Summary
Bu protokol, monositler, mikroglia, makrofajlar ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere belirli oküler mononükleer fagositik popülasyonları tanımlamak için çok parametreli akış sitometrik analizi amacıyla tüm gözleri tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için bir yöntem sağlar.
Abstract
Doğuştan gelen bağışıklık sistemi üveit, diyabetik retinopati ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu dahil olmak üzere oküler patofizyolojide önemli roller oynar. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, özellikle mononükleer fagositler, üst üste binen hücre yüzey belirteçlerini ifade eder, bu da bu popülasyonları tanımlamayı zorlaştırır. Çok parametreli akış sitometrisi, fare gözlerindeki monositleri, makrofajları, mikrogliaları ve dendritik hücreleri ayırt etmek için birden fazla hücre yüzey belirtecinin eşzamanlı, nicel analizine izin verir. Bu protokol, tüm fare gözlerinin enükleasyonunu, oküler diseksiyonu, tek bir hücre süspansiyonuna sindirimi ve miyeloid hücre belirteçleri için tek hücre süspansiyonunun lekelenmesini açıklar. Ek olarak, tek renk kontrolleri kullanarak voltajları belirlemek ve floresan eksi bir kontrol kullanarak pozitif kapıların sınırlandırması için uygun yöntemleri açıklıyoruz. Çok parametreli akış sitometrisinin en önemli sınırlaması doku mimarisinin olmamasıdır. Bu sınırlama, bireysel oküler bölmelerin çok parametreli akış sitometrisi veya ücretsiz immünoresans lekeleme ile aşılabilir. Bununla birlikte, immünofluoresans, nicel analiz eksikliği ve çoğu mikroskopta florofor sayısının azalması ile sınırlıdır. Lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyonda mononükleer fagositlerin yüksek nicel analizini sağlamak için multi-parametrik akış sitometrisinin kullanımını açıklıyoruz. Ayrıca, çok parametreli akış sitometrisi, transkriptomik veya proteomik çalışmalar için makrofaj alt kümelerinin tanımlanması, kader haritalaması ve hücre sıralama için kullanılabilir.
Introduction
Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, kompleman aktivasyonunu ve iltihabı uyaran birden fazla hücre tipi içerir. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasında doğal öldürücü (NK) hücreler, mast hücreleri, bazofiller, eozinofiller, nötrofiller ve mononükleer fagositler bulunur. Monositler, makrofajlar ve dendritik hücrelerden oluşan mononükleer fagositler, üveit, diyabetik retinopati ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) dahil olmak üzere birden fazla oftalmik durum patofizyolojisinde yer1. Bu protokolde, neovasküler AMD2'ninbir fare modelinde çok parametreli akış sitometrik analizi kullanarak mononükleer fagositlerin tanımlanmasına odaklanacağız. Bu protokol diyabetik retinopati ve/veya üveit fare modelleri için uyarlanabilir, ancak bu hastalıkların sistemik doğası nedeniyle daha kapsamlı oküler diseksiyon önerilir.
Mononükleer fagositler çakışan hücre yüzeyi işaretleyicilerini ifade eder. Uzun ömürlü doku yerleşik makrofajlar ve mikroglia yumurta sarısı kese türevi eritromileoid progenitor3'ten kaynaklanırken, makrofajların ve dendritik hücrelerin geri dönüşümü kemik iliği türevi makrofaj dendritik hücre progenitor4'tenfarklıdır. Monositler, makrofajlar ve dendritik hücrelerde ortak olan fare hücresi yüzey işaretçileri CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17ve hücre içi işaretleyici Iba18 'iiçerir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, birden fazla dokudan gelen makrofajların, monositlerin ve dendritik hücrelerin transkriptomik analizi CD64'ü makrofaja özgü bir hücre yüzeyi işaretleyicisi olarak tanımlar6. Makrofajlar sağlıklı gözlerde iris, koroid, silier vücut ve optik sinirde tanımlanmıştır3. Alternatif olarak, dendritik hücre tanımlaması daha zordur; dendritik hücre tanımlamanın en özel yöntemi, Zbtb46-GFP muhabirfaresi 9kullanılarak kader eşlemesi gerektirir. Bu muhabir satırından bağımsız olarak, CD64 yokluğu ile birlikte CD11c ve MHCII ifadesi potansiyel dendritik hücreleritanımlayabilir 6,10. Normal gözlerde kornea, konjonktiva, iris ve koroidde dendritik hücreler tanımlanmıştır11. Mikroglia retinada bulunan, kan-retina bariyeri ile korunan ve yumurta sarısı kesesi progenitör hücrelerinden elde edilen özel makrofajlardır12. Sonuç olarak, retinal mikroglia monosit türevi makrofajlardan CD45 ekspresyon13 loş seviyeleri ve akış sitomemetri antikoru 14 olarak kullanılabilen yüksek Tmem119 seviyeleri ile ayırt edilebilir. Bununla birlikte, mikroglia aktivasyonu üzerine, CD45 yukarı regüle edilebilir15 ve Tmem119 aşağı düzenlenmiş olabilir3Mikroglia biyolojisinin karmaşıklığını gösteren ve bu muhtemelen hem AMD hem de fare modelinde geçerlidir. Son olarak, monositler klasik ve klasik olmayan dahil olmak üzere en az iki alt tipe ayrılabilir. Klasik monositler CCR2+Ly6CyüksekCX3CR1düşük ifadesini gösterir ve klasik olmayan monositler CCR2-Ly6CdüşükCX3CR1yüksek işaretleyicilerigösterir 5.
İşaretçi ekspresyonunun nicel analizinin gerekliliği nedeniyle, yani yüksek ve düşük/loş seviyeler, çok parametreli akış sitometrisi, göz ve diğer dokulardaki monositler, makrofajlar, mikroglia ve dendritik hücreler arasında ayrımcılık için ideal bir yöntemdir. Ek avantajlar arasında alt popülasyonların tanımlanması, hücre popülasyonlarını transkriptomik veya proteomik analiz için sıralamak için floresanla etkinleştirilen hücre sıralamasını (FACS) kullanma yeteneği ve kader haritalaması saydır. Çok parametreli akış sitometrisinin en büyük dezavantajı doku mimarisinin olmamasıdır. Bu, oftalmik diseksiyonun çeşitli oküler alt bölümlere girmesiyle aşılabilir: kornea, konjonktiva, iris, lens, retina ve koroid-sklera kompleksi. Ek olarak, doğrulayıcı immünofluoresans görüntüleme yapılabilir, ancak belirteç sayısı ve sağlam miktar eksikliği ile sınırlıdır.
