Summary
Denne protokollen gir en metode for å fordøye hele øynene inn i en enkelt celle suspensjon med det formål å multi-parameter flyt cytometrisk analyse for å identifisere spesifikke okulære mononukleære fagocytiske populasjoner, inkludert monocytter, microglia, makrofager, og dendrittiske celler.
Abstract
Det medfødte immunsystemet spiller viktige roller i okulær patofysiologi, inkludert uveitt, diabetisk retinopati og aldersrelatert makuladegenerasjon. Medfødte immunceller, spesielt mononukleære phagocytes, uttrykker overlappende celleoverflatemarkører, noe som gjør det en utfordring å identifisere disse populasjonene. Multi-parameter flyt cytometri gjør det mulig for samtidig, kvantitativ analyse av flere celle overflatemarkører for å skille monocytter, makrofager, microglia, og dendrittiske celler i museøyne. Denne protokollen beskriver enucleation av hele museøyne, okulær disseksjon, fordøyelsen i en enkelt celle suspensjon, og farging av enkeltcelle suspensjon for myeloid celle markører. I tillegg forklarer vi de riktige metodene for å bestemme spenninger ved hjelp av enkeltfargekontroller og for å delinere positive porter ved hjelp av fluorescens minus en kontroll. Den store begrensningen av multi-parameter flyt cytometri er fraværet av vev arkitektur. Denne begrensningen kan overvinnes ved multi-parameter flyt cytometri av individuelle okulære rom eller gratis immunofluorescence farging. Imidlertid er immunofluorescence begrenset av sin mangel på kvantitativ analyse og redusert antall fluoroforer på de fleste mikroskoper. Vi beskriver bruken av multiparametrisk strømningscytometri for å gi svært kvantitativ analyse av mononukleære fagocytter i laserindusert koroid neovaskularisering. I tillegg kan multiparameterflytcytometri brukes til identifisering av makrofagsundersett, skjebnekartlegging og cellesortering for transkripsjons- eller proteomiske studier.
Introduction
Det medfødte immunsystemet inneholder flere celletyper som stimulerer komplementaktivering og betennelse. Medfødte immunceller inkluderer naturlige killer (NK) celler, mastceller, basofiler, eosinofiler, nøytrofiler, og mononukleære phagocytes. Mononukleære phagocytes, som består av monocytter, makrofager og dendrittiske celler, har vært innblandet i patofysiologien til flere oftalmiske forhold, inkludert uveitt, diabetisk retinopati og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)1. I denne protokollen vil vi fokusere på identifisering av mononukleære fagocytter ved hjelp av multiparameterflyt cytometrisk analyse i en musemodell av neovaskulær AMD2. Denne protokollen er tilpasningsdyktig for musemodeller av diabetisk retinopati og/ eller uveitt, men mer omfattende okulær disseksjon anbefales på grunn av den systemiske naturen til disse sykdommene.
Mononukleære phagocytes uttrykker overlappende celleoverflatemarkører. Langvarig vev bosatt makrofager og microglia stammer fra eggeplomme sac-avledet erytromyeloid stamfar3, mens resirkulering makrofager og dendrittiske celler skille fra benmarg-avledet makrofag dendrittiske celle stamfar4. Mus celle overflate markører felles for monocytter, makrofager, og dendrittiske celler inkluderer CD45, CD11b5,F4/806,Cx3cr17,og intracellulær markør Iba18. For å overvinne denne utfordringen definerer transkripsjonsmisk analyse av makrofager, monocytter og dendrittiske celler fra flere vev CD64 som en makrofagspesifikk celleoverflatemarkør6. Makrofager har blitt beskrevet i iris, choroid, ciliary kropp, og optisk nerve i friske øyne3. Alternativt er dendrittisk celleidentifikasjon vanskeligere; Den mest spesifikke metoden for dendrittisk celleidentifikasjon krever skjebnekartlegging ved hjelp av Zbtb46-GFP-reportermusen9. Uavhengig av denne reporterlinjen kan uttrykk for CD11c og MHCII i forbindelse med fraværet av CD64 identifisere potensielle dendrittiske celler6,10. Dendrittiske celler har blitt identifisert i hornhinnen, conjunctiva, iris og choroid i normale øyne11. Microglia er spesialiserte makrofager som ligger i netthinnen, beskyttet av blod-retinal barrieren, og avledet fra eggeplomme sac stamceller12. Som et resultat kan retinal microglia differensieres fra monocytt-avledede makrofager av deres svake nivåer av CD45 uttrykk13 og høye nivåer av Tmem119, som er tilgjengelig som en strømning cytometri antistoff14. Ved microglia aktivering, men CD45 kan være up-regulert15 og Tmem119 kan være nedregulert3, demonstrere kompleksiteten i microglia biologi og dette er trolig relevant i både AMD og musemodellen. Til slutt kan monocytter deles inn i minst to undertyper, inkludert klassisk og ikke-klassisk. Klassiske monocytter viser CCR2+Ly6ChøyCX3CR1lav uttrykk, og ikke-klassiske monocytter demonstrereCCR2-Ly6ClavCX3CR1høye markører5.
På grunn av nødvendigheten av kvantitativ analyse av markøruttrykk, det vil si høye versus lave / svake nivåer, er multiparameterflytcytometri den ideelle metoden for diskriminering mellom monocytter, makrofager, mikroglia og dendrittiske celler i øyet og andre vev. Ytterligere fordeler inkluderer identifisering av underpopulasjoner, muligheten til å bruke fluorescensaktivert cellesortering (FACS) til å sortere cellepopulasjoner for transkripsjons- eller proteomisk analyse og skjebnekartlegging. Den store ulempen med multi-parameter flyt cytometri er mangelen på vev arkitektur. Dette kan overvinnes ved oftalmisk disseksjon i de ulike okulære underkomiteene: hornhinnen, conjunctiva, iris, linse, netthinnen og choroid-sclera kompleks. I tillegg kan bekreftende immunofluorescence imaging utføres, men er begrenset av antall markører og mangel på robust kvantitet.
