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Immunology and Infection

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/61348
* These authors contributed equally

Summary

このプロトコルは、単球、ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞を含む特定の眼単核貪食集団を同定するために、多パラメータフローサイトメトリック分析を目的として、目全体を単一細胞懸濁液に消化する方法を提供する。

Abstract

自然免疫系は、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症を含む眼部病態生理学において重要な役割を果たしている。自然免疫細胞、特に単核食細胞は、重なり合う細胞表面マーカーを発現し、これらの集団を同定することが課題となる。マルチパラメータフローサイトメトリーは、マウス目の単球、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞を区別するために、複数の細胞表面マーカーの同時定量分析を可能にします。このプロトコルは、マウスの目全体の核分裂、眼圧解剖、単一細胞懸濁液への消化、および骨髄細胞マーカーに対する単一細胞懸濁液の染色について説明する。また、単色制御を用いて電圧を決定する方法や、蛍光から1つの制御を使用して正のゲートを引いた正のゲートを引いたものを解法するための適切な方法を説明します。マルチパラメータフローサイトメトリーの主な制限は、組織アーキテクチャの欠如です。この制限は、個々の眼区画のマルチパラメータフローサイトメトリーまたは無料の免疫蛍光染色によって克服することができる。しかし、免疫蛍光は、定量分析の欠如とほとんどの顕微鏡の蛍光体の数の減少によって制限されます。レーザー誘導脈絡膜新血管化における単核食細胞の定量的分析を提供するマルチパラメトリックフローサイトメトリーの使用について述べた。さらに、マルチパラメータフローサイトメトリーは、マクロファージサブセットの同定、運命マッピング、およびトランスクリプトームまたはプロテオミクス研究のための細胞分類に使用することができる。

Introduction

自然免疫系には、補体の活性化および炎症を刺激する複数の細胞タイプが含まれる。自然免疫細胞には、ナチュラルキラー(NK)細胞、肥満細胞、好塩基球、好酸球、好中球、および単核食細胞が含まれる。単球、マクロファージ、樹状細胞からなる単核食細胞は、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)1を含む複数の眼科病態の病態生理に関与している。このプロトコルでは、新血管AMD2のマウスモデルにおける多パラメータフローサイトメトリック解析を用いた単核食細胞の同定に焦点を当てる。このプロトコルは、糖尿病性網膜症および/またはuveitisのマウスモデルに適応可能であるが、これらの疾患の全身的な性質のために、より広範な眼解剖が推奨される。

単核食細胞は、重なり合う細胞表面マーカーを発現する。長期にわたる組織居住マクロファージおよびミクログリアは、黄身嚢由来のエリスロメロイド前駆体3に由来し、一方、マクロファージおよび樹状細胞を骨髄由来のマクロファージ樹状細胞前駆細胞4から分化した。単球に共通するマウス細胞表面マーカーは、マクロファージ、および樹状細胞、CD45、CD11b5、F4/806、Cx3cr17、および細胞内マーカーIba1 8を含。この課題を克服するために、複数の組織からマクロファージ、単球、および樹状細胞のトランスクリプトーム解析は、CD64をマクロファージ特異的細胞表面マーカー6と定義する。マクロファージは、虹彩、脈絡膜、毛様体、及び健康眼における視神経3に記載されている。あるいは、樹状細胞の識別がより困難である。樹状細胞同定の最も具体的な方法は、Zbtb46-GFPレポーターマウス9を使用して運命マッピングを必要とします。このレポーターラインとは無関係に、CD64の存在と併せてCD11cおよびMHCIIの発現は、潜在的な樹状細胞6,10を同定することができる。樹状細胞は正常眼11において角膜、結膜、虹彩、および脈絡膜で同定されている。ミクログリアは、そのレチナに位置する特殊なマクロファージであり、血液-腎障害によって保護され、黄身嚢前駆細胞12に由来する。その結果、レチナルミクログリアは、CD45発現13のそれらの薄暗いレベルと高レベルのTmem119によって単球由来マクロファージと区別することができ、これはフローサイトメトリー抗体14として利用可能である。しかし、ミクログリアの活性化時には、CD45はアップレギュレーション15、Tmem119はダウンレギュレート3となり、ミクログリア生物学の複雑さを示し、AMDとそのマウスモデルの両方に関連する可能性があります。最後に、単球は、古典と非古典的を含む少なくとも2つのサブタイプに分けることができます。古典的な単球ディスプレイCCR2+Ly6C高CX3CR1発現、および非古典的単球はCCR2-Ly6C低CX3CR1ハイマーカー5を実証する。

マーカー発現の定量的分析、すなわち、高いレベルと低/薄暗いレベルの必要性により、多パラメータフローサイトメトリーは、眼および他の組織における単球、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞間の識別に理想的な方法である。その他の利点としては、サブ集団の同定、蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用して、転写またはプロテオミクス解析のために細胞集団を分類する能力、および運命マッピングが含まれる。マルチパラメータフローサイトメトリーの主な欠点は、組織アーキテクチャの欠如です。これは、角膜、結膜、虹彩、レンズ、失膜、および脈絡膜-スクレラ複合体:様々な眼部区画への眼圧解剖によって克服することができる。さらに、確認免疫蛍光イメージングを行うことができますが、マーカーの数と堅牢な定量の欠如によって制限されます。