Genom geniş ilişki çalışmaları AMD16ile birden fazla tamamlayıcı gen bağlamaktadır. Kompleman aktivasyonu anafilatoksin üretimine, lökosit alımına ve ortaya çıkan iltihaplanmaya yol açar. Kompleman reseptör eksikliği olan farelerde lazer yaralanması mononükleer fagosit alımını ve lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) alanını azaltır17. Benzer şekilde, dokuya monosit alımında eksik olan C-C motifli kemokin reseptörü 2 (CCR2) nakavt faresi, hem mononükleer fagosit alımının azaldığını hem de lazer kaynaklı CNV alanı18. Bu veri bağlantısı, deneysel CNV ve muhtemelen neovasküler AMD ile mononükleer fagositleri tamamlar ve tamamlar. Bu ilişkiyi desteklemek için, kompleman reseptörleri neovasküler AMD19,20olan hastalarda periferik kan monositleri üzerinde disregüle edilir. Bu veriler AMD ve mononükleer fagositler arasında güçlü bir ilişki olduğunu göstermektedir.
Bu yazıda, çok parametreli akış sitometrisi kullanarak fare gözündeki mononükleer fagosit popülasyonlarını karakterize etmek için deneysel lazer kaynaklı CNV modelini kullanacağız. Lazer kaynaklı CNV, mevcut ilk hat neovasküler AMD tedavisinin etkinliğini gösteren neovasküler AMD'nin standart fare modelidir21. Bu protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu, oküler diseksiyonu, tek hücreli süspansiyona sindirimi, antikor boyama, tek renk kontrolleri kullanılarak lazer voltajlarının belirlenmesi ve floresan eksi bir (FMO) kontrolleri kullanılarak gating stratejisini tanımlayacaktır. Lazer kaynaklı CNV modelinin ayrıntılı bir açıklaması için lütfen önceki bir yayına bakın22. Bu protokolü kullanarak mikroglia, monositler, dendritik hücreler ve makrofaj popülasyonlarını tanımlayacağız. Ayrıca, lazer kaynaklı CNV modeli içinde makrofaj alt kümelerini daha fazla tanımlamak için MHCII ve CD11c'yi kullanacağız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. C57BL/6 fareleri Northwestern Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Merkezi'ndeki (Chicago, IL) bir bariyer tesisinde grup tarafından barındırıldı. Tüm hayvanlar, yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile 12/12 saat açık / karanlık döngüde barındırıldı.
1. Oküler doku koleksiyonu
- Her iki cinsiyette de 10-12 haftalık C57BL/6J fareleri, fare tepkisiz kalana ve artık solunamayana kadar karbondioksitin düzenlenmiş yönetimini kullanarak kurban edin. Ötanaziyi sağlamak için servikal çıkık veya diğer onaylanmış ikincil yöntemi gerçekleştirin.
NOT: Oküler dokularda olmayan dolaşımdaki lökositleri çıkarmak için transkardiyal perfüzyon yapılabilir. Bu deneyde, sistemik perfüzyon, tedavi edilmemiş veya lazerle tedavi edilmiş tüm gözlerde tespit edilen mikroglia, monositler, makrofajlar veya dendritik hücrelerin sayısını azaltmaz. Bu nedenle, bu hücre tiplerinin çoğunluğu oftalmik dokularda bulunur ve bu adım isteğe bağlıdır. - Gözleri enükle etmek için, prizden çıkarken gözün altına hafifçe bir çift kavisli tokmak yerleştirirken göz çukurunun yakınına bastırın. Gerçek gözü sıkmadan gözün altında kapalı olanpsları kıstırın. Gözü çevredeki konjonktivadan sökün (lütfen önceki yayına bakın)23.
- Optik sinir gözü ayırmak için kalan tek bağlantı olana kadar gözü yanal olarak çekin. Optik sinir genellikle gerginlikle kesilir, ancak optik siniri kesmek için bazen küçük bir makas gereklidir. Gözü 1,7 mL mikrosantrifüj tüpünde kalsiyum ve magnezyum ile soğuk 1x Hank'in Tamponlanmış Tuzlu Çözeltisine (HBSS) yerleştirin.
2. Oküler dokunun sindirimi
- Soğuk HBSS'de 0.1 mg/mL sindirim enzimi ve 0.2 mg/mL DNaz içeren sindirim tamponunu hazırlayın. Başlangıçta 2 mL steril suda 5 mg sindirim enzimini yeniden inşa edin. HBSS'de 10 mg/mL DNase ilk seyreltme hazırlayın. Sindirim tamponunun her 10 mL'si için (3 hayvan için yeterli) 9,4 mL soğuk HBSS'yi 0,4 mL yeniden inşa edilmiş sindirim enzimi ve 0,2 mL seyreltilmiş DNase I ile karıştırın.
NOT: Bu konsantrasyonlar, hücre ölümünü azaltırken, tek hücrelerin optimal antikor lekeleme seviyelerini sağlamak için birden fazla deneyde ampirik olarak belirlendi. Kollajenaz D, hücre canlılığı azaltılmış ve CD45+ hücreler azalmış sindirim enzimine alternatif olarak denenmiştir. Sindirimi en iyi duruma getirmek için yinelemeli işlemle ilgili daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma'ya bakın. - 10x toplam büyütmede bir diseksiyon mikroskobu altında, soğuk HBSS'de ince tokmaklar ve yay makası kullanarak kalan konjonktivayı ve optik siniri çıkarın.
- Temiz gözleri kuru bir diseksiyon kabına veya küçük bir tartım teknesine taşıyın. Sindirim tamponu çıkışı için gözde görsel eksenden ve bu ilk yaradan 90° uzağa iki delikli yara yapıldıktan sonra vitreus boşluğuna 30 G iğne ile donatılmış şırınga ile 0,15-0,20 mL/göz sindirim tamponu enjekte edin.
