Summary
Este protocolo proporciona un método para digerir los ojos enteros en una sola suspensión celular con el propósito de análisis citométrico de flujo multiparamétrico con el fin de identificar poblaciones fagocíticas mononucleares oculares específicas, incluyendo monocitos, microglia, macrófagos y células dendríticas.
Abstract
El sistema inmunitario innato desempeña un papel importante en la fisiopatología ocular, incluida la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad. Las células inmunes innatas, específicamente fagocitos mononucleares, expresan marcadores de superficie celular superpuestos, lo que hace que identificar estas poblaciones sea un desafío. La citometría de flujo multiparamétrico permite el análisis simultáneo y cuantitativo de múltiples marcadores de superficie celular con el fin de diferenciar monocitos, macrófagos, microglia y células dendríticas en los ojos del ratón. Este protocolo describe la enucleación de ojos enteros del ratón, disección ocular, digestión en una sola suspensión celular y tinción de la suspensión de una sola célula para marcadores de células mieloides. Además, explicamos los métodos adecuados para determinar voltajes utilizando controles de un solo color y para delinear puertas positivas usando fluorescencia menos uno controles. La principal limitación de la citometría de flujo multiparametrista es la ausencia de arquitectura tisular. Esta limitación puede superarse mediante citometría de flujo multiparar de compartimentos oculares individuales o tinción de inmunofluorescencia gratuita. Sin embargo, la inmunofluorescencia está limitada por su falta de análisis cuantitativo y la reducción del número de fluoróforos en la mayoría de los microscopios. Describimos el uso de citometría de flujo multiparamétrico para proporcionar un análisis altamente cuantitativo de fagocitos mononucleares en neovascularización coroidal inducida por láser. Además, la citometría de flujo multiparametrismo se puede utilizar para la identificación de subconjuntos de macrófago, mapeo del destino y clasificación celular para estudios transcriptómicos o proteómicos.
Introduction
El sistema inmunitario innato incluye múltiples tipos celulares que estimulan la activación y la inflamación del complemento. Las células inmunes innatas incluyen células asesinas naturales (NK), mastocitos, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y fagocitos mononucleares. Los fagocitos mononucleares, compuestos por monocitos, macrófagos y células dendríticas, se han implicado en la fisiopatología de múltiples afecciones oftálmicas como la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE)1. En este protocolo, nos centraremos en la identificación de fagocitos mononucleares utilizando análisis citométricos de flujo multiparamétrico en un modelo de ratón de AMD neovascular2. Este protocolo es adaptable para modelos de ratón de retinopatía diabética y/o uveítis, pero se recomienda una disección ocular más extensa debido a la naturaleza sistémica de estas enfermedades.
Los fagocitos mononucleares expresan marcadores de superficie celular superpuestos. Los macrófagos y microglia residentes en tejidos de larga duración se originan a partir del progenitor eritromicoide derivado del saco de yema3,mientras que el reciclaje de macrófagos y células dendríticas se diferencian del progenitor de células dendríticas de células dendríticas derivadas de la médula ósea4. Los marcadores de superficie de celda del ratón comunes a monocitos, macrófagos y celdas dendríticas incluyen CD45, CD11b5,F4/806,Cx3cr17y el marcador intracelular Iba18. Con el fin de superar este desafío, el análisis transcriptómico de macrófagos, monocitos y células dendríticas de múltiples tejidos define CD64 como un marcador de superficie celular específico del macrófago6. Se han descrito macrófagos en el iris, la coroides, el cuerpo ciliario y el nervio óptico en ojos sanos3. Alternativamente, la identificación de células dendríticas es más difícil; el método más específico de identificación de células dendríticas requiere mapeo del destino utilizando el ratón reportero Zbtb46-GFP9. Independientemente de esta línea de reportero, expresión de CD11c y MHCII en conjunto con la ausencia de CD64 puede identificar posibles células dendríticas6,10. Las células dendríticas se han identificado en córnea, conjuntiva, iris y coroides en los ojos normales11. Las microglias son macrófagos especializados ubicados en la retina, protegidos por la barrera hematoencefálica y derivados de las células progenitoras del saco de yema12. Como resultado, la microglia retiniana se puede diferenciar de los macrófagos derivados de monocitos por sus niveles tenues de la expresión CD4513 y los altos niveles de Tmem119, que está disponible como anticuerpo de citometría de flujo14. Sin embargo, tras la activación de la microglia, el CD45 puede estar regulado15 y Tmem119 puede estar regulado a la baja3,lo que demuestra la complejidad de la biología de la microglia y esto es probablemente relevante tanto en AMD como en su modelo de ratón. Por último, los monocitos se pueden dividir en al menos dos subtipos, incluidos los clásicos y no clásicos. Los monocitos clásicos muestran ccr2+ly6CaltoCX3CR1baja expresión, y los monocitos no clásicos demuestran CCR2-Ly6CbajoCX3CR1 marcadoresaltos 5.
Debido a la necesidad del análisis cuantitativo de la expresión de marcadores, es decir, niveles altos frente a bajos/tenues, la citometría de flujo multiparamétrico es el método ideal para la discriminación entre monocitos, macrófagos, microglia y células dendríticas en el ojo y otros tejidos. Otras ventajas incluyen la identificación de subpoblaciones, la capacidad de utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para ordenar las poblaciones celulares para el análisis transcriptómico o proteómico, y el mapeo del destino. La principal desventaja de la citometría de flujo multiparametrista es la falta de arquitectura tisular. Esto puede ser superado por la disección oftálmica en los diversos subcompartmentos oculares: córnea, conjuntiva, iris, lente, retina y complejo choroide-sclera. Además, se pueden realizar imágenes confirmatorias de inmunofluorescencia, pero está limitada por el número de marcadores y la falta de cuantificación robusta.