ゲノムワイド関連研究は、複数の補体遺伝子をAMD16と結合している。補体活性化はアナフィラトキシン産生、白血球のリクルート、および結果として生じる炎症をもたらす。補体受容体欠損マウスにおいて、レーザー傷害は、単核食細胞の動員およびレーザー誘導脈絡膜新血管化(CNV)領域17を減少させる。同様に、C-Cモチーフケモカイン受容体2(CCR2)ノックアウトマウスは、組織への単球募集に欠損しており、単核食細胞のリクルートとレーザー誘導CNV領域18の両方を示す。これらのデータは、実験的CNVおよびおそらく新血管AMDを有する単核食細胞を補完する。この関連を支持して、補体受容体は、新血管AMD19,20の患者において末梢血単球に対して調節不全である。これらのデータは、AMDと単核食細胞との間の強い関連を示す。

本稿では、実験レーザー誘導CNVモデルを用いて、マルチパラメータフローサイトメトリーを用いてマウスアイ中の単核食細胞集団を特徴付ける。レーザー誘導CNVは、新血管AMDの標準的なマウスモデルであり、現在の第1線新幹線AMD療法21の有効性を実証した。このプロトコルは、マウスの目の核形成、眼解剖、単一細胞懸濁液への消化、抗体染色、単色制御を用いたレーザー電圧の決定、および蛍光マイナス1(FMO)制御を用いた測定戦略について説明する。レーザー誘発CNVモデルの詳細な説明については、前の出版物22を参照してください。このプロトコルを用いて、ミクログリア、単球、樹状細胞、マクロファージ集団を定義する。さらに、MHCIIとCD11cを用いて、レーザー誘導CNVモデル内のマクロファージサブセットをさらに定義します。

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Protocol

すべての手続きは、ノースウェスタン大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。C57BL/6マウスは、ノースウェスタン大学比較医学センター(イリノイ州シカゴ)のバリア施設に収容された。すべての動物は、食料と水への無料アクセスで12/12時間の明暗サイクルに収容されました。

1. 眼組織の採取

  1. マウスが反応せず、もはや吸入しなくなるまで、二酸化炭素の調節された投与を使用して、いずれかの性別の10-12週齢のC57BL/ 6Jマウスを犠牲にする。頸部脱臼または他の承認された二次的方法を行い、安楽死を確実にする。
    注:経心筋灌流は、眼組織にない循環性白血球を除去するために行うことができる。この実験では、全身灌流は、ミクログリア、単球、マクロファージ、またはレーザー処理された全眼で検出された樹状細胞の数を減らさない。したがって、これらの細胞タイプの大部分は眼組織に位置しており、このステップは任意である。
  2. 目を引き起動させるには、ソケットの外に出ると、湾曲した鉗子を目の下にそっと置きながら、目のソケットの近くを押し下げます。実際の目を絞らずに目の下に閉じたピンチ鉗子。周囲の結膜から眼を取り除く(事前の出版物を参照してください)23.
  3. 視神経が目を切り離す唯一の残りの接続になるまで、横に目を引きます。視神経はしばしば緊張で切断するが、視神経を切るために小さいはさみが必要な場合もある。1.7 mLマイクロ遠心分離チューブにカルシウムとマグネシウムを入れたコールド1xハンクの緩衝生理液(HBSS)に目を入れます。

2. 眼組織の消化

  1. 0.1 mg/mL消化酵素と0.2 mg/mL DNaseを含む消化バッファーを冷たいHBSSで調製します。最初は滅菌水の2 mLで5mgの消化酵素を再構成する。HBSSで10mg/mL DNaseの初期希釈を準備します。消化バッファーの10 mL(3匹分の十分)ごとに、9.4mLの冷たいHBSSを0.4 mLの再構成消化酵素と希釈DNase Iを混ぜます。
    注:これらの濃度は、細胞死を減らしながら、単一細胞の抗体染色の最適なレベルを提供するために、複数の実験で経験的に決定されました。コラゲナーゼDは、細胞生存率を低下させ、CD45+細胞を減少させた消化酵素の代替として試みた。消化を最適化するための反復プロセスの詳細については、議論を参照してください。
  2. 全拡大率10倍の解剖顕微鏡の下で、冷たいHBSSで微細な鉗子とスプリングハサミを使用して残りの結膜と視神経を取り除きます。
  3. きれいな目を乾燥した解剖皿または小さな重量を量るボートに移しなさい。視覚軸を通して目に2つの穿ファリング創傷が作られ、消化バッファー出口のためのこの最初の創傷から90°離れた後、30 G針を取り付けた注射器を介して0.15-0.20 mL/目の消化バッファーを眼窩腔に注入します。
  4. 0.5 mm x 0.5 mm 未満のすべての部分を持つスプリングハサミと細かい鉗子を使用して目全体をミンチ。後のステップでピペットの先端を詰まらせないように鉗子を介して鈍い機械的破壊とレンズティッシュを解体する。各サンプルに対して、0.75 mLの消化バッファーを小皿に洗い換えます。サンプルごとに新しい料理を使用します。
  5. ピペット移動で材料を失わないように注意してP1000ピペットを使用して氷上の解離チューブに皿の内容物を移します。さらに1.5 mLの消化バッファーで皿をリンスし、解離管の総容積を3.25〜3.50 mLにします。
  6. 解離管を電子解離器に反転させ、サイクル「m_brain_03_01」を実行し、200rpmで1minの単方向回転を室温で構成し、プリロードプログラムです。すべての組織が消化バッファーとこれおよびすべての残りのステップのためのローターと接触している解離管の底にあることを確認してください。
  7. 37°Cで200rpmで30分間揺れるインキュベーターに解離管を置きます。
  8. ステップ 2.6 と 2.7 を 1 回繰り返します。2回目の30分インキュベーションに続いて、ステップ2.6のように電子解離器を使用して1つの最終的な機械的消化を行う。
  9. 10 mLのコールドフローバッファーを加えて反応を停止し、チューブを氷の上に置きます。