- 0,5 mm x 0,5 mm'den küçük tüm parçalarla yay makası ve ince askılar kullanarak tüm gözleri kıymalayın. Sonraki adımlarda pipet uçlarının tıkanmasını önlemek için lens dokusunu tokalar aracılığıyla künt mekanik bozulma ile ayrıştırmak. Her numune için, her biri 0,75 mL sindirim tamponu ile forseps ve makası küçük bir tabakta durulayın. Her örnek için yeni bir tabak kullanın.
- Pipet transferinde herhangi bir malzeme kaybetmemeye dikkat ederek P1000 pipet kullanarak yemeğin içeriğini buz üzerindeki bir ayrışma tüpüne aktarın. Yemeği ek 1,5 mL sindirim tamponu ile durulayın ve ayrışma tüpündeki toplam hacmi 3,25-3,50 mL'ye getirin.
- Dissosiyatif tüpü elektronik ayrıştırıcıya ters yerleştirin ve önceden yüklenmiş bir program olan oda sıcaklığında 200 rpm'de 1 dakika tek yönlü rotasyondan oluşan "m_brain_03_01" döngüsünü çalıştırın. Tüm dokunun sindirim tamponu ve bunun için rotor ve kalan tüm adımlarla temas halinde ayrışma tüpünün altında olduğundan emin olun.
- Ayrışma tüpünü 37 °C'de 200 rpm'de 30 dakika boyunca sallama inkübatörüne yerleştirin.
- 2.6 ve 2.7. İkinci 30 dk inkübasyondan sonra, adım 2.6'da olduğu gibi elektronik ayrıştırıcı kullanarak son bir mekanik sindirim gerçekleştirin.
- 10 mL soğuk akış tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun ve tüpleri buza yerleştirin.
3. Hücre süspansiyonunun hazırlanması
- Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için, durdurulan göz sindirim reaksiyonunu 50 mL konik santrifüj tüpünün üstüne yerleştirilmiş 40 μm'lik bir filtreden dökün. Pistonu 2,5 mL şırıngırdan kullanarak, kalan sindirilmemiş göz dokusu parçalarını filtreden geçirin.
- Sindirilmemiş göz dokusu parçalarını filtreden tekrar geçirmek için aynı pistonu kullanmadan önce ayrışma tüpünü 10 mL Akış tamponu ile yıkayın ve filtreyi durulayın.
- 5 mL Akış arabelleği kullanarak 3.2 adımını yineleyin.
- Ayrışma tüpünü yıkayın ve son 10 mL Akış tamponu ile filtreleyin.
NOT: Toplam sindirim hacmi ve akış tamponu her numune için yaklaşık 38-40 mL'dir. - Konik tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj edin. Hücre peletini bozmadan süpernatantı dekant.
- Steril suya 10x lysing çözeltisi ekleyerek 1x lising çözeltisi hazırlayın. Tüpü başka bir tüpe vurarak peletı parçala. Kırmızı kan hücrelerini lyse etmek için, oda sıcaklığında (RT) dönen 30 s için 1 mL 1x lising çözeltisi ekleyin.
- 20 mL Akış arabelleği ile reaksiyonu durdurun.
- Konik tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj edin. Hücre peletini bozmadan süpernatantı dekant.
- Tüpü başka bir tüpe vurarak peletin ayrıştırın. Tüp başına 5 mL soğuk 1x HBSS ekleyin.
- 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj tüpler. Aspirat süpernatant.
4. Mononükleer fagositler için hücre süspansiyonunun lekelenerek boyanır
- Soğuk HBSS'de Canlı/Ölü boyası 1:5.000 seyrelterek numune başına 0,5 mL Canlı/Ölü lekesi hazırlayın.
- Peletin tamamen ayrıştırmasını sağlamak için bir P1000 pipet kullanarak her numuneye Canlı/Ölü lekesi ekleyin. Numuneleri 1,2 mL mikro titre tüplerine aktarın.
- Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak için küçük bir aliquot (10 μL) alın (bkz. 4.4). Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca Canlı / Ölü lekeli örnekleri kuluçkaya yatırın.
- Örnek başına canlı hücre sayısını belirlemek için Trypan mavisini kullanarak hücreleri sayın.
NOT: Tipik olarak, 10-12 haftalık bir C57BL/6J fareden 2 göz, 2 x 106'dan az canlı hücre içerir. - Numuneleri 400 μL soğuk Akış tamponu ekleyerek yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.
- Hücreleri 500 μL soğuk Akış tamponunda tamamen yeniden depolar. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.
- 50 μL Fc bloğunda 5 x10 6 canlı hücreyi bloke edin (saflaştırılmış sıçan fare önleyici CD16/CD32'nin soğuk Akış tamponunda 1:50 seyreltme). 5 x 106'dan fazla canlı hücre varsa, hacimleri uygun şekilde artırın.
- Numuneyi tamamen dağıttığından emin olarak peletin içine Fc bloğu ekleyin. 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın.
- 5 x 10 6 canlı hücre başına doğrudan Fc bloğundaki hücrelere 50 μL antikor boyama çözeltisi ekleyin (çözeltiye dahil edilen her antikorun seçimi ve miktarı için Tablo1'e bakın) ve tamamen karıştırın. 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
NOT: Antikor miktarları akış sitometresi konfigürasyona bağlıdır ve her laboratuvar ve cihaz için bağımsız olarak titratlanmalıdır. Filtrelerin ve aynaların cihaz yapılandırması için Tablo 2'ye bakın. Antikorları titratlamak için üreticinin önerisiyle başlayın ve boyama indeksini hesaplayın. Değişen antikor konsantrasyonlarının bir test çalışmasını gerçekleştirin (üreticinin tavsiyesinin hem üstünde hem de altında) ve boyama indeksinin tutulduğu en düşük antikor konsantrasyonu seçin. Ayrıca, tek renk kontrolünden daha az parlak pozitif boyama olduğundan emin olun. Negatif lekeli hücrelerin ölçek üzerinde olduğundan ve 1 x 102'deveya daha az bir tepeye sahip olduğundan emin olmak için lekelenmemiş hücreleri kullanın. Pozitif lekeli hücreleri tanımlamak için floresan eksi bir kontrol kullanın. - Numuneleri 700 μL soğuk Akış tamponu ekleyerek yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.