Genom bred tilknytning studier har knyttet flere komplement gener med AMD16. Komplementaktivering fører til anapyatoksproduksjon, leukocyttrekruttering og resulterende betennelse. I komplement reseptor mangelfull mus, laser skade reduserer mononukleær phagocyte rekruttering og laser-indusert choroidal neovaskularisering (CNV) område17. På samme måte viser C-C-motivet chemokinreseptor 2 (CCR2) knockout mus, som er mangelfull i monocytt rekruttering til vevet, både redusert mononukleær phagocyte rekruttering og laser-indusert CNV-område18. Disse datakoblingen utfyller og mononukleære phagocytes med eksperimentelle CNV og muligens neovaskulær AMD. Til støtte for denne foreningen er komplementreseptorer dysregulert på perifere blodmon monocytter hos pasienter med neovaskulær AMD19,20. Disse dataene viser en sterk sammenheng mellom AMD og mononukleære fagocytter.
I dette manuskriptet vil vi bruke den eksperimentelle laserinduserte CNV-modellen til å karakterisere de mononukleære fagocytterpopulasjonene i museøyet ved hjelp av multiparameterflytcytometri. Laserindusert CNV er standard musemodell av neovaskulær AMD, som viste effekten av nåværende førstelinje neovaskulær AMD-behandling21. Denne protokollen vil beskrive enucleation av museøyne, okulær disseksjon, fordøyelsen i en enkelt celle suspensjon, antistoff farging, bestemmelse av laserspenninger ved hjelp av enkelt fargekontroller, og gating strategi ved hjelp av fluorescens minus en (FMO) kontroller. For en detaljert beskrivelse av den laserinduserte CNV-modellen, se en tidligere publikasjon22. Ved hjelp av denne protokollen vil vi definere mikroglia, monocytter, dendrittiske celler og makrofagpopulasjoner. Videre vil vi bruke MHCII og CD11c til å ytterligere definere makrofagsundersett i laserindusert CNV-modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee. C57BL/6 mus ble gruppert plassert ved et barriereanlegg ved Center for Comparative Medicine ved Northwestern University (Chicago, IL). Alle dyrene ble plassert i 12/12 h lys / mørk syklus med fri tilgang til mat og vann.
1. Innsamling av okulært vev
- Ofre 10-12 uker gamle C57BL/6J mus av begge kjønn ved hjelp av regulert administrasjon av karbondioksid til musen ikke svarer og ikke lenger inhalerer. Utfør cervical forvridning eller annen godkjent sekundær metode for å sikre eutanasi.
MERK: Transcardial perfusjon kan utføres for å fjerne sirkulerende leukocytter som ikke er i okulære vev. I dette eksperimentet reduserer systemisk perfusjon ikke antall microglia, monocytter, makrofager eller dendrittiske celler som oppdages i ubehandlede eller laserbehandlede hele øyne. Derfor er de fleste av disse celletypene plassert i oftalmisk vev, og dette trinnet er valgfritt. - For å omslutte øynene, trykk ned i nærheten av øyekontakten mens du plasserer et par buede tang forsiktig under øyet når den skiller seg ut av stikkontakten. Klyp tang lukket under øyet uten å klemme det faktiske øyet. Løsne øyet fra den omkringliggende konjunktiva (se forutgående publisering)23.
- Trekk øyet sideveis til optisk nerve er den eneste gjenværende tilkoblingen for å løsne øyet. Optisk nerve snerer ofte med spenning, men en liten saks er noen ganger nødvendig for å kutte optisk nerve. Plasser øyet i kaldt 1x Hanks bufret saltløsning (HBSS) med kalsium og magnesium i 1,7 ml mikrocentrifugerør.
2. Fordøyelse av okulært vev
- Forbered fordøyelsesbufferen som inneholder 0,1 mg/ml fordøyelsesenzym og 0,2 mg/ml DNase i kaldt HBSS. Rekonstituer 5 mg fordøyelsesenzym i 2 ml sterilt vann i utgangspunktet. Forbered en innledende fortynning på 10 mg/ml DNase i HBSS. For hver 10 ml av fordøyelsesbufferen (tilstrekkelig for 3 dyr) bland 9,4 ml kald HBSS med 0,4 ml rekonstituert fordøyelsesenzym og 0,2 ml fortynnet DNase I.
MERK: Disse konsentrasjonene ble empirisk bestemt over flere eksperimenter for å gi optimale nivåer av antistofffarging av enkeltceller, samtidig som celledød reduseres. Kollagen D ble prøvd som et alternativ til fordøyelsesenzym med redusert celle levedyktighet og redusert CD45+ celler. Vennligst se Diskusjon for mer informasjon om iterativ prosess for å optimalisere fordøyelsen. - Under et dissekerende mikroskop ved 10x total forstørrelse, fjern de resterende conjunctiva og optisk nerve ved hjelp av fine tang og vårsaks i kaldt HBSS.
- Flytt rene øyne til en tørr dissekeringsfat eller liten veiebåt. Injiser 0,15-0,20 ml/fordøyelsesbufferen via sprøyte utstyrt med 30 G kanyle inn i glasslegemet etter at to perforerende sår er laget i øyet gjennom den visuelle aksen og 90° unna dette første såret for fordøyelsesbufferuttrering.
- Hakke hele øynene ved hjelp av vårsaks og fine tang med alle stykker mindre enn 0, 5 mm x 0,5 mm. Dissosier linsevev med sløv mekanisk forstyrrelse via tang for å forhindre tilstopping av pipettespisser i påfølgende trinn. For hver prøve, skyll tang og saks hver med 0,75 ml fordøyelsesbuffer i liten tallerken. Bruk en ny tallerken for hver prøve.