3. 細胞懸濁液の調製

  1. 単一細胞懸濁液を作成するには、50 mL円錐形遠心分離管の上部に配置された40 μmフィルターを介して停止した眼の消化反応を注ぎます。2.5 mLの注射器からプランジャーを使用して、残りの未消化眼組織をフィルターに押し込みます。
  2. 同じプランジャーを使用して再び未消化の眼組織片をフィルターに通す前に、フローバッファーとリンスフィルターの10 mLで解離チューブを洗浄します。
  3. 5 mL のフローバッファを使用して、ステップ 3.2 を繰り返します。
  4. 解離管を洗浄し、フローバッファーの最後の 10 mL でフィルターします。
    注:消化およびフローバッファの総量は、各サンプルで約38〜40 mLです。
  5. 円錐管を4°Cで10分間 400xg で遠心する。細胞ペレットを乱さずに上清をデカントする。
  6. 滅菌水に10倍溶解溶液を加えて1x溶解液を調製します。別のチューブにチューブをフリックしてペレットを分割します。赤血球を溶解するには、室温(RT)で渦巻く30 sの1x溶解溶液の1mLを加える。
  7. 20 mLのフローバッファで反応を停止します。
  8. 円錐管を4°Cで10分間 400xg で遠心する。細胞ペレットを乱さずに上清をデカントする。
  9. 別のチューブにチューブをフリックしてペレットを解化します。チューブあたり5 mLのコールド1x HBSSを追加します。
  10. 遠心管 400xg で4°Cで10分間。吸気上清。

4. 単核食細胞の細胞懸濁液の染色

  1. 冷たいHBSSでライブ/デッド染料1:500を希釈することにより、サンプルごとに0.5 mLのライブ/デッド染色を準備してください。
  2. P1000ピペットを使用して各サンプルにライブ/デッド染色を加え、ペレットを完全に解約してください。サンプルを1.2 mLマイクロ価器チューブに移します。
  3. 小さなアリコート(10 μL)を取り、ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンター(4.4参照)を使用して細胞を数えます。暗闇の中で室温で15分間、ライブ/デッド染色でサンプルをインキュベートします。
  4. Trypan ブルーを使用してセル数をカウントし、サンプルあたりのライブ セル数を決定します。
    注:通常、10-12週齢のC57BL/6Jマウスの2つの目は、2 x 106個 の生細胞未満を含んでいます。
  5. 400 μL のコールド フロー バッファを加えてサンプルを洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。
  6. 500 μL のコールド フロー バッファで細胞を完全に再懸濁します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。
  7. Fcブロックの50 μL(精製ラット抗マウスCD16/CD32のコールドフローバッファーでの1:50希釈)で最大5 x 106の生細胞をブロックします。5 x 106個以上の細胞の場合は、ボリュームを適宜増やしてください。
  8. サンプルを完全に解体するようにペレットにFc ブロックを加えます。4°Cで20分間インキュベートします。
  9. 50 μLの抗体染色溶液(溶液に含まれる各抗体の選択量については表1を参照)を、生細胞あたり5 x 106の細胞を直接Fcブロック内の細胞に加え、完全に混合します。4°Cで30分間インキュベートします。
    注:抗体量はフローサイトメーターの構成に依存し、各ラボと機器に対して個別に滴定する必要があります。フィルターとミラーのインストゥルメント構成については、 表 2 を参照してください。抗体を評価するには、メーカーの推奨から始め、染色指数を計算します。様々な抗体濃度(メーカーの推奨値の上下)の試験実行を行い、染色指数が維持される抗体の最低濃度を選択します。また、単色コントロールよりも明るい正の染色を確認してください。負の染色されたセルがスケールで、1 x 102未満のピークを持つことを確認するために、染色されていないセルを使用します。正に染色された細胞を定義するには、蛍光から 1 つのコントロールを引いたものを使用します。
  10. 700 μL のコールド フロー バッファを加えてサンプルを洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。
  11. 場合によっては、抗体染色後、フローバッファー内のパラホルムアルデヒドを500 μLの2%で固定できます。室温で15分間サンプルを固定します。次に、4.10に記載のとおり1回の洗浄を行う。4 °Cで固定サンプルを保管してください。カウントビードは、フローサイトメトリーデータ収集の日に追加する必要があります。固定サンプルは、1〜2日でフローサイトメーターで実行する必要があります。
    注意:パラホルムアルデヒドは腐食性および健康上の危険である。
  12. 500 μL のコールド フロー バッファを使用して、サンプルを再度洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱すことなく上清の半分を吸引する。
  13. ペレットを再懸濁し、96ウェルのUボトムアッセイプレートに移します。遠心板 400xg で5分4°Cで。上清をデカントするには、プレートをひっくり返し、1つの強いシェイクでペレットを乱すことなく、液体をシンク盆地に取り除きます。
  14. 新しい1.2 mLマイクロ・トイターチューブに、50 μLのウェルボルテックス・カウントビーズを配置します。
  15. 200 μL のコールド フロー バッファで 96 ウェル プレートにペレットを再懸濁します。前のステップからビーズの上に細胞混合物を追加します。250 μL/マイクロ力さチューブの総容積でフローサイトメーターで実行します。

