Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Переваривание целых глаз мыши для мульти-параметрического потока Цитометрического анализа моноядерных фагоцитов

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/61348
Automatic Translation
1, *2, *1
1Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол предоставляет метод переваривания цельных глаз в одноклеточную суспензию с целью многотехатрического цитометрического анализа потока с целью выявления специфических глазных моноядерных фагоцитных популяций, включая моноциты, микроглии, макрофаги и дендритные клетки.

Abstract

Врожденная иммунная система играет важную роль в глазной патофизиологии, включая увеит, диабетическую ретинопатию и возрастную макулярную дегенерацию. Врожденные иммунные клетки, в частности моноядерные фагоциты, выражают перекрывающиеся маркеры поверхности клеток, что делает идентификацию этих популяций сложной задачей. Цитометрия многотехатрийного потока позволяет проводить одновременный количественный анализ нескольких маркеров поверхности клеток, чтобы дифференцировать моноциты, макрофаги, микроглии и дендритные клетки в глазах мыши. Этот протокол описывает энуклеацию целых глаз мыши, рассечение глаз, пищеварение в одноклеточную подвеску и окрашивание одноклеточной суспензии для маркеров миелоидных клеток. Кроме того, мы объясняем правильные методы определения напряжения с помощью одного цветового управления и для разграничения положительных ворот с помощью флуоресценции минус один элемент управления. Основным ограничением цитометрии многотехатрийного потока является отсутствие архитектуры тканей. Это ограничение может быть преодолено с помощью мульти-параметра потока цитометрии отдельных глазных отсеков или бесплатного окрашивания иммунофлуоресценции. Тем не менее, иммунофлуоресценция ограничена отсутствием количественного анализа и сокращением количества флюорофоров на большинстве микроскопов. Мы описываем использование цитометрической цитометрии многопланетного потока для обеспечения высококоличего анализа моноядерных фагоцитов при лазерной хороидной неоваскуляризации. Кроме того, цитометрия многотравматического потока может быть использована для идентификации подмножества макрофагов, картирования судьбы и сортировки клеток для транскриптомических или протеомных исследований.

Introduction

Врожденная иммунная система включает в себя несколько типов клеток, которые стимулируют активацию дополнения и воспаление. Врожденные иммунные клетки включают естественные клетки убийцы (НК), тучные клетки, базофилы, эозинофилы, нейтрофилов и моноядерные фагоциты. Моноядерные фагоциты, которые состоят из моноцитов, макрофагов и дендритных клеток, были вовлечены в патофизиологию множественных офтальмологических состояний, включая увеит, диабетическую ретинопатию и возрастную макулярную дегенерацию (AMD)1. В этом протоколе мы сосредоточимся на выявлении моноядерных фагоцитов с использованием многотеатрического цитометрического анализа потока в мышиной модели неоваскулярной AMD2. Этот протокол адаптируется для мышиных моделей диабетической ретинопатии и/или увеита, но более обширное рассечение глаз рекомендуется из-за системного характера этих заболеваний.

Моноядерные фагоциты выражают перекрывающиеся маркеры поверхности клеток. Долгосрочные ткани резидентов макрофагов и микроглии происходят из желточного мешка полученных эритромиелоидныхпрародителя 3, в то время как переработка макрофагов и дендритных клеток отличаются от костного мозга полученных макрофагов дендритных клетокпрародителя 4. Маркеры поверхности клеток мыши, общие для моноцитов, макрофагов и дендритных клеток включают CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17, и внутриклеточный маркер Iba18. Для того, чтобы преодолеть эту проблему, транскриптомный анализ макрофагов, моноцитов и дендритных клеток из нескольких тканей определяет CD64 как макрофаг-специфический маркер поверхностиклеток 6. Макрофаги были описаны в радужной оболочке глаза, хороид, цилиарного тела, и зрительного нерва в здоровыхглазах 3. Кроме того, дендритная идентификация клеток является более сложной; наиболее специфический метод дендритной идентификации клеток требует картирования судьбы с помощью мыши репортера9. Независимо от этой линии репортера, выражение CD11c и MHCII в сочетании с отсутствием CD64 может определить потенциальные дендритныеклетки 6,10. Дендритные клетки были выявлены в роговицы, конъюнктивы, радужной оболочки глаза, и хороид в нормальныхглазах 11. Микроглии являются специализированными макрофагами, расположенными в сетчатке, защищенными гемово-сетчаткой барьером и полученными из клеток-предшественников желточногомешка 12. В результате, микроглии сетчатки могут быть дифференцированы от моноцитов полученных макрофагов их тусклый уровень экспрессии CD4513 и высокие уровни Tmem119, который доступен в качестве потока цитометрииантитела 14. После активации микроглии, однако, CD45 может быть до регулируемых15 и Tmem119 может быть внизрегулируется 3, демонстрируя сложность биологии микроглии, и это, вероятно, имеет отношение как в AMD и его мыши модели. Наконец, моноциты можно разделить по крайней мере на два подтипа, включая классический и неклассический. Классические моноциты отображаютCCR2 и Ly6C высокой CX3CR1 низкой экспрессии, и неклассических моноцитов продемонстрировать CCR2-Ly6CнизкийCX3CR1высокие маркеры 5.

В связи с необходимостью количественного анализа экспрессии маркеров, т.е. высоких и низких/димовых уровней, цитометрия многотеатрийного потока является идеальным методом для дискриминации моноцитов, макрофагов, микроглий и дендритных клеток в глазу и других тканях. Дополнительные преимущества включают идентификацию суб популяций, возможность использования флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) для сортировки популяций клеток для транскриптомного или протеомного анализа, а также картирование судьбы. Основным недостатком цитометрии многотехатрийного потока является отсутствие архитектуры тканей. Это можно преодолеть путем офтальмологического вскрытия в различные глазные подкомпартии: роговицу, конъюнктиву, радужную оболочку, хрусталик, сетчатку и хороидно-склерический комплекс. Кроме того, может быть выполнена подтверждаемая иммунофлуоресценция, но ограниченная количеством маркеров и отсутствием надежной количественной оценки.