- Overfør innholdet i fatet til et dissosiasjonsrør på is ved hjelp av P1000 pipette som tar vare på å ikke miste noe materiale i pipetteoverføringen. Skyll fatet med ytterligere 1,5 ml fordøyelsesbuffer som gir det totale volumet i dissosiasjonsrøret til 3,25-3,50 ml.
- Plasser dissosiasjonsrøret invertert på elektronisk dissosiator og kjør syklus "m_brain_03_01", bestående av 1 min enveis rotasjon ved 200 rpm ved romtemperatur, som er et forhåndslastet program. Sørg for at alt vev er på bunnen av dissosiasjonsrøret i kontakt med fordøyelsesbufferen og rotoren for dette og alle gjenværende trinn.
- Plasser dissosiasjonsrøret i ristingsinkubatoren i 30 min ved 200 o/min ved 37 °C.
- Gjenta trinn 2.6 og 2.7 en ekstra gang. Etter andre 30 min inkubasjon utføre en endelig mekanisk fordøyelse ved hjelp av elektronisk dissosiator som i trinn 2.6.
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 10 ml kald strømningsbuffer og plasser rør på is.
3. Fremstilling av cellesuspensjon
- For å lage encellede suspensjon, hell den stoppede øyefordøyelsesreaksjonen gjennom et 40 μm filter plassert på toppen av et konisk sentrifugerør på 50 ml. Bruk stempelet fra en 2,5 ml sprøyte til å skyve eventuelle gjenværende biter av ufordøyd øyevev gjennom filteret.
- Vask dissosiasjonsrøret med 10 ml strømningsbuffer og skyll filteret før du bruker det samme stempelet til igjen å passere ufordøyde øyevevsdeler gjennom filteret.
- Gjenta trinn 3.2 ved hjelp av 5 ml strømningsbuffer.
- Vask dissosiasjonsrøret og filtrer med en endelig 10 ml strømningsbuffer.
MERK: Totalt volum av fordøyelses- og strømningsbuffer er ca. 38-40 ml for hver prøve. - Sentrifuger konisk rør ved 400 x g i 10 min ved 4 °C. Dekanter det overnaturlige uten å forstyrre cellepellet.
- Forbered 1x lysing løsning ved å tilsette 10x lysing løsning for sterilt vann. Bryt opp pelleten ved å knipse røret mot et annet rør. For å lyse røde blodlegemer, tilsett 1 ml 1x lysing løsning i 30 s med virvlende ved romtemperatur (RT).
- Stopp reaksjonen med 20 ml strømningsbuffer.
- Sentrifuger konisk rør ved 400 x g i 10 min ved 4 °C. Dekanter det overnaturlige uten å forstyrre cellepellet.
- Dissosier pelleten ved å knipse røret mot et annet rør. Tilsett 5 ml kald 1x HBSS per rør.
- Sentrifugerør ved 400 x g i 10 min ved 4 °C. Aspirerer overnatur.
4. Farging av cellesuspensjon for mononukleære fagocytter
- Forbered 0,5 ml Live/Dead-flekk per prøve ved å fortynne Live/Dead fargestoff 1:5 000 i kaldt HBSS.
- Legg til Live / Dead flekk til hver prøve ved hjelp av en P1000 pipette som sørger for å ta av pelleten helt. Overfør prøver til 1,2 ml mikrotitrerør.
- Ta en liten aliquot (10 μL) for å telle celler ved hjelp av et hemocytometer eller automatisk celleteller (se 4.4). Inkuber prøver med Levende/Død flekk i 15 min ved romtemperatur i mørket.
- Telle celler som bruker Trypan blå for å bestemme antall levende celler per prøve.
MERK: Vanligvis inneholder 2 øyne fra en 10-12 uker gammel C57BL/6J-mus mindre enn 2 x 106 levende celler. - Vask prøvene ved å tilsette 400 μL kald strømningsbuffer. Sentrifugerør i et mikrottitrerørstativ ved 400 x g i 10 min ved 4 °C. Aspirer den overnaturlige uten å forstyrre cellepellet.
- Resuspend celler helt i 500 μL kald strømningsbuffer. Sentrifugerør i et mikrottitrerørstativ ved 400 x g i 10 min ved 4 °C. Aspirer den overnaturlige uten å forstyrre cellepellet.
- Blokker opptil 5 x 106 levende celler i 50 μL Fc blokk (1:50 fortynning i kald Flow buffer av renset rotte anti-mus CD16/CD32). Hvis mer enn 5 x 106 levende celler, øke volumene riktig.
- Legg Fc blokk til pellet sørg for å helt dissosiere prøven. Inkuber i 20 min ved 4 °C.
- Tilsett 50 μL antistofffargingsløsning (se tabell 1 for valg og mengde av hvert antistoff som er inkludert i oppløsningen) per 5 x 106 levende celler direkte til celler i Fc-blokk og bland helt. Inkuber i 30 min ved 4 °C.
MERK: Antistoffmengder er avhengig av strømningssytometerkonfigurasjonen og bør titreres uavhengig av hverandre for hvert laboratorium og instrument. Se tabell 2 for instrumentkonfigurasjon av filtre og speil. For å titrere antistoffer, start med produsentens anbefaling, og beregn fargeindeksen. Utfør en testkjøring av varierende antistoffkonsentrasjoner (både over og under produsentens anbefaling) og velg den laveste konsentrasjonen av antistoff der fargeindeksen opprettholdes. Sørg også for at positiv farging som er mindre lys enn enfargekontrollen. Bruk uopphetede celler for å sikre at negativt beisede celler er på skala og har en topp på eller mindre enn 1 x 102. Bruk en fluorescens minus en kontroll for å definere de positivt beisede cellene. - Vask prøvene ved å tilsette 700 μL kald strømningsbuffer. Sentrifugerør i et mikrottitrerørstativ ved 400 x g i 10 min ved 4 °C. Aspirer den overnaturlige uten å forstyrre cellepellet.