Estudios de asociación del genoma han vinculado múltiples genes complementarios con AMD16. La activación del complemento conduce a la producción de anafiltoxina, el reclutamiento de leucocitos y la inflamación resultante. En ratones deficientes en receptores complementarios, la lesión láser reduce el reclutamiento de fagocitos mononucleares y la neovascularización coroidal inducida por láser (CNV) área17. Del mismo modo, el ratón knockout del receptor de quimiocina con motivo C-C 2 (CCR2), que es deficiente en el reclutamiento de monocitos al tejido, demuestra tanto la disminución del reclutamiento de fagocitos mononucleares como el área18del CNV inducida por láser. Estos enlaces de datos complementan y mononucleares fagocitos con CNV experimental y posiblemente AMD neovascular. En apoyo de esta asociación, los receptores complementarios están disregulados en monocitos sanguíneos periféricos en pacientes con DMM neovascular19,20. Estos datos demuestran una fuerte asociación entre la AMD y los fagocitos mononucleares.
En este manuscrito, utilizaremos el modelo experimental de CNV inducido por láser para caracterizar las poblaciones mononucleares de fagocitos en el ojo del ratón utilizando citometría de flujo multiparametral. El CNV inducido por láser es el modelo estándar de ratón de la AMD neovascular, que demostró la eficacia de la terapia amd neovascular de primera línea actual21. Este protocolo describirá la enucleación de los ojos del ratón, la disección ocular, la digestión en una sola suspensión celular, la tinción de anticuerpos, la determinación de voltajes láser utilizando controles de un solo color y la estrategia de gating utilizando controles de fluorescencia menos uno (FMO). Para obtener una descripción detallada del modelo CNV inducido por láser, consulte la publicaciónanterior 22. Con este protocolo, definiremos microglia, monocitos, células dendríticas y poblaciones de macrófago. Además, utilizaremos MHCII y CD11c para definir aún más subconjuntos de macrófago dentro del modelo CNV inducido por láser.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Los ratones C57BL/6 estaban alojados en una instalación de barrera en el Centro de Medicina Comparada de la Universidad Northwestern (Chicago, IL). Todos los animales estaban alojados en ciclo claro/oscuro de 12/12 h con libre acceso a alimentos y agua.
1. Recolección de tejido ocular
- Sacrificar ratones C57BL/6J de 10-12 semanas de edad de cualquiera de los dos sexos usando la administración regulada de dióxido de carbono hasta que el ratón no responda y ya no inhale. Realizar dislocación cervical u otro método secundario aprobado para garantizar la eutanasia.
NOTA: Se puede realizar perfusión transcardial para eliminar los leucocitos circulantes que no están en los tejidos oculares. En este experimento, la perfusión sistémica no reduce el número de microglia, monocitos, macrófagos o células dendríticas detectadas en ojos enteros sin tratar o tratados con láser. Por lo tanto, la mayoría de estos tipos de células se encuentran en los tejidos oftálmicos y este paso es opcional. - Para enuclear los ojos, empuje hacia abajo cerca de la cavidad ocular mientras coloca un par de fórceps curvas suavemente debajo del ojo mientras se destaca de la cavidad. Pellizcar fórceps cerrados debajo del ojo sin apretar el ojo real. Desalojar la vista de la conjuntiva circundante (véase la publicación previa)23.
- Tire del ojo lateralmente hasta que el nervio óptico sea la única conexión restante para separar el ojo. El nervio óptico a menudo se corta con tensión, pero una pequeña tijera a veces es necesaria para cortar el nervio óptico. Coloque el ojo en la solución salina tamponada (HBSS) fría de 1x Hank con calcio y magnesio en tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
2. Digestión del tejido ocular
- Preparar el tampón de digestión que contiene 0,1 mg/mL enzima de digestión y 0,2 mg/ml DNase en HBSS frío. Reconstituir 5 mg de enzima digestión en 2 ml de agua estéril inicialmente. Preparar una dilución inicial de 10 mg/ml de DNase en HBSS. Por cada 10 ml del tampón de digestión (suficiente para 3 animales) mezclar 9,4 ml de HBSS frío con 0,4 ml de enzima de digestión reconstituida y 0,2 ml de DNase I diluido.
NOTA: Estas concentraciones se determinaron empíricamente sobre múltiples experimentos para proporcionar niveles óptimos de tinción de anticuerpos de células individuales, al tiempo que se reducía la muerte celular. La colágena D se probó como una alternativa a la enzima digestión con menor viabilidad celular y disminución de las células CD45+. Consulte Discusión para obtener más detalles sobre el proceso iterativo para optimizar la digestión. - Bajo un microscopio diseccionador a una ampliación total de 10x, retire la conjuntiva y el nervio óptico restantes usando fórceps finos y tijeras de resorte en HBSS frío.
- Mueva los ojos limpios a un plato de disección seco o a un pequeño bote de pesaje. Inyectar 0,15-0,20 ml/ojo de amortiguador de digestión a través de jeringa equipada con aguja de 30 G en la cavidad vítrea después de que dos heridas perforadoras se hacen en el ojo a través del eje visual y a 90° de distancia de esta primera herida para la salida del búfer de digestión.