Геном широкий ассоциации исследования связаны несколько генов дополнения с AMD16. Активация дополнения приводит к выработке анафилактоксина, набору лейкоцитов и, как следствие, воспалению. В дополнение к рецептору недостаточно мышей, лазерная травма уменьшает моноядерных фагоцитов набора и лазерной индуцированных хороидной неоваскуляризации (CNV)области 17. Аналогичным образом, C-C мотив хемокин рецептор 2 (CCR2) нокаут мыши, которая не хватает моноцитов набора в ткани, демонстрирует как снижение моноядерных фагоцитов набора и лазерной индуцированной области CNV18. Эти данные связывают дополнение и моноядерные фагоциты с экспериментальным CNV и, возможно, неоваскулярной AMD. В поддержку этой ассоциации, дополнение рецепторов дисрегулируются на периферических моноцитов крови у пациентов с неоваскулярной AMD19,20. Эти данные свидетельствуют о сильной связи между AMD и моноядерными фагоцитами.

В этой рукописи мы будем использовать экспериментальную лазерную индуцированную модель CNV для характеристики моноядерных популяций фагоцитов в мышином глазу с использованием цитометрии многотактного потока. Лазерно-индуцированной CNV является стандартной моделью мыши неоваскулярной AMD, которая продемонстрировала эффективность текущей первой линии неоваскулярной терапии AMD21. Этот протокол будет описывать энуклеацию глаз мыши, рассечение глаз, пищеварение в одноклеточную подвеску, окрашивание антител, определение лазерных напряжений с использованием одного цветового контроля и стратегию фиксации с использованием флуоресценции минус один (FMO) управления. Для подробного описания лазерной индуцированной модели CNV, пожалуйста, смотрите предыдущую публикацию22. Используя этот протокол, мы определим микроглии, моноциты, дендритные клетки и популяции макрофагов. Кроме того, мы будем использовать MHCII и CD11c для дальнейшего определения подмножего макрофагов в лазерной индуцированной модели CNV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Северо-Западного университета. C57BL/6 мышей были группы размещены на барьер объекта в Центре сравнительной медицины в Северо-Западном университете (Чикаго, Иллинойс). Все животные были размещены в 12/12 ч свет / темный цикл с бесплатным доступом к пище и воде.

1. Коллекция глазной ткани

  1. Пожертвование 10-12-недельный C57BL/6J мышей любого пола с использованием регулируемого администрирования двуокиси углерода, пока мышь не отвечает и больше не вдыхает. Выполните вывих шейки матки или другой утвержденный вторичный метод для обеспечения эвтаназии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Транскардиальная перфузия может быть выполнена для удаления циркулирующих лейкоцитов, которые не находятся в глазных тканях. В этом эксперименте системная перфузия не уменьшает количество микроглии, моноцитов, макрофагов или дендритных клеток, обнаруженных в необработанных или обработанных лазером цельных глазах. Таким образом, большинство из этих типов клеток расположены в офтальмологических тканях, и этот шаг является необязательным.
  2. Чтобы увядить глаза, нажмите вниз возле глазницы, поместив пару изогнутых типсов мягко под глазом, как он выделяется из гнезда. Pinch щипси закрыты под глазом, не сжимая фактический глаз. Выбить глаз из окружающей конъюнктивы (пожалуйста, см. предыдущую публикацию)23.
  3. Потяните глаз боковой, пока зрительный нерв является единственным оставшимся соединением, чтобы отделить глаз. Зрительный нерв часто разрывается с напряжением, но маленькие ножницы иногда необходимо сократить зрительный нерв. Поместите глаз в холодный 1x Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) с кальцием и магнием в микроцентрифугной трубке 1,7 мл.

2. Переваривание глазной ткани

  1. Приготовьте буфер пищеварения, содержащий фермент пищеварения 0,1 мг/мл и 0,2 мг/мл DNase в холодном HBSS. Восстановить фермент пищеварения 5 мг в 2 мл стерильной воды на начальном этапе. Подготовка первоначального разбавления 10 мг/мл DNase в HBSS. На каждые 10 мл буфера пищеварения (достаточно для 3 животных) смешайте 9,4 мл холодного HBSS с 0,4 мл восстановленного фермента пищеварения и 0,2 мл разбавленного DNase I.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти концентрации были эмпирически определены в течение нескольких экспериментов, чтобы обеспечить оптимальный уровень окрашивания антител отдельных клеток, при одновременном снижении смертности клеток. Коллагеназа D была опробована в качестве альтернативы ферменту пищеварения с пониженной жизнеспособностью клеток и снижением CD45и клеток. Более подробную информацию о итеративном процессе оптимизации пищеварения можно найти в обсуждении.
  2. Под рассечением микроскопа при 10-х общем увеличении удалите оставшуюся конъюнктиву и зрительный нерв с помощью тонких типсов и пружинных ножниц в холодном HBSS.
  3. Переместите чистые глаза на сухое рассекаемое блюдо или небольшую лодку для взвешивания. Ввините 0.15-0.20 mL/eye буфера пищеварения через шприц, оснащенный иглой 30 G в стекловидную полость после того, как две перфорирующие раны сделаны в глазу через ось зрения и на 90 градусов от этой первой раны для регресса буфера пищеварения.
  4. Фарш цельные глаза с помощью пружинных ножниц и тонких типсов со всеми кусочками меньше, чем 0,5 мм х 0,5 мм. Диссоциативная ткань объектива с тупым механическим нарушением с помощью типсов, чтобы предотвратить засорение пипетки советы в последующих шагах. Для каждого образца, промыть типсы и ножницы каждый с 0,75 мл буфера пищеварения в небольшое блюдо. Используйте новое блюдо для каждого образца.
  5. Передача содержимого блюда в диссоциацию трубки на льду с помощью P1000 пипетки заботиться, чтобы не потерять материал в пипетке передачи. Промыть блюдо дополнительными 1,5 мл буфера пищеварения доведя общий объем в диссоциательной трубке до 3,25-3,50 мл.
  6. Поместите диссоциационную трубку, перевернутую на электронный диссоциатор, и запустите цикл "m_brain_03_01", состоящий из 1 мин однонаправленного вращения при 200 об/мин при комнатной температуре, что является предварительно загруженной программой. Убедитесь, что все ткани находится в нижней части диссоциации трубки в контакте с буфером пищеварения и ротором для этого и всех оставшихся шагов.
  7. Поместите диссоциацию трубки в трясущимся инкубаторе в течение 30 минут при 200 об/мин при 37 градусах Цельсия.
  8. Повторите шаги 2.6 и 2.7 один дополнительный раз. После второго 30 мин инкубации выполнить один окончательный механического пищеварения с использованием электронного диссоциатора, как в шаге 2.6.
  9. Остановите реакцию, добавив 10 мл буфера холодного потока и поместите трубки на лед.

