Summary
Dieses Protokoll bietet eine Methode, um ganze Augen in eine einzelzellige Suspension zum Zweck der multiparametern Flow-Zytometrie-Analyse zu verdauen, um spezifische mononukleäre phagozytische Populationen zu identifizieren, einschließlich Monozyten, Mikroglia, Makrophagen und dendritischen Zellen.
Abstract
Das angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle in der okulären Pathophysiologie, einschließlich Uveitis, diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration. Angeborene Immunzellen, insbesondere mononukleäre Phagozyten, exprimieren überlappende Zelloberflächenmarker, was die Identifizierung dieser Populationen zu einer Herausforderung macht. Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die gleichzeitige, quantitative Analyse mehrerer Zelloberflächenmarker, um Monozyten, Makrophagen, Mikroglia und dendritische Zellen in Mausaugen zu unterscheiden. Dieses Protokoll beschreibt die Enukleation ganzer Mausaugen, die Augensektion, die Verdauung in eine einzellige Suspension und die Färbung der einzelzelligen Suspension für myeloische Zellmarker. Darüber hinaus erklären wir die richtigen Methoden zur Bestimmung von Spannungen mit Einzelfarbsteuerungen und zur Abgrenzung positiver Tore mit Fluoreszenz minus 1 Steuerung. Die Hauptbeschränkung der Multiparameter-Flow-Zytometrie ist das Fehlen von Gewebearchitektur. Diese Einschränkung kann durch Multiparameter-Flow-Zytometrie einzelner Augenkompartimente oder kostenlose Immunfluoreszenzfärbung überwunden werden. Die Immunfluoreszenz wird jedoch durch den Mangel an quantitativer Analyse und die geringere Anzahl von Fluorophoren auf den meisten Mikroskopen begrenzt. Wir beschreiben den Einsatz multiparametrischer Durchflusszytometrie zur hochquantitativen Analyse mononuklearer Phagozyten in laserinduzierter choroidaler Neovaskularisation. Darüber hinaus kann die Multiparameter-Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Makrophagen-Teilmengen, Schicksalskartierung und Zellsortierung für transkriptomische oder proteomische Studien verwendet werden.
Introduction
Das angeborene Immunsystem umfasst mehrere Zelltypen, die die Komplementaktivierung und Entzündung stimulieren. Angeborene Immunzellen umfassen natürliche Killerzellen (NK) Zellen, Mastzellen, Basophile, Eosinophile, Neutrophile, und mononukleäre Phagozyten. Mononukleare Phagozyten, die aus Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen bestehen, wurden in die Pathophysiologie mehrerer ophthalmologischer Erkrankungen wie Uveitis, diabetische Retinopathie und altersbedingte Makuladegeneration (AMD)1verwickelt. In diesem Protokoll werden wir uns auf die Identifizierung mononuklearer Phagozyten mittels multiparameterr Flusszytometrieanalyse in einem Mausmodell der neovaskulären AMD2konzentrieren. Dieses Protokoll ist anpassungsfähig für Mausmodelle der diabetischen Retinopathie und/oder Uveitis, aber eine umfassendere Augensektion wird aufgrund der systemischen Natur dieser Krankheiten empfohlen.
Mononukleare Phagozyten exprimiert überlappende Zelloberflächenmarker. Langlebige Gewebe-Resident-Makrophagen und Mikroglia stammen aus dem aus dem Dottersack abgeleiteten Erythromyeloid-Vorläufer3, während das Recycling von Makrophagen und dendritischen Zellen sich vom Knochenmark-abgeleiteten makrophagenen dendritischen Zellvorläufer4unterscheidet. Zu den Mauszelloberflächenmarkern, die Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen gemeinsam sind, gehören CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17und der intrazelluläre Marker Iba18. Um diese Herausforderung zu meistern, definiert die transkriptomische Analyse von Makrophagen, Monozyten und dendritischen Zellen aus mehreren Geweben CD64 als makrophagenspezifischen Zelloberflächenmarker6. Makrophagen wurden in der Iris, Der Aderhaut, dem Ziliarkörper und dem Sehnerv in gesunden Augen beschrieben3. Alternativ ist die dendritische Zellidentifikation schwieriger; Die spezifischste Methode der dendritischen Zellidentifikation erfordert eine Schicksalskartierung mit der Zbtb46-GFP-Reportermaus9. Unabhängig von dieser Reporterzeile kann die Expression von CD11c und MHCII in Verbindung mit dem Fehlen von CD64 potenzielle dendritische Zellen6,10identifizieren. Dendritische Zellen wurden in Hornhaut, Bindehaut, Iris und Aderhaut in normalen Augen11identifiziert. Mikroglia sind spezialisierte Makrophagen in der Netzhaut, geschützt durch die Blut-Retina-Barriere, und abgeleitet von Dotter-Sac-Vorläuferzellen12. Dadurch kann die retinale Mikroglia von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen durch ihre düsteren Konzentrationen von CD45-Expression13 und hohen Konzentrationen von Tmem119 unterschieden werden, die als Durchflusszytometrie-Antikörper14erhältlich sind. Bei der Aktivierung von Mikroglia kann CD45 jedoch15 und Tmem119 herunterreguliert sein3, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, und dies ist wahrscheinlich sowohl für AMD als auch für sein Mausmodell relevant. Schließlich können Monozyten in mindestens zwei Subtypen unterteilt werden, darunter klassische und nicht-klassische. Klassische Monozyten zeigen CCR2+Ly6ChighCX3CR1Low Expression, und nicht-klassische Monozyten zeigen CCR2-Ly6ClowCX3CR1High Marker5.
Aufgrund der Notwendigkeit der quantitativen Analyse der Markerexpression, d.h. hoher im Vergleich zu niedrigen/niedrigen Konzentrationen, ist die Multiparameter-Flow-Zytometrie die ideale Methode zur Diskriminierung zwischen Monozyten, Makrophagen, Mikroglia und dendritischen Zellen im Auge und anderen Geweben. Weitere Vorteile sind die Identifizierung von Subpopulationen, die Möglichkeit, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zur Sortierung von Zellpopulationen für transkriptomische oder proteomische Analysen zu verwenden, und Schicksalskartierung. Der Hauptnachteil der Multiparameter-Flow-Zytometrie ist der Mangel an Gewebearchitektur. Dies kann durch die ophthalmologische Dissektion in die verschiedenen okulären Subkompartimente überwunden werden: Hornhaut, Bindehaut, Iris, Linse, Netzhaut und Aderhautsklera-Komplex. Darüber hinaus kann eine bestätigende Immunfluoreszenz-Bildgebung durchgeführt werden, ist jedoch durch die Anzahl der Marker und den Mangel an robuster Quantifizierung begrenzt.