- Ojos enteros mince usando tijeras de resorte y fórceps finos con todas las piezas más pequeñas de 0,5 mm x 0,5 mm. Disociar el tejido de la lente con una interrupción mecánica contundente a través de fórceps para evitar la obstrucción de puntas de pipeta en pasos posteriores. Para cada muestra, enjuague los fórceps y tijeras cada uno con 0,75 ml de amortiguador de digestión en un plato pequeño. Use un plato nuevo para cada muestra.
- Transfiera el contenido del plato a un tubo de disociación en hielo utilizando pipeta P1000 teniendo cuidado de no perder ningún material en la transferencia de pipeta. Enjuague el plato con 1,5 ml adicionales de amortiguador de digestión, lo que eleva el volumen total en tubo de disociación a 3,25-3,50 ml.
- Coloque el tubo de disociación invertido en disociador electrónico y ejecute el ciclo "m_brain_03_01", que consiste en una rotación unidireccional de 1 min a 200 rpm a temperatura ambiente, que es un programa precargado. Asegúrese de que todo el tejido esté en la parte inferior del tubo de disociación en contacto con el búfer de digestión y el rotor para este y todos los pasos restantes.
- Coloque el tubo de disociación en la incubadora de agitación durante 30 minutos a 200 rpm a 37 °C.
- Repita los pasos 2.6 y 2.7 una vez más. Después de la segunda incubación de 30 minutos realizar una digestión mecánica final utilizando disociador electrónico como en el paso 2.6.
- Detenga la reacción añadiendo 10 ml de amortiguador de flujo frío y coloque tubos sobre hielo.
3. Preparación de la suspensión celular
- Para crear la suspensión de una sola célula, vierta la reacción de digestión ocular detenida a través de un filtro de 40 μm colocado en la parte superior de un tubo centrífugo cónico de 50 ml. Usando el émbolo de una jeringa de 2,5 ml, empuje cualquier pedazo restante de tejido ocular indigno a través del filtro.
- Lave el tubo de disociación con 10 ml de tampón flow y enjuague el filtro antes de usar el mismo émbolo para pasar de nuevo piezas de tejido ocular no digerida a través del filtro.
- Repita el paso 3.2 usando 5 mL de búfer de flujo.
- Lave el tubo de disociación y filtre con un amortiguador final de 10 ml de flujo.
NOTA: El volumen total de digestión y búfer de flujo es de aproximadamente 38-40 ml para cada muestra. - Centrífuga el tubo cónico a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
- Prepare la solución de lysing 1x añadiendo solución de lisante de 10x al agua estéril. Rompe el pellet moviendo el tubo contra otro tubo. Para liar los glóbulos rojos, añadir 1 ml de solución de lisante 1x para 30 s con remolino a temperatura ambiente (RT).
- Detenga la reacción con 20 ml de búfer de flujo.
- Centrífuga el tubo cónico a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
- Disociar el pellet moviendo el tubo contra otro tubo. Añadir 5 ml de frío 1x HBSS por tubo.
- Tubos centrífugas a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar supernadante.
4. Tinción de la suspensión celular para fagocitos mononucleares
- Prepare 0,5 ml de mancha viva/muerta por muestra diluyendo el tinte vivo/muerto 1:5.000 en HBSS frío.
- Agregue la mancha Live/Dead a cada muestra usando una pipeta P1000 asegurándose de disociar el pellet por completo. Transfiera muestras a tubos de micro titulaciones de 1,2 ml.
- Tome una pequeña alícuota (10 μL) para contar las células utilizando un hemociclomeciómetro o contador de células automático (ver 4.4). Incuba muestras con mancha viva/muerta durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Cuente celdas usando Trypan blue para determinar el número de celdas vivas por muestra.
NOTA: Típicamente, 2 ojos de un ratón C57BL/6J de 10-12 semanas de edad contienen menos de 2 x 106 células vivas. - Lave muestras añadiendo 400 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
- Células resuspend completamente en 500 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
- Bloquee hasta 5 x 106 células vivas en 50 μL de bloque Fc (dilución de 1:50 en búfer de flujo frío de rata purificada anti-ratón CD16/CD32). Si más de 5 x 106 células vivas, aumente los volúmenes adecuadamente.
- Añadir bloque Fc al pellet asegurándose de disociar completamente la muestra. Incubar durante 20 min a 4 °C.
- Añadir 50 μL de solución de tinción de anticuerpos (ver Tabla 1 para su elección y cantidad de cada anticuerpo que se incluye en la solución) por 5 x 106 células vivas directamente a las células en bloque Fc y mezclar completamente. Incubar durante 30 min a 4 °C.
NOTA: Las cantidades de anticuerpos dependen de la configuración del citómetro de flujo y deben valorarse de forma independiente para cada laboratorio e instrumento. Consulte la Tabla 2 para la configuración de instrumentos de filtros y espejos. Para valorar anticuerpos, comience con la recomendación del fabricante y calcule el índice de tinción. Realice una prueba de concentraciones de anticuerpos variables (tanto por encima como por debajo de la recomendación del fabricante) y elija la concentración más baja de anticuerpos donde se mantiene el índice de tinción. Además, asegúrese de que la tinción positiva que es menos brillante que el control de un solo color. Utilice células sin manchar para asegurarse de que las células manchadas negativamente están a escala y tienen un pico en o menos de 1 x 102. Utilice una fluorescencia menos un control para definir las células manchadas positivamente. - Lave muestras añadiendo 700 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
- Opcionalmente, después de la tinción de anticuerpos, las muestras se pueden fijar con 500 μL de paraformaldehído del 2% en el búfer de flujo. Corrija muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, realice un lavado como se describe en 4.10. Almacene muestras fijas a 4 °C. Las cuentas de recuento deben agregarse el día de la recopilación de datos de citometría de flujo. Las muestras fijas deben ejecutarse en el cytómetro de flujo en 1-2 días.
PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es un peligro corrosivo y para la salud. - Lave muestras de nuevo usando 500 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar la mitad del sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
- Resuspend pellets y transferir a un pozo 96, placa de ensayo de fondo en U. Placa centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Para decantar el sobrenadante, gire la placa y en una sacudida fuerte desaloje el líquido en una cuenca del fregadero, sin perturbar el pellet.
- En un nuevo tubo micro titulador de 1,2 ml, coloque 50 μL de cuentas de recuento bien vórtices.
- Pellets resuspend en 96 placa de pozo en 200 μL de amortiguador de flujo frío. Agregue la mezcla celular en la parte superior de las cuentas del paso anterior. Ejecute el citómetro de flujo en un volumen total de 250 μL / tubo de micro titulador.
5. Recopilación de datos de citometría de flujo
- Encienda y prepare el citómetro de flujo. Las instrucciones enumeradas aquí son para un cytómetro láser de cuatro modificados (Tabla 2).
- Ejecute una muestra de prueba, que incluye una pequeña alícuota de cada muestra, para asegurarse de que todas las células están a escala para cada detector. Ajuste los voltajes para que todas las celdas estén a escala.
- Ejecute controles de un solo color (SCC) para cada fluoróforo utilizado en el cóctel de tinción(Tabla 3). Coloque el tubo de micro titulación en un tubo de poliestireno de 5 ml más grande para colocarlo en la etapa del citómetro de flujo.
NOTA: Los fluoróforos radiculares como BV421 (Azul Pacífico), FITC, PE, Alexa647 (APC) y Alexa700 no requieren el mismo anticuerpo que el cóctel (es decir, CD19 PE para CD64 PE). Sin embargo, los fluoróforos tándem como PE-CF594, PE-Cy7 o APC-Cy7 requieren el mismo anticuerpo para SCC que el cóctel debido a la posible disociación de los fluoróforos conjugados.- Cree el SCC para BV421 añadiendo 2 gotas de cuentas de compensación a un tubo de titer de 1,2 ml junto con 1 μL de hámster anti-ratón CD11c BV421. Las cuentas de compensación se utilizan porque CD11c BV421 es un subtipo lambda IgG en lugar de kappa como se describe en 5.3.3. Incubar durante 15 minutos a 4 °C. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.
- Crea el SCC para el tinte Live/Dead añadiendo una gota de cuentas de tinción positivas (tapa verde) a partir de las cuentas reactivas de amina, seguidas de 1 μL de tinte Vivo/Muerto. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Añadir una gota de las cuentas negativas (tapa blanca) de las cuentas reactivas amina. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.
- Cree los SCC restantes añadiendo una gota de cuentas de tinción positivas (tapa verde) del conjunto de cuentas anti-rata y anti-hámster Ig kappa, seguida de la cantidad de anticuerpos enumerada(Tabla 3)en un tubo de titer de 1,2 ml. Incubar durante 15 min a 4 °C. Añadir una gota de las cuentas negativas (tapa blanca) de la anti-rata y anti-hámster Ig kappa conjunto de cuentas. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.
- Vórtice todas las mezclas de cuentas completamente. Almacene los SCCs a 4 °C durante un tiempo de hasta 3 días.
NOTA: El SCC para ratones reporteros fluorescentes son células sin manchar. - Al ejecutar SCCs, establezca voltajes de tal manera que la muestra SCC tenga un pico mayor que cualquier fluorescencia para una muestra de células en el mismo canal detector. Además, se deben fijar tensiones para que cualquier SCC tenga al menos una diferencia de registro de 0,5 entre el pico del histograma en el canal de interés frente a cualquier otro canal (Figura 1).
- Ejecute muestras en eventos de mantenimiento "Bajos"/segundo por debajo de 4000. Si el caudal no se puede reducir adecuadamente, diluya las muestras con un búfer de flujo frío adicional. Registre el volumen agregado, ya que esto será necesario para el cálculo del recuento (ver resultados representativos).
- Recopile al menos 3 x 106 eventos por muestra. Esto puede ser mayor que el número de células debido a que los gránulos pigmentos y los desechos cuentan como eventos en el cytómetro.
- Registre una Fluorescencia Menos Uno (FMO) para cada fluoróforo que no sea Vivo/Muerto para una estrategia de gating adecuada en la sección 6.4. Una FMO es una muestra que ha sido manchada con todos los fluoróforos excepto uno.
- Limpie y apague el citómetro de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante o de la instalación.
6. Anotación de datos de citometría de flujo
- Abra una nueva hoja de trabajo mediante el software de análisis. Importe archivos FCS desde el citómetro para todas las muestras y controles de un solo color.
- Utilice SCCs para crear una matriz de compensación.
- Aplique la matriz de compensación a sus muestras manchadas y FMOs.
- Utilice los FMOs para determinar la tinción positiva para dibujar puertas.