3. Подготовка клеточной подвески

  1. Чтобы создать одноклеточную подвеску, залить остановленную реакцию пищеварения глаз через 40 мкм фильтр, размещенный на верхней части 50 мл конической центрифуги трубки. Используя поршень из шприца 2,5 мл, проталкивайте через фильтр оставшиеся кусочки непереваренной ткани глаза.
  2. Вымойте диссоциальную трубку с 10 мл буфера потока и промыть фильтр, прежде чем использовать тот же поршень снова пройти непереваренных частей ткани глаза через фильтр.
  3. Повторите шаг 3.2 с помощью 5 мл буфера потока.
  4. Вымойте диссоциальную трубку и фильтр с окончательным 10 мл буфера потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем реактора и буфера потока составляет около 38-40 мл для каждого образца.
  5. Центрифуга конической трубки при 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Декант супернатант, не нарушая клеточной гранулы.
  6. Подготовка 1x облив решение, добавив 10x лисинг раствор стерильной воды. Разбейте гранулы, щелкивая трубку против другой трубки. Чтобы вылить красные кровяные тельца, добавьте 1 мл раствора 1x лиза на 30 с закрученной при комнатной температуре (RT).
  7. Остановите реакцию с 20 мл буфера потока.
  8. Центрифуга конической трубки при 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Декант супернатант, не нарушая клеточной гранулы.
  9. Отмежеваться гранулы, щелкая трубку против другой трубки. Добавьте 5 мл холодного 1x HBSS на трубку.
  10. Центрифуга трубки при 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспират супернатант.

4. Окрашивание клеточной суспензии для моноядерных фагоцитов

  1. Подготовь 0,5 мл живого/мертвого пятна на образец, разбавляя живой/мертвый краситель 1:5,000 в холодном HBSS.
  2. Добавить Live / Мертвые пятна на каждый образец с помощью P1000 пипетки убедившись, чтобы разобщить гранулы полностью. Передача образцов в 1,2 мл микро-titer труб.
  3. Возьмите небольшую алициту (10 МКЛ) для подсчета ячеек с помощью гемоцитометра или автоматической счетчика ячейки (см. 4.4). Инкубировать образцы с Live / Мертвые пятна в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.
  4. Подсчитайте клетки, использующие Trypan blue, чтобы определить количество живых клеток на образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 2 глаза от 10-12-недельной мыши C57BL/6J содержат менее 2 х 106 живых клеток.
  5. Вымойте образцы, добавив 400 МКЛ буфера холодного потока. Центрифуги трубки в микро-стойку тюбер трубки на 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспирировать супернатант, не нарушая клеточной гранулы.
  6. Повторное течение ячеек полностью в 500 йл буфера холодного потока. Центрифуги трубки в микро-стойку тюбер трубки на 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспирировать супернатант, не нарушая клеточной гранулы.
  7. Блок до 5 х 106 живых клеток в 50 МКЛ блока Fc (1:50 разбавления в холодном буфере потока очищенных крыс анти-мышь CD16/CD32). Если более 5 х 106 живых клеток, увеличить объемы надлежащим образом.
  8. Добавьте блок Fc к грануле убедившись, что полностью разобщить образец. Инкубация в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия.
  9. Добавьте 50 МКЛ раствора окрашивания антител (см. таблицу 1 для выбора и количества каждого антитела, которое входит в раствор) на 5 х 106 живых клеток непосредственно к клеткам в блоке Fc и полностью перемешать. Инкубировать в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество антител зависит от конфигурации цитометра потока и должно быть титровано независимо для каждой лаборатории и инструмента. Смотрите таблицу 2 для конфигурации инструмента фильтров и зеркал. Чтобы титровать антитела, начните с рекомендации производителя и рассчитайте индекс окрашивания. Выполните тестовый запуск различных концентраций антител (как выше, так и ниже рекомендации производителя) и выберите самую низкую концентрацию антител, где поддерживается индекс окрашивания. Кроме того, убедитесь, что положительное окрашивание, которое является менее ярким, чем одноцветный контроль. Используйте необлитаемые клетки, чтобы убедиться, что отрицательно окрашенные клетки находятся в масштабе и имеют пик на уровне или менее 1 х 102. Используйте флуоресценцию минус один контроль для определения положительно окрашенных клеток.
  10. Вымойте образцы, добавив 700 МКЛ буфера холодного потока. Центрифуги трубки в микро-стойку тюбер трубки на 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспирировать супернатант, не нарушая клеточной гранулы.
  11. Опционально, после окрашивания антител, образцы могут быть исправлены с 500 йл 2% параформальдегида в буфере потока. Исправить образцы в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем выполните одну стирку, как описано в 4.10. Храните фиксированные образцы при 4 градусах Цельсия. Граф бисер должен быть добавлен в день сбора данных цитометрии потока. Фиксированные образцы следует запускать на цитометре потока в течение 1-2 дней.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид является коррозионным и опасно для здоровья.
  12. Снова вымойте образцы, используя 500 МКЛ буфера холодного потока. Центрифуги трубки в микро-стойку тюбер трубки на 400 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Аспирировать половину супернатанта, не нарушая клеточной гранулы.
  13. Resuspend гранулы и передачи на 96 хорошо, U-дно анализ пластины. Центрифуга пластины при 400 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию. Чтобы вы декантировать супернатант, переверните пластину и в одном сильном встряхивании выбить жидкость в раковину бассейна, не нарушая гранулы.
  14. В новой трубке микро-рейтеров 1,2 мл, поместите 50 МКЛ хорошо вихревых бусин.
  15. Resuspend гранулы в 96 пластины хорошо в 200 йл холодного потока буфера. Добавить клеточной смеси на верхней части бисера от предыдущего шага. Запуск на поток цитометра в общем объеме 250 йл / микро-титер трубки.