Genomweite Assoziationsstudien haben mehrere Komplementgene mit AMD16verknüpft. Die Komplementaktivierung führt zur Anaphylatoxinproduktion, Zur Rekrutierung von Leukozyten und zu einer daraus resultierenden Entzündung. Bei Komplementrezeptor-Mangelmäusen reduziert die Laserverletzung die mononukleäre Phagozytenrekrutierung und den laserinduzierten choroidalen Neovaskularisationsbereich (CNV)17. In ähnlicher Weise zeigt die C-C-Motiv-Chemokin-Rezeptor-2 (CCR2)-Knockout-Maus, die einen Mangel an Monozytenrekrutierung im Gewebe hat, sowohl eine verringerte mononukleäre Phagozytenrekrutierung als auch den laserinduzierten CNV-Bereich18. Diese Daten verbinden Komplement und mononukleäre Phagozyten mit experimenteller CNV und möglicherweise neovaskulärer AMD. Zur Unterstützung dieser Assoziation werden Komplementrezeptoren bei Patienten mit neovaskulärer AMD19,20. Diese Daten zeigen einen starken Zusammenhang zwischen AMD und mononukleären Phagozyten.
In diesem Manuskript verwenden wir das experimentelle laserinduzierte CNV-Modell, um die mononukleären Phagozytenpopulationen im Mausauge mittels Multiparameter-Flow-Zytometrie zu charakterisieren. Laserinduzierte CNV ist das Standard-Mausmodell der neovaskulären AMD, das die Wirksamkeit der aktuellen ersten linie neovaskulären AMD-Therapie21demonstrierte. Dieses Protokoll beschreibt die Enukleation von Mausaugen, die Augensektion, die Verdauung in eine Einzelzellsuspension, die Antikörperfärbung, die Bestimmung von Laserspannungen mit Einzelfarbsteuerungen und die Gating-Strategie mit Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen. Eine detaillierte Beschreibung des laserinduzierten CNV-Modells finden Sie in einer früheren Publikation22. Mit diesem Protokoll definieren wir Mikroglia, Monozyten, dendritische Zellen und Makrophagenpopulationen. Darüber hinaus werden wir MHCII und CD11c verwenden, um Makrophagen-Teilmengen innerhalb des laserinduzierten CNV-Modells weiter zu definieren.
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Protocol
Alle Verfahren wurden vom Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. C57BL/6-Mäuse wurden in einer Barriereanlage am Center for Comparative Medicine der Northwestern University (Chicago, IL) untergebracht. Alle Tiere wurden in 12/12 h Licht/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.
1. Sammlung von Augengewebe
- Opfern Sie 10-12-Wochen-alte C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts mit regulierter Verabreichung von Kohlendioxid, bis die Maus nicht mehr reagiert und nicht mehr einatmet. Führen Sie Zervixdislokation oder eine andere zugelassene sekundäre Methode durch, um Dieeuthanasie zu gewährleisten.
HINWEIS: Transkardiale Perfusion kann durchgeführt werden, um zirkulierende Leukozyten zu entfernen, die sich nicht in den Augengeweben befinden. In diesem Experiment reduziert die systemische Perfusion nicht die Anzahl von Mikroglia, Monozyten, Makrophagen oder dendritischen Zellen, die in unbehandelten oder laserbehandelten ganzen Augen nachgewiesen werden. Daher befinden sich die meisten dieser Zelltypen im ophthalmologischen Gewebe und dieser Schritt ist optional. - Um die Augen zu enukleieren, drücken Sie in der Nähe der Augenhöhle nach unten, während Sie ein Paar gekrümmte Zangen sanft unter das Auge legen, während es aus der Steckdose herausragt. Pinch Zange unter dem Auge geschlossen, ohne das eigentliche Auge zu drücken. Augen aus der umgebenden Bindehaut lösen (siehe vorherige Veröffentlichung)23.
- Ziehen Sie das Auge seitlich, bis der Sehnerv die einzige verbleibende Verbindung ist, um das Auge zu lösen. Der Sehnerv trennt sich oft mit Spannung, aber manchmal ist eine kleine Schere notwendig, um den Sehnerv zu schneiden. Legen Sie das Auge in kalte 1x Hank es Buffered Saline Solution (HBSS) mit Kalzium und Magnesium in 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr.
2. Verdauung des Augengewebes
- Bereiten Sie den Verdauungspuffer vor, der 0,1 mg/ml Verdauungsenzym und 0,2 mg/ml DNase in kalten HBSS enthält. Rekonstituieren Sie zunächst 5 mg Verdauungsenzym in 2 ml sterilem Wasser. Bereiten Sie eine anfängliche Verdünnung von 10 mg/ml DNase in HBSS vor. Pro 10 ml des Verdauungspuffers (ausreichend für 3 Tiere) 9,4 ml kalteHBSS mit 0,4 ml rekonstituiertem Verdauungsenzym und 0,2 ml verdünnter DNase I mischen.
HINWEIS: Diese Konzentrationen wurden empirisch über mehrere Experimente bestimmt, um ein optimales Maß an Antikörperfärbung einzelner Zellen zu ermöglichen und gleichzeitig den Zelltod zu reduzieren. Collagenase D wurde als Alternative zum Verdauungsenzym mit reduzierter Zelllebensfähigkeit und verminderter CD45+ Zellen ausprobiert. Weitere Informationen zum iterativen Prozess zur Optimierung der Verdauung finden Sie in der Diskussion. - Entfernen Sie unter einem Sezierender Mikroskop bei 10-facher Gesamtvergrößerung die verbleibende Bindehaut und den Sehnerv mit feinen Zangen und Federscheren in kalten HBSS.
- Bewegen Sie saubere Augen zu einer trockenen Sezschale oder einem kleinen Wägeboot. Injizieren Sie 0,15-0,20 ml/Auge des Verdauungspuffers über eine Spritze mit 30 G Nadel in die Glaskörperhöhle, nachdem zwei perforierende Wunden im Auge durch die Sehachse und 90° von dieser ersten Wunde entfernt für den Verdauungspufferausgang gemacht wurden.
- Mit Federschere und feinen Zangen mit allen Teilen kleiner als 0,5 mm x 0,5 mm ganze Augen zerkleinern. Dissoziieren Sie Linsengewebe mit stumpfer mechanischer Störung über Zangen, um das Verstopfen von Pipettenspitzen in nachfolgenden Schritten zu verhindern. Für jede Probe, Spülen Zangen und Schere jeweils mit 0,75 ml Verdauungspuffer in kleine Schale. Verwenden Sie für jede Probe ein neues Gericht.