5. フローサイトメトリーデータの収集

  1. オンにして、フローサイトメーターを準備します。ここに記載されている指示は、修正された4つのレーザーサイトメーターのためのものです(表2)。
  2. 各サンプルの小さなアリコートを含むテストサンプルを実行し、各検出器のすべてのセルがスケールであることを確認します。すべてのセルがスケールになるように電圧を調整します。
  3. 染色カクテルに使用されるフルオロフォアごとに単一のカラーコントロール(SCC)を実行する(表3)。マイクロ力価チューブを大きな5 mLポリスチレンチューブに入れ、フローサイトメーターステージに配置します。
    注:BV421(パシフィックブルー)、FITC、PE、Alexa647(APC)、Alexa700などの根管内フルオロフォアは、カクテルと同じ抗体を必要としません(CD64 PEのCD19 PE)。しかし、PE-CF594、PE-Cy7、またはAPC-Cy7のようなタンデムフルオロフォアは、コンジュゲートフルオロフォアの解離の可能性があるため、カクテルと同じSCC抗体を必要とします。
    1. 1.2 mLのタイターチューブに2滴の補償ビーズを加え、ハムスターアンチマウスCD11c BV421を1μLと一緒に追加して、BV421用のSCCを作成します。補正ビーズは、CD11c BV421が5.3.3で説明したようにカッパではなくIgGラムダサブタイプであるため使用されます。4°Cで15分間インキュベートします。0.2 mL のフロー バッファを追加します。
    2. アミン反応性ビーズから正の染色ビーズ(グリーンキャップ)を1滴加え、その後1 μLのライブ/デッド染料を追加して、ライブ/デッド染料用のSCCを作成します。暗闇の中で室温で15分間インキュベートします。アミン反応性ビーズからマイナスビーズ(白キャップ)を1滴追加します。0.2 mL のフロー バッファを追加します。
    3. 抗ラットおよび抗ハムスターIgカッパビーズセットから正の染色ビーズ(緑色のキャップ)を1滴加え、続いて1.2 mLの塊茎チューブに記載されている抗体量(表3)を加えて、残りのSCCを作成します。4°Cで15分間インキュベートします。アンチラットとアンチハムスターIgカッパビーズセットからマイナスビーズ(白キャップ)の1滴を追加します。0.2 mL のフロー バッファを追加します。
    4. 渦は完全にすべてのビーズ混合物。SCCは4°Cで3日間保存します。
      注:蛍光レポーターマウスのSCCは、染色されていない細胞です。
    5. SCCを実行する場合、SCCサンプルが同じ検出器チャネル内の細胞のサンプルに対してどの蛍光よりも大きいピークを有するような電圧を設定する。さらに、任意のSCCが、対象チャネルのヒストグラムピークと他のチャンネルとの間に少なくとも0.5のログ差を持たるように電圧を設定する必要があります(図1)。
  4. 「低」でサンプルを実行し、イベント/秒を4000以下に抑えます。流量を適切に下げることができない場合は、追加のコールドフローバッファでサンプルを希釈します。カウント計算に必要となるように、追加されたボリュームを記録します (代表結果を参照)。
  5. サンプルごとに少なくとも 3 x 106 のイベントを収集します。これは、あなたのサイトメーター上のイベントとしてカウントされる顔料顆粒や破片のために細胞数よりも高い可能性があります。
  6. セクション6.4の適切な格言戦略のために、ライブ/デッド以外の蛍光性マイナス1(FMO)を記録します。FMOは、1つを除くすべてのフルオロフォアで染色されたサンプルです。
  7. 製造元または施設の指示に従ってフローサイトメーターを清掃し、シャットダウンします。

6. フローサイトメトリーデータのアノテーション

  1. 分析ソフトウェアを使用して新しいワークシートを開きます。すべてのサンプルと単色コントロールのサイトメーターからFCSファイルをインポートします。
  2. SCC を使用して、報酬マトリックスを作成します。
  3. 補正マトリックスを染色したサンプルと MMO に適用します。
  4. FMOを使用して、ゲートを描画するための正の染色を決定します。

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Representative Results

図1 は、赤レーザーのSCCとセルの無補償周波数ヒストグラムを示しました:Alexa647、Alexa700、およびAPC-Cy7。 図1Aでは、マゼンタ線はAlexa647のSCCのピークを表し、シアンラインは意図された0.5ログの違いを示しました。Alexa700とAPC-Cy7のピークはシアンラインの左(明るさが低い)であることに注意してください。また、セルはすべてマゼンタラインの左側にあったことに注意してください。SCCピークの右側にあるいずれの細胞も補償されなかった。特定のチャネルは、フッ素色素の化学(すなわち.e.e.)の化学に基づいて他のチャネルに流出することが知られていた。 バイオレットレーザー: BV421 -> V500, 黄緑色レーザー: PE -> PE-CF594, 赤レーザー: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, クロスレーザー: PE-Cy7 -> APC-Cy7)。上記の条件のいずれかが満たされない場合、1つのチャンネルの電圧を上方に調整し、流出チャネルを下に移動することができます。赤レーザーの追加例については、 図 1B および 図 1C を参照してください。電圧が決定され、記録されたら、すべてのサンプルは電圧パラメータで実行する必要があります。報酬設定ウィザードが存在し、役に立つ場合があります。

セル数の定量化には、カウントビードの識別が必要です。 図2Aは 、単一マウスの2つの目からのすべての分析イベントに対するFSC-AとSSC-Aプロパティを示した。SSC 電圧を調整して、カウントビーズが SSC-Aの高 いイベントと FSC-Aの低 イベントの非常にタイトなコレクションとして表示されるようにすることが重要です。ビーズカウントは、PE対APC-Cy7(図2B)をプロットすることによって洗浄され、確認されました。クリーンビーズは、PE+ とAPC-Cy7- イベントのタイトなクラスターでした。