5. Сбор данных о цитометрии потока

  1. Включите и подготовьте поток цитометра. Инструкции, перечисленные здесь для модифицированных четыре лазерных цитометра (Таблица 2).
  2. Вы запустите тестовый образец, который включает в себя небольшую алицита из каждого образца, чтобы убедиться, что все ячейки находятся в масштабе для каждого детектора. Отрегулируйте напряжение так, чтобы все ячейки были в масштабе.
  3. Вы запустите одиночные элементы управления цветом (SCC) для каждого фторфора, используемого в окрашивание коктейль (Таблица 3). Поместите микро-трубку titer в большую полистироловую трубку объемом 5 мл для размещения на стадии цитометра потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корневые флюорофоры, такие как BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) и Alexa700 не требуют того же антитела, что и коктейль (т.е. CD19 PE для CD64 PE). Тем не менее, тандем флюорофоры, как PE-CF594, PE-Cy7, или APC-Cy7 требуют того же антитела для SCC, как коктейль из-за потенциальной диссоциации конъюгированных фторфоров.
    1. Создайте SCC для BV421, добавив 2 капли компенсационных бусинок в 1,2 мл тюбика вместе с 1 йл хомяка антимошашки CD11c BV421. Компенсационные бусины используются потому, что CD11c BV421 является подтипом IgG lambda, а не каппа, как описано в 5.3.3. Инкубация в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия. Добавьте 0,2 мл буфера потока.
    2. Создайте SCC для живого/мертвого красителя, добавив одну каплю положительных окрашивающих бусин (зеленая шапочка) из реактивных бусин амина, а затем 1 йл живого/мертвого красителя. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Добавьте одну каплю отрицательных бусин (белая шапочка) из амина реактивных бусин. Добавьте 0,2 мл буфера потока.
    3. Создайте оставшиеся SCCs, добавив одну каплю положительных шариков окрашивания (зеленая шапочка) из анти-крысы и анти-хомяка Ig kappa бисера набор, а затем количество антител, перечисленных (Таблица 3) в 1,2 мл титр трубки. Инкубировать в течение 15 мин при 4 градусов по Цельсию. Добавьте одну каплю отрицательных бусин (белая шапочка) из анти-крысы и анти-хомяка Ig kappa бисера набор. Добавьте 0,2 мл буфера потока.
    4. Vortex все смеси бисера полностью. Храните SCC при 4 градусах Цельсия в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SCC для флуоресцентных мышей репортер не окрашенных клеток.
    5. При запуске SCC установите напряжение таким образом, что образец SCC имеет пик больше, чем любая флуоресценция для образца клеток в том же канале детектора. Кроме того, напряжение должно быть установлено таким образом, чтобы любой SCC имеет по крайней мере 0,5 Лог разница между пиком гистограммы в канале интереса по сравнению с любым другим каналом (Рисунок 1).
  4. Вы запустите образцы на "Низкий" сохраняя события / второй ниже 4000. Если скорость потока не может быть снижена надлежащим образом, разбавьте образцы дополнительным буфером холодного потока. Замечите добавленный объем, так как это будет необходимо для расчета счета (см. репрезентативные результаты).
  5. Соберите не менее 3 х 106 событий на выборку. Это может быть выше, чем количество клеток из-за пигментных гранул и мусора подсчета, как события на цитометре.
  6. Запись флуоресценции Минус один (FMO) для каждого флюорофора, кроме Live / Dead для надлежащей стратегии gating в разделе 6.4. FMO является образцом, который был окрашен со всеми флюорофорами, кроме одного.
  7. Очистите и выключите цитометр потока в соответствии с инструкциями производителя или предприятия.

6. Аннотация данных цитометрии потока

  1. Откройте новый лист с помощью программного обеспечения для анализа. Импорт файлов FCS из цитометра для всех образцов и одноцветных элементов управления.
  2. Используйте SCC для создания матрицы компенсации.
  3. Примените матрицу компенсации к окрашенным образцам и FMOs.
  4. Используйте FMOs для определения положительного окрашивания, чтобы нарисовать ворота.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показаны некомпенсированные гистограммы частоты для SCC и клетки для красного лазера: Alexa647, Alexa700 и APC-Cy7. На рисунке 1A,пурпурная линия изображала пик SCC для Alexa647, в то время как циановая линия показала предназначенную разницу в 0,5 журнала. Обратите внимание, что пик в Alexa700 и APC-Cy7 был слева (менее яркий) голубой линии. Также обратите внимание, что все клетки были слева от пурпурной линии. Любые ячейки справа от пика SCC не были компенсированы. Конкретные каналы, как известно, разлива в другие на основе химии фторхромных красителей (т.е. фиолетовый лазер: BV421 - 'gt; V500, желто-зеленый лазер: PE -GT; PE-CF594, Красный лазер: Alexa647 - Если ни одно из вышеперечисленных условий не будет выполнено, напряжение одного канала может быть скорректировано вверх, в то время как любые каналы разлива могут быть перемещены вниз. Дополнительные примеры красного лазера можно найти на рисунке 1B и рисунке 1C. После того, как напряжение было определено, а затем записано, все образцы должны быть запущены с параметрами напряжения. Компенсация, настроенная мастером, существует и может быть полезной.

Для количественной оценки количеств клеток необходима идентификация бисера. Рисунок 2A показал свойства FSC-A против SSC-A для всех проанализированных событий с двух глаз одной мыши. Важно настроить напряжение SSC, чтобы убедиться, что ваши бусы кол видны как очень плотная коллекция SSC-Aвысокой и FSC-Aнизких событий. Количество шариков было очищено и подтверждено заговором PE против APC-Cy7 (рис 2B). Чистые бусы были плотнымкластером PE и APC-Cy7- событий.