- Übertragen Sie den Inhalt der Schale auf ein Dissoziationsrohr auf Eis mit P1000 Pipette, wobei darauf geachtet wird, dass kein Material in der Pipettenübertragung verloren geht. Spülen Sie die Schale mit zusätzlichen 1,5 ml Verdauungspuffer, wodurch das Gesamtvolumen in Dissoziationsrohr auf 3,25-3,50 ml.
- Legen Sie das Dissoziationsrohr invertiert auf den elektronischen Dissoziator und laufen Sie den Zyklus "m_brain_03_01", bestehend aus 1 min unidirektionaler Drehung bei 200 U/min bei Raumtemperatur, was ein vorinstalliertes Programm ist. Stellen Sie sicher, dass sich das gesamte Gewebe an der Unterseite des Dissoziationsrohrs in Kontakt mit dem Verdauungspuffer und dem Rotor für diesen und alle verbleibenden Schritte befindet.
- Legen Sie das Dissoziationsrohr in den Schüttelinkubator für 30 min bei 200 U/min bei 37 °C.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 ein weiteres Mal. Nach der zweiten 30 min Inkubation führen Sie eine letzte mechanische Verdauung mit elektronischem Dissoziator wie in Schritt 2.6 durch.
- Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 ml Kaltstrompuffer hinzufügen und Rohre auf Eis legen.
3. Vorbereitung der Zellsuspension
- Um eine einzellige Suspension zu erzeugen, gießen Sie die angehaltene Augenverdauungsreaktion durch einen 40-m-Filter, der auf der Oberseite eines 50 ml konischen Zentrifugenrohrs platziert wird. Mit dem Kolben aus einer 2,5 ml Spritze schieben Sie alle verbleibenden Teile des unverdauten Augengewebes durch den Filter.
- Waschen Sie das Dissoziationsrohr mit 10 ml Flow-Puffer und Spülfilter, bevor Sie den gleichen Kolben verwenden, um wieder unverdaute Augengewebeteile durch den Filter zu leiten.
- Wiederholen Sie Schritt 3.2 mit 5 ml Flow-Puffer.
- Waschen Sie das Dissoziationsrohr und den Filter mit einem endgültigen 10 ml Flow-Puffer.
HINWEIS: Das Gesamtvolumen des Verdauungs- und Durchflusspuffers beträgt etwa 38-40 ml pro Probe. - Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Dekant den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
- Bereiten Sie 1x Lysing-Lösung vor, indem Sie sterilem Wasser eine 10-fache Lysing-Lösung hinzufügen. Brechen Sie das Pellet auf, indem Sie das Rohr gegen ein anderes Rohr streicheln. Um rote Blutkörperchen zu lysieren, fügen Sie 1 ml 1x Lysing-Lösung für 30 s mit Wirbeln bei Raumtemperatur (RT).
- Stoppen Sie die Reaktion mit 20 ml Flow-Puffer.
- Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Dekant den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
- Dissoziieren Sie das Pellet, indem Sie das Rohr gegen ein anderes Rohr streicheln. Fügen Sie 5 ml kalte 1x HBSS pro Tube hinzu.
- Zentrifugenrohre bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirat Überstand.
4. Färbung der Zellsuspension für mononukleäre Phagozyten
- Bereiten Sie 0,5 ml Lebend/Totfleck pro Probe vor, indem Sie Live/Dead Farbstoff 1:5.000 in kalten HBSS verdünnen.
- Fügen Sie jeder Probe mit einer P1000 Pipette einen Live/Dead-Fleck hinzu, der sich erstellt, um das Pellet vollständig zu trennen. Proben in 1,2 ml Mikrotiterröhren übertragen.
- Nehmen Sie einen kleinen Aliquot (10 L), um Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler zu zählen (siehe 4.4). Inkubieren Sie Proben mit Live/Dead-Färbung für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Zählen Sie Zellen mit Trypan blue, um die Anzahl der lebenden Zellen pro Probe zu bestimmen.
HINWEIS: In der Regel enthalten 2 Augen einer 10-12 Wochen alten C57BL/6J-Maus weniger als 2 x 106 lebende Zellen. - Waschen Sie Proben, indem Sie 400 l kalten Durchflusspuffer hinzufügen. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
- Resuspend Zellen vollständig in 500 l kalten Flow-Puffer. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
- Blockieren Sie bis zu 5 x 106 lebende Zellen in 50 l Fc Block (1:50 Verdünnung im kalten Durchflusspuffer der gereinigten Rattenanti-Maus-CD16/CD32). Wenn mehr als 5 x 106 lebende Zellen, erhöhen Volumen angemessen.
- Fügen Sie dem Pellet einen Fc-Block hinzu, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig getrennt wird. 20 min bei 4 °C inkubieren.
- Fügen Sie 50 l Antikörper-Färbelösung (siehe Tabelle 1 zur Auswahl und Menge jedes Antikörpers, der in der Lösung enthalten ist) pro 5 x 106 lebenden Zellen direkt zu den Zellen in Fc Block hinzufügen und vollständig mischen. 30 min bei 4 °C inkubieren.
HINWEIS: Antikörpermengen sind abhängig von der Durchflusszytometerkonfiguration und sollten für jedes Labor und Instrument unabhängig getitriert werden. Siehe Tabelle 2 für die Instrumentenkonfiguration von Filtern und Spiegeln. Um Antikörper zu tittieren, beginnen Sie mit der Empfehlung des Herstellers und berechnen Sie den Färbeindex. Führen Sie einen Testlauf mit unterschiedlichen Antikörperkonzentrationen (sowohl oberhalb als auch unterhalb der Empfehlung des Herstellers) durch und wählen Sie die niedrigste Antikörperkonzentration, bei der der Färbeindex beibehalten wird. Stellen Sie außerdem sicher, dass die positive Färbung weniger hell ist als die einfarbige Steuerung. Verwenden Sie ungefärbte Zellen, um sicherzustellen, dass negativ gefärbte Zellen auf einer Skala sind und einen Spitzenwert von 1 x 102haben. Verwenden Sie eine Fluoreszenz minus ein Steuerelement, um die positiv gefärbten Zellen zu definieren. - Waschen Sie Proben, indem Sie 700 l kalten Durchflusspuffer hinzufügen. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
- Optional können die Proben nach der Antikörperfärbung mit 500 l Paraformaldehyd im Durchflusspuffer fixiert werden. Proben für 15 min bei Raumtemperatur fixieren. Führen Sie dann eine Wäsche durch, wie in 4.10 beschrieben. Feste Proben bei 4 °C lagern. Zählperlen sollten am Tag der Datenerfassung der Durchflusszytometrie hinzugefügt werden. Feste Proben sollten auf durchflusszytometer in 1-2 Tagen laufen.