- İsteğe bağlı olarak, antikor boyamadan sonra, numuneler Akış tamponunda% 2 paraformaldehitin 500 μL'si ile sabitlenebilir. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika sabitlayın. Ardından, 4.10'da açıklandığı gibi bir yıkama gerçekleştirin. Sabit numuneleri 4 °C'de saklayın. Akış sitometrisi veri toplama gününde sayım boncukları eklenmelidir. Sabit numuneler 1-2 gün içinde akış sitometresinde çalıştırılmalıdır.
DİkKAT: Paraformaldehit aşındırıcı ve sağlık açısından zararlıdır. - Numuneleri 500 μL soğuk Akış tamponu kullanarak tekrar yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantın yarısını aspire edin.
- Peletleri yeniden alıp 96 kuyuya, U-bottom test plakasına aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj plakası. Süpernatantı dekante etmek için, plakayı ters çevirin ve güçlü bir sallamada sıvıyı rahatsız edici bir pelet olmadan bir lavabo havzasına yerinden sökün.
- Yeni bir 1,2 mL mikro titre tüpüne, 50 μL iyi girdaplı sayım boncukları yerleştirin.
- Peletleri 200 μL soğuk Akış tamponunda 96 kuyu plakasında yeniden depolar. Önceki adımdan itibaren boncukların üstüne hücre karışımı ekleyin. Toplam 250 μL / mikro titre tüpü hacminde akış sitometresi üzerinde çalıştırın.
5. Akış sitometrisi verilerinin toplanması
- Akış sitometresi açın ve hazırlayın. Burada listelenen talimatlar değiştirilmiş dört lazer sitometresi içindir (Tablo 2).
- Tüm hücrelerin her dedektör için ölçekte olduğundan emin olmak için her örnekten küçük bir aliquot içeren bir test örneği çalıştırın. Voltajları tüm hücrelerin ölçeğinde olacak şekilde ayarlayın.
- Boyama kokteylinde kullanılan her florofor için tek renk kontrolleri (SCC) çalıştırın(Tablo 3). Mikro titre tüpünü akış sitometresi aşamasına yerleştirmek için daha büyük bir 5 mL polistiren tüpe yerleştirin.
NOT: BV421 (Pasifik Mavisi), FITC, PE, Alexa647 (APC) ve Alexa700 gibi kök floroforları kokteylle aynı antikoru gerektirmez (örneğin, CD64 PE için CD19 PE). Bununla birlikte, PE-CF594, PE-Cy7 veya APC-Cy7 gibi tandem floroforlar, konjuge floroforların potansiyel ayrışması nedeniyle SCC için kokteyl ile aynı antikoru gerektirir.- 1,2 mL'lik titre tüpüne 2 damla kompanzasyon boncukları ve 1 μL hamster anti-mouse CD11c BV421 ekleyerek BV421 için SCC'yi oluşturun. CD11c BV421, 5.3.3'te açıklandığı gibi kappa yerine bir IgG lambda alt tipi olduğundan kompanzasyon boncukları kullanılır. 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.
- Amin reaktif boncuklardan bir damla pozitif boyama boncukları (yeşil kapak) ve ardından 1 μL Canlı / Ölü boya ekleyerek Canlı / Ölü boyası için SCC oluşturun. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Amin reaktif boncuklarından negatif boncuklardan (beyaz kapak) bir damla ekleyin. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.
- Anti-sıçan ve anti-hamster Ig kappa boncuk setinden bir damla pozitif boyama boncukları (yeşil kapak) ekleyerek kalan SCC'leri oluşturun, ardından 1,2 mL'lik bir titer tüpünde listelenen antikor miktarı (Tablo 3). 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın. Anti-sıçan ve anti-hamster Ig kappa boncuk setinden negatif boncuklardan (beyaz kapak) bir damla ekleyin. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.
- Girdap tüm boncuk karışımları tamamen. SCC'leri 4 °C'de 3 güne kadar saklayın.
NOT: Floresan muhabir fareler için SCC, tespit edilmemiş hücrelerdir. - SCC'leri çalıştırırken, SCC örneğinin aynı dedektör kanalındaki bir hücre örneği için herhangi bir floresandan daha yüksek bir tepeye sahip olacak şekilde voltajları ayarlayın. Buna ek olarak, herhangi bir SCC'nin ilgi kanalındaki histogram zirvesi ile diğer kanallar arasında en az 0,5 Log farkı olacak şekilde voltajlar ayarlanmalıdır (Şekil 1).
- Olayları/saniyeyi 4000'in altında tutarak "Düşük" üzerinde örnekler çalıştırın. Akış hızı uygun şekilde düşürülemezse, numuneleri ek soğuk akış tamponu ile seyreltin. Sayım hesaplaması için gerekli olacağından eklenen birimi kaydedin (bkz. temsili sonuçlar).
- Örnek başına en az 3 x 106 olay toplayın. Bu, pigment granülleri ve sitometrenizdeki olaylar olarak sayan döküntüler nedeniyle hücre sayısından daha yüksek olabilir.
- Bölüm 6.4'te uygun gating stratejisi için Live/Dead dışındaki her florofor için bir Floresan Eksi Bir (FMO) kaydedin. FDO, biri hariç tüm floroforlarla boyanmış bir örnektir.
- Akış sitometresini üretici veya tesis talimatlarına göre temizleyin ve kapatın.
6. Akış sitometrisi verilerinin ek açıklaması
- Çözümleme yazılımını kullanarak yeni bir çalışma sayfası açın. Tüm örnekler ve tek renkli kontroller için FCS dosyalarını sitometreden içe aktarın.
- Ücret matrisi oluşturmak için SCC'leri kullanın.
- Kompanzasyon matrisini lekeli örneklerinize ve IPO'larınıza uygulayın.