Синглты и живые клетки были затем определены из всех событий. Синглеты были определены путем построения FSC-H против FSC-A. Синглеты были положительно коррелированы в этих двух свойствах, в то время как дублетные и тройные клетки имели больший FSC-A, чем FSC-H(рисунок 2C). Живые клетки были очерчены путем построения Live / Dead против FSC-A. Мертвые клетки были живые / мертвые положительные, и клетки демонстрируют больше FSC-A, чем мусор (рис 2D). Обратите внимание, что количество бусин были Live / Deadи были удалены на этом этапе.

На рисунке 3 показана первоначальная стратегия определения разграничения моноядерных фагоцитов из живых, синглетных клеток. Live синглеты были визуализированы с помощью CD45 против CD11b участок(рисунок 3, слева). Обратите внимание, что былиотобраныCD45 и CD11b- (в основном В-клетки и Т-клетки), CD45dimCD11b (ативная микроглия) и CD45- CD11b - клетки (проникновение иммунных клеток, увеличенные с помощью лазера (Fig 3B, left). Отсутствие CD45 иячеек в CD45 FMO подтвердило выбор ворот(рисунок 3C, слева). Далее, нейтрофилов, Эозинофилы, B-клетки, НК-клетки и Т-клетки были исключены путем построенияCD45 и живых синглетов с использованием ворот Lineage (Лин: Ly6G «нейтрофилов», SiglecF «эозинофилов», B220 «B-клеток», NK1.1 «НК-клетки», CD4 «Т-клетки» и CD8 «Т-клетки») Легко наблюдалось увеличениегрупп CD11b и Lin- ячеек между группами No Laser (рисунок3A, средний) и лазерным (рисунок3B,средний). Обратите внимание на отсутствие CD11bиLin-клеток в CD11b FMO(рисунок 3C, средний) и отсутствиелиньковых клеток в Лин FMO(рисунок 3C, справа). Микроглию можно отделить от проникновения моноядерных фагоцитов по количеству экспрессии CD4513,24. CD11bиLin- клетки были визуализированы с помощью участка CD11b против CD45 для идентификации CD45тусклой мнимой микроглии и CD45с высоким проникновением моноядерных фагоцитов. Относительное увеличение CD45высоких моноядерных фагоцитов было ясно в лазерной обработке мыши(рисунок 3A,B, справа).

На рисунке 4 определены микроглии, три подмножества макрофагов, моноциты и дендритные клетки. Микроглии были определены путем построения CD45тусклые клетки на CD64 против MHCII участок(рисунок 4, левая панель). Микроглии были показаны, чтобы быть CD64иMHCIIнизким ранее13. Микроглии были относительно неизменными с лазером и отсутствует в CD64 FMO(рисунок 4A,C слева). Высокиеячейки CD45 были построены на том же графике CD64 против MHCII. CD64-MHCII- были выявлены макрофаги (MHCII- Macs), CD64-MHCII- моноциты, и MHCII и клетки были идентифицированы(рисунок 4A,B, средний левый). Обратите внимание на отсутствие ячеек MHCII в MHCII FMO(рисунок 4C, средний левый). КлеткиMHCII были дополнительно дискриминированы с помощью CD64 и CD11c.CD64и CD11c- макрофаги (CD11c- Macs), CD64и CD11c и макрофаги (CD11cи Macs), и CD64 - CD11c идендритные клетки (DCs) были определены(рисунок 4A,B, средний правый). Обратите внимание на отсутствие CD11cи клеток в CD11c FMO(рисунок 4C, средний справа). Моноциты были подтипом, как классические Ly6C или неклассических Ly6C- моноциты(рисунок 4, справа). Обратите внимание на отсутствие Ly6Cи моноцитов в Ly6C FMO(рисунок 4C, справа).

Количество ячеек на мышь (или на 2 глаза) было рассчитано со следующим уравнением:

Equation 1

Используя объемы в этом методе, уравнение:

Equation 2

Количество ячеей и количество шариков будут специфичны для каждого образца. Концентрация бисера специфична для каждой партии графа бисера и обеспечивается производителем на каждом флаконе.

Макрофаги проникают в хороид после лазернойтравмы 25,а истощение макрофага уменьшает область CNV18. Эти более старые изучения полагаются на изображении immunofluorescence, которое не может надежно продифференцировать моноядерные фагоциты, или немногие маркеры потока цитометрические для идентификации макрофага. Неоднородность макрофага является новой концепцией в врожденной иммунологии, где макрофаги способны выполнять несколько функций в зависимости от их происхождения имикроокноронности тканей 12,26. Мы выполнили мульти-параметр цитометрию потока на необработанных и лазерных обработанных глазах мыши на 3-й день после лазерной травмы для выявления моноядерных фагоцитов и неоднородности макрофага. Лазерная обработка увеличила MHCII-, CD11c-, и CD11c и макрофаги на 7,0-25,6, 2,8-7,2, и 3,9-8,2 раза соответственно(рисунок 5A,C). Дендритные количество клеток также были up-regulated 4.5-4.7-раза лазером(рисунок 5F). Количество микроглий и моноцитов не было затронуто лазерным лечением(рисунок 5D,E). До enucleation не было обнаружено существенных различий с системной перфузией или без нее. Эти результаты демонстрируют увеличение популяций макрофагов и дендритных клеток после лазерной травмы без изменения микроглии или моноцитов. Кроме того, эти данные подчеркивают, как цитометрия многотехарифного потока может обнаружить неоднородность макрофагов.