次に、シングルとライブセルがすべてのイベントから同定されました。シングルはFSC-H対FSC-Aをプロットして決定した。この2つの特性においてシングルは正の相関を示し、タブレットセルとトリプレットセルはFSC-HよりもFSC-Aが大きい(図2C)。生細胞は、生/死対FSC-Aをプロットすることによって線引いた。死細胞は生細胞/死んだ陽性であり、細胞は残骸よりも大きなFSC-Aを示す(図2D)。カウントビーズはライブ/デッド+ であり、このステップで削除されました。

図3は、生きた単一細胞からの単核食細胞の線引きに関する初期の格言戦略を示す。ライブシングルはCD45とCD11bプロットを用いて可視化された(図3、左)。なお、CD45+CD11b-(主にB細胞及びT細胞)、CD45薄暗いCD11b+(推定ミクログリア)、およびCD45+CD11b+細胞(免疫細胞に浸潤、レーザー[図3B、左])を選択した。 CD45 FMO中にCD45+細胞が存在しない場合、ゲート選択が確認された(図3C、左)。次に、好中球、 好酸球、B細胞、NK細胞、およびT細胞を、リネージゲートを用いてCD45+生一重をプロットして除外した(Lin:Ly6G[好中球]、シグレフ[好酸球]、B220[B細胞]、NK1.1[NK細胞]、CD4[T細胞]、CD8細胞)対CD1細胞。CD11b+Lin-レーザーなし(図3A、中間)とレーザー(図3B、中間)群の間の細胞の増加は容易に観察された。CD11b FMO(図3C、中央)にCD11b+Lin-細胞が不足しており、Lin FMO内のLin+細胞の欠如(図3C、右)に注意してください。ミクログリアは、CD45発現13,24の量によって浸潤単核食細胞から分離することができる。CD11b+Lin-細胞をCD11b対CD45プロットを用いて可視化し、CD45薄暗い推定ミクログリアおよびCD45浸潤単核食細胞を同定した。CD45高単核食細胞の相対的増加は、レーザー処理マウスで明らかであった(図3A,B,右)。

図4は、ミクログリア、3つのマクロファージサブセット、単球、および樹状細胞を同定した。ミクログリアは、CD64とMHCIIプロットにCD45薄暗細胞をプロットすることによって決定した(図4、左パネル)。ミクログリアは、以前は13のCD64+MHCII低い値であることが示されている。マイクログリアはレーザーで比較的変わらず、CD64 FMOに存在しなかった(図4A,C左)。CD45細胞は、次に同じCD64対MHCIIグラフにプロットされた。CD64+MHCII-マクロファージ(MHCII-Mac)、CD64-MHCII-単球、およびMHCII+細胞が同定された(4A、B、中央左)。MHCIIFMOにMHCII +細胞がないことに注意してください(図4C、中央左)。MHCII+細胞はさらにCD64およびCD11c.CD64+CD11c-マクロファージ(CD11c-Mac)、CD64+CD11c+マクロファージ(CD11c+Mac)、およびCD64-CD11c+樹状細胞(Dc)を定義した(図4A、B、中央右)。 CD11c FMO に CD11c+セルがないことに注意してください (図 4C、中央右)。単球は、古典的なLy6C+または非古典的なLy6C-単球としてサブタイプされた(図4、右)。Ly6C FMOにLy6C+単球が存在しないことに注意してください(図4C、右)。

マウス当たりのセル数(または2目当たり)は、次の式で計算しました。

Equation 1

この方法のボリュームを使用すると、次の式が計算されます。

Equation 2

セル数とビード数は、各サンプルに固有です。ビーズの濃度は、カウントビーズの各ロットに固有であり、各バイアルのメーカーによって提供されます。

マクロファージはレーザー損傷25の後に脈絡膜に浸潤し、マクロファージ枯渇はCNV領域18を減少させる。これらの古い研究は、単核食細胞を確実に区別できない免疫蛍光イメージングに依存しており、マクロファージ同定のためのフローサイトメトリックマーカーの数が少ない。マクロファージ異種性は、自然免疫学における新たな概念であり、マクロファージは、その起源および組織微小環境12,26に応じて複数の機能を行うことができる。レーザー損傷後3日目に、単核食細胞およびマクロファージ異質性を同定するために、未治療およびレーザー処理されたマウス眼に対してマルチパラメータフローサイトメトリーを行った。レーザー治療は、MHCII-, CD11c-、およびCD11c+マクロファージをそれぞれ7.0-25.6、2.8-7.2、および3.9-8.2倍に増加した(図5A,C)。樹状細胞数もレーザーによって4.5-4.7倍のアップレギュレーションを行った(図5F)。ミクログリアと単球数はレーザー治療の影響を受けなかった(図5D,E)。核形成前に全身灌流の有無にかかわらず有意差は検出されなかった。これらの結果は、ミクログリアまたは単球に変化を伴うレーザー損傷後のマクロファージ集団および樹状細胞の増加を示す。さらに、これらのデータは、マルチパラメータフローサイトメトリーがマクロファージの不均一性を検出する方法を強調している。

抗体またはバッファー フルオロフォア クローン サンプルあたりの量 (ng)
ラット抗マウスLy6C Fitc AL-21 15
マウスアンチマウスCD64 Pe X54-5/7.1 40
ラット抗マウスティム4 アレクサフルーター 647 RMT4-54 300
ハムスター抗マウス CD11c BV 421 HL3 300
ラット抗マウスLy6G PE-CF594 1A8 10
マウスアンチマウスNK1.1 PE-CF594 PK136 10
ラット抗マウスシグレックF PE-CF594 E50-2440 20
ラット抗マウスB220 PE-CF594 RA3-6B2 20
ラット抗マウス CD8 PE-CF594 53-6.7 40
ラット抗マウス CD4 PE-CF594 RM4-5 20
ラット抗マウスMHC II アレクサフルーター 700 M5/114.15.2 2.5
ラット抗マウス CD11b APC-Cy7 M1/70 2
ラット抗マウス CD45 PE-Cy7 30-F11 6
MACS バッファ