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Representative Results
La Figura 1 mostró histogramas de frecuencia no compensados para los SCCs y las celdas para el láser rojo: Alexa647, Alexa700 y APC-Cy7. En la Figura 1A,la línea magenta representaba el pico del SCC para Alexa647, mientras que la línea de cian mostraba la diferencia de registro 0.5 prevista. Observe que el pico en Alexa700 y APC-Cy7 fue a la izquierda (menos brillante) de la línea de cian. También tenga en cuenta que todas las celdas estaban a la izquierda de la línea magenta. Las células a la derecha del pico SCC no fueron compensadas. Se sabía que los canales específicos se derramaban en otros basándose en la química de los tintes fluorocromáticos (es decir. Láser violeta: BV421 -> V500, Láser amarillo-verde: PE -> PE-CF594, Láser rojo: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, Láser cruzado: PE-Cy7 -> APC-Cy7). Si no se cumpliera alguna de las condiciones anteriores, la tensión de un canal podría ajustarse hacia arriba mientras que cualquier canal de derrame podría moverse hacia abajo. Consulte la Figura 1B y la Figura 1C para ver ejemplos adicionales del láser rojo. Una vez que se determinaron y registraron las tensiones, todas las muestras deben ejecutarse con los parámetros de voltaje. Existe un asistente de configuración de compensación que puede ser útil.
La identificación del cordón de recuento es necesaria para cuantificar el recuento de celdas. La Figura 2A mostró las propiedades FSC-A vs SSC-A para todos los eventos analizados de dos ojos de un solo ratón. Es importante ajustar el voltaje SSC para asegurarse de que sus cuentas de recuento son visibles como una colección muy apretada de eventosaltos SSC-A y FSC-Abajos. Los recuentos de cuentas se limpiaron y confirmaron trazando PE vs APC-Cy7 (Fig. 2B). Cuentas limpias eran un grupo apretado de PE+ y APC-Cy7- eventos.
Los singletes y las células vivas fueron identificados a continuación de todos los eventos. Los singletes se determinaron trazando FSC-H vs FSC-A. Los singletes se correlacionaron positivamente en estas dos propiedades, mientras que las células de doblete y triplete tenían mayor FSC-A que FSC-H (Figura 2C). Las celdas vivas se delinearon trazando Live / Dead vs FSC-A. Las células muertas eran vivas / muertas positivas, y las células demuestran mayor FSC-A que los desechos (Fig. 2D). Tenga en cuenta que las cuentas de recuento eran Live / Dead+ y se eliminaron en este paso.
La Figura 3 muestra la estrategia inicial de gating para la delineación de fagocitos mononucleares de células individuales vivas. Los singletes en vivo se visualizaron mediante una gráfica CD45 frente a CD11b(Figura 3,izquierda). Tenga en cuenta que cd45+CD11b- (principalmente células B y células T), CD45dimCD11b+ (microglia putativa), y CD45+CD11b+ células (infiltrado células inmunes, aumentado con láser [Fig 3B, izquierda]) fueron seleccionados. La ausencia de células CD45+ en el CD45 FMO confirmó la selección de la compuerta (Figura 3C,izquierda). A continuación, neutrófilos, eosinófilos, células B, células NK y células T fueron excluidos trazando CD45+ singletes vivos usando la puerta de linaje (Lin: Ly6G [neutrófilos], SiglecF [eosinófilos], B220 [células B], NK1.1 [células NK], CD4 [células T] y CD8 [células T]) vs CD11b. El aumento de CD11b+Lin- células entre los grupos Sin láser(Figura 3A,medio) y Láser(Figura 3B,medio). Observe la falta de células CD11b+Lin en el CD11b FMO(Figura 3C,centro) y la falta de lin+ celdas en el Lin FMO (Figura 3C,derecha). Microglia se puede separar de la infiltración de fagocitos mononucleares por la cantidad de cd45 expresión13,24. CD11b+Lin- las células fueron visualizadas usando un complot CD11b vs CD45 para identificar microglia putativetenue CD45 y fagocitos mononucleares dealta infiltración CD45. El aumento relativo de fagocitos mononuclearesaltos CD45 fue claro en el ratón tratado con láser(Figura 3A,B,derecha).
Figura 4 microglia identificada, tres subconjuntos de macrófago, monocitos y células dendríticas. Microglia se determinó trazando célulastenues CD45 en una gráfica CD64 vs MHCII(Figura 4,panel izquierdo). Se ha demostrado que Microglia es CD64+MHCIIbajo anteriormente13. Microglia se mantuvo relativamente sin cambios con láser y ausente en el CD64 FMO(Figura 4A,C izquierda). Las célulasaltas CD45 fueron trazadas a continuación en el mismo gráfico CD64 vs MHCII. CD64+MHCII- macrófagos (MHCII- Macs), CD64-MHCII- monocitos, y MHCII+ células fueron identificados (Figura 4A,B, centro izquierda). Observe la ausencia de MHCII+ células en el MHCII FMO (Figura 4C, centro izquierda). Las células MHCII+ fueron discriminadas aún más usando CD64 y CD11c. CD64+CD11c- macphages (CD11c- Macs), CD64+CD11c+ macfages (CD11c+ Macs), y CD64-CD11c+ células dendríticas (DCs) fueron definidas (Figura 4A, B,centro derecha). Observe la ausencia de CD11c+ celdas en el CD11c FMO (Figura 4C,centro derecha). Los monocitos fueron subtipos como Ly6C + clásico+ o Ly6C no clásico- monocitos(Figura 4,derecha). Tenga en cuenta la ausencia de Ly6C+ monocitos en el FMO Ly6C (Figura 4C,derecha).
El número de celdas por ratón (o por 2 ojos) se calculó con la siguiente ecuación:
Utilizando los volúmenes de este método, la ecuación es:
El recuento de celdas y el recuento de cuentas serán específicos de cada muestra. La concentración de cuentas es específica de cada lote de cuentas de recuento y proporcionada por el fabricante en cada vial.