Антитела или буфер Флюорофор Клон Сумма на образец (ng)
крыса анти-мышь Ly6C FITC АЛЬ-21 15
мышь анти-мышь CD64 Pe X54-5/7.1 40
крыса анти-мышь Tim4 AlexaFluor 647 RMT4-54 300
хомяк анти-мышь CD11c BV 421 HL3 300
крыса анти-мышь Ly6G PE-CF594 1A8 10
мышь анти-мышь NK1.1 PE-CF594 PK136 10
крыса анти-мышь Siglec F PE-CF594 E50-2440 20
крыса анти-мышь B220 PE-CF594 RA3-6B2 20
крыса анти-мышь CD8 PE-CF594 53-6.7 40
крыса анти-мышь CD4 PE-CF594 RM4-5 20
крыса анти-мышь MHC II AlexaFluor 700 M5/114.15.2 2.5
крыса анти-мышь CD11b БТР-Си7 M1/70 2
крыса анти-мышь CD45 PE-Cy7 30-F11 6
Буфер MACS

Таблица 1: Флюорофор антител и клоны (см. шаг 4.9). Как правило, один образец является одним или двумя переваренными глазами. Добавить буфер потока в трубку, а затем каждое антитело. Разбавления могут быть сделаны, чтобы избежать пипетки слишком мал объем, при одновременном изменении общего объема буфера потока надлежащим образом. Смотрите таблицу материалов для номера продукта и компании.

Лазерный Слот PMT Фильтр Зеркало Цвета
Фиолетовый (405nm) A 525/50 505LP V500 или AmCyan
B 450/50 Тихоокеанский синий, eFluor 450, V450 или BV421
Синий (488nm/FSC) A 710/50 685LP PerCP-Cy5.5, PerCP, PI или 7AAD
B 525/50 505LP FITC, CFSE, GFP или AlexaFluor 488
C 488/10 Ssc
желто-зеленый (561 нм) A 780/60 735LP PE-Cy7
B 610/20 600LP PE-CF594, mCherry или DsRed2
C 582/15 Pe
Красный (640nm) A 780/60 735LP БТР-Си7, БТР-Н7 или БТР-эФлюор 780
B 730/45 690LP AlexaFluor 700
C 670/30 БТР или AlexaFluor 647

Таблица 2: Конфигурация цитометра потока. Фильтр и зеркальная установка для четырехлазного цитометра и доступных фторфоров, которые могут быть обнаружены в каждом канале. ПМТ - фотомультипьерная трубка, FSC - перемотка вперед, SSC - боковой рассеяние.

Антитела Флюорофор Клон Сумма за SCC (ng)
крыса анти-мышь CD45 FITC 30-F11 500
крыса анти-мышь CD19 Pe 1D3 40
крыса анти-мышь Tim4 AlexaFluor 647 RMT4-54 100
хомяк анти-мышь CD11c BV421 HL3 200
крыса анти-мышь Siglec F PE-CF594 E50-2440 40
крыса анти-мышь CD19 AlexaFluor 700 1D3 200
крыса анти-мышь CD11b БТР-Си7 M1/70 200
крыса анти-мышь CD45 PE-Cy7 30-F11 200
Live / Мертвый краситель eФтор 506 N/A 1 мкл

Таблица 3: Антитела флюорофор и клоны для одного цветового контроля. Каждое антитело должно быть добавлено к соответствующей компенсации шарик, как указано в шагах 5.3.1 - 5.3.3.