表1:抗体フルオロフォア及びクローン(ステップ4.9参照) 一般的に、1つのサンプルは、1つまたは2つの消化された目のいずれかである。まず、各抗体をチューブに流量バッファーを追加します。希釈は、総流量を適切に変更しながら、体積が小さすぎるピペットを避けるために行うことができます。製品番号と会社の材料表を参照してください。

レーザー PMT スロット フィルター ミラー
バイオレット (405nm) A 525/50 505LP V500 またはアムシアン
B 450/50 パシフィックブルー、eFluor 450、V450またはBV421
ブルー (488nm/FSC) A 710/50 685LP PerCP-Cy5.5、PerCP、PIまたは7AAD
B 525/50 505LP FITC、CFSE、GFPまたはアレクサフルーター 488
C 488/10 Ssc
黄緑色 (561nm) A 780/60 735LP PE-Cy7
B 610/20 600LP PE-CF594、mCherryまたはDsRed2
C 582/15 Pe
レッド (640nm) A 780/60 735LP APC-Cy7、APC-H7またはAPC-eFluor 780
B 730/45 690LP アレクサフルーター 700
C 670/30 APCまたはアレクサフルーター 647

表2:フローサイトメーターの構成。 4レーザーサイトメーターと各チャンネルで検出可能なフルオロフォアのフィルタとミラーの設定。PMT =フォトマルチプライヤーチューブ、FSC=前方散乱、SSC=側面散乱。

抗体 フルオロフォア クローン SCC あたりの金額 (ng)
ラット抗マウス CD45 Fitc 30-F11 500
ラット抗マウス CD19 Pe 1D3 40
ラット抗マウスティム4 アレクサフルーター 647 RMT4-54 100
ハムスター抗マウス CD11c BV421 HL3 200
ラット抗マウスシグレックF PE-CF594 E50-2440 40
ラット抗マウス CD19 アレクサフルーター 700 1D3 200
ラット抗マウス CD11b APC-Cy7 M1/70 200
ラット抗マウス CD45 PE-Cy7 30-F11 200
ライブ / デッドダイ eFluor 506 N/a 1 μl

表3:単色制御用の抗体フルオロフォアおよびクローン。 各抗体は、ステップ 5.3.1 ~ 5.3.3 で概説されているように、適切な補正ビードに追加する必要があります。

Figure 1
図1:赤レーザー用に設定された代表的な電圧。(A) Alexa647用のシングルカラーコントロール(SCC)左側に、Alexa647のSCCが表示されます。左中央には、Alexa647 SCCのAlexa700チャンネルへの流出が表示されます。Alexa647 SCCのピークはマゼンタで示され、0.5ログゴールの差分はシアンで表示されます。ピークはシアンラインよりも左(明るさが低い)であることに注意してください。中右は、APC-Cy7 チャンネルへの Alexa647 SCC の流出を示します。右はAlexa647チャンネルのセルを示しています。すべてのセルは SCC (マゼンタライン) よりも明るくないことを確認します。(B) Alexa700 用 SCC。左中央にAlexa700のSCCが表示されます。左はAlexa700 SCCのAlexa647チャンネルへの流出を表示します。中右は、APC-Cy7 チャンネルへの Alexa700 SCC の流出を示します。Alexa700 SCCのピークはマゼンタで示され、0.5ログゴールの差分はシアンで表示されます。ピークはシアンラインよりも左(明るさが低い)であることに注意してください。右はAlexa700チャンネルのセルを示しています。すべてのセルは SCC (マゼンタライン) よりも明るくないことを確認します。(C) APC-Cy7 の SCC。左と中央左は、それぞれAlexa647とAlexa700へのAPC-Cy7 SCCの流出を示しています。両方のピークがシアンラインの左側にあることに注意してください。中右は ACP-Cy7 SCC を示します。右はAPC-Cy7チャネルのセルを示しています。すべてのセルは SCC (マゼンタライン) よりも明るくないことを確認します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:カウントビーズ、シングル、およびライブセルの代表的な識別。(A)等高線プロット上のすべてのセルの側散乱領域 (SSC-A) と前方散乱領域 (FSC-A) の値。カウントビーズは、高SSC-A、低FSC-A、および均一なビーズの非常にタイトなクラスタリングによって識別されます。(B) PE 対 APC-Cy7 は、クリーンなビーズ ゲート用にプロットします。A と B の間の矢印は、カウントビードの正のイベントのみをプロットしたことを示します。クリーンカウントビーズは、高いPEと低いAPC-Cy7蛍光によって線引されます。(C) FSC-Height (FSC-H) vs FSC-面積 (FSC-A) プロットは、正相関ワイドラインでシングルセルを示します。ダブレットやその他の多重は、FSC-Height よりも大きなFSCエリアを示しています。(D) シングルセルのライブ /デッド VS FSC-A.生細胞は、ライブ/デッドローとFSC-A陽性として定義されます。パーセンテージは親の割合を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:単核食細胞の代表的な同定左:CD45対CD11bの未レーザー(A)、レーザー(B)、および蛍光マイナス1(FMO)対照(C)からの生細胞の疑似色プロット。左: CD45+セルはA-Bで定義され、FMOには存在しない。レーザー加工(B)群におけるCD45+CD11b+細胞の増加に注意してください。中央:CD45+セルの系統 (Lin) マーカー対 CD11b の疑似色プロット。CD11b+ Lin-細胞はA-Bで線引きされ、CD11b(下)のFMOには存在しない。右:CD11bとCD11b+ LinのCD45プロット-細胞。CD45薄暗いおよびCD45高細胞が同定される。レーザー加工(B)群におけるCD45細胞の増加に注目してください。パーセンテージは親の割合を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:ミクログリア、樹状細胞、単球、およびマクロファージサブセットの代表的な同定。左:CD45薄暗い細胞のCD64とMHCIIの疑似色プロットは、ミクログリアをCD64+MHCIIと定義する。レーザーを入れない(A)およびレーザー(B)基におけるミクログリアの同様の量、およびFMO制御(C)におけるミクログリアの欠如に注意してください。中央左:CD45細胞のCD64対MHCII疑似色プロットは、MHCII-マクロファージをCD64+MHCIIとして定義し、単球をCD64 - MHCII-、およびMHCII+細胞と定義する。レーザー化基(B)におけるMHCII-マクロファージの増加、FMO中にMHCII+細胞の存在、およびCD64 FMO(C、左)がCD64+およびCD64-細胞のカットオフを決定するのに役立った。中央の右:MHCII+細胞の CD64 と CD11c の疑似色プロット。CD11c-マクロファージはCD64+CD11c-,CD11c+マクロファージとして定義し、CD64+CD11c+、樹状細胞(DC)をCD64-CD11c+として線引した マクロファージサブセットと樹状細胞の両方をレーザー(B)で増加した。FMO(C)にCD11c+セルがないことに注意してください。右: Ly6C対Tim4単球の疑似色プロット。古典的なLy6C+および非古典的なLy6C-単球が同定された。古典的なLy6C+単球はLy6C FMO(C)に存在しなかったことに注意してください。パーセンテージは親の割合を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:全身灌流の有無にかかわらず、レーザー化されていないマウスとレーザー化されたマウスの間の単核食細胞の代表的なデータ。MHCII- (A),CD11c-(B),およびCD11c+(C)マクロファージ数はすべてレーザーで増加した。 レーザーを使っていないミクログリア(D)または単球(E)の間に変化は検出されなかった。樹状細胞(DC)もレーザー(F)で増加した。ブラウンフォーサイスとウェルチANOVAとダネットのT3多重比較検定は、グループ間の不均一な差異による統計的差異を定義するために使用されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