Los macrófagos se infiltran en el coroide después de la lesión láser25,y el agotamiento del macrófago reduce el área18del CNV. Estos estudios más antiguos se basan en imágenes de inmunofluorescencia, que no pueden diferenciar de forma fiable los fagocitos mononucleares, o menos marcadores citométricos de flujo para la identificación de macrófagos. La heterogeneidad del macrófago es un concepto emergente en inmunología innata, donde los macrófagos son capaces de realizar múltiples funciones dependiendo de su origen y microambiente tisular12,26. Realizamos citometría de flujo multiparar en ojos de ratón sin tratar y tratados con láser el día 3 después de una lesión láser para identificar fagocitos mononucleares y heterogeneidad de macrófago. El tratamiento con láser aumentó el MHCII-, CD11c-, y CD11c+ macrófagos en 7.0-25.6, 2.8-7.2, y 3.9-8.2 veces respectivamente (Figura 5A,C). Los recuentos de células dendríticas también se regularon 4,5-4,7 veces por láser(Figura 5F). Los recuentos de microglia y monocitos no se vieron afectados por el tratamiento con láser(Figura 5D,E). No se detectaron diferencias significativas con o sin perfusión sistémica antes de la enucleación. Estos resultados demuestran un aumento de las poblaciones de macrófago y células dendríticas después de lesiones láser sin cambios en microglia o monocitos. Además, estos datos resaltan cómo la citometría de flujo multiparametrómica puede detectar la heterogeneidad del macrófago.
| Anticuerpo o amortiguador | Fluoróforo | Clon | Cantidad por muestra (ng) |
| rata anti-ratón Ly6C | Fitc | AL-21 | 15 |
| ratón anti-ratón CD64 | Pe | X54-5/7.1 | 40 |
| rata anti-ratón Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 300 |
| hámster anti-ratón CD11c | BV 421 | HL3 | 300 |
| rata anti-ratón Ly6G | PE-CF594 | 1A8 | 10 |
| ratón anti-ratón NK1.1 | PE-CF594 | PK136 | 10 |
| rata anti-ratón Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 20 |
| rata anti-ratón B220 | PE-CF594 | RA3-6B2 | 20 |
| rata anti-ratón CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | 40 |
| rata anti-ratón CD4 | PE-CF594 | RM4-5 | 20 |
| rata anti-ratón MHC II | AlexaFluor 700 | M5/114.15.2 | 2.5 |
| rata anti-ratón CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 2 |
| rata anti-ratón CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 6 |
| Búfer MACS |
Tabla 1: Fluoróforo y clones anticuerpos (véase el paso 4.9). Por lo general, una muestra es uno o dos ojos digeridos. Agregue el búfer de flujo a un tubo primero que a cada anticuerpo. Las diluciones se pueden hacer para evitar el pipeteo de un volumen demasiado pequeño, mientras cambia el volumen total del búfer de flujo adecuadamente. Consulte Tabla de materiales para el número de producto y la empresa.
| Láser | Ranura PMT | Filtro | Espejo | Colores |
| Violeta (405nm) | Un | 525/50 | 505LP | V500 o AmCyan |
| B | 450/50 | Azul Pacífico, eFluor 450, V450 o BV421 | ||
| Azul (488nm/FSC) | Un | 710/50 | 685LP | PerCP-Cy5.5, PerCP, PI o 7AAD |
| B | 525/50 | 505LP | FITC, CFSE, GFP o AlexaFluor 488 | |
| C | 488/10 | Ssc | ||
| Amarillo-Verde (561nm) | Un | 780/60 | 735LP | PE-Cy7 |
| B | 610/20 | 600LP | PE-CF594, mCherry o DsRed2 | |
| C | 582/15 | Pe | ||
| Rojo (640nm) | Un | 780/60 | 735LP | APC-Cy7, APC-H7 o APC-eFluor 780 |
| B | 730/45 | 690LP | AlexaFluor 700 | |
| C | 670/30 | APC o AlexaFluor 647 |
Tabla 2: Configuración del citómetro de flujo. Filtro y configuración de espejo para un cytómetro de cuatro láser y los fluoróforos disponibles que se pueden detectar en cada canal. PMT = tubo fotomultiplier, FSC = dispersión hacia delante, SSC = dispersión lateral.
| Anticuerpo | Fluoróforo | Clon | Importe por SCC (ng) |
| rata anti-ratón CD45 | Fitc | 30-F11 | 500 |
| rata anti-ratón CD19 | Pe | 1D3 | 40 |
| rata anti-ratón Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 100 |
| hámster anti-ratón CD11c | BV421 | HL3 | 200 |
| rata anti-ratón Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 40 |
| rata anti-ratón CD19 | AlexaFluor 700 | 1D3 | 200 |
| rata anti-ratón CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 200 |
| rata anti-ratón CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 200 |
| Colorante vivo / muerto | eFluor 506 | N/A | 1 μl |
Tabla 3: Fluoróforo anticuerpo y clones para controles de un solo color. Cada anticuerpo debe añadirse al cordón de compensación adecuado como se describe en los pasos 5.3.1 – 5.3.3.