- Eventuelt, etter antistofffarging, kan prøvene festes med 500 μL på 2% paraformaldehyd i flowbuffer. Fiks prøver i 15 min ved romtemperatur. Deretter utfører du en vask som beskrevet i 4.10. Oppbevar faste prøver ved 4 °C. Count perler bør legges på dagen for flyt cytometri datainnsamling. Faste prøver bør kjøres på strømningscytometer om 1-2 dager.
FORSIKTIG: Paraformaldehyd er et korroderende og en helsefare. - Vask prøvene igjen ved hjelp av 500 μL kald strømningsbuffer. Sentrifugerør i et mikrottitrerørstativ ved 400 x g i 10 min ved 4 °C. Aspirer halvparten av det overnaturlige uten å forstyrre cellepelleten.
- Resuspend pellets og overføre til en 96 brønn, U-bunn analyse plate. Sentrifugeplate ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. For å dekantere det overnaturante, snu platen over og i en sterk riste løsne væsken i et vaskbasseng, uten å forstyrre pellet.
- I et nytt 1,2 ml mikrotitrerør plasserer du 50 μL godt innaddne telleperler.
- Resuspend pellets i 96 brønnplate i 200 μL kald strømningsbuffer. Tilsett celleblanding på toppen av perler fra forrige trinn. Kjør på strømningssytometer i totalt volum på 250 μL / mikrotitrerør.
5. Innsamling av flytcytometridata
- Slå på og klargjør strømningscytometeret. Instruksjonene som er oppført her er for en modifisert fire laser cytometer (Tabell 2).
- Kjør en testprøve, som inkluderer en liten aliquot fra hver prøve, for å sikre at alle celler er i skala for hver detektor. Juster spenninger slik at alle celler er i skala.
- Kjør enkeltfargekontroller (SCC) for hver fluorofor som brukes i fargingscocktail (tabell 3). Plasser mikrotitrerøret i et større 5 ml polystyrenrør for plassering på strømningscytometerstadiet.
MERK: Rotfluorer som BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) og Alexa700 krever ikke samme antistoff som cocktailen (det vil si CD19 PE for CD64 PE). Imidlertid krever tandemfluorer som PE-CF594, PE-Cy7 eller APC-Cy7 samme antistoff for SCC som cocktail på grunn av potensiell dissosiasjon av de konjugerte fluoroforene.- Lag SCC for BV421 ved å legge til 2 dråper kompensasjon perler til en 1,2 ml titer rør sammen med 1 μL hamster anti-mus CD11c BV421. Kompensasjon perler brukes fordi CD11c BV421 er en IgG lambda subtype i stedet for kappa som beskrevet i 5.3.3. Inkuber i 15 minutter ved 4 °C. Legg til 0,2 ml strømningsbuffer.
- Lag SCC for Live / Dead fargestoff ved å legge til en dråpe positive farging perler (grønn cap) fra amin reaktive perler, etterfulgt av 1 μL av Live / Dead fargestoff. Inkuber i 15 min ved romtemperatur i mørket. Legg til en dråpe av de negative perlene (hvit hette) fra aminreaktive perler. Legg til 0,2 ml strømningsbuffer.
- Lag de resterende SCCene ved å legge til en dråpe positive fargingperler (grønn hette) fra anti-rotte og anti-hamster Ig kappa perlesett, etterfulgt av antistoffmengden oppført (Tabell 3) i et 1,2 ml titerrør. Inkuber i 15 min ved 4 °C. Legg til en dråpe av de negative perlene (hvit hette) fra anti-rotte og anti-hamster Ig kappa perlesett. Legg til 0,2 ml strømningsbuffer.
- Vortex alle perleblandinger helt. Oppbevar SC-ene ved 4 °C i opptil 3 dager.
MERK: SCC for fluorescerende reportermus er uopphetede celler. - Når du kjører SC-er, må du angi spenninger slik at SCC-prøven har en topp som er større enn noen fluorescens for en prøve av celler i samme detektorkanal. I tillegg bør spenninger stilles inn slik at enhver SCC har minst 0,5 Loggforskjell mellom histogrammet toppen i interessekanalen kontra noen annen kanal (figur 1).
- Kjør eksempler på "Lav" holde hendelser / sekund under 4000. Hvis strømningshastigheten ikke kan senkes på riktig måte, kan du fortynne prøver med ekstra kaldstrømningsbuffer. Registrere volumet som legges til, da dette vil være nødvendig for opptellingsberegningen (se representative resultater).
- Samle minst 3 x 106 hendelser per prøve. Dette kan være høyere enn cellenummeret på grunn av pigmentgranulat og rusk som teller som hendelser på cytometeret.
- Registrer en fluorescens minus en (FMO) for hver fluorophore annet enn Live / Dead for riktig gating strategi i § 6.4. En FMO er en prøve som har blitt farget med alle fluoroforer unntatt en.
- Rengjør og slå av strømningscytometeret i henhold til produsentens eller anleggets instruksjoner.
6. Merknad av flytcytometridata
- Åpne et nytt regneark ved hjelp av analyseprogramvare. Importer FCS-filer fra cytometer for alle prøver og enfargekontroller.
- Bruk SCCer til å opprette en kompensasjonsmatrise.
- Påfør kompensasjonsmatrisen på dine beisede prøver og FMOer.