マルチパラメータフローサイトメトリーは、複雑な組織における複数の細胞タイプの定量分析を可能にします。本報告では、マウス眼でのレーザー損傷後の単球、樹状細胞、マクロファージサブセットを含む単核食細胞集団のフローサイトメトリック検出について述べた。Liyanageらは最近、好中球、好酸球、リンパ球、DC、マクロファージ、マクロファージ、および単球27を検出するための同様の格子戦略を報告した。当社の格言戦略は、主にCD64の追加によって異なります。Liyanageらは、DCをCD4-CD8-B220-CD11b + CD11c+細胞、マクロファージをCD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1 -Ly6G-細胞として識別する。 我々は、DCをCD4-CD8-B220-Ly6G-シグレックF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- CD4-CD8-B220-Ly6G-シグレックF-NK1.1-CD11b+CD64+細胞として同定する。CD64を使用してDCをマクロファージから判別することは十分に確立されており、この戦略はCD11c+マクロファージを含むマクロファージ異種性を同定することを可能にする。この方法の主な制限は、組織アーキテクチャまたは目の中の特定の細胞の位置に関するデータを提供しないことです。これらの細胞が、retina、脈絡膜、虹彩、または別の眼構造にあるかどうかを判断するために、我々のプロトコルは、組織学的方法と組み合わせるか、または個々の眼部区画上のマルチパラメータフローサイトメトリーを個別に実行するために、より広範な眼球切除を含むように変更することができます。

解剖によって生じた差異を防ぐために、マウスの目全体の消化プロトコルを最適化しました。例えば、角膜、虹彩、およびレンズを除去した後眼球カップの解剖は、保持された虹彩または角膜材料(下解剖)または正常後眼球領域へのレーザー損傷の増加(過剰解剖)からばらつきを生み出す可能性がある。レーザーを使っていない眼とレーザー化した眼の対照は、レチノコリダル傷害による単核食細胞の浸潤を検出する。全身性疾患が眼に及ぼす影響、すなわち、uveitisおよび糖尿病の分析のためには、個々の眼小区画分析が不可欠である。プロトコルのセクション2では消化方法が最も重要であり、セクション3-5の他のステップは複数の組織タイプ24で正常に使用されている。(1)化学消化法(コラゲナーゼD対消化酵素)の検査、(2)化学消化の長さの決定(30分、60分、90分)、(3)機械的消化器の添加(なし、1回、2回、3回)を含む反復的な方法を通じて消化条件に達しました。各ステップで、細胞の生存率とCD45HiCD64+(マクロファージに浸潤する)細胞の数によって消化条件の成功を判断した。消化酵素(補足材料表を参照)はコラゲターゼDよりも多くの生きた細胞を回収し、消化酵素濃度の半分を試みるとマクロファージの浸潤が少ないことがわかりました。次に、機械的消化を伴う化学消化の60分は、浸潤マクロファージ集団をほぼ倍増した。3つの機械的消化は、シングルの25〜30%の生細胞および最も浸潤するマクロファージ集団で最適であった。最後に、より速い機械的消化条件は、生細胞およびマクロファージの両方の深刻な損失を引き起こした。