Figure 1
Рисунок 1: Представительное напряжение, настроенное для красного лазера. (A) Единый цвет управления (SCCs) для Alexa647. Слева показан SCC для Alexa647. Левая середина отображает разлив Alexa647 SCC в канал Alexa700. Пик Alexa647 SCC показан в пурпурном и 0,5 Лог цели дифференциал отображается в циан. Обратите внимание, что пик слева (менее яркий), чем голубой линии. Среднее право демонстрирует разлив Alexa647 SCC в канал APC-Cy7. Справа иллюстрирует клетки в канале Alexa647. Обратите внимание, что все ячейки менее яркие, чем SCC (пурпурная линия). (B) SCC для Alexa700. Средний левый показывает SCC для Alexa700. Слева отображает разлив Alexa700 SCC в alexa647 канала. Средний правый демонстрирует разлив Alexa700 SCC в канал APC-Cy7. Пик Alexa700 SCC показан в пурпурном и 0,5 Лог цели дифференциал отображается в циановом. Обратите внимание, что пик слева (менее яркий), чем голубой линии. Справа иллюстрирует клетки в канале Alexa700. Обратите внимание, что все ячейки менее яркие, чем SCC (пурпурная линия). (C)SCC для APC-Cy7. Левый и средний левый показывают разлив APC-Cy7 SCC в Alexa647 и Alexa700, соответственно. Обратите внимание, что оба пика находятся слева от линии циана. Средний правый демонстрирует ACP-Cy7 SCC. Справа иллюстрирует клетки в канале APC-Cy7. Обратите внимание, что все ячейки менее яркие, чем SCC (пурпурная линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативная идентификация графовых бусин, синглетов и живых клеток. (A)Область бокового рассеяния (SSC-A) против области рассеяния вперед (FSC-A) для всех ячеек на контурном участке. Граф бисера определены высокие SSC-A, низкий FSC-A, и очень жесткие кластеризации равномерной бусы. (B) PE против APC-Cy7 участок для чистых ворот бисера. Стрелка между A и B указывает на построение только положительных событий графа шарика. Чистые бусинки очерчены высокой ПЭ и низкой флуоресценцией БТР-Cy7. (C) FSC-Height (FSC-H) против FSC-Area (FSC-A) участок всех ячеек демонстрирует синглетные ячейки в положительно коррелированных широкой линии. Дублеты и другие мультиплексы показывают больше FSC-Area, чем FSC-Height. (D) Live / Dead против FSC-A для синглетных ячеек. Live клетки определяются как Live / Мертвые низким и FSC-A положительным. Проценты указывают процент родителей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативная идентификация моноядерных фагоцитов. Слева: CD45 против CD11b псевдоцветный участок живых клеток от unlasered (A), лазером ( B ), и флуоресценции минус один (FMO) управления (C). Слева: CD45и клетки определяются в A-B и отсутствуют в FMO. Обратите внимание на увеличение CD45иCD11bи клеток в лазерной(B)группе. Средний: Псевдоцветный участок линии (Lin) маркер против CD11b для CD45и клеток. CD11bиLin- ячейки очерчены в A-B и отсутствуют в FMO для CD11b (внизу). Справа: CD11b против CD45 участок CD11bи Lin- клетки. CD45тусклый и CD45 высокиеклетки определены. Обратите внимание на увеличение CD45высоких клеток в лазерной (B) группы. Проценты указывают процент родителей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативная идентификация микроглии, дендритных клеток, моноцитов и подмножество макрофагов. Слева: CD64 против MHCII псевдоцветный участок CD45тусклые клетки определяет микроглии, как CD64иMHCIIнизким . Обратите внимание на аналогичное количество микроглии в неслыхах(A)и лазерных(B)группах, а также отсутствие микроглии в управлении FMO(C). Средний левый: CD64 против MHCII псевдоцветный участок CD45высоких клеток определяет MHCII - макрофаги, как CD64и MHCII-, моноциты, как CD64-MHCII-и MHCII -клетки. Обратите внимание на увеличение MHCII-макрофагов в лазерной группе (B), отсутствие клеток MHCII в FMO (C, средний), и CD64 FMO (C, слева) помогли определить отбой дляCD64 и CD64 -клетки. Среднее право: CD64 против CD11c псевдоцветный участок MHCIIи ячеек. CD11c- макрофаги были определены как CD64и CD11c-, CD11cи макрофаги были определены как CD64и CD11c , и дендритные клетки (DCs) были очерчены как CD64-CD11c. Оба подмножества макрофагов и дендритных клеток были увеличены с помощью лазера (B). Обратите внимание на отсутствие CD11cи ячеек в FMO (C). Справа: Ly6C против Tim4 псевдоцветный участок моноцитов. Выявлены классические Ly6C и неклассицные Ly6C- моноциты. Обратите внимание, что классические Ly6C и моноциты отсутствовали в Ly6C FMO (C). Проценты указывают процент родителей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные данные по моноядерным фагоцитам между нелазерованными и лазерными мышами как с системной перфузией, так и без нее. MHCII- (A), CD11c- ( B), и CD11c ( C )макрофагвсе были увеличены с лазером. Не было обнаружено никаких изменений между нелазерной и лазерноймикроглией (D)или моноцитами(E). Дендритные клетки (DC) также были увеличены с лазером (F). Браун Форсайт и Уэлч ANOVA с T3 Даннетт несколько тест сравнения был использован для определения статистических различий из-за неравных различий между группами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Цитометрия многотехатрийного потока позволяет количественно провести количественный анализ нескольких типов клеток в сложной ткани. В этом докладе мы описываем цитометрическое обнаружение потока моноядерных популяций фагоцитов, включая моноциты, дендритные клетки и подмножества макрофагов, после лазерной травмы глаза мыши. Liyanage и др. Недавно сообщили о подобной стратегии гэтинга для обнаружения нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов, ДК, макрофагов, проникновения макрофагов имоноцитов 27. Наша стратегия в первую очередь отличается добавлением CD64. Liyanage et al идентифицирует DC как CD4-CD8-B220 - CD11b-CD11cи макрофаги как CD4 - CD8-B220-CD11b-CD11c-NK1.1-Ly6G -клетки. Мы определяем DC как CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1 - CD11b-CD11c- CD64 -клетки и макрофаги как CD4 - CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b и CD64 . Использование CD64 для дискриминации DC от макрофаговхорошо зарекомендовало себя 6, и эта стратегия позволяет нам определить макрофаг неоднородности, в том числе CD11c "макрофаги. Основным ограничением этого метода является то, что он не предоставляет данных об архитектуре тканей или о местоположении определенных клеток в глазу. Для того, чтобы определить, находятся ли эти клетки в сетчатке, хороиде, радужной оболочке глаза или другой глазной структуре, наш протокол можно комбинировать с гистологическими методами или модифицировать, чтобы включить более обширное офтальмологическое вскрытие для индивидуального запуска цитометрии многотематического потока на каждой глазной подкомпартии.

Мы оптимизировали протокол для переваривания целых глаз мыши, чтобы предотвратить любые отклонения, созданные вскрытием. Например, вскрытие задних глаз чашки с удалением роговицы, радужной оболочки глаза и хрусталика может создать изменчивость от сохраненной радужной оболочки глаза или роговицы материала (под препарирование) или увеличение лазерной травмы нормальной задней области чашки глаза (чрезмерное рассечение). Наше сравнение между контролем без глаз и лазерных глаз обнаруживает инфильтрацию моноядерных фагоцитов из-за ретинохоридальной травмы. Для анализа воздействия системных заболеваний на глаз, т.е. увеита и диабета, необходим индивидуальный подкомпонтийный анализ глаз. Метод пищеварения, в разделе 2 протокола, является наиболее важным, в то время как другие шаги в разделах 3 - 5 были успешно использованы на нескольких типахтканей 24. Мы пришли к нашим условиям пищеварения с помощью итеративного метода, который включает в себя: (1) тестирование метода химического пищеварения (Коллагеназа D против фермента пищеварения), (2) определение длины химического пищеварения (30, 60 и 90 минут), и (3) добавление механического пищеварения (ни один раз, два, три раза). На каждом шагу мы судили об успехе условий пищеварения по жизнеспособности клеток и количествуклетокCD45 HiCD64 (инфильтрации макрофагов). Мы обнаружили, что фермент пищеварения (см. Дополнительная таблица материалов) восстановил больше живых клеток, чем коллагеназа D и попытка половину концентрации фермента пищеварения привело к меньшему проникновению макрофагов. Далее, 60 минут химического пищеварения с механическим пищеварением почти в два раза проникающих популяций макрофагов. Три механических пищеварения были оптимальными с 25-30% живых клеток синглетов и наиболее проникающих популяций макрофагов. Наконец, более быстрые условия механического пищеварения вызвали сильную потерю как живых клеток, так и макрофагов.

В будущем мы предлагаем расширить метод путем удаления роговицы, радужной оболочки глаза и хрусталика, а затем отдельно переваривать сетчатку и заднюю чашку глаза (склеру, хороид и пигментированный эпителий сетчатки). С помощью этой модификации, мы ожидаем, чтобы уменьшить условия пищеварения из-за белковых и плотных характеристик хрусталика и роговицы соответственно. Эти сокращения могут включать снижение концентрации ферментов пищеварения, переход на коллагеназу, сокращение времени пищеварения или уменьшение количества механического пищеварения. Мы ожидаем общего снижения условий пищеварения для задней чашки глаза, и дальнейшее снижение условий пищеварения для сетчатки в одиночку.