- Bruk FMOene til å bestemme positiv farging for å tegne porter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viste ukompenserte frekvens histogrammer for SCC og celler for den røde laseren: Alexa647, Alexa700, og APC-Cy7. I figur 1Aavbildet magentalinjen toppen av SCC for Alexa647, mens cyan-linjen viste den tiltenkte 0,5 Loggforskjellen. Legg merke til at toppen i Alexa700 og APC-Cy7 var til venstre (mindre lys) av cyan linjen. Vær også oppmerksom på at cellene var alle til venstre for magenta linjen. Eventuelle celler til høyre for SCC-toppen ble ikke kompensert. Spesifikke kanaler var kjent for å søle inn i andre basert på kjemien i fluorokromfargestoffene (det vil si Violet Laser: BV421 -> V500, Gulgrønn laser: PE -> PE-CF594, Rød laser: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 ,gt; APC-Cy7, Cross Laser: PE-Cy7 -> APC-Cy7). Hvis en av de ovennevnte betingelsene ikke ble oppfylt, kunne spenningen til en kanal justeres oppover mens eventuelle sølkanaler kunne flyttes ned. Se figur 1B og figur 1C for flere eksempler på den røde laseren. Når spenningene er bestemt og deretter registrert, må alle prøver kjøres med spenningsparametrene. Det finnes en veiviser for kompensasjonsoppsett og kan være nyttig.
Count perle identifikasjon er nødvendig for kvantifisering av celletellinger. Figur 2A viste FSC-A vs SSC-A egenskaper for alle analyserte hendelser fra to øyne av en enkelt mus. Det er viktig å justere SSC-spenningen for å sikre at telleperlene dine er synlige som en svært tett samling av SSC-Ahøye og FSC-Alave hendelser. Perletellinger ble rengjort og bekreftet ved å plotte PE vs APC-Cy7 (Fig 2B). Rene perler var en stram klynge av PE+ og APC-Cy7- hendelser.
Singleter og levende celler ble neste identifisert fra alle hendelser. Singlets ble bestemt ved å plotte FSC-H vs FSC-A. Singleter var positivt korrelert i disse to egenskapene, mens dobbelt- og trillingceller hadde større FSC-A enn FSC-H (figur 2C). Levende celler ble avgrenset ved å plotte Live / Dead vs FSC-A. Døde celler var Live / Dead positive, og celler viser større FSC-A enn rusk (Fig 2D). Merk at telle perler var Live / Dead+ og ble fjernet på dette trinnet.
Figur 3 viser den første gating strategien for avgrensning av mononukleære phagocytes fra levende, singlet celler. Live singlets ble visualisert ved hjelp av en CD45 versus CD11b plot (Figur 3, venstre). Merk at CD45+CD11b- (for det meste B-celler og T-celler), CD45dimCD11b+ (antatt microglia) og CD45+CD11b+ celler (infiltrerende immunceller, økt med laser [Fig 3B, venstre]) ble valgt. Fraværet av CD45+ celler i CD45 FMO bekreftet gatevalget (figur 3C, venstre). Deretter nøytrofiler, eosinofiler, B-celler, NK-celler og T-celler ble ekskludert ved å plotte CD45+ live singlets ved hjelp av Lineage gate (Lin: Ly6G [nøytrofiler], SiglecF [eosinofiler], B220 [B-celler], NK1.1 [NK-celler], CD4 [T-celler] og CD8 [T-celler]) vs CD11b. Økningen i CD11b+Lin- celler mellom No Laser (Figur 3A, midten) og Laser (Figur 3B, midten) grupper ble lett observert. Legg merke til mangelen på CD11b+Lin- celler i CD11b FMO (Figur 3C, midten) og mangelen på Lin+ celler i Lin FMO (Figur 3C, høyre). Microglia kan skilles fra infiltrerende mononukleære phagocytes med mengden CD45 uttrykk13,24. CD11b+Lin- cellene ble visualisert ved hjelp av en CD11b vs CD45 plott for å identifisere CD45dim putative microglia og CD45høy infiltrerende mononukleære phagocytes. Den relative økningen i CD45høye mononukleære phagocytes var klar i laserbehandlet mus (Figur 3A, B, høyre).
Figur 4 identifiserte microglia, tre makrofagsundersett, monocytter og dendrittiske celler. Microglia ble bestemt ved å plotte CD45dim celler på en CD64 vs MHCII plot (Figur 4, venstre panel). Microglia har vist seg å være CD64+MHCIIlav tidligere13. Microglia var relativt uendret med laser og fraværende i CD64 FMO (Figur 4A, C igjen). CD45høye celler ble deretter plottet på samme CD64 vs MHCII graf. CD64+MHCII- makrofager (MHCII- Mac), CD64-MHCII- monocytter og MHCII+ celler ble identifisert (Figur 4A, B, midten til venstre). Legg merke til fraværet av MHCII+ celler i MHCII FMO (figur 4C, midt til venstre). MHCII+ celler ble ytterligere diskriminert ved hjelp av CD64 og CD11c. CD64+CD11c- makrofager (CD11c- Mac), CD64+CD11c+ makrofager (CD11c+ Mac), og CD64-CD11c+ dendrittiske celler (DCer) ble definert (Figur 4A, B, midten til høyre). Legg merke til fraværet av CD11c+ celler i CD11c FMO (Figur 4C, midten til høyre). Monocytter ble underskrevet som klassisk Ly6C+ eller ikke-klassisk Ly6C- monocytter (Figur 4, høyre). Legg merke til fraværet av Ly6C+ monocytter i Ly6C FMO (Figur 4C, høyre).
Antall celler per mus (eller per 2 øyne) ble beregnet med følgende ligning:
Ved hjelp av volumene i denne metoden er ligningen:
Celleantall og perleantall vil være spesifikk for hver prøve. Konsentrasjonen av perler er spesifikk for hver masse telleperler og levert av produsenten på hvert hetteglass.
