-54 | 300 |
| الهامستر المضادة للماوس CD11c | BV 421 | HL3 | 300 |
| الجرذان المضادة للماوس Ly6G | PE-CF594 | 1A8 | 10 |
| الماوس مكافحة الماوس NK1.1 | PE-CF594 | PK136 | 10 |
| الفئران المضادة للفأرة Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 20 |
| رات المضادة للفأرة B220 | PE-CF594 | RA3-6B2 | 20 |
| رات المضادة للماوس CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | 40 |
| رات المضادة للماوس CD4 | PE-CF594 | RM4-5 | 20 |
| الفئران المضادة للفأرة MHC الثاني | أليكسافلور 700 | M5/114.15.2 | 2.5 |
| رات المضادة للماوس CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 2 |
| رات المضادة للماوس CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 6 |
| المخزن المؤقت MACS |
الجدول 1: فلوروفور الأجسام المضادة والمستنسخات (انظر الخطوة 4-9). عموما، عينة واحدة هي إما واحد أو اثنين من العينين هضم. إضافة تدفق العازلة إلى أنبوب أولا ثم كل الأجسام المضادة. يمكن إجراء التخفيف لتجنب الأنابيب صغيرة جدا وحدة تخزين، في حين تغيير وحدة التخزين العازلة تدفق الإجمالي بشكل مناسب. راجع جدول المواد لرقم المنتج والشركة.
| الليزر | فتحة PMT | تصفيه | مراه | الالوان |
| بنفسجي (405nm) | ألف | 525/50 | 505 ليرة لبنانية | V500 أو AmCyan |
| ب | 450/50 | أزرق المحيط الهادئ، eFluor 450، V450 أو BV421 | ||
| أزرق (488nm/FSC) | ألف | 710/50 | 685 ليرة لبنانية | PerCP-Cy5.5، PerCP، PI أو 7AAD |
| ب | 525/50 | 505 ليرة لبنانية | FITC، CFSE، GFP أو AlexaFluor 488 | |
| ج | 488/10 | Ssc | ||
| الأصفر والأخضر (561nm) | ألف | 780/60 | 735 ليرة لبنانية | PE-Cy7 |
| ب | 610/20 | 600 ليرة لبنانية | PE-CF594، MCherry أو DSRed2 | |
| ج | 582/15 | Pe | ||
| أحمر (640nm) | ألف | 780/60 | 735 ليرة لبنانية | APC-Cy7، APC-H7 أو APC-eFluor 780 |
| ب | 730/45 | 690 ليرة لبنانية | أليكسافلور 700 | |
| ج | 670/30 | APC أو AlexaFluor 647 |
الجدول 2: تكوين جهاز قياس التدفق. إعداد المرشح والمرآة لمقياس الأربعة ليزر وفلوروفورات المتوفرة التي يمكن الكشف عنها في كل قناة. PMT = أنبوب الmultiplier الضوئي، FSC = مبعثر إلى الأمام، SSC = تشتت الجانب.
| جسم | فلووفور | استنساخ | المبلغ لكل SCC (نانوغرام) |
| رات المضادة للماوس CD45 | FITC | 30-F11 | 500 |
| رات المضادة للماوس CD19 | Pe | 1D3 | 40 |
| الفئران المضادة للفأرة Tim4 | أليكسافلور 647 | RMT4-54 | 100 |
| الهامستر المضادة للماوس CD11c | BV421 | HL3 | 200 |
| الفئران المضادة للفأرة Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 40 |
| رات المضادة للماوس CD19 | أليكسافلور 700 | 1D3 | 200 |
| رات المضادة للماوس CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 200 |
| رات المضادة للماوس CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 200 |
| لايف / صبغة الميت | eFluor 506 | غير مُنَدِيًا | 1 ميكرولتر |
الجدول 3: الفلوروفور المضاد والمستنسخات لضوابط لون واحد. يجب إضافة كل جسم مضاد إلى خرزة التعويض المناسبة كما هو موضح في الخطوات 5-3-1 - 5-3-3.