今後、角膜、虹彩、レンズを取り除き、網膜と後眼球(スクラ、脈絡膜、網膜色素上皮)を別々に消化する方法を提案します。この改変により、レンズと角膜のタンパク質性と緻密な特性により、消化条件を低減することが期待されます。これらの減少は、消化酵素濃度の低下を含めることができます, コラゲターゼへの切り替え, 消化時間の短縮, または機械的消化の減少量.後眼球カップの消化条件は全体的に低下し、レチナ単独の消化条件はさらに低下すると予想されます。

今後の方向性としては、従来の6レーザー機器またはスペクトルフローサイトメトリーへの従来のマルチパラメータフローサイトメトリーパネルの拡張が含まれます。スペクトルフローサイトメトリーは、利用可能なフィルタによって決定されるのではなく、スペクトル全体にわたってフルオロフォア検出を可能にします。スペクトルフローサイトメトリーは、より具体的な色検出をもたらします。しかし、スペクトルフローサイトメトリーは、全く新しい一連の考慮事項に従う必要があり、この原稿の範囲を超えています。詳細については、この最近のJoVEの記事28を参照してください。6つのレーザーの器械は6-9の探知器を加える紫外線レーザーを含んでいる。マウスの眼のフローサイトメトリーパネルにマーカーを追加する場合は、より多くの眼細胞タイプの検出をお勧めします。例えば、リネージゲートは、好中球、好酸球、肥満細胞、NK細胞、およびリンパ球を独立して検出するために分離することができる。定常状態ではマクロファージが少ないため、単核食細胞のサブセット検出を増やすることは推奨されません。新しい抗体を添加する際には、慎重な抗体滴定を提案する。

要約すると、マウスの目の中で単核食細胞集団を検出するための適応性のある、強い方法を提示した。単球、樹状細胞、マクロファージ、ミクログリアの細胞表面マーカーが重なり合うため、マルチパラメータフローサイトメトリーはこれらの細胞集団を検出する最良の方法です。フローサイトメトリーは、細胞タイプの解析、運命マッピング、および/または細胞の並べ替えの分析に使用して、トランスクリプトームまたはプロテオーム評価を行うことができます。その主な制限は組織アーキテクチャの欠如であり、主要な知見は伝統的な組織学を使用して確認することができる。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

JALはNIH助成金K08EY030923によってサポートされました。CMCは、NIH国立関節炎・筋骨格疾患研究所のK01助成金(5K01AR060169)と、ルプス研究同盟の新しい研究助成金(637405)によって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
1.7 ml microcentrifuge tubes Costar 3620
10 ml pipettes Fisher Scientific 431031
15 ml conicals ThermoFisher 339650
1x HBSS, 500 ml Gibco 14025-092
2.5 ml syringe Henke Sass Wolf 7886-1
20% paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15713-S
25 ml pipettes Fisher Scientific 431032
30 G needle Exel 26437
3ml luer lock syringe Fisher Scientific 14955457
41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish Fisher Scientific 08-732-112
50 ml conicals Falcon 352070
96-well, U-bottom assay plate without lid Falcon 353910
Amine reactive beads ThermoFisher A10628
Analysis software FlowJo v 10
Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set BD Biosciences 552845
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
Cell counter Invitrogen AMQAX1000
Cell counter slides Invitrogen C10283
Compensation beads ThermoFisher 01-1111-42
Count beads ThermoFisher 01-1234-42
Curved forceps Fisher Scientific 16-100-123
Digestion enzyme Sigma Aldrich 5401020001
Dissecting microscope National Optical and Scientific Instruments, Inc. DC3-420T
Dissociation tubes Miltenyi Biotec 130-096-334
DNase Roche 10104159001
Electronic dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
FACS Diva software BD Biosciences
Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142
Fine forceps Integra Miltex 17035X
Flow buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Flow cytometer BD Biosciences
Flow tubes Falcon 352008
Hamster anti-mouse CD11c BV421 BD Biosciences 562782
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-123
Live/Dead dye ThermoFisher 65-0866-14
Lysing solution, 10x solution BD Biosciences 555899
Micro titer tube and rack Fisher Scientific 02-681-380
Mouse anti-mouse CD64 PE BioLegend 139304
Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 BD Biosciences 562864
P1000 pipet tips Denville Scientific P2404
P1000 pipettor Gilson FA10006M
P2 pipet tips eppendorf 22491806
P2 pipettor Gilson FA10001M
P20 pipettor Gilson FA10003M
P200 pipet tips Denville Scientific P2401
P200 pipettor Gilson FA10005M
Pipet man Fisher Scientific FB14955202
Rat anti-mouse B220 PECF594 BD Biosciences 562313
Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 BD Biosciences 557657
Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 BD Biosciences 557958
Rat anti-mouse CD19 PE BD Biosciences 553786
Rat anti-mouse CD4 PECF594 BD Biosciences 562314
Rat anti-mouse CD45 FITC ThermoFisher 11-0451-82
Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 BD Biosciences 552848
Rat anti-mouse CD8 PECF594 BD Biosciences 562315
Rat anti-mouse Ly6C BD Biosciences 561085
Rat anti-mouse Ly6G PECF594 BD Biosciences 562700
Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 BioLegend 107622
Rat anti-mouse Siglec F PECF594 BD Biosciences 562757
Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 BD Biosciences 564178
Shaking incubator Labnet 311DS
Spring scissors Fine Science Tools 15024-10
Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh Fisher Scientific 22363547
Sterile water, 500 ml Gibco A12873-01
Swinging bucket centrifuge eppendorf 5910 R
Trypan blue, 0.4% solution Gibco 15250061

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References

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単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化
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