Makrofager infiltrerer koroidet etter laserskade25, og makrofaguttømming reduserer CNV-området18. Disse eldre studiene er avhengige av immunofluorescence imaging, som ikke pålitelig kan skille mononukleære phagocytes, eller færre strømningscytokometriske markører for makrofagidentifikasjon. Makrofag heterogenitet er et fremvoksende konsept i medfødt immunologi, hvor makrofager er i stand til å utføre flere funksjoner avhengig av opprinnelse og vev mikromiljø12,26. Vi utførte multi-parameter flyt cytometri på ubehandlede og laserbehandlede museøyne på dag 3 etter laserskade for å identifisere mononukleære fagocytter og makrofag heterogenitet. Laserbehandling økte MHCII-, CD11c-og CD11c+ makrofager med henholdsvis 7,0-25,6, 2,8-7,2 og 3,9-8,2 ganger (figur 5A, C). Dendrittiske celletall var også oppregulert 4,5-4,7 ganger med laser (figur 5F). Microglia og monocytttall ble ikke påvirket av laserbehandling (figur 5D,E). Ingen signifikante forskjeller ble påvist med eller uten systemisk perfusjon før enucleation. Disse resultatene viser økte makrofagpopulasjoner og dendrittiske celler etter laserskade uten endring til mikroglia eller monocytter. Videre fremhever disse dataene hvordan multi-parameter flyt cytometri kan oppdage makrofag heterogenitet.
| Antistoff eller buffer | Fluorofor | Klone | Beløp per prøve (ng) |
| rotte anti-mus Ly6C | FITC | AL-21 Leilighet | 15 |
| mus anti-mus CD64 | Pe | X54-5/7.1 | 40 |
| rotte anti-mus Tim4 | AlexaFluor 647 | Rmt4-54 Gjestgiveri | 300 |
| hamster anti-mus CD11c | 2007: 2000 000 000 | 2009– 2009 | 300 |
| rotte anti-mus Ly6G | PE-CF594 | 1A8 (andre personer) | 10 |
| mus anti-mus NK1.1 | PE-CF594 | PK136 Leilighet | 10 |
| rotte anti-mus Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 20 |
| rotte anti-mus B220 | PE-CF594 | Ra3-6B2 Leilighet | 20 |
| rotte anti-mus CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | 40 |
| rotte anti-mus CD4 | PE-CF594 | Rm4-5 | 20 |
| rotte anti-mus MHC II | AlexaFluor 700 | M5/114.15.2 Leilighet | 2.5 |
| rotte anti-mus CD11b | APC-Cy7 | M1/70 Leilighet | 2 |
| rotte anti-mus CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 Leilighet | 6 |
| MACS-buffer |
Tabell 1: Antistofffluofor og kloner (se trinn 4.9). Vanligvis er en prøve enten ett eller to fordøyd øyne. Legg til strømningsbuffer i et rør først og deretter hvert antistoff. Fortynninger kan gjøres for å unngå pipettering for lite volum, samtidig som det endrer det totale strømningsbuffervolumet på riktig måte. Se Materialse tabell for produktnummer og firma.
| Laser | PMT-spor | Filter | Speil | Farger |
| Fiolett (405nm) | A | 525/50 | 505.000 000 000 | V500 eller AmCyan |
| B | 450/50 | Pacific Blue, eFluor 450, V450 eller BV421 | ||
| Blå (488nm/FSC) | A | 710/50 | 685.685.2009: | PerCP-Cy5.5, PerCP, PI eller 7AAD |
| B | 525/50 | 505.000 000 000 | FITC, CFSE, GFP eller AlexaFluor 488 | |
| C | 488/10 | Ssc | ||
| Gul-grønn (561nm) | A | 780/60 | 735.2000-000 0 | PE-Cy7 |
| B | 610/20 | 600LP (andre personer) | PE-CF594, mCherry eller DsRed2 | |
| C | 582/15 | Pe | ||
| Rød (640nm) | A | 780/60 | 735.2000-000 0 | APC-Cy7, APC-H7 eller APC-eFluor 780 |
| B | 730/45 | 690LP (andre personer) | AlexaFluor 700 | |
| C | 670/30 | APC eller AlexaFluor 647 |
Tabell 2: Konfigurasjon av strømningscytometer. Filter- og speiloppsett for et fire-laser cytometer og tilgjengelige fluoroforer som kan oppdages i hver kanal. PMT = photomultiplier tube, FSC = fremover scatter, SSC = side scatter.
| Antistoff | Fluorofor | Klone | Beløp per SCC (ng) |
| rotte anti-mus CD45 | FITC | 30-F11 Leilighet | 500 |
| rotte anti-mus CD19 | Pe | 1D3 (andre personer) | 40 |
| rotte anti-mus Tim4 | AlexaFluor 647 | Rmt4-54 Gjestgiveri | 100 |
| hamster anti-mus CD11c | 2007: 100 000 00 | 2009– 2009 | 200 |
| rotte anti-mus Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 40 |
| rotte anti-mus CD19 | AlexaFluor 700 | 1D3 (andre personer) | 200 |
| rotte anti-mus CD11b | APC-Cy7 | M1/70 Leilighet | 200 |
| rotte anti-mus CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 Leilighet | 200 |
| Live / Dead Dye | eFluor 506 | N/a | 1 μl |
Tabell 3: Antistofffluofor og kloner for enkeltfargekontroller. Hvert antistoff bør legges til riktig kompensasjon perle som beskrevet i trinn 5.3.1 – 5.3.3.