Figura 1: Tensión representativa configurada para el láser rojo. (A) Controles de color únicos (SCCs) para Alexa647. A la izquierda, se muestra el SCC para Alexa647. El centro izquierdo muestra el derrame del Alexa647 SCC en el canal Alexa700. El pico del Alexa647 SCC se muestra en magenta y el diferencial de meta de registro 0.5 se muestra en cian. Tenga en cuenta que el pico es a la izquierda (menos brillante) que la línea de cian. La derecha media demuestra el derrame del Alexa647 SCC en el canal APC-Cy7. Right ilustra las celdas del canal Alexa647. Tenga en cuenta que todas las celdas son menos brillantes que el SCC (línea magenta). (B) SCC para Alexa700. El centro izquierda muestra el SCC para Alexa700. Left muestra el derrame del Alexa700 SCC en el canal Alexa647. La derecha media demuestra el derrame del Alexa700 SCC en el canal APC-Cy7. El pico del Alexa700 SCC se muestra en magenta y el diferencial de objetivo de registro 0.5 se muestra en cian. Tenga en cuenta que el pico es a la izquierda (menos brillante) que la línea de cian. Right ilustra las celdas del canal Alexa700. Tenga en cuenta que todas las celdas son menos brillantes que el SCC (línea magenta). (C) SCC para APC-Cy7. Izquierda y centro izquierda muestran el derrame del SCC APC-Cy7 en Alexa647 y Alexa700, respectivamente. Tenga en cuenta que ambos picos están a la izquierda de la línea de cian. La derecha media demuestra el ACP-Cy7 SCC. La derecha ilustra las células en el canal APC-Cy7. Tenga en cuenta que todas las celdas son menos brillantes que el SCC (línea magenta). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Identificación representativa de cuentas de recuento, singletes y células vivas. (A) Área de dispersión lateral (SSC-A) vs área de dispersión hacia delante (FSC-A) para todas las celdas en un trazado de contorno. Las cuentas de recuento se identifican mediante un alto SSC-A, un FSC-A bajo y una agrupación muy estrecha de las cuentas uniformes. (B) PE vs parcela APC-Cy7 para puerta de cuentas limpia. La flecha entre A y B indica el trazado de solo los eventos positivos de cuentas de recuento. Las cuentas de recuento limpio están delineadas por una alta EP y una fluorescencia baja de APC-Cy7. (C) Fsc-Height (FSC-H) vs FSC-Area (FSC-A) traza de todas las células demuestra células singlet en una línea ancha positivamente correlacionada. Los dobletes y otros multiplets muestran mayor área FSC que fsc-altura. (D) Live / Dead vs FSC-A para celdas singlet. Las células vivas se definen como Vivas / Muertas bajas y FSC-A positivas. Los porcentajes indican el porcentaje de padre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Identificación representativa de fagocitos mononucleares. Izquierda: CD45 vs CD11b pseudocolor trazado de células vivas de unlasered (A), láser (B), y fluorescencia menos uno (FMO) control (C). Izquierda: CD45+ las celdas se definen en A-B y ausentes en el FMO. Observe el aumento de CD45+CD11b+ celdas en el grupo láser (B). Medio: Trazado pseudocolor de marcador de linaje (Lin) vs CD11b para celdas CD45+. CD11b+Lin- las células están delineadas en A-B y están ausentes en la FMO para CD11b (abajo). Derecha: CD11b vs CD45 trazado de CD11b+Lin- celdas. Se identificancélulas altas CD45dim y CD45. Observe el aumento de las célulasaltas CD45 en el grupo láser (B). Los porcentajes indican el porcentaje de padre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Identificación representativa de microglia, células dendríticas, monocitos y subconjuntos de macrófago. Izquierda: Cd64 vs MHCII pseudocolor trazado de célulastenues CD45 define microglia como CD64+MHCIIbajo. Tenga en cuenta la cantidad similar de microglia en grupos sin láser (A) y láser (B), y la ausencia de microglia en el control FMO (C). Centro izquierda: Cd64 vs MHCII pseudocolor trazado de célulasaltas CD45 define MHCII- macrófagos como CD64+MHCII-, monocitos como CD64-MHCII-, y MHCII+ celdas. Tenga en cuenta el aumento de los macrófagos MHCII- en el grupo láser (B), la ausencia de células MHCII+ en el FMO (C, medio) y el CD64 FMO (C, izquierda) ayudaron a determinar el límite para las células CD64+ y CD64- . Centro derecha: CD64 vs CD11c pseudocolor trazado de MHCII+ celdas. CD11c- macrófagos se definieron como CD64+CD11c-, CD11c+ macrófagos se identificaron como CD64+CD11c+, y las celdas dendríticas (DCs) se delinearon como CD64-CD11c+. Tanto los subconjuntos de macrófago como las células dendríticas se incrementaron con láser (B). Observe la ausencia de células CD11c+ en el FMO (C). Derecha: Trama pseudocolor Ly6C vs Tim4 de monocitos. Clásico Ly6C+ y no clásico Ly6C- monocitos fueron identificados. Tenga en cuenta que los monocitos clásicos de Ly6C+ estaban ausentes en el Ly6C FMO (C). Los porcentajes indican el porcentaje de padre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Datos representativos de fagocitos mononucleares entre ratones sin láser y láser con y sin perfusión sistémica. Los recuentos de macrófago MHCII- (A), CD11c- (B) y CD11c+ (C) se incrementaron con láser. No se detectaron cambios entre microglia sin láser y láser(D)o monocitos (E). Las células dendríticas (DC) también se incrementaron con láser (F). Brown Forsythe y Welch ANOVA con la prueba de comparación múltiple T3 de Dunnett se utilizaron para definir diferencias estadísticas debido a variaciones desiguales entre grupos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La citometría de flujo multiparamétrico permite el análisis cuantitativo de múltiples tipos de células en un tejido complejo. En este informe, describimos la detección citométrica de flujo de poblaciones mononucleares de fagocitos, incluidos monocitos, células dendríticas y subconjuntos de macrófagos, después de lesiones láser en el ojo del ratón. Liyanage et al recientemente informó de una estrategia de gating similar para detectar neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, DCs, macrófagos, macrofagos infiltrados y monocitos27. Nuestra estrategia de gating difiere principalmente por la adición de CD64. Liyanage et al identifica DC como CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ celdas, y macrófagos como CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- celdas. Identificamos DC como CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- celdas y macrófagos como CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD64+ celdas. El uso de CD64 para discriminar DC de macrófagos está bien establecido6,y esta estrategia nos permite identificar la heterogeneidad del macrófago, incluyendo macrófagos CD11c+. La principal limitación de este método es que no proporciona datos sobre la arquitectura del tejido o la ubicación de células específicas dentro del ojo. Con el fin de determinar si estas células están en la retina, coroide, iris u otra estructura ocular, nuestro protocolo se puede combinar con métodos histológicos o modificarse para incluir disección oftálmica más extensa para ejecutar individualmente citometría de flujo multiparamétrico en cada subcomparto ocular.
Hemos optimizado el protocolo de digestión de ojos enteros del ratón para evitar cualquier varianza creada por disección. Por ejemplo, la disección de las ventosas posteriores con la eliminación de córnea, iris y lente podría crear variabilidad a partir de iris retenido o material corneal (sub-disección) o aumento de lesiones láser a la zona normal de la copa ocular posterior (disección excesiva). Nuestra comparación entre los ojos sin láser y el control detecta la infiltración de fagocitos mononucleares debido a lesiones retinochoridales. Para el análisis de los efectos de las enfermedades sistémicas en el ojo, es decir, uveítis y diabetes, el análisis individual del subcompartimiento ocular es esencial. El método de digestión, en la sección 2 del protocolo, es el más crítico, mientras que otros pasos en las secciones 3 - 5 se han utilizado con éxito en múltiples tipos de tejido24. Llegamos a nuestras condiciones de digestión a través de un método iterativo que implicaba: (1) pruebas del método de digestión química (Collagenase D vs enzima digestión), (2) determinación de la longitud de la digestión química (30, 60 y 90 minutos), y (3) adición de digestión mecánica (ninguna, una, dos, tres veces). En cada paso juzgamos el éxito de las condiciones de digestión por viabilidad celular y número de células CD45HiCD64+ (infiltrados en macrófagos). Encontramos que la enzima digestión (ver Tabla suplementaria de materiales) recuperó más células vivas que la colágenasa D e intentando la mitad de la concentración de enzimas de digestión resultó en menos macrófagos infiltrados. A continuación, 60 minutos de digestión química con digestión mecánica casi duplicaron las poblaciones de macrófago infiltrados. Tres digestións mecánicas fueron óptimas con 25-30% células vivas de singletes y las poblaciones de macrófago más infiltradas. Finalmente, condiciones de digestión mecánica más rápidas causaron la pérdida grave de células vivas y macrófagos.
En el futuro, proponemos extender el método mediante la eliminación de la córnea, el iris y la lente seguido de digerir por separado la retina y la copa posterior del ojo (esclerótica, coroide y epitelio pigmentado retiniano). Con esta modificación, esperamos reducir las condiciones de digestión debido a las características proteicas y densas de la lente y la córnea respectivamente. Estas reducciones podrían incluir reducción de la concentración de enzimas de digestión, cambio a colágeno, disminución del tiempo de digestión, o disminución de la cantidad de digestión mecánica. Esperamos condiciones generales de digestión reducidas para la copa posterior del ojo, y condiciones de digestión más disminuidas solo para la retina.
Otras direcciones futuras incluyen la expansión de nuestro panel de citometría de flujo multiparametral convencional a un instrumento láser convencional de 6 o citometría de flujo espectral. La citometría de flujo espectral permite la detección de fluoróforo en todo el espectro, en lugar de determinarse por los filtros disponibles. La citometría de flujo espectral da como resultado una detección de color más específica. Sin embargo, la citometría de flujo espectral requiere un conjunto completamente nuevo de consideraciones a seguir y está fuera del alcance de este manuscrito. Para obtener más información, consulte este reciente artículo28de JoVE . Los 6 instrumentos láser incluyen un láser ultravioleta, que añade 6-9 detectores. Al agregar marcadores a un panel de citometría de flujo ocular del ratón, recomendamos la detección de más tipos de células oculares. Por ejemplo, la puerta del linaje podría separarse para detectar neutrófilos, eosinófilos, mastocitos, células NK y linfocitos de forma independiente. No se recomienda aumentar la detección de subconjuntos de fagocitos mononucleares debido al pequeño número de macrófagos en estado estacionaria. Al agregar nuevos anticuerpos, sugerimos una valoración cuidadosa de anticuerpos.
En resumen, hemos presentado un método adaptable y robusto para la detección de poblaciones mononucleares de fagocitos en el ojo del ratón. Debido a los marcadores de superficie celular altamente superpuestos de monocitos, células dendríticas, macrófagos y microglia, la citometría de flujo multiparar es el mejor método para detectar estas poblaciones celulares. La citometría de flujo se puede utilizar para el análisis de tipos de células, mapeo de destino y/o clasificación celular para la evaluación transcriptómica o proteómica. Su principal limitación es la falta de arquitectura tisular, y los hallazgos clave se pueden confirmar utilizando la histología tradicional.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
JAL fue apoyado por la subvención de los NIH K08EY030923; Cmc fue apoyado por una subvención K01 (5K01AR060169) del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticos del NIH y una Nueva Beca de Investigación (637405) de la Alianza de Investigación lupus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
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