VORSICHT: Paraformaldehyd ist ein korrosives und gesundheitsgefährdendes Mittel. - Waschen Sie die Proben erneut mit 500 l kaltem Durchflusspuffer. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Die Hälfte des Überstandes aspirieren, ohne das Zellpellet zu stören.
- Pellets aufsetzen und auf eine 96-Gut,U-Boden-Assayplatte übertragen. Zentrifugenplatte bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Um den Überstand zu dekantatigen, drehen Sie die Platte um und in einem starken Shake lösen Sie die Flüssigkeit in ein Waschbecken, ohne Pellet zu stören.
- In einem neuen 1,2 ml Mikrotiterrohr 50 l gut wirbelnde Zählperlen platzieren.
- Pellets in 96 Brunnenplatten in 200 l Kaltflusspuffer resuspendieren. Fügen Sie Zellmischung auf der Oberseite der Perlen aus dem vorherigen Schritt. Laufen Sie auf Durchflusszytometer in einem Gesamtvolumen von 250 L / Mikro-Titer-Rohr.
5. Erfassung von Flusszytometriedaten
- Schalten Sie das Durchflusszytometer ein und bereiten Sie es vor. Hier aufgeführte Anweisungen sind für ein modifiziertes Vierlaserzytometer (Tabelle 2).
- Führen Sie eine Testprobe aus, die einen kleinen Aliquot aus jeder Probe enthält, um sicherzustellen, dass alle Zellen für jeden Detektor skaliert werden. Passen Sie die Spannungen so an, dass alle Zellen skaliert sind.
- Führen Sie Single Color Controls (SCC) für jedes Fluorophor aus, das in Derfärbecocktails verwendet wird (Tabelle 3). Legen Sie Mikrotiterrohr in ein größeres 5 ml Polystyrolrohr für die Platzierung auf der Durchflusszytometer-Stufe.
HINWEIS: Wurzelfluorophore wie BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) und Alexa700 benötigen nicht den gleichen Antikörper wie der Cocktail (d. h. CD19 PE für CD64 PE). Tandem-Fluorophore wie PE-CF594, PE-Cy7 oder APC-Cy7 benötigen jedoch aufgrund einer möglichen Dissoziation der konjugierten Fluorophore denselben Antikörper für SCC wie Cocktail.- Erstellen Sie den SCC für BV421, indem Sie 2 Tropfen Kompensationsperlen zu einem 1,2 ml Titerrohr zusammen mit 1 L Hamster-Anti-Maus-CD11c BV421 hinzufügen. Kompensationsperlen werden verwendet, da CD11c BV421 ein IgG-Lambda-Subtyp und nicht Kappa ist, wie in 5.3.3 beschrieben. 15 Min. bei 4 °C inkubieren. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.
- Erstellen Sie den SCC für den Live/Dead Farbstoff, indem Sie einen Tropfen positiver Färbeperlen (grüne Kappe) aus den amin-reaktiven Perlen hinzufügen, gefolgt von 1 L Live/Dead Farbstoff. 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Fügen Sie einen Tropfen der negativen Perlen (weiße Kappe) aus der Amin reaktive Perlen. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.
- Erstellen Sie die verbleibenden SCCs, indem Sie einen Tropfen positiver Färbeperlen (grüne Kappe) aus dem Anti-Ratten- und Antihamster-Ig-Kappa-Perlenset hinzufügen, gefolgt von der aufgeführten Antikörpermenge (Tabelle 3) in einem 1,2 ml Titerrohr. 15 min bei 4 °C inkubieren. Fügen Sie einen Tropfen der negativen Perlen (weiße Kappe) aus der Anti-Ratte und Anti-Hamster Ig kappa Perlen-Set. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.
- Wirbel alle Perlenmischungen vollständig. ScCs bei 4 °C für bis zu 3 Tage lagern.
HINWEIS: Das SCC für fluoreszierende Reportermäuse sind ungefärbte Zellen. - Legen Sie beim Ausführen von SCCs Spannungen so fest, dass die SCC-Probe einen Spitzenwert hat, der größer ist als jede Fluoreszenz für eine Zelle im selben Detektorkanal. Darüber hinaus sollten Spannungen so eingestellt werden, dass jeder SCC mindestens 0,5 Log-Differenz zwischen dem Histogramm-Peak im Kanal von Interesse im Vergleich zu jedem anderen Kanal hat (Abbildung 1).
- Führen Sie Beispiele auf "Niedrig" aus, in dem Ereignisse/Sekunden unter 4000 bleiben. Wenn die Durchflussmenge nicht entsprechend gesenkt werden kann, verdünnen Sie Proben mit zusätzlichem Kaltflusspuffer. Zeichnen Sie das hinzugefügte Volumen auf, da dies für die Zählberechnung erforderlich ist (siehe repräsentative Ergebnisse).
- Sammeln Sie mindestens 3 x 106 Ereignisse pro Stichprobe. Dies kann höher sein als die Zellzahl aufgrund von Pigmentgranulat und Schmutz, der als Ereignisse auf Ihrem Zytometer zählt.
- Zeichnen Sie eine Fluoreszenz Minus One (FMO) für jedes Fluorophor außer Live/Dead für eine korrekte Gating-Strategie in Abschnitt 6.4 auf. Ein FMO ist eine Probe, die mit allen Fluorophoren bis auf eine gefärbt wurde.
- Durchflusszytometer gemäß Hersteller- oder Anlagenanweisungen reinigen und herunterfahren.
6. Anmerkung der Durchflusszytometriedaten
- Öffnen Sie ein neues Arbeitsblatt mit Analysesoftware. Importieren Sie FCS-Dateien aus dem Zytometer für alle Proben und einfarbigen Steuerelemente.
- Verwenden Sie SCCs, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen.
- Wenden Sie die Kompensationsmatrix auf Ihre gebeizten Proben und FMOs an.