Дополнительные направления в будущем включают расширение нашей обычной многотехатриальной цитометрии потока до обычного 6 лазерного инструмента или спектральной цитометрии потока. Спектральная цитометрия потока позволяет обнаруживать фторфор по всему спектру, а не определяться доступными фильтрами. Спектральная цитометрия потока приводит к более специфическому обнаружению цвета. Тем не менее, спектральная цитометрия потока требует совершенно нового набора соображений, которые должны следовать и выходит за рамки этой рукописи. Для получения более подробной информации, пожалуйста, смотрите эту недавнюю статьюJoVE 28. 6 лазерных приборов включают ультрафиолетовый лазер, который добавляет 6-9 детекторов. При добавлении маркеров в мышь глаз потока цитометрии панели, мы рекомендуем обнаружение более глазных типов клеток. Например, ворота Lineage могут быть отделены для самостоятельного обнаружения нейтрофилов, эозинофилов, тучных клеток, НК-клеток и лимфоцитов. Не рекомендуется увеличивать подмножество обнаружения моноядерных фагоцитов из-за небольшого количества макрофагов в стабильном состоянии. При добавлении новых антител мы предлагаем тщательное титровать антитела.

Таким образом, мы представили адаптируемый, надежный метод обнаружения моноядерных популяций фагоцитов в глазу мыши. Благодаря сильно перекрывающимся маркерам поверхности клеток моноцитов, дендритных клеток, макрофагов и микроглии, цитометрия многотеатрийного потока является лучшим методом для обнаружения этих клеточных популяций. Цитометрия потока может быть использована для анализа типов клеток, картирования судьбы и/или сортировки клеток для транскриптомной или протеомной оценки. Его основным ограничением является отсутствие архитектуры тканей, и ключевые выводы могут быть подтверждены с помощью традиционной гистологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

JAL была поддержана грантом NIH K08EY030923; CMC была поддержана грантом K01 (5K01AR060169) от Национального института артрита и болезней опорно-двигательного мозга и новым исследовательским грантом (637405) от Исследовательского альянса волчанки.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
1.7 ml microcentrifuge tubes Costar 3620
10 ml pipettes Fisher Scientific 431031
15 ml conicals ThermoFisher 339650
1x HBSS, 500 ml Gibco 14025-092
2.5 ml syringe Henke Sass Wolf 7886-1
20% paraformaldehyde solution Electron Microscopy Sciences 15713-S
25 ml pipettes Fisher Scientific 431032
30 G needle Exel 26437
3ml luer lock syringe Fisher Scientific 14955457
41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish Fisher Scientific 08-732-112
50 ml conicals Falcon 352070
96-well, U-bottom assay plate without lid Falcon 353910
Amine reactive beads ThermoFisher A10628
Analysis software FlowJo v 10
Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set BD Biosciences 552845
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664
Cell counter Invitrogen AMQAX1000
Cell counter slides Invitrogen C10283
Compensation beads ThermoFisher 01-1111-42
Count beads ThermoFisher 01-1234-42
Curved forceps Fisher Scientific 16-100-123
Digestion enzyme Sigma Aldrich 5401020001
Dissecting microscope National Optical and Scientific Instruments, Inc. DC3-420T
Dissociation tubes Miltenyi Biotec 130-096-334
DNase Roche 10104159001
Electronic dissociator Miltenyi Biotec 130-095-937
FACS Diva software BD Biosciences
Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142
Fine forceps Integra Miltex 17035X
Flow buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Flow cytometer BD Biosciences
Flow tubes Falcon 352008
Hamster anti-mouse CD11c BV421 BD Biosciences 562782
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-123
Live/Dead dye ThermoFisher 65-0866-14
Lysing solution, 10x solution BD Biosciences 555899
Micro titer tube and rack Fisher Scientific 02-681-380
Mouse anti-mouse CD64 PE BioLegend 139304
Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 BD Biosciences 562864
P1000 pipet tips Denville Scientific P2404
P1000 pipettor Gilson FA10006M
P2 pipet tips eppendorf 22491806
P2 pipettor Gilson FA10001M
P20 pipettor Gilson FA10003M
P200 pipet tips Denville Scientific P2401
P200 pipettor Gilson FA10005M
Pipet man Fisher Scientific FB14955202
Rat anti-mouse B220 PECF594 BD Biosciences 562313
Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 BD Biosciences 557657
Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 BD Biosciences 557958
Rat anti-mouse CD19 PE BD Biosciences 553786
Rat anti-mouse CD4 PECF594 BD Biosciences 562314
Rat anti-mouse CD45 FITC ThermoFisher 11-0451-82
Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 BD Biosciences 552848
Rat anti-mouse CD8 PECF594 BD Biosciences 562315
Rat anti-mouse Ly6C BD Biosciences 561085
Rat anti-mouse Ly6G PECF594 BD Biosciences 562700
Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 BioLegend 107622
Rat anti-mouse Siglec F PECF594 BD Biosciences 562757
Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 BD Biosciences 564178
Shaking incubator Labnet 311DS
Spring scissors Fine Science Tools 15024-10
Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh Fisher Scientific 22363547
Sterile water, 500 ml Gibco A12873-01
Swinging bucket centrifuge eppendorf 5910 R
Trypan blue, 0.4% solution Gibco 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
  2. Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
  3. O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
  4. Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
  5. Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
  6. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  7. Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
  8. Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
  9. Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
  10. Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
  11. Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
  12. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  13. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
  14. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  15. Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
  16. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
  17. Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
  18. Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
  19. Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
  20. Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
  21. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
  22. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
  23. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
  24. Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
  25. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
  26. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  27. Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
  28. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 160 глаз цитометрия потока макрофаг микроглия моноцит миелоид
Переваривание целых глаз мыши для мульти-параметрического потока Цитометрического анализа моноядерных фагоцитов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Droho, S., Cuda, C. M., Lavine, J.… More

Droho, S., Cuda, C. M., Lavine, J. A. Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes. J. Vis. Exp. (160), e61348, doi:10.3791/61348 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter