Summary
Detta protokoll ger en metod för att smälta hela ögon till en enda cell suspension för multi-parameter flöde cytometrisk analys för att identifiera specifika okulär mononuclear phagocytic populationer, inklusive monocyter, mikroglia, makrofager och dendritiska celler.
Abstract
Det medfödda immunsystemet spelar viktiga roller i okulär patofysiologi inklusive druvhinneinflammation, diabetiker retinopati och åldersrelaterad makuladegeneration. Medfödda immunceller, särskilt mononukleära fagocyter, uttrycker överlappande cellytemarkörer, vilket gör identifiering av dessa populationer till en utmaning. Multiparameterflödescytometri möjliggör samtidig, kvantitativ analys av flera cellytans markörer för att skilja monocyter, makrofager, mikroglia och dendritiska celler i musögon. Detta protokoll beskriver enucleation av hela mus ögon, okulär dissekering, matsmältningen i en enda cell suspension och färgning av encelliga suspension för myeloisk cell markörer. Dessutom förklarar vi de rätta metoderna för att bestämma spänningar med hjälp av enfärgskontroller och för att avgränsa positiva grindar med fluorescens minus en kontroll. Den största begränsningen av multiparameter flöde cytometri är avsaknaden av vävnad arkitektur. Denna begränsning kan övervinnas genom multiparameter flöde cytometri av enskilda okulär fack eller gratis immunofluorescens färgning. Immunofluorescens begränsas dock av dess brist på kvantitativ analys och minskat antal fluorforer på de flesta mikroskop. Vi beskriver användningen av multi-parametriska flöde cytometri att ge mycket kvantitativ analys av mononuclear phagocytes i laser-inducerad choroidal neovascularization. Dessutom kan multiparameter flöde cytometri användas för identifiering av makrofag delmängder, öde mappning och cell sortering för transkriptomic eller proteomic studier.
Introduction
Det medfödda immunsystemet innehåller flera celltyper som stimulerar komplementaktivering och inflammation. Medfödda immunceller inkluderar naturliga mördarceller (NK), mastceller, basofiler, eosinofiler, neutrofiler och mononukleära fagocyter. Mononukleära fagocyter, som består av monocyter, makrofager och dendritiska celler, har varit inblandade i patofysiologin hos flera oftalmiska tillstånd inklusive druvhinneinflammation, diabetiker retinopati och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD)1. I detta protokoll kommer vi att fokusera på identifiering av mononukleära farocyter med hjälp av multiparameter flöde cytometrisk analys i en musmodell av neovaskulär AMD2. Detta protokoll är anpassningsbart för mus modeller av diabetiker retinopati och/eller druvhinneinflammation, men mer omfattande okulär dissekering rekommenderas på grund av den systemiska karaktären av dessa sjukdomar.
Mononukleära fagocyter uttrycker överlappande cellytans markörer. Långvariga vävnad bosatta makrofager och mikroglia härstammar från äggula säck-härledda erythromyeloid föregångare3, medan återvinning makrofager och dendritiska celler skiljer sig från benmärg-härledda makrofag dendritic cell föregångare4. Muscellsmarkörer som är gemensamma för monocyter, makrofager och dendritiska celler inkluderar CD45, CD11b5,F4/806,Cx3cr17och den intracellulära markören Iba18. För att övervinna denna utmaning definierar transkriptomisk analys av makrofager, monocyter och dendritiska celler från flera vävnader CD64 som en makrofagspecifik cellytans markör6. Makrofager har beskrivits i iris, choroid, ciliary kropp och optik nerv i friska ögon3. Alternativt är dendritisk cellidentifiering svårare; den mest specifika metoden för dendritisk cellidentifiering kräver ödesmappning med hjälp av Zbtb46-GFP-reportermusen9. Oberoende av denna reporter linje, uttryck för CD11c och MHCII i samband med frånvaron av CD64 kan identifiera potentiella dendritiska celler6,10. Dendritiska celler har identifierats i hornhinnan, bindhinnan, iris och choroid i normala ögon11. Microglia är specialiserade makrofager som ligger i näthinnan, skyddade av blod-retinalbarriären, och härrör från äggula sac stamceller12. Som ett resultat kan retinal microglia skiljas från monocyt-härledda makrofager genom deras dim nivåer av CD45 uttryck13 och höga nivåer av Tmem119, som finns som ett flöde cytometry antikroppar14. Vid mikrogliaaktivering kan CD45 dock vara uppreglerad15 och Tmem119 kan vara nedreglerad3, vilket visar komplexiteten i mikrogliabiologi och detta är sannolikt relevant i både AMD och dess musmodell. Slutligen kan monocyter delas in i minst två undertyper, inklusive klassiska och icke-klassiska. Klassiska monocyter visar CCR2+Ly6ChögCX3CR1lågt uttryck, och icke-klassiska monocyter visar CCR2-Ly6ClågCX3CR1höga markörer5.
På grund av nödvändigheten av kvantitativ analys av marköruttryck, dvs. Ytterligare fördelar inkluderar identifiering av subpopulationer, förmågan att använda fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att sortera cellpopulationer för transkriptomisk eller proteomisk analys och ödesmappning. Den största nackdelen med multiparameter flöde cytometri är bristen på vävnad arkitektur. Detta kan övervinnas genom oftalmisk dissekering i de olika okulära underkommittéerna: hornhinna, bindhinnan, iris, linsen, näthinnan och choroid-sclera-komplexet. Dessutom kan bekräftande immunofluorescens imaging utföras, men begränsas av antalet markörer och brist på robust kvantifiering.
Genom breda associationsstudier har kopplat flera komplementgener till AMD16. Komplementaktivering leder till anafylatoxinproduktion, leukocytrekrytering och resulterande inflammation. Som komplement receptor bristfälliga möss, laser skada minskar mononuclear phagocyte rekrytering och laser-inducerad choroidal neovascularization (CNV) område17. På samma sätt visar C-C-motivet chemokinreceptor 2 (CCR2) knockoutmus, som har brist på monocytrekrytering till vävnaden, både minskad mononukleär fagocytrekrytering och laserinducerat CNV-område18. Dessa datalänk komplement och mononuclear phagocytes med experimentell CNV och eventuellt neovascular AMD. Till stöd för denna associering är komplementreceptorer dysregulerade på perifera blodmonocyter hos patienter med neovaskulär AMD19,20. Dessa data visar en stark koppling mellan AMD och mononuclear phagocytes.
I detta manuskript kommer vi att använda den experimentella laserinducerade CNV-modellen för att karakterisera de mononukleära fagocytpopulationerna i musögat med hjälp av multiparameterflödescytometri. Laser-inducerad CNV är standard mus modell av neovaskulär AMD, som visat effekten av nuvarande första raden neovaskulär AMD terapi21. Detta protokoll kommer att beskriva enucleation av mus ögon, okulär dissekering, matsmältningen i en enda cell suspension, antikropp färgning, bestämning av laser spänningar med hjälp av en färg kontroller och gating strategi med fluorescens minus en (FMO) kontroller. En detaljerad beskrivning av den laserinducerade CNV-modellen finns i en tidigare publikation22. Med hjälp av detta protokoll kommer vi att definiera mikroglia, monocyter, dendritiska celler och makrofagpopulationer. Dessutom kommer vi att använda MHCII och CD11c för att ytterligare definiera makrofagunderenheter inom laserinducerad CNV-modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer godkändes av Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee. C57BL/6 möss var grupp inhysta vid en barriäranläggning vid Center for Comparative Medicine vid Northwestern University (Chicago, IL). Alla djur var inhyst i 12/12 h ljus / mörk cykel med fri tillgång till mat och vatten.
1. Insamling av okulär vävnad
- Offra 10-12 veckor gamla C57BL/6J möss av båda könen med reglerad administrering av koldioxid tills musen inte svarar och inte längre andas in. Utför massundersökning förskjutning eller annan godkänd sekundär metod för att säkerställa dödshjälp.
OBS: Transkardiell perfusion kan utföras för att avlägsna cirkulerande leukocyter som inte finns i okulärvävnaderna. I detta experiment minskar systemisk perfusion inte antalet mikroglia, monocyter, makrofager eller dendritiska celler som detekteras i obehandlade eller laserbehandlade hela ögon. Därför finns majoriteten av dessa celltyper i de oftalmiska vävnaderna och detta steg är valfritt. - För att locka ögon, tryck ner nära ögonhålan medan du placerar ett par böjda tångar försiktigt under ögat när det sticker ut ur uttaget. Nyp tången stängd under ögat utan att klämma på det faktiska ögat. Lossa ögat från den omgivande bindhinnan (se föregående publikation)23.
- Dra i ögat i senareled tills synnerven är den enda återstående anslutningen för att lossa ögat. Den optiska nerven bryter ofta med spänning, men en liten sax är ibland nödvändig för att skära optiknerven. Placera ögat i kall 1x Hanks buffrade saltlösning (HBSS) med kalcium och magnesium i 1,7 ml mikrocentrifugrör.
2. Matsmältning av okulär vävnad
- Förbered matsmältningsbufferten som innehåller 0, 1 mg/ml matsmältningsenzym och 0,2 mg/ml DNase i kall HBSS. Reconstitute 5 mg matsmältningsenzym i 2 ml sterilt vatten initialt. Bered en initial utspädning på 10 mg/ml DNase i HBSS. För varje 10 ml av rötningsbufferten (tillräcklig för 3 djur) blanda 9,4 ml kall HBSS med 0,4 ml rekonstituerat matsmältningsenzym och 0,2 ml utspädd DNase I.
OBS: Dessa koncentrationer fastställdes empiriskt över flera experiment för att ge optimala nivåer av antikroppsfärgning av enstaka celler, samtidigt som celldöden minskade. CollagenasE D försöktes som ett alternativ till matsmältning enzym med minskad cell livskraft och minskade CD45+ celler. Se Diskussion för mer information om iterativ process för att optimera matsmältningen. - Under ett dissekerande mikroskop vid 10x total förstoring, ta bort återstående konjunktiva och optisk nerv med fina tång och fjädersax i kall HBSS.
- Flytta rena ögon till en torr dissekeringsform eller liten vägbåt. Injicera 0,15-0,20 ml/öga av matsmältningsbuffert via spruta försedd med 30 G nål i glaskroppshålan efter att två perforerande sår har gjorts i ögat genom den visuella axeln och 90° bort från detta första sår för matsmältningsbuffertutgång.
- Hacka hela ögon med fjädersax och fina tångar med alla bitar mindre än 0,5 mm x 0,5 mm. Dissociate linsvävnad med trubbig mekanisk störning via tång för att förhindra igensättning av pipettspetsar i efterföljande steg. För varje prov, skölj tång och sax var och en med 0,75 ml rötbuffert i liten skål. Använd en ny maträtt för varje prov.
- Överför innehållet i skålen till ett dissociationsrör på is med P1000-pipetten och se till att inte förlora något material i pipettöverföringen. Skölj skålen med ytterligare 1,5 ml rötningsbuffert, vilket ger den totala volymen i dissociationsröret till 3,25-3,50 ml.
- Placera dissociationsröret inverterat på elektronisk dissociator och körcykel "m_brain_03_01", bestående av 1 min enkelriktad rotation vid 200 varv/min vid rumstemperatur, vilket är ett förladdat program. Se till att all vävnad är i botten av dissociationsröret i kontakt med matsmältningsbufferten och rotorn för detta och alla återstående steg.
- Placera dissociationsröret i skakande inkubator i 30 min vid 200 varv/min vid 37 °C.
- Upprepa steg 2.6 och 2.7 en extra gång. Efter andra 30 min inkubation utföra en slutlig mekanisk matsmältning med hjälp av elektronisk dissociator som i steg 2.6.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 10 ml kallflödesbuffert och placera rören på is.
3. Förberedelse av cellupphängning
- För att skapa encellig suspension, häll den stoppade ögonrötningsreaktionen genom ett 40 μm-filter placerat på toppen av ett 50 ml koniskt centrifugeringsrör. Använd kolven från en 2,5 ml spruta och tryck eventuella återstående bitar av osmält ögonvävnad genom filtret.
- Tvätta dissociationsröret med 10 ml flödesbuffert och sköljfilter innan du använder samma kolv för att återigen passera osmälta ögonvävnadsbitar genom filtret.
- Upprepa steg 3.2 med 5 ml flödesbuffert.
- Tvätta dissociationsröret och filtret med en slutlig flödesbuffert på 10 ml.
OBS: Den totala volymen av matsmältnings- och flödesbufferten är ca 38-40 ml för varje prov. - Centrifugera det koniska röret vid 400 x g i 10 min vid 4 °C. Dekanta supernaten utan att störa cellpelleten.
- Förbered 1x lyslösning genom att tillsätta 10x lyslösning till sterilt vatten. Bryt upp pelleten genom att snärta röret mot ett annat rör. För att lysa röda blodkroppar, tillsätt 1 ml 1x lyslösning i 30 s med virvlande vid rumstemperatur (RT).
- Stoppa reaktionen med 20 ml flödesbuffert.
- Centrifugera det koniska röret vid 400 x g i 10 min vid 4 °C. Dekanta supernaten utan att störa cellpelleten.
- Dissociera pelleten genom att snärta röret mot ett annat rör. Tillsätt 5 ml kall 1x HBSS per rör.
- Centrifugrör vid 400 x g i 10 min vid 4 °C. Aspirera supernatant.
4. Färgning av cellupphängning för mononukleära fagocyter
- Förbered 0,5 ml levande/död fläck per prov genom att späda ut Levande/Dött färgämne 1:5 000 i kall HBSS.
- Tillsätt levande/död fläck i varje prov med en P1000-pipett och se till att ta bort pelleten helt. Överför prover till 1,2 ml mikrotitrrör.
- Ta en liten alikvot (10 μL) för att räkna celler med hjälp av en hemocytometer eller automatisk cellräknare (se 4.4). Inkubera prover med Levande/Död fläck i 15 min vid rumstemperatur i mörker.
- Räkna celler med trypanblått för att bestämma antalet levande celler per prov.
OBS: Vanligtvis innehåller 2 ögon från en 10-12 veckor gammal C57BL/6J-mus mindre än 2 x 106 levande celler. - Tvätta proverna genom att tillsätta 400 μL kallflödesbuffert. Centrifugrör i ett mikro titerrörsställ vid 400 x g i 10 min vid 4 °C. Aspirera supernaten utan att störa cellpelleten.
- Återanvända celler helt i 500 μL kallflödesbuffert. Centrifugrör i ett mikro titerrörsställ vid 400 x g i 10 min vid 4 °C. Aspirera supernaten utan att störa cellpelleten.
- Blockera upp till 5 x 106 levande celler i 50 μL Fc-block (1:50 utspädning i kall flödesbuffert av renad råtta antimus CD16/CD32). Om mer än 5 x 106 levande celler, öka volymerna på lämpligt sätt.
- Tillsätt Fc-blocket i pelleten och se till att provet är helt dissocierat. Inkubera i 20 min vid 4 °C.
- Tillsätt 50 μL antikroppsfärgningslösning (se tabell 1 för val och mängd av varje antikropp som ingår i lösningen) per 5 x 106 levande celler direkt till celler i Fc-block och blanda helt. Inkubera i 30 min vid 4 °C.
OBS: Antikroppsmängderna är beroende av flödescytometerkonfigurationen och bör titreras oberoende av varje labb och instrument. Se tabell 2 för instrumentkonfiguration av filter och speglar. För att titrera antikroppar, börja med tillverkarens rekommendation och beräkna färgningsindexet. Utför en provkörning av olika antikroppskoncentrationer (både över och under tillverkarens rekommendation) och välj den lägsta koncentrationen av antikroppar där färgningsindexet bibehålls. Se också till att positiv färgning som är mindre ljus än enfärgskontrollen. Använd obefläckade celler för att säkerställa att negativt färgade celler är i skala och har en topp på eller mindre än 1 x 102. Använd en fluorescens minus en kontroll för att definiera de positivt färgade cellerna. - Tvätta proverna genom att tillsätta 700 μL kallflödesbuffert. Centrifugrör i ett mikro titerrörsställ vid 400 x g i 10 min vid 4 °C. Aspirera supernaten utan att störa cellpelleten.
- Alternativt, efter antikroppsfärgning, kan proverna fixeras med 500 μL 2% paraformaldehyd i flödesbuffert. Fixera proverna i 15 minuter vid rumstemperatur. Utför sedan en tvätt enligt beskrivningen i 4.10. Förvara fasta prover vid 4 °C. Räkna pärlor bör läggas till på dagen för flöde cytometri data insamling. Fasta prover ska köras på flödescytometer om 1-2 dagar.
VARNING: Paraformaldehyd är en frätande och en hälsorisk. - Tvätta proverna igen med 500 μL kallflödesbuffert. Centrifugrör i ett mikro titerrörsställ vid 400 x g i 10 min vid 4 °C. Aspirera hälften av supernaten utan att störa cellpelleten.
- Återanvänd pellets och överför till en 96 brunn, U-botten analysplatta. Centrifugplatta vid 400 x g i 5 min vid 4 °C. För att dekantera supernaten, vänd plattan och i en stark skaka lossa vätskan i en diskbänksbassäng, utan störande pellet.
- I ett nytt 1,2 ml mikrotitrrör placerar du 50 μL väl virvlade räknepärlor.
- Återanvänd pellets i 96 brunnsplatta i 200 μL kall flödesbuffert. Tillsätt cellblandning på toppen av pärlor från föregående steg. Kör på flödescytometer i total volym på 250 μL / mikro titerrör.
5. Insamling av flödescytometridata
- Slå på och förbered flödescytometern. Instruktionerna som listas här är för en modifierad fyra lasercytometer(tabell 2).
- Kör ett testprov, som innehåller ett litet alikvot från varje prov, för att säkerställa att alla celler är i skala för varje detektor. Justera spänningarna så att alla celler är i skala.
- Kör enfärgskontroller (SCC) för varje fluorofor som används i färgcocktail (tabell 3). Placera mikrotitrröret i ett större 5 ml polystyrenrör för placering på flödescytometerstadiet.
OBS: Rotfluorforer som BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) och Alexa700 kräver inte samma antikropp som cocktailen (dvs. CD19 PE för CD64 PE). Tandemfluoroforer som PE-CF594, PE-Cy7 eller APC-Cy7 kräver dock samma antikropp för SCC som cocktail på grund av potentiell dissociation av de konjugerade fluorforerna.- Skapa SCC för BV421 genom att lägga till 2 droppar kompensationspärlor till ett titerrör på 1,2 ml tillsammans med 1 μL hamster antimus CD11c BV421. Kompensationspärlor används eftersom CD11c BV421 är en IgG lambda subtyp snarare än kappa enligt beskrivningen i 5.3.3. Inkubera i 15 minuter vid 4 °C. Tillsätt 0,2 ml flödesbuffert.
- Skapa SCC för live/dead-färgämnet genom att lägga till en droppe positiva färgpärlor (grönt lock) från de reaktiva pärlorna för aminer, följt av 1 μL levande/dött färgämne. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker. Tillsätt en droppe av de negativa pärlorna (vitt lock) från de reaktiva pärlorna för aminer. Tillsätt 0,2 ml flödesbuffert.
- Skapa de återstående sccs genom att lägga till en droppe positiva färgpärlor (grönt lock) från anti-råtta och anti-hamster Ig kappa pärla set, följt av antikropp mängd anges (Tabell 3) i en 1,2 mL titer rör. Inkubera i 15 min vid 4 °C. Tillsätt en droppe av de negativa pärlorna (vitt lock) från anti-råtta och anti-hamster Ig kappa pärla set. Tillsätt 0,2 ml flödesbuffert.
- Vortex alla pärlblandningar helt. Förvara SCC vid 4 °C i upp till 3 dagar.
OBS: SCC för fluorescerande reportermöss är obekräftade celler. - När du kör SCC: er, ställ in spänningar så att SCC-provet har en topp som är större än någon fluorescens för ett prov av celler i samma detektorkanal. Dessutom bör spänningar ställas in så att varje SCC har minst 0,5 Loggskillnad mellan histogramtoppen i intressekanalen jämfört med någon annan kanal (figur 1).
- Kör exempel på "Låg" hålla händelser/sekund under 4000. Om flödeshastigheten inte kan sänkas på lämpligt sätt, späd prover med ytterligare kallflödesbuffert. Registrera volymen som läggs till eftersom detta kommer att vara nödvändigt för beräkning av antal (se representativa resultat).
- Samla in minst 3 x 106 händelser per prov. Detta kan vara högre än cellnumret på grund av pigmentgranulat och skräpräkning som händelser på din cytometer.
- Spela in en Fluorescens Minus One (FMO) för varje fluorofor annat än Live/Dead för korrekt gatingstrategi i avsnitt 6.4. En FMO är ett prov som har färgats med alla fluorforer utom ett.
- Rengör och stäng av flödescytometern enligt tillverkarens eller anläggningens anvisningar.
6. Anteckning av flödescytometridata
- Öppna ett nytt kalkylblad med hjälp av analysprogram. Importera FCS-filer från cytometern för alla prover och enfärgskontroller.
- Använd SCC:er för att skapa en kompensationsmatris.
- Applicera kompensationsmatrisen på dina färgade prover och FMOs.
- Använd FMOs för att bestämma positiv färgning för att rita grindar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visade okompenserade frekvens histogram för SCCs och celler för den röda lasern: Alexa647, Alexa700 och APC-Cy7. I figur 1Aavbildade magentalinjen toppen av SCC för Alexa647, medan cyanlinjen visade den avsedda 0,5 logskillnaden. Observera att toppen i Alexa700 och APC-Cy7 var till vänster (mindre ljus) av cyanlinjen. Observera också att cellerna var alla till vänster om magentalinjen. Alla celler till höger om SCC-toppen kompenserades inte. Specifika kanaler var kända för att spilla in i andra baserat på kemin hos fluorokromfärgämnena (dvs. Violett laser: BV421 -> V500, gulgrön laser: PE -> PE-CF594, Röd laser: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, Cross Laser: PE-Cy7 -> APC-Cy7). Om något av ovanstående villkor inte uppfylldes skulle spänningen på en kanal kunna justeras uppåt medan eventuella spillkanaler kunde flyttas nedåt. Se figur 1B och figur 1C för ytterligare exempel på den röda lasern. När spänningarna har fastställts och sedan registrerats måste alla prover köras med spänningsparametrarna. Det finns en kompensationskonfigurationsguide som kan vara användbar.
Identifiering av räknepärlor är nödvändig för kvantifiering av antalet celler. Figur 2A visade FSC-A vs SSC-A egenskaper för alla analyserade händelser från två ögon av en enda mus. Det är viktigt att justera SSC-spänningen för att se till att dina räknepärlor är synliga som en mycket snäv samling av SSC-A-höga och FSC-A-låga händelser. Pärlor räknas rengjordes och bekräftades genom plottning PE vs APC-Cy7 (Fig 2B). Rena pärlor var ett tätt kluster av PE+ och APC-Cy7- händelser.
Singlets och levande celler identifierades sedan från alla händelser. Singlets bestämdes genom att plotta FSC-H vs FSC-A. Singlets var positivt korrelerade i dessa två egenskaper medan doublet och triplet celler hade större FSC-A än FSC-H (Figur 2C). Levande celler avgränsades genom att plotta Live / Dead vs FSC-A. Döda celler var Levande / Döda positiva, och celler visar större FSC-A än skräp (Fig 2D). Observera att räknepärlor var Live / Dead+ och togs bort i det här steget.
Figur 3 visar den ursprungliga gatingstrategin för avgränsning av mononukleära fagocyter från levande, singletceller. Levande singlar visualiserades med hjälp av ett CD45 jämfört med CD11b-diagram(bild 3, vänster). Observera att CD45+CD11b- (mestadels B-celler och T-celler), CD45dimCD11b+ (putativ mikroglia) och CD45+CD11b+ celler (infiltrera immunceller, ökade med laser [Fig 3B, vänster]) valdes. Frånvaron av CD45+ celler i CD45 FMO bekräftade portvalet(figur 3C, vänster). Därefter neutrofiler, eosinofiler, B-celler, NK-celler och T-celler uteslöts genom plottning av CD45+ levande singlar med hjälp av härstamningsgrind (Lin: Ly6G [neutrofiler], SiglecF [eosinofiler], B220 [B-celler], NK1.1 [NK-celler], CD4 [T-celler] och CD8 [T-celler]) vs CD11b. Ökningen av CD11b+Lin- celler mellan no laser(figur 3A,mitten) och lasergrupper(figur 3B,mitten) observerades lätt. Observera bristen på CD11b+Lin-celler i CD11b FMO(figur 3C,mitten) och bristen på Lin+ celler i Lin FMO (Figur 3C, höger). Mikroglia kan separeras från att infiltrera mononukleära fagocyter med mängden CD45-uttryck13,24. CD11b+Lin- celler visualiserades med hjälp av en CD11b vs CD45 plot för att identifiera CD45dim förmodade microglia och CD45hög infiltrera mononuclear faagocyter. Den relativa ökningen av CD45höga mononukleära fagocyter var tydlig i den laserbehandlade musen(figur 3A, B,höger).
Figur 4 identifierade mikroglia, tre makrofagundergrupper, monocyter och dendritiska celler. Microglia bestämdes genom att rita CD45dim celler på en CD64 vs MHCII plot(Figur 4, vänster panel). Microglia har visat sig vara CD64+MHCIIlåg tidigare13. Mikroglia var relativt oförändrat med laser och frånvarande i CD64 FMO(figur 4A,C kvar). CD45höga celler ritades nästa på samma CD64 vs MHCII diagram. CD64+MHCII- makrofager (MHCII- Mac), CD64-MHCII- monocyter och MHCII+ celler identifierades(figur 4A, B,mitten till vänster). Observera frånvaron av MHCII+ celler i MHCII FMO (Figur 4C, mitten till vänster). MHCII+ celler diskriminerades ytterligare med CD64 och CD11c. CD64+CD11c- makrofager (CD11c- Macs), CD64+CD11c+ makrofager (CD11c+ Mac) och CD64-CD11c+ dendritiska celler (DCs) definierades (Figur 4A, B, mitten höger). Observera frånvaron av CD11c+ celler i CD11c FMO (Bild 4C, mitten till höger). Monocyter var subtypade som klassiska Ly6C+ eller icke-klassiska Ly6C- monocyter (Figur 4, höger). Observera frånvaron av Ly6C+ monocyter i Ly6C FMO (Figur 4C, höger).
Antalet celler per mus (eller per 2 ögon) beräknades med följande ekvation:
Med hjälp av volymerna i den här metoden är ekvationen:
Antalet celler och antalet pärlor kommer att vara specifika för varje exempel. Koncentrationen av pärlor är specifik för varje parti av räknepärlor och tillhandahålls av tillverkaren på varje injektionsflaska.
Makrofager infiltrerar chorofen efter laserskada25, och makrofagutarmning minskar CNV-område18. Dessa äldre studier förlitar sig på immunofluorescens imaging, som inte på ett tillförlitligt sätt kan skilja mononuclear phagocytes, eller färre flöde cytometriska markörer för makrofag identifiering. Makrofag heterogeneitet är ett framväxande begrepp inom medfödd immunologi, där makrofager kan utföra flera funktioner beroende på deras ursprung och vävnad mikromiljö12,26. Vi utförde multi-parameter flöde cytometri på obehandlade och laserbehandlade mus ögon på dag 3 efter laser skada för att identifiera mononuclear phagocytes och makrofag heterogenitet. Laserbehandlingen ökade MHCII-, CD11c-och CD11c+ makrofager med 7,0-25,6, 2,8-7,2 respektive 3,9-8,2 gånger(figur 5A,C). Dendritiska cellantal var också uppreglerade 4,5-4,7 gånger med laser (Figur 5F). Antalet mikroglia och monocyter påverkades inte av laserbehandling (figur 5D,E). Inga signifikanta skillnader upptäcktes med eller utan systemisk perfusion före enucleation. Dessa resultat visar ökade makrofag populationer och dendritiska celler efter laser skada utan förändring till microglia eller monocyter. Dessutom belyser dessa data hur multiparameterflödescytometri kan upptäcka makrofag heterogeneitet.
| Antikropp eller buffert | Fluorofor | Klon | Belopp per prov (ng) |
| råtta antimus Ly6C | Fitc | AL-21 | 15 |
| mus anti-mus CD64 | Pe | X54-5/7.1 | 40 |
| råtta antimus Tim4 | AlexaFluor 647 (olika) | RMT4-54 | 300 |
| hamster anti-mus CD11c | BV 421 | HL3 (på HL3) | 300 |
| råtta antimus Ly6G | PE-CF594 | 1A8 (på 1A8) | 10 |
| mus antimus NK1.1 | PE-CF594 | PK136 (PK136) | 10 |
| råtta antimus Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 20 |
| råtta antimus B220 | PE-CF594 | RA3-6B2 | 20 |
| råtta antimus CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | 40 |
| råtta antimus CD4 | PE-CF594 | RM4-5 (på RM4-5) | 20 |
| råtta antimus MHC II | AlexaFluor 700 (olika) | M5/114.15.2 | 2.5 |
| råtta antimus CD11b | APC-Cy7 (på 1997) | M1/70 (engelska) | 2 |
| råtta antimus CD45 | PE-Cy7 (på 2) | 30-F11 | 6 |
| MACS-buffert |
Tabell 1: Antikroppsfluorfor och kloner (se steg 4.9). I allmänhet är ett prov antingen ett eller två smälta ögon. Lägg till flödesbuffert i ett rör först och sedan varje antikropp. Utspädningar kan göras för att undvika pipetting för liten volym, samtidigt som den totala flödesbuffertvolymen ändras på lämpligt sätt. Se Tabell över material för produktnummer och företag.
| Laser | PMT-kortplats | Filter | Spegel | Färger |
| Violett (405nm) | A | 525/50 | 505LP | V500 eller AmCyan |
| B | 450/50 | Pacific Blue, eFluor 450, V450 eller BV421 | ||
| Blå (488nm/FSC) | A | 710/50 | 685LP | PerCP-Cy5.5, PerCP, PI eller 7AAD |
| B | 525/50 | 505LP | FITC, CFSE, GFP eller AlexaFluor 488 | |
| C | 488/10 | Ssc | ||
| Gulgrön (561nm) | A | 780/60 | 735LP | PE-Cy7 (på 2) |
| B | 610/20 | 600LP | PE-CF594, mCherry eller DsRed2 | |
| C | 582/15 | Pe | ||
| Röd (640nm) | A | 780/60 | 735LP | APC-Cy7, APC-H7 eller APC-eFluor 780 |
| B | 730/45 | 690LP (på 690LP) | AlexaFluor 700 (olika) | |
| C | 670/30 | APC eller AlexaFluor 647 |
Tabell 2: Konfiguration av flödescytometer. Filter- och spegelinställningar för en cytometer med fyra lasrar och tillgängliga fluorforer som kan detekteras i varje kanal. PMT = fotomultiplierrör, FSC = främre scatter, SSC = sidospridning.
| Antikropp | Fluorofor | Klon | Belopp per SCC (ng) |
| råtta antimus CD45 | Fitc | 30-F11 | 500 |
| råtta antimus CD19 | Pe | 1D3 (på 1D3) | 40 |
| råtta antimus Tim4 | AlexaFluor 647 (olika) | RMT4-54 | 100 |
| hamster anti-mus CD11c | BV421 (BV421) | HL3 (på HL3) | 200 |
| råtta antimus Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 40 |
| råtta antimus CD19 | AlexaFluor 700 (olika) | 1D3 (på 1D3) | 200 |
| råtta antimus CD11b | APC-Cy7 (på 1997) | M1/70 (engelska) | 200 |
| råtta antimus CD45 | PE-Cy7 (på 2) | 30-F11 | 200 |
| Levande / Dött färgämne | eFluor 506 | Ej tillämpligt | 1 μl |
Tabell 3: Antikroppsfluorfor och kloner för enfärgskontroller. Varje antikropp bör läggas till lämpliga kompensationspärlor enligt steg 5.3.1–5.3.3.
Figur 1: Representativ spänning för den röda lasern. (A) Enfärgskontroller (SCC) för Alexa647. Till vänster visas SCC för Alexa647. Vänster mitten visar spillet av Alexa647 SCC i Alexa700-kanalen. Toppen av Alexa647 SCC visas i magenta och 0,5 Log goal differential visas i cyan. Observera att toppen är till vänster (mindre ljus) än cyanlinjen. Mitten till höger visar spillet av Alexa647 SCC i APC-Cy7-kanalen. Höger illustrerar cellerna i Alexa647-kanalen. Observera att alla celler är mindre ljusa än SCC (magentalinjen). B)SCC för Alexa700. Mitten till vänster visar SCC för Alexa700. Vänster visar spillet av Alexa700 SCC i Alexa647-kanalen. Mitten till höger visar spillet av Alexa700 SCC i APC-Cy7-kanalen. Toppen av Alexa700 SCC visas i magenta och 0,5 Log goal differential visas i cyan. Observera att toppen är till vänster (mindre ljus) än cyanlinjen. Höger illustrerar cellerna i Alexa700-kanalen. Observera att alla celler är mindre ljusa än SCC (magentalinjen). C)SCC för APC-Cy7. Vänster och mitten vänster visar spillet av APC-Cy7 SCC i Alexa647 respektive Alexa700. Observera att båda topparna är till vänster om cyanlinjen. Mitten till höger demonstrerar AVS-Cy7 SCC. Höger illustrerar cellerna i APC-Cy7-kanalen. Observera att alla celler är mindre ljusa än SCC (magentalinjen). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativ identifiering av räknepärlor, singlets och levande celler. (A) Sidospridningsområde (SSC-A) vs främre punktområde (FSC-A) för alla celler på ett konturdiagram. Räkna pärlor identifieras av höga SSC-A, låg FSC-A och mycket snäv klustring av enhetliga pärlor. (B)PE vs APC-Cy7 tomt för ren pärla grind. Pilen mellan A och B anger plottning av endast de positiva händelserna för räknepärlor. Rena räknepärlor avgränsas av hög PE och låg APC-Cy7 fluorescens. C)FSC-höjd (FSC-H) vs FSC-område (FSC-A) i alla celler visar singlet celler i en positivt korrelerad bred linje. Dubbletor och andra multiplar visar större FSC-område än FSC-höjd. (D) Live / Dead vs FSC-A för singlet-celler. Levande celler definieras som Live / Dead low och FSC-A positiva. Procenttal anger procent av överordnad. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativ identifiering av mononukleära farocyter. Vänster: CD45 vs CD11b pseudocolor plot av levande celler från unlasered (A), lasered (B), och fluorescens minus en (FMO) kontroll (C). Vänster: CD45+ celler definieras i A-B och saknas i FMO. Observera ökningen av CD45+CD11b+ celler i gruppen laserad (B). Mitten: Pseudocolor plot of lineage (Lin) markör vs CD11b för CD45+ celler. CD11b+Lin- celler avgränsas i A-B och saknas i FMO för CD11b (nederkant). Höger: CD11b vs CD45 plot av CD11b+Lin- celler. CD45dim och CD45höga celler identifieras. Observera ökningen avCD45-höga celler i den laserade (B) gruppen. Procenttal anger procent av överordnad. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativ identifiering av mikroglia, dendritiska celler, monocyter och makrofagundergrupper. Vänster: CD64 vs MHCII pseudocolor plot av CD45dim celler definierar microglia som CD64+MHCIIlåg. Observera liknande mängd mikroglia i grupper med oförsedd(A)och laserad (B) och avsaknaden av mikroglia i FMO-kontrollen (C). Mitten vänster: CD64 vs MHCII pseudocolor plot av CD45höga celler definierar MHCII- makrofager som CD64+MHCII-, monocyter som CD64-MHCII-och MHCII+ celler. Observera ökningen av MHCII- makrofager i den laserade gruppen (B), frånvaron av MHCII + celler i FMO (C, mitten) och CD64 FMO (C, vänster) hjälpte till att bestämma cutoff för CD64+ och CD64- celler. Mitten till höger: CD64 vs CD11c pseudocolor plot av MHCII+ celler. CD11c- makrofager definierades som CD64+CD11c-, CD11c+ makrofager identifierades som CD64+CD11c+och dendritiska celler (DCs) avgränsades som CD64-CD11c+. Både makrofag delmängder och dendritiska celler ökades med laser (B). Observera frånvaron av CD11c+ celler i FMO (C). Höger: Ly6C vs Tim4 pseudocolor plot av monocyter. Klassisk Ly6C+ och icke-klassisk Ly6C- monocyter identifierades. Observera att klassiska Ly6C+ monocyter var frånvarande i Ly6C FMO (C). Procenttal anger procent av överordnad. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Representativa uppgifter för mononukleära farocyter mellan olasererade och laserade möss både med och utan systemisk perfusion. MHCII- (A), CD11c- (B) och CD11c+ (C) makrofag räknas alla ökade med laser. Inga förändringar upptäcktes mellan unlasered och lasered microglia (D) eller monocyter (E). Dendritiska celler (DC) ökades också med laser (F). Brown Forsythe och Welch ANOVA med Dunnetts T3-multipla jämförelsetest användes för att definiera statistiska skillnader på grund av ojämlika avvikelser mellan grupper. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multiparameterflödescytometri möjliggör kvantitativ analys av flera celltyper i en komplex vävnad. I denna rapport beskriver vi flöde cytometric detektion av mononuclear phagocyte populationer, inklusive monocyter, dendritiska celler och makrofag delmängder, efter laser skada i mus ögat. Liyanage et al rapporterade nyligen en liknande gating strategi för att upptäcka neutrofiler, eosinofiler, lymfocyter, DCs, makrofager, infiltrera makrofager och monocyter27. Vår gating strategi skiljer sig främst genom tillägg av CD64. Liyanage et al identifierar DC som CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ celler och makrofager som CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- celler. Vi identifierar DC som CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- celler och makrofager som CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK.1-CD11b+CD64+ celler. Användningen av CD64 för att diskriminera DC från makrofager är väl etablerad6, och denna strategi gör det möjligt för oss att identifiera makrofag heterogenitet, inklusive CD11c + makrofager. Den största begränsningen av denna metod är att den inte ger data om vävnadsarkitektur eller placeringen av specifika celler i ögat. För att avgöra om dessa celler är i näthinnan, choroid, iris eller en annan okulär struktur, kan vårt protokoll kombineras med histologiska metoder eller ändras för att inkludera mer omfattande oftalmisk dissekering för att individuellt köra multiparameter flöde cytometri på varje okulär underavdelning.
Vi har optimerat protokollet för matsmältning av hela musögon för att förhindra varians som skapas av dissekering. Till exempel kan dissekering av bakre ögonkoppar med avlägsnande av hornhinna, iris och lins skapa variation från bibehållen iris eller hornhinnans material (under dissekering) eller ökad laserskada på normalt bakre ögonkoppsområde (överdesektion). Vår jämförelse mellan kontroll unlasered och lasered ögon upptäcker infiltration av mononuclear phagocytes på grund av retinochoridal skada. För analys av effekterna av systemiska sjukdomar på ögat, dvs. uveit och diabetes, är individuell okulär underkommittéanalys avgörande. Metoden för matsmältning, i avsnitt 2 i protokollet, är den mest kritiska, medan andra steg i avsnitt 3 - 5 har använts framgångsrikt på flera vävnadstyper24. Vi anlände till våra matsmältningsförhållanden genom en iterativ metod som involverade: (1) testning av kemisk matsmältningsmetod (Collagenase D vs matsmältningsenzym), (2) bestämning av längden på kemisk matsmältning (30, 60 och 90 minuter) och (3) tillsats av mekanisk matsmältning (ingen, en gång, två, tre gånger). Vid varje steg bedömde vi framgången för matsmältningsförhållandena efter cellens livskraft och antalet CD45HiCD64+ (infiltrera makrofager) celler. Vi fann att matsmältningsenzym (se Kompletterande tabell över material) återhämtade fler levande celler än Collagenase D och försök hälften av matsmältning enzym koncentrationen resulterade i färre infiltrera makrofager. Därefter fördubblade 60 minuters kemisk matsmältning med mekanisk matsmältning nästan de infiltrerande makrofagpopulationerna. Tre mekaniska matsmältningar var optimala med 25-30% levande celler av singlets och de mest infiltrerande makrofagpopulationerna. Slutligen orsakade snabbare mekaniska matsmältningsförhållanden allvarlig förlust av både levande celler och makrofager.
I framtiden föreslår vi att metoden utökas genom att ta bort hornhinnan, iris och lins följt av separat smältning av näthinnan och den bakre ögonkoppen (sclera, choroid och retinal pigmenterat epitel). Med denna modifiering förväntar vi oss att minska matsmältningsförhållandena på grund av linsens respektive hornhinnans proteinhaltiga och täta egenskaper. Dessa minskningar kan inkludera minskad matsmältning enzym koncentration, byta till Collagenase, minskad tid av matsmältningen eller minskad mängd mekanisk matsmältning. Vi förväntar oss övergripande minskade matsmältningsförhållanden för den bakre ögonkoppen, och ytterligare minskade matsmältningsförhållanden för näthinnan ensam.
Ytterligare framtida riktningar inkluderar expansionen av vår konventionella multiparameterflödescytometripanel till ett konventionellt 6-laserinstrument eller spektralflödescytometri. Spektralflödescytometri möjliggör fluorofordetektering över hela spektrumet, snarare än bestäms av de tillgängliga filtren. Spektralflödescytometri resulterar i mer specifik färgdetektering. Spektralflödescytometri kräver dock att en helt ny uppsättning överväganden följs och ligger utanför detta manuskripts räckvidd. För mer information, se den senaste JoVE-artikeln28. De 6 laserinstrumenten inkluderar en ultraviolett laser, som lägger till 6-9 detektorer. När du lägger till markörer på en cytometripanel för musögonflöde rekommenderar vi detektion av fler okulära celltyper. Härstamningsporten kan till exempel separeras för att upptäcka neutrofiler, eosinofiler, mastceller, NK-celler och lymfocyter oberoende av varandra. Det rekommenderas inte att öka detektion av mononukleära fagocyter på grund av det lilla antalet makrofager i stabilt tillstånd. När vi lägger till nya antikroppar föreslår vi noggrann antikroppstitrering.
Sammanfattningsvis har vi presenterat en anpassningsbar, robust metod för påvisande av mononukleära fagocytpopulationer i musögat. På grund av de mycket överlappande cellytans markörer av monocyter, dendritiska celler, makrofager och mikroglia är multiparameterflödescytometri den bästa metoden för att upptäcka dessa cellulära populationer. Flödescytometri kan användas för analys av celltyper, ödesmappning och/eller cellsortering för transkriptions- eller proteomisk utvärdering. Dess stora begränsning är brist på vävnad arkitektur, och viktiga resultat kan bekräftas med hjälp av traditionell histologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
JAL fick stöd av NIH-bidraget K08EY030923; CMC stöddes av ett K01-anslag (5K01AR060169) från NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases och ett nytt forskningsbidrag (637405) från Lupus Research Alliance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