- Verwenden Sie die FMOs, um positive Färbung zu bestimmen, um Tore zu ziehen.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigte unkompensierte Frequenzhistogramme für die SCCs und Zellen für den roten Laser: Alexa647, Alexa700 und APC-Cy7. In Abbildung 1Azeigte die Magentalinie den Peak des SCC für Alexa647, während die Cyanlinie den beabsichtigten Unterschied von 0,5 Log zeigte. Beachten Sie, dass der Gipfel in Alexa700 und APC-Cy7 links (weniger hell) der Cyan-Linie war. Beachten Sie auch, dass sich die Zellen alle links von der Magentalinie befanden. Zellen rechts vom SCC-Peak wurden nicht kompensiert. Spezifische Kanäle waren dafür bekannt, auf andere basierend auf der Chemie der Fluorchromfarbstoffe zu verschütten (z.B. Violettlaser: BV421 -> V500, Gelb-Grüner Laser: PE -> PE-CF594, Roter Laser: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, Cross Laser: PE-Cy7 -> APC-Cy7). Wenn eine der oben genannten Bedingungen nicht erfüllt ist, könnte die Spannung eines Kanals nach oben eingestellt werden, während alle Verschüttungskanäle nach unten verschoben werden können. Weitere Beispiele für den roten Laser finden Sie in Abbildung 1B und Abbildung 1C. Sobald die Spannungen ermittelt und dann aufgezeichnet wurden, müssen alle Proben mit den Spannungsparametern ausgeführt werden. Ein Assistent zum Einrichten von Entschädigungen ist vorhanden und kann hilfreich sein.
Für die Quantifizierung der Zellzahl ist eine Perekerkennung erforderlich. Abbildung 2A zeigte FSC-A vs SSC-A Eigenschaften für alle analysierten Ereignisse von zwei Augen einer Maus. Es ist wichtig, die SSC-Spannung anzupassen, um sicherzustellen, dass Ihre Zählperlen als eine sehr enge Sammlung von SSC-AHigh- und FSC-A-Low-Events sichtbar sind. Die Anzahl der Perlen wurde gereinigt und durch Plotten VON PE vs APC-Cy7 (Abb. 2B) bestätigt. Saubere Perlen waren ein enger Haufen von PE+ und APC-Cy7- Ereignisse.
Singlets und lebende Zellen wurden als nächstes aus allen Ereignissen identifiziert. Singlets wurden durch Plotten FSC-H gegen FSC-A bestimmt. Singlets waren in diesen beiden Eigenschaften positiv korreliert, während Doppel- und Tripletzellen eine größere FSC-A als FSC-H hatten (Abbildung 2C). Lebende Zellen wurden durch Plotten von Live / Dead vs FSC-A abgegrenzt. Tote Zellen waren Live / Dead positiv, und Zellen zeigen größere FSC-A als Schutt (Abb. 2D). Beachten Sie, dass Zählperlen Live / Dead+ waren und bei diesem Schritt entfernt wurden.
Abbildung 3 zeigt die anfängliche Gating-Strategie für die Abgrenzung mononuklearer Phagozyten aus lebenden Einzelzellen. Live-Singlets wurden mit einem CD45-im-CD11b-Plot visualisiert(Abbildung 3, links). Beachten Sie, dass CD45+CD11b- (meist B-Zellen und T-Zellen), CD45dimCD11b+ (vermeintliche Mikroglia) und CD45+CD11b+ Zellen (infiltrierende Immunzellen, erhöht mit Laser [Abb. 3B, links]) ausgewählt wurden. Das Fehlen von CD45+ Zellen im CD45 FMO bestätigte die Gate-Auswahl (Abbildung 3C, links). Als nächstes Neutrophile, Eosinophile, B-Zellen, NK-Zellen und T-Zellen wurden durch Plotten von CD45+ Live-Singlets mit Lineage Gate (Lin: Ly6G [Neutrophile], SiglecF [eosinophils], B220 [B-Zellen], NK1.1 [NK-Zellen], CD4 [T-Zellen], und CD8 [T-Zellen]) vs CD1b1 ausgeschlossen. Der Anstieg der Gruppen CD11b+Lin- Zellen zwischen No Laser (Abbildung 3A, Mitte) und Laser (Abbildung 3B, Mitte) war leicht zu beobachten. Beachten Sie das Fehlen von CD11b+Lin-Zellen im CD11b-FMO (Abbildung 3C, Mitte) und das Fehlen von Lin+ Zellen im Lin FMO (Abbildung 3C, rechts). Mikroglia kann durch die Menge des CD45-Ausdrucks13,24von infiltrierenden mononukleären Phagozyten getrennt werden. CD11b+Lin- Zellen wurden mit einem CD11b vs CD45 Plot visualisiert, um CD45dim vermeintliche Mikroglia und CD45hoch infiltrierende mononukleäre Phagozyten zu identifizieren. Der relative Anstieg der CD45-Hochmononuklethen war bei der laserbehandelten Maus deutlich(Abbildung 3 A,B, rechts).
Abbildung 4 identifizierte Mikroglia, drei Makrophagen-Untermengen, Monozyten und dendritische Zellen. Mikroglia wurden durch Plotten vonCD45-Dim-Zellen auf einem CD64-gegen-MHCII-Plot bestimmt(Abbildung 4, linkes Panel). Microglia haben sich als CD64+MHCIIniedrig zuvor13gezeigt. Mikroglia waren mit Laser relativ unverändert und fehlten im CD64 FMO(Abbildung 4A,C links). CD45-Hochzellen wurden als nächstes auf demselben CD64-Vs-MHCII-Diagramm dargestellt. CD64+MHCII- Makrophagen (MHCII- Macs), CD64-MHCII- Monozyten und MHCII+ Zellen wurden identifiziert (Abbildung 4A,B, Mitte links). Beachten Sie das Fehlen von MHCII+ Zellen im MHCII FMO (Abbildung 4C, Mitte links). MHCII+ Zellen wurden mit CD64 und CD11c weiter diskriminiert. CD64+CD11c- Makrophagen (CD11c- Macs), CD64+CD11c+ Makrophagen (CD11c+ Macs) und CD64-CD11c+ dendritische Zellen (DCs) wurden definiert (Abbildung 4A,B, Mitte rechts). Beachten Sie das Fehlen von CD11c+ Zellen im CD11c FMO (Abbildung 4C, Mitte rechts). Monozyten wurden als klassische Ly6C+ oder nicht-klassische Ly6C- Monozyten subtypisiert(Abbildung 4, rechts). Beachten Sie das Fehlen von Ly6C+ Monozyten im Ly6C FMO (Abbildung 4C, rechts).
Die Anzahl der Zellen pro Maus (oder pro 2 Augen) wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:
Bei Verwendung der Volumes in dieser Methode lautet die Gleichung wie:
Die Anzahl der Zellen und die Perlenanzahl ist für jede Probe spezifisch. Die Konzentration der Perlen ist spezifisch für jede Menge Zählperlen und wird vom Hersteller auf jeder Durchstechflasche bereitgestellt.