- Kapıları çizmek için pozitif boyamayı belirlemek için IPO'ları kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, SCC'ler ve kırmızı lazer hücreleri için telafi edilmemiş frekans histogramları gösterdi: Alexa647, Alexa700 ve APC-Cy7. Şekil 1A'da,macenta çizgisi Alexa647 için SCC'nin zirvesini gösterirken, camgöbeği çizgisi hedeflenen 0,5 Günlük farkını göstermiştir. Alexa700 ve APC-Cy7'deki tepe noktasının siyan hattının solunda (daha az parlak) olduğuna dikkat edin. Ayrıca, hücrelerin hepsinin macenta çizgisinin solunda olduğunu unutmayın. SCC zirvesinin sağındaki hücreler tazmin edildi. Belirli kanalların florokrom boyaların kimyasına dayanarak başkalarına döküldüğü bilinmektedir (yani. Menekşe Lazer: BV421 -> V500, Sarı-Yeşil Lazer: PE -> PE-CF594, Kırmızı Lazer: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, Çapraz Lazer: PE-Cy7 -> APC-Cy7). Yukarıdaki koşullardan herhangi biri karşılanmadıysa, bir kanalın voltajı yukarı doğru ayarlanabilirken, herhangi bir dökülme kanalı aşağı doğru hareket ettirilebilir. Kırmızı lazerin ek örnekleri için Şekil 1B ve Şekil 1C'ye bakın. Gerilimler belirlendikten ve kaydedildikten sonra, tüm numuneler voltaj parametreleri ile çalıştırılmalıdır. Bir ücret kurulum sihirbazı var ve yararlı olabilir.
Hücre sayılarının ölçülmesi için sayım boncuk tanımlaması gereklidir. Şekil 2A, tek bir farenin iki gözünden analiz edilen tüm olaylar için FSC-A vs SSC-A özelliklerini gösterdi. Sayım boncuklarınızın SSC-Ayüksek ve FSC-Adüşük olaylarının çok sıkı bir koleksiyonu olarak görünür olduğundan emin olmak için SSC voltajını ayarlamak önemlidir. Boncuk sayımları PE vs APC-Cy7 (Şekil 2B) çizilerek temizlendi ve onaylandı. Temiz boncuklar pe+ ve APC-Cy7 sıkı bir küme oldu- olaylar.
Singlet'lar ve canlı hücreler daha sonra tüm olaylardan tanımlandı. Singlet'lar FSC-H vs FSC-A çizilerek belirlendi. Doublet ve üçüz hücreler FSC-H'den daha büyük FSC-A'ya sahipken singlet'lar bu iki özellikte pozitif korelasyona sahipti (Şekil 2C). Canlı hücreler Canlı / Ölü vs FSC-A çizilerek belirlendi. Ölü hücreler Canlı / Ölü pozitifti ve hücreler enkazdan daha büyük FSC-A gösteriyor (Şekil 2D). Sayım boncuklarının Canlı / Ölü+ olduğunu ve bu adımda kaldırıldığını unutmayın.
Şekil 3, mononükleer fagositlerin canlı, tek hücreli hücrelerden tanımlaması için ilk gating stratejisini göstermektedir. Canlı singlet'lar CD45 ve CD11b çizimi kullanılarak görselleştirildi(Şekil 3, sol). CD45+CD11b- (çoğunlukla B hücreleri ve T hücreleri), CD45dimCD11b+ (putatif mikroglia) ve CD45+CD11b+ hücrelerin (bağışıklık hücrelerine sızan, lazerle arttırılan [Şekil 3B, sol]) seçildiğini unutmayın. CD45 FMO'da CD45+ hücrelerinin bulunmaması kapı seçimini doğruladı(Şekil 3C, sol). Sırada nötrofiller, eozinofiller var. B hücreleri, NK hücreleri ve T hücreleri, Lineage kapısı (Lin: Ly6G [nötrofiller], SiglecF [eozinofiller], B220 [B hücreleri], NK1.1 [NK hücreleri], CD4 [T hücreleri] ve CD8 [T hücreleri]) ve CD11b kullanılarak CD45+ canlı singlet'lar çizilerek dışlandı. Cd11b+Lin- No Laser(Şekil 3A, orta) ve Lazer(Şekil 3B, orta) grupları arasındaki hücrelerde artış kolayca gözlendi. CD11b FMO'da CD11b+Lin hücrelerinin eksikliğine dikkat edin(Şekil 3C, orta) ve Lin FMO'daki Lin+ hücrelerinin eksikliği (Şekil 3C, sağ). Microglia, mononükleer fagositlere sızmaktan CD45 ifademiktarı 13,24ileayrılabilir. CD11b+Lin- hücreler CD45dim putative microglia ve CD45yüksek sızan mononükleer fagositleri tanımlamak için cd11b vs CD45 grafiği kullanılarak görselleştirildi. CD45yüksek mononükleer fagositlerdeki göreceli artış Lazerle tedavi edilen farede açıktı(Şekil 3A,B, sağ).
Şekil 4'te mikroglia, üç makrofaj alt kümesi, monositler ve dendritik hücreler tanımlanmıştır. Mikroglia, CD64 vs MHCII çizimi(Şekil 4, sol panel) üzerinde CD45dim hücreleri çizilerek belirlendi. Microglia'nın CD64+MHCIIdaha önce düşük olduğu gösterilmiştir13. Microglia lazer ile nispeten değişmedi ve CD64 FMO'da yoktu(Şekil 4A,C sol). CD45yüksek hücreleri daha sonra aynı CD64 vs MHCII grafiğinde çizildi. CD64+MHCII- makrofajlar (MHCII- Mac'ler), CD64-MHCII- monositler ve MHCII+ hücreleri tanımlanmıştır(Şekil 4A,B, orta sol). MHCII FMO'da MHCII+ hücrelerinin yokluğuna dikkat edin (Şekil 4C, orta sol). MHCII+ hücreleri CD64 ve CD11c kullanılarakdaha da ayırt edildi. CD11c FMO'da CD11c+ hücrelerinin olmamasına dikkat edin (Şekil 4C, orta sağ). Monositler klasik Ly6C+ veya klasik olmayan Ly6C- monositler olarak alt tiplenmiştir (Şekil 4, sağ). Ly6C FMO'da Ly6C+ monositlerin yokluğuna dikkat edin (Şekil 4C, sağ).
Fare başına (veya 2 göz başına) hücre sayısı aşağıdaki denklemle hesaplanmıştır:
Bu yöntemdeki birimleri kullanarak denklem:
Hücre sayısı ve boncuk sayısı her örneğe özgü olacaktır. Boncukların konsantrasyonu, her bir sürü sayma parçasına özgüdür ve üretici tarafından her şişede sağlanır.
Makrofajlar lazer yaralanmasından sonra korooide sızar25ve makrofaj tükenmesi CNV alanınıazaltır 18. Bu eski çalışmalar, mononükleer fagositleri güvenilir bir şekilde ayırt edemeyen immünofluoresans görüntülemesine veya makrofaj tanımlaması için daha az akış sitometrik belirteçlerine dayatmaktadır. Makrofaj heterojenliği, makrofajların kökenlerine ve doku mikroçevrelerine bağlı olarak birden fazla işlevi yerine getirebildiği doğuştan gelen bir immünoloji kavramıdır12,26. Mononükleer fagositleri ve makrofaj heterojenliğini tanımlamak için lazer yaralanmasından sonra 3. günde tedavi edilmemiş ve lazerle tedavi edilen fare gözlerine çok parametreli akış sitometrisi yaptık. Lazer tedavisi MHCII-, CD11c-ve CD11c+ makrofajları sırasıyla 7.0-25.6, 2.8-7.2 ve 3.9-8.2 kat artırdı (Şekil 5A,C). Dendritik hücre sayıları da lazerle 4.5-4.7 kat yukarı düzenlenmiştir (Şekil 5F). Mikroglia ve monosit sayımları lazer tedavisindenetkilenmemiştir (Şekil 5D,E). Enükleasyondan önce sistemik perfüzyonlu veya sistemik perfüzyonsuz anlamlı bir fark saptanmamıştır. Bu sonuçlar, lazer yaralanmasından sonra mikroglia veya monositlerde hiçbir değişiklik olmadan makrofaj popülasyonlarının ve dendritik hücrelerin arttığını göstermektedir. Ayrıca, bu veriler çok parametreli akış sitometrisi makrofaj heterojenliğini nasıl algılayabilir vurgulamaktadır.
| Antikor veya tampon | Florofor | Klon | Örnek başına tutar (ng) |
| fare anti-fare Ly6C | FITC | AL-21 | 15 |
| fare fare önleme CD64 | Pe | X54-5/7.1 | 40 |
| fare anti-fare Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 300 |
| hamster fare karşıtı CD11c | BV 421 | HL3 | 300 |
| fare anti-fare Ly6G | PE-CF594 | 1A8 | 10 |
| fare fare önleme NK1.1 | PE-CF594 | PK136 | 10 |
| fare anti-fare Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 20 |
| fare anti-fare B220 | PE-CF594 | RA3-6B2 | 20 |
| fare fare önleyici CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | 40 |
| fare fare önleyici CD4 | PE-CF594 | RM4-5 | 20 |
| fare anti-fare MHC II | AlexaFluor 700 | M5/114.15.2 | 2.5 |
| fare fare önleyici CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 2 |
| fare fare önleyici CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 6 |
| MACS arabelleği |
Tablo 1: Antikor floroforu ve klonları (bkz. adım 4.9). Genellikle, bir örnek bir veya iki sindirilmiş gözdür. Önce bir tüpe sonra her antikora akış tamponu ekleyin. Seyreltmeler, toplam akış arabelleği hacmini uygun şekilde değiştirirken, çok küçük bir birimin pipetleilmesini önlemek için yapılabilir. Ürün numarası ve şirket için Malzeme Tablosu'nu görme.
| Lazer | PMT Yuvası | Filtre | Ayna | Renk |
| Menekşe (405nm) | A | 525/50 | 505LP | V500 veya AmCyan |
| B | 450/50 | Pasifik Mavisi, eFluor 450, V450 veya BV421 | ||
| Mavi (488nm/FSC) | A | 710/50 | 685LP | PerCP-Cy5.5, PerCP, PI veya 7AAD |
| B | 525/50 | 505LP | FITC, CFSE, GFP veya AlexaFluor 488 | |
| C | 488/10 | Ssc | ||
| Sarı-Yeşil (561nm) | A | 780/60 | 735LP | PE-Cy7 |
| B | 610/20 | 600LP | PE-CF594, mCherry veya DsRed2 | |
| C | 582/15 | Pe | ||
| Kırmızı (640nm) | A | 780/60 | 735LP | APC-Cy7, APC-H7 veya APC-eFluor 780 |
| B | 730/45 | 690LP | AlexaFluor 700 | |
| C | 670/30 | APC veya AlexaFluor 647 |
Tablo 2: Akış sitometresinin konfigürasyonu. Dört lazerli sitometre ve her kanalda tespit edilebilen mevcut floroforlar için filtre ve ayna kurulumu. PMT = fotomultiplier tüp, FSC = ileri saçılma, SSC = yan dağılım.
| Antikor | Florofor | Klon | SCC başına tutar (ng) |
| fare fare önleyici CD45 | FITC | 30-F11 | 500 |
| fare fare önleyici CD19 | Pe | 1D3 | 40 |
| fare anti-fare Tim4 | AlexaFluor 647 | RMT4-54 | 100 |
| hamster fare karşıtı CD11c | BV421 | HL3 | 200 |
| fare anti-fare Siglec F | PE-CF594 | E50-2440 | 40 |
| fare fare önleyici CD19 | AlexaFluor 700 | 1D3 | 200 |
| fare fare önleyici CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 200 |
| fare fare önleyici CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 200 |
| Canlı / Ölü Boya | eFluor 506 | Yok | 1 μl |
Tablo 3: Tek renk kontrolleri için antikor floroforu ve klonları. Her antikor, 5.3.1 – 5.3.3 adımlarında belirtildiği gibi uygun kompanzasyon boncuklarına eklenmelidir.