الشكل 1: الجهد الممثل اقامة بالليزر الأحمر. (أ) عناصر تحكم لون واحد (SCCs) لـ Alexa647. على اليسار، يتم عرض SCC لـ Alexa647. الوسط الأيسر يعرض تسرب من Alexa647 SCC في قناة Alexa700. تظهر ذروة Alexa647 SCC باللون الأرجواني ويتم عرض فارق هدف Log 0.5 باللون السماوي. لاحظ أن الذروة إلى اليسار (أقل إشراقا) من الخط السماوي. الوسط اليمين يوضح تسرب من Alexa647 SCC في قناة APC-Cy7. الحق يوضح الخلايا في قناة Alexa647. لاحظ أن كافة الخلايا أقل إشراقا من SCC (الخط الأرجواني). (ب) SCC ل Alexa700. يظهر اليسار الأوسط SCC ل Alexa700. اليسار يعرض تسرب من Alexa700 SCC في قناة Alexa647. الوسط اليمين يوضح تسرب من Alexa700 SCC في قناة APC-Cy7. تظهر ذروة Alexa700 SCC باللون الأرجواني ويتم عرض فارق هدف Log 0.5 باللون السماوي. لاحظ أن الذروة إلى اليسار (أقل إشراقا) من الخط السماوي. الحق يوضح الخلايا في قناة Alexa700. لاحظ أن كافة الخلايا أقل إشراقا من SCC (الخط الأرجواني). (C) SCC ل APC-Cy7. اليسار والأوسط تظهر تسرب من APC-Cy7 SCC في Alexa647 و Alexa700، على التوالي. لاحظ أن كلا الذروتين على يسار الخط السماوي. اليمين الأوسط يوضح ACP-Cy7 SCC. الحق يوضح الخلايا في قناة APC-Cy7. لاحظ أن كافة الخلايا أقل إشراقا من SCC (الخط الأرجواني). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تعريف تمثيلي لخرز العد، والعزب، والخلايا الحية. (أ) ناحية التشتت الجانبي (SSC-A) مقابل منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) لكافة الخلايا على مخطط كفاف. يتم تحديد الخرز العد من قبل SSC عالية-A، FSC-A منخفضة، وتكتل ضيق جدا من الخرز موحدة. (B) PE مقابل APC-Cy7 مؤامرة لبوابة حبة نظيفة. يشير السهم بين A و B إلى رسم الأحداث الإيجابية لخرط العد فقط. يتم تحديد الخرز العد نظيفة من قبل PE عالية ومنخفضة APC-Cy7 fluorescence. (C) FSC-Height (FSC-H) مقابل FSC-Area (FSC-A) مؤامرة من جميع الخلايا يوضح خلايا مفردة في خط عريض مرتبط بشكل إيجابي. تظهر Doublets و multiplets أخرى أكبر FSC-area من FSC-height. (D) لايف / الميت مقابل FSC-A للخلايا المفردة. يتم تعريف الخلايا الحية كما لايف / الميت منخفضة و FSC-A إيجابية. تشير النسب المئوية إلى النسبة المئوية للوالد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحديد التمثيلي للphagocytes أحادية النوى. اليسار: CD45 مقابل CD11b مؤامرة pseudocolor من الخلايا الحية من unlasered (A) ، ليزر (B) ، وفلوريسنس ناقص واحد (FMO) السيطرة (C). إلى اليسار: CD45+ الخلايا المحددة في A-B وتغيب في FMO. لاحظ زيادة CD45+CD11b+ الخلايا في الليزر (B) المجموعة. الوسط: مؤامرة pseudocolor من النسب (لين) علامة مقابل CD11b لD45+ الخلايا. CD11b+لين- يتم تحديد الخلايا في A-B وتغيب في FMO لD11b (أسفل). إلى اليمين: CD11b مقابل مؤامرة CD45 من CD11b+لين- الخلايا. يتم التعرف على خلايا CD45خافتة وD45عالية. لاحظ الزيادة في الخلاياعالية CD45 في مجموعة الليزر (B). تشير النسب المئوية إلى النسبة المئوية للوالد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحديد تمثيلي للميكرغليا، والخلايا التشعبية، والوحديات، والخلايا الضامة. اليسار: CD64 vs MHCII مؤامرة pseudocolor من الخلاياالخافتة CD45 يعرف microglia كما CD64+MHCIIمنخفضة. لاحظ كمية مماثلة من microglia في unlasered (A) و lasered (B) مجموعات ، وعدم وجود microglia في السيطرة FMO (C). اليسار الأوسط: CD64 vs MHCII مؤامرة pseudocolor من الخلاياالعالية CD45 يحدد MHCII- الضامة كما CD64+MHCII-، monocytes CD64-MHCII-و MHCII+ الخلايا. لاحظ الزيادة في MHCII- الضامة في مجموعة ليزر (B) ، وعدم وجود خلايا MHCII + في FMO (C، الأوسط)، وساعد على CD64 FMO (جيم، اليسار) في تحديد قطع لC64+ وC64- الخلايا. يمين الوسط: CD64 مقابل CD11c مؤامرة pseudocolor من MHCII+ الخلايا. CD11c-- تم تعريف الضامة CD64+CD11c--، CD11c+ الضامة تم تحديد CD64+CD11c+، والخلايا التشعب (DCs) تم تحديد CD64--CD11c+. تم زيادة كل من مجموعات الضامة والخلايا المتجّن مع الليزر (B). لاحظ غياب خلايا CD11c+ في FMO (C). الحق: Ly6C مقابل تيم 4 مؤامرة pseudocolor من monocytes. الكلاسيكية Ly6C+ وغير الكلاسيكية Ly6C- تم تحديد monocytes. لاحظ أن الكلاسيكية Ly6C+ monocytes كانت غائبة في FMO Ly6C (C). تشير النسب المئوية إلى النسبة المئوية للوالد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: بيانات تمثيلية للباتيفات أحادية النوى بين الفئران غير المُحلَّبة والصارمِسة على حد سواء مع الضخّ النظامي أو بدونه. MHCII- (A),CD11c- (B),و CD11c+ (C)تم زيادة جميع أعداد الضامة مع الليزر. لم يتم الكشف عن أي تغييرات بين microglia unlasered و lasered (D) أو monocytes (E). كما زادت الخلايا التشعبية (DC) مع الليزر (F). تم استخدام براون فرصيث وويلش ANOVA مع اختبار المقارنة المتعددة T3 من دونيت لتحديد الاختلافات الإحصائية بسبب التباينات غير المتكافئة بين المجموعات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
متعدد المعلمة تدفق cytometry يسمح للتحليل الكمي لأنواع الخلايا المتعددة في الأنسجة المعقدة. في هذا التقرير، نحن وصف الكشف عن تدفق الخلايا من السكان البلعميات أحادية النواة، بما في ذلك أحادية الخلايا، والخلايا التشعبية، ومجاميع الضامة، بعد إصابة الليزر في عين الماوس. Liyanage وآخرون ذكرت مؤخرا استراتيجية مماثلة لسور للكشف عن العدلات، يوسنوفيليات، الخلايا الليمفاوية، DCs، الضامة، الضامة التسلل، ومحاديات27. لدينا استراتيجية البوابات يختلف في المقام الأول من خلال إضافة CD64. Liyanage وآخرون يحدد العاصمة CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ الخلايا، و الضامة كما CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- الخلايا. نحدد العاصمة CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- الخلايا والخلايا الضامة CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD64+ الخلايا. استخدام CD64 للتمييز DC من الضامة6، وهذه الاستراتيجية تسمح لنا لتحديد التغايرية الضامة ، بما في ذلك الضامة CD11c + . القيد الرئيسي لهذه الطريقة هو أنه لا يوفر بيانات عن بنية الأنسجة أو موقع خلايا محددة داخل العين. من أجل تحديد ما إذا كانت هذه الخلايا في شبكية العين أو المشيمية أو القزحية أو بنية أخرى للعين ، يمكن دمج بروتوكولنا مع الطرق النسيجية أو تعديلها لتشمل تشريحًا أكثر شمولاً لتشريح البصر لتشغيل عملية استئصال تدفق متعددة المعلمة بشكل فردي على كل قسم فرعي للعين.
لقد قمنا بتحسين البروتوكول لهضم عيون الماوس بأكملها لمنع أي تباين تم إنشاؤه بواسطة التشريح. على سبيل المثال، يمكن أن تشريح من أكواب العين الخلفية مع إزالة القرنية، قزحية، والعدسة خلق تقلب من مادة القزحية أو القرنية (تحت التشريح) أو زيادة إصابة الليزر لمنطقة كأس العين الخلفية الطبيعية (الإفراط في تشريح). لدينا مقارنة بين العينين غير المتحكمين بالليزر يكشف عن تسلل البلعات أحادية النوى بسبب إصابة الريتينوتشوريدال. لتحليل آثار الأمراض الجهازية على العين، أي التهاب العنب والسكري، تحليل الفرد تحت قسم العين ضروري. طريقة الهضم، في القسم 2 من البروتوكول، هو الأكثر أهمية، في حين أن خطوات أخرى في الأقسام 3-5 قد استخدمت بنجاح على أنواع أنسجة متعددة24. وصلنا إلى ظروف الهضم لدينا من خلال طريقة متكررة التي تنطوي على: (1) اختبار طريقة الهضم الكيميائية (Collagenase D مقابل الانزيم الهضم)، (2) تحديد طول الهضم الكيميائي (30، 60، و 90 دقيقة)، و (3) إضافة الهضم الميكانيكي (لا شيء، مرة واحدة، مرتين، ثلاث مرات). في كل خطوة حكمنا على نجاح ظروف الهضم من قبل الخلية البقاء وعدد من CD45مرحباCD64+ (اختراق الضامة) الخلايا. وجدنا أن إنزيم الهضم (انظر الجدول التكميلي للمواد) تعافى خلايا حية أكثر من Collagenase D ومحاولة نصف تركيز انزيم الهضم أدى إلى عدد أقل من الضامة المتسللة. المقبل، 60 دقيقة من الهضم الكيميائي مع الهضم الميكانيكية تضاعف تقريبا السكان الضامة المتسللة. وكانت ثلاث عمليات الهضم الميكانيكية الأمثل مع 25-30٪ خلايا حية من العزب وأكثر سكان الضامة المتسللين. وأخيرا، تسبب أسرع ظروف الهضم الميكانيكية خسارة شديدة من الخلايا الحية على حد سواء و الضامة.