Makrophagen infiltrieren die Aderhaut nach Laserverletzung25, und Makrophagenerschöpfung reduziert CNV-Bereich18. Diese älteren Studien stützen sich auf die Immunfluoreszenz-Bildgebung, die mononukleäre Phagozyten nicht zuverlässig unterscheiden kann, oder weniger zytometrische Durchflussmarker für die Makrophagenidentifikation. Makrophagenheterogenität ist ein neu entstehendes Konzept in der angeborenen Immunologie, wo Makrophagen in der Lage sind, mehrere Funktionen je nach Herkunft und Gewebemikroumgebung auszuführen12,26. Wir führten multiparameter-Flow-Zytometrie an unbehandelten und laserbehandelten Mausaugen an Tag 3 nach Laserverletzungen durch, um mononukleäre Phagozyten und Makrophagenheterogenität zu identifizieren. Die Laserbehandlung erhöhte mHCII-, CD11c-und CD11c+ Makrophagen um 7.0-25.6, 2.8-7.2 und 3.9-8.2 falten(Abbildung 5A,C). Die Anzahl der dendritischen Zellzahlen wurde ebenfalls 4,5-4,7-fach per Laser hochreguliert (Abbildung 5F). Die Anzahl der Mikroglia- und Monozytenzahlen wurde durch die Laserbehandlung nicht beeinflusst (Abbildung 5D,E). Vor der Enukleation wurden keine signifikanten Unterschiede mit oder ohne systemische Perfusion festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen erhöhte Makrophagenpopulationen und dendritische Zellen nach Laserverletzungen ohne Änderung von Mikroglia oder Monozyten. Darüber hinaus zeigen diese Daten, wie multiparameter-Flow-Zytometrie Makrophagenheterogenität erkennen kann.
| Antikörper oder Puffer | Fluorophor | Klon | Betrag pro Probe (ng) |
| Ratte Anti-Maus Ly6C | Fitc | AL-21 | 15 |
| Maus Anti-Maus CD64 | Pe | X54-5/7.1 | 40 |
| Ratte Anti-Maus Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 300 |
| Hamster Anti-Maus CD11c | BV 421 | HL3 | 300 |
| Ratte Anti-Maus Ly6G | PE-CF594 | 1A8 | 10 |
| Maus Anti-Maus NK1.1 | PE-CF594 | PK136 | 10 |
| Ratte Anti-Maus Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 20 |
| Ratte Anti-Maus B220 | PE-CF594 | RA3-6B2 | 20 |
| Ratte Anti-Maus CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | 40 |
| Ratte Anti-Maus CD4 | PE-CF594 | RM4-5 | 20 |
| Ratte Anti-Maus MHC II | AlexaFluor 700 | M5/114.15.2 | 2.5 |
| Ratte Anti-Maus CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 2 |
| Ratte Anti-Maus CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 6 |
| MACS-Puffer |
Tabelle 1: Antikörperfluorophor und Klone (siehe Schritt 4.9). Im Allgemeinen ist eine Probe entweder ein oder zwei verdauliche Augen. Fügen Sie einem Rohr zuerst einen Durchflusspuffer hinzu, dann jeden Antikörper. Verdünnungen können vorgenommen werden, um zu vermeiden, dass ein zu kleines Volumen zu klein wird, während das Gesamtdurchflusspuffervolumen entsprechend geändert wird. Siehe Tabelle der Materialien für Produktnummer und Unternehmen.
| Laser | PMT-Steckplatz | Filter | Spiegel | Farben |
| Violett (405nm) | Eine | 525/50 | 505LP | V500 oder AmCyan |
| B | 450/50 | Pacific Blue, eFluor 450, V450 oder BV421 | ||
| Blau (488nm/FSC) | Eine | 710/50 | 685LP | PerCP-Cy5.5, PerCP, PI oder 7AAD |
| B | 525/50 | 505LP | FITC, CFSE, GFP oder AlexaFluor 488 | |
| C | 488/10 | Ssc | ||
| Gelb-Grün (561nm) | Eine | 780/60 | 735LP | PE-Cy7 |
| B | 610/20 | 600LP | PE-CF594, mCherry oder DsRed2 | |
| C | 582/15 | Pe | ||
| Rot (640nm) | Eine | 780/60 | 735LP | APC-Cy7, APC-H7 oder APC-eFluor 780 |
| B | 730/45 | 690LP | AlexaFluor 700 | |
| C | 670/30 | APC oder AlexaFluor 647 |
Tabelle 2: Konfiguration des Durchflusszytometers. Filter- und Spiegelaufbau für ein Vierlaser-Zytometer und die verfügbaren Fluorophore, die in jedem Kanal detektiert werden können. PMT = Photomultiplierrohr, FSC = Vorwärtsstreuung, SSC = Seitenstreuung.
| Antikörper | Fluorophor | Klon | Betrag pro SCC (ng) |
| Ratte Anti-Maus CD45 | Fitc | 30-F11 | 500 |
| Ratte Anti-Maus CD19 | Pe | 1D3 | 40 |
| Ratte Anti-Maus Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 100 |
| Hamster Anti-Maus CD11c | BV421 | HL3 | 200 |
| Ratte Anti-Maus Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 40 |
| Ratte Anti-Maus CD19 | AlexaFluor 700 | 1D3 | 200 |
| Ratte Anti-Maus CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 200 |
| Ratte Anti-Maus CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 200 |
| Live / Dead Dye | eFluor 506 | N/A | 1 l |
Tabelle 3: Antikörperfluorophor und Klone für einfarbige Kontrollen. Jeder Antikörper sollte der entsprechenden Kompensationsperle gemäß den Schritten 5.3.1 – 5.3.3 hinzugefügt werden.