Şekil 1: Kırmızı lazer için temsili voltaj kuruldu. (A) Alexa647 için tek renk denetimleri (SCC'ler). Solda, Alexa647 için SCC gösterilir. Sol orta, Alexa647 SCC'nin Alexa700 kanalına dökülmesini görüntüler. Alexa647 SCC'nin zirvesi macenta ile gösterilir ve 0.5 Log hedef diferansiyeli siyan içinde görüntülenir. Tepe noktasının siyan çizgisinden daha solda (daha az parlak) olduğunu unutmayın. Orta sağ, Alexa647 SCC'nin APC-Cy7 kanalına döküldüğünü gösterir. Sağ, Alexa647 kanalındaki hücreleri gösterir. Tüm hücrelerin SCC'den (macenta çizgisi) daha az parlak olduğunu unutmayın. (B) Alexa700 için SCC. Orta sol Alexa700 için SCC gösterir. Sol, Alexa700 SCC'nin Alexa647 kanalına dökülmesini görüntüler. Orta sağ, Alexa700 SCC'nin APC-Cy7 kanalına döküldüğünü gösterir. Alexa700 SCC'nin zirvesi macenta ile gösterilir ve 0.5 Log hedef diferansiyeli siyan içinde görüntülenir. Tepe noktasının siyan çizgisinden daha solda (daha az parlak) olduğunu unutmayın. Sağda Alexa700 kanalındaki hücreler gösterilmektedir. Tüm hücrelerin SCC'den (macenta çizgisi) daha az parlak olduğunu unutmayın. (C) APC-Cy7 için SCC. Sol ve orta sol, APC-Cy7 SCC'nin sırasıyla Alexa647 ve Alexa700'e dökülmesini gösterir. Her iki tepenin de siyan çizgisinin solunda olduğunu unutmayın. Orta sağ ACP-Cy7 SCC'sini gösterir. Sağ, APC-Cy7 kanalındaki hücreleri gösterir. Tüm hücrelerin SCC'den (macenta çizgisi) daha az parlak olduğunu unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sayım boncuklarının, singlet'ların ve canlı hücrelerin temsili tanımlaması. (A) Kontur grafiğindeki tüm hücreler için yan dağılım alanı (SSC-A) ve ileri saçılma alanı (FSC-A). Sayım boncukları yüksek SSC-A, düşük FSC-A ve tekdüze boncukların çok sıkı kümelenmesi ile tanımlanır. (B) Pe vs APC-Cy7 temiz boncuk kapısı için arsa. A ve B arasındaki ok, yalnızca sayı boncuk pozitif olaylarının çizilmesini gösterir. Temiz sayım boncukları yüksek PE ve düşük APC-Cy7 floresan ile deliner. (C) Tüm hücrelerin FSC-Height (FSC-H) vs FSC-Area (FSC-A) grafiği, tekli hücreleri pozitif olarak ilişkili geniş bir çizgide gösterir. Çiftler ve diğer çoğulutlar FSC Yüksekliğinden daha büyük FSC Alanı gösterir. (D) Singlet hücreleri için Canlı / Ölü vs FSC-A. Canlı hücreler Live / Dead low ve FSC-A pozitif olarak tanımlanır. Yüzdeler üst öğenin yüzdesini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mononükleer fagositlerin temsili tanımlaması. Sol: CD45 vs CD11b psödoklor canlı hücrelerin çizilmemiş (A), lazerli (B) ve floresan eksi bir (FMO) kontrolden (C). Sol: CD45+ hücreler A-B'de tanımlanır ve FMO'da yoktur. Lazerli (B) grubundaki CD45+CD11b+ hücrelerin artışına dikkat edin. Orta: CD45+ hücreler için soy (Lin) işaretçisi vs CD11b sahte renk çizimi. CD11b+Lin- hücreler A-B'de tanımlamalı ve CD11b için FMO'da yoktur (altta). Doğru: CD11b vs CD45 CD11b+Lin- hücrelerin çizimi. CD45dim ve CD45yüksek hücreler tanımlanır. Lazerli (B) gruptaki CD45yüksek hücrelerindeki artışa dikkat edin. Yüzdeler üst öğenin yüzdesini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mikroglia, dendritik hücreler, monositler ve makrofaj alt kümelerinin temsili tanımlaması. Sol: CD45dim hücrelerinin CD64 vs MHCII pseudocolor arsası mikroglia'yı CD64+MHCIIdüşükolarak tanımlar. Unlasered (A) ve lazerli (B) gruplarındaki benzer miktarda mikrogliaya ve FMO kontrolünde (C) mikroglia yokluğuna dikkat edin. Orta sol: CD45yüksek hücrelerinin CD64 vs MHCII sahtekolor grafiği MHCII- makrofajları CD64+MHCII-, monositleri CD64-MHCII-ve MHCII+ hücreleri olarak tanımlar. MhCII- lazerli gruptaki (B) makrofajlardaki artışa, FMO'da (C, orta) MHCII+ hücrelerinin bulunmamasına ve CD64 FMO'nun (C, solda) CD64+ ve CD64- hücrelerin kesilmesini belirlemeye yardımcı olduğuna dikkat edin. Orta sağ: MHCII+ hücrelerinin CD64 vs CD11c psödoklor arsası. CD11c- makrofajlar CD64+CD11c-, CD11c+ makrofajlar CD64+CD11c+olarak tanımlandı ve dendritik hücreler (DC' ler) CD64-CD11c+olarak tanımlandı. Lazer (B) ile hem makrofaj alt kümeleri hem de dendritik hücreler arttırıldı. FMO'da (C) CD11c+ hücrelerinin olmamasına dikkat edin. Sağ: Ly6C vs Tim4 sahtesiklor monositler arsa. Klasik Ly6C+ ve klasik olmayan Ly6C- monositler tanımlanmıştır. Klasik Ly6C+ monositlerin Ly6C FMO'da (C) bulunmadığını unutmayın. Yüzdeler üst öğenin yüzdesini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hem sistemik perfüzyonlu hem de sistemik perfüzyonsuz ve lazerli fareler arasındaki mononükleer fagositler için temsili veriler. MHCII- (A), CD11c- (B) ve CD11c+ (C) makrofaj sayıları lazerle artırıldı. Unlasered ve lazerli mikroglia (D) veya monositler (E) arasında herhangi bir değişiklik tespit edilmemiştir. Dendritik hücreler (DC) de lazer(F)ile arttırıldı. Dunnett'in T3 çoklu karşılaştırma testi ile Brown Forsythe ve Welch ANOVA, gruplar arasındaki eşit olmayan farklılıklar nedeniyle istatistiksel farklılıkları tanımlamak için kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çok parametreli akış sitometrisi, karmaşık bir dokudaki birden fazla hücre tipinin nicel analizini sağlar. Bu raporda, fare gözünde lazer yaralanmasından sonra monositler, dendritik hücreler ve makrofaj alt kümeleri de dahil olmak üzere mononükleer fagosit popülasyonlarının akış sitometrik tespitini açıklıyoruz. Liyanage ve arkadaşları son zamanlarda nötrofilleri, eozinofilleri, lenfositleri, DC'leri, makrofajları, sızan makrofajları ve monositleri tespit etmek için benzer bir gating stratejisi bildirdi27. Gating stratejimiz öncelikle CD64'ün eklenmesiyle farklılık gösterir. Liyanage ve diğerleri DC'yi CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ hücreler ve makrofajları CD4 - CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- hücreler olarak tanımlar. DC'yi CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- hücreler ve makrofajları CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b + CD64+hücreler olarak tanımlıyoruz. CD64'ün DC'yi makrofajlardan ayırt etmek için kullanımı iyi belirlenmiştir6ve bu strateji, CD11c+ makrofajlar da dahil olmak üzere makrofaj heterojenliğini tanımlamamızı sağlar. Bu yöntemin en büyük sınırlaması, doku mimarisi veya göz içindeki belirli hücrelerin konumu hakkında veri sağlamamasıdır. Bu hücrelerin retina, koroid, iris veya başka bir oküler yapıda olup olmadığını belirlemek için, protokolümüz histolojik yöntemlerle birleştirilebilir veya her oküler alt komplemde ayrı ayrı çok parametreli akış sitometrisi çalıştırmak için daha kapsamlı oftalmik diseksiyon içerecek şekilde değiştirilebilir.