Figur 1: Representativ spenning satt opp for den røde laseren. (A)Enkelt fargekontroller (SCCer) for Alexa647. Til venstre vises SCC for Alexa647. Venstre midten viser søl av Alexa647 SCC i Alexa700-kanalen. Toppen av Alexa647 SCC vises i magenta og 0.5 Log mål differensial vises i cyan. Legg merke til at toppen er til venstre (mindre lys) enn cyan linjen. Midten til høyre demonstrerer utslippet av Alexa647 SCC inn i APC-Cy7-kanalen. Høyre illustrerer cellene i Alexa647-kanalen. Vær oppmerksom på at alle celler er mindre lyse enn SCC (magenta-linjen). (B) SCC for Alexa700. Midtre venstre viser SCC for Alexa700. Venstre viser søl av Alexa700 SCC i Alexa647-kanalen. Midten til høyre demonstrerer utslippet av Alexa700 SCC inn i APC-Cy7-kanalen. Toppen av Alexa700 SCC vises i magenta og 0.5 Log mål differensial vises i cyan. Legg merke til at toppen er til venstre (mindre lys) enn cyan linjen. Høyre illustrerer cellene i Alexa700-kanalen. Vær oppmerksom på at alle celler er mindre lyse enn SCC (magenta-linjen). (C) SCC for APC-Cy7. Venstre og midten til venstre viser utslippet av APC-Cy7 SCC i henholdsvis Alexa647 og Alexa700. Legg merke til at begge toppene er til venstre for cyan linjen. Midten til høyre demonstrerer ACP-Cy7 SCC. Høyre illustrerer cellene i APC-Cy7-kanalen. Vær oppmerksom på at alle celler er mindre lyse enn SCC (magenta-linjen). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ identifikasjon av telleperler, singleter og levende celler. (A) Side scatter område (SSC-A) vs fremover scatter område (FSC-A) for alle celler på en kontur plott. Count perler er identifisert av høy SSC-A, lav FSC-A, og svært tett klynger av uniform perler. (B)PE vs APC-Cy7 tomten for ren perle gate. Pilen mellom A og B indikerer plotting av bare telle perle positive hendelser. Rene count perler er avgrenset av høy PE og lav APC-Cy7 fluorescens. (C) FSC-Høyde (FSC-H) vs FSC-Area (FSC-A) plott av alle celler demonstrerer singlet celler i en positivt korrelert bred linje. Doublets og andre multipler viser større FSC-området enn FSC-Høyde. (D) Live / Dead vs FSC-A for singlet celler. Levende celler er definert som Live / Dead low og FSC-A positiv. Prosenter indikerer prosent av overordnet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativ identifikasjon av mononukleære fagocytter. Venstre: CD45 vs CD11b pseudocolor plott av levende celler fra unlasered (A), lasered (B), og fluorescens minus en (FMO) kontroll (C). Venstre: CD45+ celler er definert i A-B og fraværende i FMO. Legg merke til økningen av CD45+CD11b+ celler i den laserede (B) gruppen. Midten: Pseudocolor tomten av avstamning (Lin) markør vs CD11b for CD45+ celler. CD11b+Lin- celler er avgrenset i A-B og er fraværende i FMO for CD11b (nederst). Høyre: CD11b vs CD45 tomten av CD11b+Lin- celler. CD45dim og CD45høye celler er identifisert. Legg merke til økningen i CD45høye celler i den laserede (B)-gruppen. Prosenter indikerer prosent av overordnet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ identifikasjon av microglia, dendrittiske celler, monocytter og makrofagsundersett. Venstre: CD64 vs MHCII pseudocolor tomten av CD45dim celler definerer microglia som CD64+MHCIIlav. Legg merke til lignende mengde microglia i ulasered (A) og lasered (B) grupper, og fravær av microglia i FMO-kontrollen (C). Midtre venstre: CD64 vs MHCII pseudocolor plot av CD45høye celler definerer MHCII- makrofager som CD64+MHCII-, monocytter som CD64-MHCII-og MHCII+ celler. Legg merke til økningen i MHCII- makrofager i den lasererte gruppen (B), fraværet av MHCII + celler i FMO (C, midten), og CD64 FMO (C, venstre) bidro til å bestemme cutoff for CD64+ og CD64- celler. Midtre høyre: CD64 vs CD11c pseudocolor plott av MHCII+ celler. CD11c- makrofager ble definert som CD64+CD11c-, CD11c+ makrofager ble identifisert som CD64+CD11c+, og dendrittiske celler (DCer) ble avgrenset som CD64-CD11c+. Både makrofagsundersett og dendrittiske celler ble økt med laser (B). Legg merke til fraværet av CD11c+ celler i FMO (C). Høyre: Ly6C vs Tim4 pseudocolor plott av monocytter. Klassisk Ly6C+ og ikke-klassisk Ly6C- monocytter ble identifisert. Legg merke til at klassiske Ly6C+ monocytter var fraværende i Ly6C FMO (C). Prosenter indikerer prosent av overordnet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative data for mononukleære fagocytter mellom ulaserte og laserede mus både med og uten systemisk perfusjon. MHCII- (A), CD11c- (B) og CD11c+ (C) makrofag teller ble alle økt med laser. Det ble ikke oppdaget endringer mellom ulasert og laseret mikroglia (D) eller monocytter (E). Dendrittiske celler (DC) ble også økt med laser (F). Brown Forsythe og Welch ANOVA med Dunnetts T3 multippelsammenligningstest ble brukt til å definere statistiske forskjeller på grunn av ulik variasjon mellom grupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multi-parameter flyt cytometri gjør det mulig for kvantitativ analyse av flere celletyper i et komplekst vev. I denne rapporten beskriver vi flyten cytometrisk påvisning av mononukleære fagocytter populasjoner, inkludert monocytter, dendrittiske celler, og makrofag undergrupper, etter laserskade i museøyet. Liyanage et al rapporterte nylig en lignende gating strategi for å oppdage nøytrofiler, eosinofiler, lymfocytter, DCer, makrofager, infiltrerende makrofager og monocytter27. Vår gating strategi primært varierer ved tillegg av CD64. Liyanage et al identifiserer DC som CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ celler, og makrofager som CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- celler. Vi identifiserer DC som CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- celler og makrofager som CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD64+ celler. Bruken av CD64 for å diskriminere DC fra makrofager er godtetablert 6, og denne strategien tillater oss å identifisere makrofag heterogenitet, inkludert CD11c + makrofager. Den viktigste begrensningen av denne metoden er at den ikke gir data om vevsarkitektur eller plasseringen av bestemte celler i øyet. For å avgjøre om disse cellene er i netthinnen, choroid, iris eller en annen okulær struktur, kan vår protokoll kombineres med histologiske metoder eller endres for å inkludere mer omfattende oftalmisk disseksjon for å individuelt kjøre multiparameterflytcytometri på hver okulære underavdeling.