Abbildung 1: Repräsentative Spannung für den roten Laser eingerichtet. (A) Single Color Controls (SCCs) für Alexa647. Auf der linken Seite wird der SCC für Alexa647 angezeigt. In der linken Mitte wird das Auslaufen des Alexa647 SCC in den Alexa700-Kanal angezeigt. Die Spitze des Alexa647 SCC wird in Magenta und die 0,5 Log Zieldifferenz in Cyan angezeigt. Beachten Sie, dass der Peak links (weniger hell) als die Cyan-Linie ist. Mitte rechts zeigt das Auslaufen des Alexa647 SCC in den APC-Cy7-Kanal. Rechts zeigt die Zellen im Alexa647-Kanal. Beachten Sie, dass alle Zellen weniger hell sind als die SCC (Magenta-Linie). (B) SCC für Alexa700. Mitte links zeigt den SCC für Alexa700. Links zeigt das Auslaufen des Alexa700 SCC in den Alexa647-Kanal. Mitte rechts zeigt das Auslaufen des Alexa700 SCC in den APC-Cy7-Kanal. Die Spitze des Alexa700 SCC wird in Magenta und die 0,5 Log Zieldifferenz in Cyan angezeigt. Beachten Sie, dass der Peak links (weniger hell) als die Cyan-Linie ist. Rechts zeigt die Zellen im Alexa700-Kanal. Beachten Sie, dass alle Zellen weniger hell sind als die SCC (Magenta-Linie). (C) SCC für APC-Cy7. Links und links zeigen die Verschüttung des APC-Cy7 SCC in Alexa647 bzw. Alexa700. Beachten Sie, dass sich beide Spitzen links von der Cyan-Linie befinden. Mitte rechts zeigt den ACP-Cy7 SCC. Rechts zeigt die Zellen im APC-Cy7-Kanal. Beachten Sie, dass alle Zellen weniger hell sind als die SCC (Magenta-Linie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Identifizierung von Zählperlen, Singlets und lebenden Zellen. (A) Seitenstreufläche (SSC-A) vs. Vorwärtsstreufläche (FSC-A) für alle Zellen in einem Konturdiagramm. Zählperlen werden durch hohe SSC-A, niedrige FSC-A und sehr enge Clusterbildung der einheitlichen Perlen identifiziert. (B) PE vs APC-Cy7 Plot für sauberes Perlentor. Der Pfeil zwischen A und B zeigt das Plotten nur der Zählperle positive Ereignisse an. Saubere Zählperlen werden durch hohe PE- und niedrige APC-Cy7-Fluoreszenz abgegrenzt. (C) FSC-Height (FSC-H) vs FSC-Area (FSC-A) Plot aller Zellen zeigt Singlet-Zellen in einer positiv korrelierten breiten Linie. Doublets und andere Multiplets weisen eine größere FSC-Fläche auf als FSC-Height. (D) Live / Dead vs FSC-A für Singlet-Zellen. Lebende Zellen werden als Live / Dead low und FSC-A positiv definiert. Prozentsätze geben prozentual den Anteil des übergeordneten Elements an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Identifizierung mononuklearer Phagozyten. Links: CD45 vs CD11b Pseudocolor-Plot von lebenden Zellen aus unlasered (A), gelasert (B), und Fluoreszenz minus ein (FMO) Steuerung (C). Links: CD45+ Zellen sind in A-B definiert und im FMO nicht vorhanden. Beachten Sie die Zunahme von CD45+CD11b+ Zellen in der gelaserten (B) Gruppe. Mitte: Pseudocolor-Plot der Abstammung (Lin) Marker vs CD11b für CD45+ Zellen. CD11b+Lin- Zellen sind in A-B abgegrenzt und fehlen im FMO für CD11b (unten). Rechts: CD11b vs CD45 Plot von CD11b+Lin- Zellen. CD45Dim und CD45hohe Zellen werden identifiziert. Beachten Sie die Zunahme derCD45-Hochzellen in der gelaserten (B) Gruppe. Prozentsätze geben prozentual den Anteil des übergeordneten Elements an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Identifizierung von Mikroglia, dendritischen Zellen, Monozyten und Makrophagen-Teilmengen. Links: CD64 vs MHCII Pseudocolor Plot von CD45Dim-Zellen definiert Mikroglia als CD64+MHCIIniedrig. Beachten Sie die ähnliche Menge an Mikroglia in unlasered (A) und gelasert (B) Gruppen, und das Fehlen von Mikroglia in der FMO-Steuerung (C). Mitte links: CD64 vs MHCII Pseudocolor Plot von CD45high Cells definiert MHCII- Makrophagen als CD64+MHCII-, Monozyten als CD64-MHCII-und MHCII+ Zellen. Beachten Sie die Zunahme der MHCII-Makrophagen in der gelaserten Gruppe (B), das Fehlen von MHCII+-Zellen im FMO (C, Mitte) und der CD64 FMO (C, links) halfen bei der Bestimmung des Cutoffs für CD64+ und CD64-Zellen. Mitte rechts: CD64 vs CD11c Pseudocolor-Plot von MHCII+ Zellen. CD11c- Makrophagen wurden definiert als CD64+CD11c-, CD11c+ Makrophagen wurden als CD64+CD11c+identifiziert, und dendritische Zellen (DCs) wurden als CD64-CD11c+abgrenzet. Sowohl Makrophagen-Untermengen als auch dendritische Zellen wurden mit Laser (B) erhöht. Beachten Sie das Fehlen von CD11c+ Zellen im FMO (C). Rechts: Ly6C vs Tim4 Pseudocolor Plot von Monozyten. Klassische Ly6C+ und nicht-klassische Ly6C- Monozyten wurden identifiziert. Beachten Sie, dass klassische Ly6C+ Monozyten im Ly6C FMO (C) fehlten. Prozentsätze geben prozentual den Anteil des übergeordneten Elements an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Daten für mononukleare Phagozyten zwischen unlasered und gelaserten Mäusen sowohl mit als auch ohne systemische Perfusion. MHCII- (A), CD11c- (B) und CD11c+ (C) Makrophagenzahlen wurden alle mit Laser erhöht. Es wurden keine Veränderungen zwischen unlasered und gelasert mikroglia (D) oder monozyten (E) festgestellt. Dendritische Zellen (DC) wurden auch mit Laser (F) erhöht. Brown Forsythe und Welch ANOVA mit Dunnetts T3-Mehrfachvergleichstest wurden verwendet, um statistische Unterschiede aufgrund ungleicher Abweichungen zwischen Gruppen zu definieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die quantitative Analyse mehrerer Zelltypen in einem komplexen Gewebe. In diesem Bericht beschreiben wir die zytometrische Durchflussdetektion mononuklearer Phagozytenpopulationen, einschließlich Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen-Untergruppen, nach Laserverletzungen im Mausauge. Liyanage et al vor kurzem berichtet eine ähnliche Gating-Strategie, um Neutrophile zu erkennen, Eosinophile, Lymphozyten, DCs, Makrophagen, infiltrierende Makrophagen, und Monozyten27. Unsere Gating-Strategie unterscheidet sich in erster Linie durch die Hinzufügung von CD64. Liyanage et al identifiziert DC als CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ Zellen und Makrophagen als CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- Zellen. Wir identifizieren DC als CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- Zellen und Makrophagen als CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD64+ Zellen. Die Verwendung von CD64 zur Unterscheidung von DC von Makrophagen ist gut etabliert6, und diese Strategie ermöglicht es uns, Makrophagenheterogenität zu identifizieren, einschließlich CD11c+ Makrophagen. Die Hauptbeschränkung dieser Methode ist, dass sie keine Daten über die Gewebearchitektur oder die Position bestimmter Zellen im Auge liefert. Um festzustellen, ob sich diese Zellen in der Netzhaut, Aderhaut, Iris oder einer anderen Augenstruktur befinden, kann unser Protokoll mit histologischen Methoden kombiniert oder modifiziert werden, um eine umfassendere ophthalmologische Dissektion einzubeziehen, um die Multiparameter-Durchflusszytometrie auf jedem Ook-Subkom individuell auszuführen.