في المستقبل، نقترح توسيع هذه الطريقة عن طريق إزالة القرنية والقزحية والعدسة تليها هضم شبكية العين وكوب العين الخلفي (ظهارة مصطبغة شبكية العين، المشيمية، الشبكية). مع هذا التعديل، ونحن نتوقع للحد من ظروف الهضم بسبب الخصائص البروتينية والكثيفة للعدسة والقرنية على التوالي. ويمكن أن تشمل هذه التخفيضات انخفاض تركيز انزيم الهضم، والتحول إلى Collagenase، وانخفاض الوقت من الهضم، أو انخفاض كمية الهضم الميكانيكية. نتوقع انخفاض في حالات الهضم بشكل عام لكوب العين الخلفي، ومزيد من تقلص ظروف الهضم للشبكية وحدها.
وتشمل الاتجاهات المستقبلية الإضافية توسع لوحة تدفق التدفقات التقليدية متعددة المعالم إلى أداة ليزر 6 تقليدية أو قياس تدفق الطيفي. يسمح قياس التدفق الطيفي للتدفق الضوئي بالكشف عن الفلوروفور عبر الطيف بأكمله، بدلاً من تحديده بواسطة المرشحات المتاحة. نتائج قياس التدفق السيكترية في اكتشاف ألوان أكثر تحديداً. ومع ذلك، يتطلب قياس التدفق الطيفي للتدفق السيكتري مجموعة جديدة تماماً من الاعتبارات التي يجب اتباعها، وهو خارج نطاق هذه المخطوطة. لمزيد من التفاصيل، يرجى الاطلاع على هذه المادة جوفي الأخيرة28. وتشمل أجهزة الليزر 6 ليزر الأشعة فوق البنفسجية، الذي يضيف 6-9 كاشفات. عند إضافة علامات إلى لوحة قياس تدفق العين الماوس، نوصي بالكشف عن المزيد من أنواع الخلايا العينية. على سبيل المثال، يمكن فصل بوابة النسب للكشف عن العدلات والويوزين والخلايا الصاريّة وخلايا NK والخلايا اللمفاوية بشكل مستقل. لا ينصح بزيادة الكشف عن مجموعة فرعية من البلعات أحادية النوى بسبب العدد الصغير من الضامة في حالة ثابتة. عند إضافة أجسام مضادة جديدة، نقترح معايرة الأجسام المضادة بعناية.
باختصار، لقد عرضنا طريقة قابلة للتكيف وقوية للكشف عن السكان البلعميات أحادية النوى في عين الماوس. بسبب علامات سطح الخلية المتداخلة للغاية من أحادية الخلايا، والخلايا التكجرية، الضامة، وmicroglia، multi-parameter flow cytometry هو أفضل طريقة للكشف عن هذه التجمعات الخلوية. يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل أنواع الخلايا، ورسم الخرائط للمصير، و/أو فرز الخلايا من أجل التقييم المستنسخ أو البروتيومي. القيد الرئيسي هو نقص بنية الأنسجة ، ويمكن تأكيد النتائج الرئيسية باستخدام الأنسجة التقليدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وكان دعم JAL من قبل منحة المعاهد القومية للصحة K08EY030923; تم دعم CMC بمنحة K01 (5K01AR060169) من المعهد الوطني للتشاتيم القومي للأمراض العضلية والعظام ومنحة أبحاث جديدة (637405) من تحالف أبحاث الذئبة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