Vi har optimalisert protokollen for fordøyelse av hele museøyne for å forhindre varians skapt av disseksjon. For eksempel kan disseksjon av bakre øyekopper med fjerning av hornhinnen, iris og linse skape variasjon fra beholdt iris eller hornhinnemateriale (under disseksjon) eller økt laserskade på normalt bakre øyekoppområde (overdeksjon). Vår sammenligning mellom kontroll ulaserede og laserede øyne oppdager infiltrasjon av mononukleære fagocytter på grunn av retinochoridal skade. For analyse av effekten av systemiske sykdommer på øyet, det vil at uveitt og diabetes er individuell okulær underkomitéanalyse viktig. Metoden for fordøyelse, i avsnitt 2 i protokollen, er den mest kritiske, mens andre trinn i seksjon 3 - 5 har blitt brukt med hell på flere vevstyper24. Vi kom til fordøyelsesforholdene våre gjennom en iterativ metode som involverte: (1) testing av kjemisk fordøyelsesmetode (Collagenase D vs fordøyelsesenzym), (2) bestemmelse av lengden på kjemisk fordøyelse (30, 60 og 90 minutter), og (3) tillegg av mekanisk fordøyelse (ingen, en gang, to ganger, tre ganger). På hvert trinn dømte vi suksessen til fordøyelsesforholdene etter celle levedyktighet og antall CD45HiCD64+ (infiltrerende makrofager) celler. Vi fant at fordøyelsesenzym (se Supplerende table of Materials) gjenopprettet flere levende celler enn KollagenasE D og forsøk på halvparten av fordøyelsen enzymkonsentrasjon resulterte i færre infiltrerende makrofager. Deretter, 60 minutter med kjemisk fordøyelse med mekanisk fordøyelse nesten doblet infiltrerende makrofag populasjoner. Tre mekaniske fordøyelser var optimale med 25-30% levende celler av singlets og de mest infiltrerende makrofagpopulasjoner. Til slutt forårsaket raskere mekaniske fordøyelsesforhold alvorlig tap av både levende celler og makrofager.
I fremtiden foreslår vi å utvide metoden ved å fjerne hornhinnen, iris og linsen etterfulgt av separat fordøye netthinnen og bakre øyekopp (sclera, choroid og retinal pigmentert epitel). Med denne endringen forventer vi å redusere fordøyelsesforholdene på grunn av proteinene og tette egenskapene til linsen og hornhinnen henholdsvis. Disse reduksjonene kan omfatte redusert fordøyelsesenzymkonsentrasjon, bytte til kollagennase, redusert fordøyelsestid eller redusert mengde mekanisk fordøyelse. Vi forventer generelle reduserte fordøyelsesforhold for bakre øyekopp, og ytterligere reduserte fordøyelsesforhold for netthinnen alene.
Ytterligere fremtidige retninger inkluderer utvidelse av vår konvensjonelle multi-parameter flyt cytometri panel til en konvensjonell 6 laser instrument eller spektral flyt cytometri. Spektral strømningscytometri gjør det mulig for fluorofordeteksjon over hele spekteret, i stedet for bestemt av de tilgjengelige filtrene. Spektral strømningscytometri resulterer i mer spesifikk fargedeteksjon. Imidlertid krever spektral flytcytometri et helt nytt sett med hensyn som skal følges og er utenfor omfanget av dette manuskriptet. For mer informasjon, vennligst se denne siste JoVE artikkel28. De 6 laserinstrumentene inkluderer en ultrafiolett laser, som legger til 6-9 detektorer. Når du legger til markører i et museøyestrømcytometripanel, anbefaler vi at du påvisning av mer okulære celletyper. For eksempel kan Lineage gate skilles for å oppdage nøytrofiler, eosinofiler, mastceller, NK-celler og lymfocytter uavhengig. Det anbefales ikke å øke påvisning av bikulturære fagocytter på grunn av det lille antallet makrofager ved steady state. Når du legger til nye antistoffer, foreslår vi forsiktig antistofftitrering.
Oppsummert har vi presentert en tilpasningsdyktig, robust metode for påvisning av mononukleære fagocytter i museøyet. På grunn av de svært overlappende celleoverflatemarkørene til monocytter, dendrittiske celler, makrofager og microglia, er multiparameterflytcytometri den beste metoden for å oppdage disse cellulære populasjonene. Flow cytometri kan brukes til analyse av celletyper, skjebnekartlegging og/eller cellesortering for transkripsjons- eller proteomisk evaluering. Den store begrensningen er mangel på vevarkitektur, og viktige funn kan bekreftes ved hjelp av tradisjonell histologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
JAL ble støttet av NIH-stipendet K08EY030923; CMC ble støttet av et K01-stipend (5K01AR060169) fra NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases og a Novel Research Grant (637405) fra Lupus Research Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