Wir haben das Protokoll für die Verdauung ganzer Mausaugen optimiert, um Abweichungen zu verhindern, die durch Sezieren entstehen. Zum Beispiel könnte die Zerlegung von hinteren Augenbechern mit Entfernung von Hornhaut, Iris und Linse Variabilität von zurückgehaltenem Iris- oder Hornhautmaterial (Untersektion) oder erhöhte Laserverletzungen im normalen hinteren Augenbecherbereich (Überdintisierung) erzeugen. Unser Vergleich zwischen kontrollunlaserten und gelaserten Augen erkennt die Infiltration mononuklearer Phagozyten aufgrund von Retinochoridalenverletzungen. Für die Analyse der Auswirkungen systemischer Erkrankungen auf das Auge, d.h. Uveitis und Diabetes, ist eine individuelle augenokuläre Subkompartimmentanalyse unerlässlich. Die Methode der Verdauung, in Abschnitt 2 des Protokolls, ist die kritischste, während andere Schritte in Abschnitt3 - 5 erfolgreich auf mehreren Gewebetypen24verwendet wurden. Wir gelangten zu unseren Verdauungsbedingungen durch eine iterative Methode, die beinhaltete: (1) Prüfung der chemischen Verdauungsmethode (Collagenase D vs. Verdauungsenzym), (2) Bestimmung der Länge der chemischen Verdauung (30, 60 und 90 Minuten) und (3) Zugabe der mechanischen Verdauung (keine, einmal, zweimal, dreimal). Bei jedem Schritt beurteilten wir den Erfolg der Verdauungsbedingungen anhand der Zelllebensfähigkeit und der Anzahl der CD45HiCD64+ (infiltrierenden Makrophagen) Zellen. Wir fanden heraus, dass das Verdauungsenzym (siehe Ergänzende Materialtabelle) mehr lebende Zellen zurückgewonnen hat als Collagenase D, und der Versuch, die Hälfte der Konzentration des Verdauungsenzyms zu versuchen, führte zu weniger infiltrierenden Makrophagen. Als nächstes haben 60 Minuten chemischer Verdauung mit mechanischer Verdauung die infiltrierenden Makrophagenpopulationen fast verdoppelt. Drei mechanische Verdauungen waren optimal mit 25-30% lebenden Zellen von Singlets und den infiltrierendsten Makrophagenpopulationen. Schließlich verursachten schnellere mechanische Verdauungsbedingungen schweren Verlust sowohl von lebenden Zellen als auch von Makrophagen.
In Zukunft schlagen wir vor, die Methode zu erweitern, indem man die Hornhaut, Die Iris und die Linse entfernt, gefolgt von der getrennten Verdauung der Netzhaut und der hinteren Augentasse (Sklera, Aderhaut und retinale pigmentiertes Epithel). Mit dieser Modifikation erwarten wir, die Verdauungsbedingungen aufgrund der proteinhaltigen und dichten Eigenschaften der Linse bzw. Der Hornhaut zu reduzieren. Diese Reduktionen könnten eine verminderte Konzentration des Verdauungsenzyms, den Wechsel zu Kollagennase, eine verminderte Verdauungszeit oder eine verminderte Menge an mechanischer Verdauung umfassen. Wir erwarten insgesamt reduzierte Verdauungsbedingungen für die hintere Augentasse und weitere verminderte Verdauungsbedingungen für die Netzhaut allein.
Weitere zukünftige Richtungen sind die Erweiterung unseres konventionellen Multiparameter-Flow-Zytometrie-Panels auf ein herkömmliches 6-Laser-Instrument oder Spektralflusszytometrie. Die Spektralflusszytometrie ermöglicht die Fluorophordetektion über das gesamte Spektrum, anstatt durch die verfügbaren Filter bestimmt zu werden. Spektrale Durchflusszytometrie führt zu einer spezifischeren Farberkennung. Die spektrale Strömungszytometrie erfordert jedoch eine völlig neue Reihe von Überlegungen und geht über den Rahmen dieses Manuskripts hinaus. Weitere Informationen finden Sie in diesem aktuellen JoVE-Artikel28. Die 6 Laserinstrumente verfügen über einen ultravioletten Laser, der 6-9 Detektoren hinzufügt. Beim Hinzufügen von Markern zu einem Mausaugenfluss-Zytometrie-Panel empfehlen wir die Erkennung von mehr Augenzelltypen. Beispielsweise könnte das Lineage-Gate getrennt werden, um Neutrophile, Eosinophile, Mastzellen, NK-Zellen und Lymphozyten unabhängig voneinander zu erkennen. Es wird nicht empfohlen, die Teilmengendetektion mononuklearer Phagozyten aufgrund der geringen Anzahl von Makrophagen im stationären Zustand zu erhöhen. Bei der Zugabe neuer Antikörper empfehlen wir eine sorgfältige Antikörpertitration.
Zusammenfassend haben wir eine anpassungsfähige, robuste Methode zum Nachweis mononuklearer Phagozytenpopulationen im Mausauge vorgestellt. Aufgrund der stark überlappenden Zelloberflächenmarker von Monozyten, dendritischen Zellen, Makrophagen und Mikroglia ist die Multiparameter-Durchflusszytometrie die beste Methode, um diese Zellpopulationen zu erkennen. Die Durchflusszytometrie kann für die Analyse von Zelltypen, Schicksalskartierung und/oder Zellsortierung für die transkriptomische oder proteomische Auswertung verwendet werden. Seine Hauptbeschränkung ist der Mangel an Gewebearchitektur, und wichtige Erkenntnisse können mit der traditionellen Histologie bestätigt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
JAL wurde durch den NIH-Zuschuss K08EY030923 unterstützt; CMC wurde durch ein K01-Stipendium (5K01AR060169) des NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases und ein Novel Research Grant (637405) der Lupus Research Alliance unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
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