Diseksiyonun yarattığı herhangi bir varyansı önlemek için tüm fare gözlerinin sindirimi için protokolü optimize ettik. Örneğin, kornea, iris ve lensin çıkarılmasıyla arka göz kapaklarının diseksiyonu, tutulan iris veya kornea malzemesinden (eksik diseksiyon) değişkenlik veya normal arka göz kabı bölgesine (aşırı diseksiyon) artan lazer yaralanması yaratabilir. Kontrol unlasered ve lazerli gözler arasındaki karşılaştırmamız, retinochoridal yaralanma nedeniyle mononükleer fagositlerin sızmasını algılar. Sistemik hastalıkların göz üzerindeki etkilerinin yani üveit ve diyabetin analizi için bireysel oküler alt ünite analizi şarttır. Protokolün bölüm 2'sinde sindirim yöntemi en kritik olanıdır, bölüm 3 - 5'teki diğer adımlar birden fazla doku tipinde başarıyla kullanılmıştır24. Sindirim koşullarımıza, içeren yinelemeli bir yöntemle ulaştık: (1) kimyasal sindirim yönteminin (Kollajenaz D vs sindirim enzimi), (2) kimyasal sindirim uzunluğunun belirlenmesi (30, 60 ve 90 dakika) ve (3) mekanik sindirim ilavesi (hiçbiri, bir kez, iki kez, üç kez). Her adımda sindirim koşullarının başarısını hücre canlılığı ve CD45HiCD64+ (makrofajlara sızan) hücrelerin sayısına göre değerlendirdik. Sindirim enziminin (bkz. Ek Malzeme Tablosu) Kollajenaz D'den daha fazla canlı hücre kurtardığını ve sindirim enzim konsantrasyonunun yarısının denenmesi makrofajların daha az sızmasına neden olduğunu bulduk. Daha sonra, mekanik sindirim ile 60 dakikalık kimyasal sindirim, sızan makrofaj popülasyonlarını neredeyse ikiye katladı. Üç mekanik sindirim, %25-30 canlı singlet hücreleri ve en çok sızan makrofaj popülasyonları ile optimaldi. Son olarak, daha hızlı mekanik sindirim koşulları hem canlı hücrelerin hem de makrofajların ciddi kaybına neden oldu.
Gelecekte, kornea, iris ve lensi çıkararak ve ardından retinayı ve arka göz kabını (sklera, koroid ve retina pigmentli epitel) ayrı ayrı sindirerek yöntemi genişletmeyi öneriyoruz. Bu modifikasyon ile sırasıyla lens ve korneanın proteinasöz ve yoğun özellikleri nedeniyle sindirim koşullarını azaltmayı bekliyoruz. Bu azalmalar arasında sindirim enzim konsantrasyonunun azalması, Kollajenaz'a geçilmesi, sindirim süresinin azalması veya mekanik sindirim miktarının azalması sayılabilir. Arka göz kabı için genel olarak daha az sindirim koşulları ve sadece retina için daha da azalmış sindirim koşulları bekliyoruz.
Gelecekteki ek talimatlar arasında geleneksel çok parametreli akış sitometri panelimizin geleneksel 6 lazer aletine veya spektral akış sitometrisine genişletilmesi yer almaktadır. Spektral akış sitometrisi, mevcut filtreler tarafından belirlenme yerine tüm spektrumda florofor tespitini sağlar. Spektral akış sitometrisi daha spesifik renk algılama ile sonuçlanır. Bununla birlikte, spektral akış sitometrisi, takip edilmesi gereken tamamen yeni bir dizi husus gerektirir ve bu makalenin kapsamı dışındadır. Daha fazla bilgi için, lütfen bu son JoVE makale28' e bakın. 6 lazer aleti, 6-9 dedektör ekleyen ultraviyole lazer içerir. Fare göz akışı sitometri paneline işaretleyiciler eklerken, daha fazla oküler hücre tipinin algılanmasını öneririz. Örneğin, Soyu kapısı nötrofilleri, eozinofilleri, mast hücrelerini, NK hücrelerini ve lenfositleri bağımsız olarak tespit etmek için ayrılabilir. Sabit durumdaki makrofajların az sayıda olması nedeniyle mononükleer fagositlerin alt küme algılamasının artırılması önerilmez. Yeni antikorlar eklerken, dikkatli antikor titrasyonu öneriyoruz.
Özetle, fare gözünde mononükleer fagosit popülasyonlarının tespiti için uyarlanabilir, sağlam bir yöntem sunduk. Monositlerin, dendritik hücrelerin, makrofajların ve mikrogliaların yüksek oranda örtüşen hücre yüzeyi belirteçleri nedeniyle, çok parametreli akış sitometrisi bu hücresel popülasyonları tespit etmek için en iyi yöntemdir. Akış sitometrisi, transkriptomik veya proteomik değerlendirme için hücre tiplerinin analizi, kader haritalaması ve/veya hücre sıralama için kullanılabilir. Başlıca sınırlaması doku mimarisi eksikliğidir ve temel bulgular geleneksel histoloji kullanılarak doğrulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
JAL, NIH hibesi K08EY030923 tarafından desteklendi; CMC, NIH Ulusal Artrit ve Kas-İskelet Hastalıkları Enstitüsü'nden K01 hibesi (5K01AR060169) ve Lupus Araştırma Birliği'nden Yeni Araştırma Hibesi (637405) ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
