Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En rørledning ved hjelp av bilateral in utero elektroporasjon for å avhøre genetiske påvirkninger på gnageratferd

doi: 10.3791/61350 Published: May 21, 2020

Summary

Rollen til nylig oppdagede sykdomsrelaterte gener i patogenesen av nevropsykiatriske lidelser forblir uklar. En modifisert bilateral in utero elektroporasjonsteknikk gjør det mulig for genoverføring i store populasjoner av nevroner og undersøkelse av de forårsakende effektene av genuttrykksendringer på sosial atferd.

Abstract

Som genom-wide association studier kaste lys over heterogen genetiske grunnlaget for mange nevrologiske sykdommer, behovet for å studere bidraget fra bestemte gener til hjernens utvikling og funksjon øker. Stole på musemodeller for å studere rollen til spesifikke genetiske manipulasjoner er ikke alltid mulig siden transgene muselinjer er ganske kostbare og mange nye sykdomsrelaterte gener ennå ikke har kommersielt tilgjengelige genetiske linjer. I tillegg kan det ta år med utvikling og validering for å opprette en muselinje. In utero elektroporasjon tilbyr en relativt rask og enkel metode for å manipulere genuttrykk på en celle-type spesifikk måte in vivo som bare krever å utvikle et DNA plasmid for å oppnå en bestemt genetisk manipulasjon. Bilateral in utero elektroporasjon kan brukes til å målrette mot store populasjoner av frontal cortex pyramidale nevroner. Ved å kombinere denne genoverføringsmetoden med atferdstilnærminger kan man studere effekten av genetiske manipulasjoner på funksjonen til prefrontale cortex-nettverk og den sosiale oppførselen til unge og voksne mus.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Genome-wide association studier (GWAS) har drevet oppdagelsen av nye kandidat gener som er forbundet med hjernenpatologier 1,2,3,4. Disse studiene har vært spesielt gunstige i å forstå ødeleggende nevropsykiatriske lidelser som schizofreni (SCZ), hvor undersøkelsen av nye gener har fungert som et utgangspunkt for nye linjer med forskning og terapeutisk intervensjon5,6. Gener som skjuler risiko for SCZ viser partisk uttrykk i prefrontal cortex (PFC) under prenatal og tidlig postnatal utvikling, en region innblandet i patologien til flere nevropsykiatriskelidelser 7. I tillegg viser musemodeller av psykiatriske lidelser unormal aktivitet iPFC-nettverk 6,8,9. Disse resultatene tyder på at SZC-tilknyttede gener kan spille en rolle i utviklingskablingene i denne regionen. Videre undersøkelse ved hjelp av dyremodeller er nødvendig for å forstå bidraget fra disse kandidatgenene til etablering av forbindelser i PFC og for å avgjøre om disse genene har en årsaksrolle i patogenesen av nevropsykiatriske lidelser. Genetiske manipulasjonsteknikker hos mus som tillater studie av genuttrykksendringer på spesifikke nevronale kretser under prenatal og tidlig postnatal utvikling, er en lovende metode for å forstå de molekylære mekanismene som knytter genuttrykksendringer til PFC-dysfunksjon.

Genetiske muselinjer tilbyr en metode for å studere virkningen av bestemte gener på hjernens utvikling og funksjon. Imidlertid kan det være begrensende å stole på transgene mus, siden det ikke alltid er kommersielt tilgjengelige linjer for å undersøke effekten av spesifikke gener på å utvikle nevrale kretser. Videre kan det være ekstremt kostbart og tidkrevende å utvikle tilpassede muselinjer. Bruken av interseksjonelle genetiske manipulasjonsstrategier som kombinerer transgene mus med virale tilnærminger har revolusjonert forståelsenav hjernen 10,11,12. Til tross for mye fremgang, kommer virale strategier med visse begrensninger avhengig av virusvektortypen, inkludert begrensninger i emballasjekapasitet som kan begrense viraluttrykk13 og celletoksisitet forbundet med viraluttrykk14. Videre, under de fleste eksperimentelle forhold, krever robust genuttrykk ved hjelp av adeno-assosiert virus (AAVs) ca 2 til 4uker 15, noe som gjør rutinemessige virale strategier umulig å manipulere gener under tidlig postnatal utvikling.

In utero electroporation (IUE) er en alternativ tilnærming som muliggjør en rask og billig genoverføring16,17 som, kombinert med fluorescerende merking og farmakogenetiske eller optogenetiske tilnærminger, gir en kraftig plattform for å dissekere funksjonen til nevronale kretser. I tillegg, med utviklingen av CRISPR-Cas9 genom redigering gener kan overuttrykkes eller nøyaktig endres gjennom celle-type spesifikk knock-down eller knock-out av bestemte gener eller gjennom modulering av arrangører18,19. Genmanipulering tilnærminger ved hjelp av IUE er spesielt fordelaktig når effekten av gener på nevronale kretser må testes under smale utviklingsvinduer20. IUE er en allsidig teknikk og overuttrykk kan enkelt oppnås ved å sette inn et gen i en uttrykksvektor under en bestemt promotor. Ytterligere kontroll av genuttrykk kan oppnås ved å drive uttrykk ved hjelp av arrangører av forskjellige styrker eller bruke induknelige promotorer som er i stand til å kontrolleregenuttrykk 21,22. I tillegg tillater IUE målretting av celler innenfor bestemte kortikale lag, celletyper og hjerneområder, som ikke alltid er mulig ved hjelp av andre tilnærminger5,17. Nylige fremskritt i IUE-konfigurasjonen basert på bruk av tre elektroder, som genererer en mer effektiv elektrisk feltdistribusjon, har utvidet funksjonsrepertoaret til denne metoden og tillot forskere å målrette mot nye celletyper og øke effektiviteten, nøyaktigheten og antall celler som kan målrettes23,24. Denne teknikken ble nylig brukt til å bestemme årsaksrollen til komplementkomponenten 4A (C4A), et gen knyttet til SCZ, i PFC-funksjon og tidlig kognisjon5.

Presentert her er en eksperimentell rørledning som kombinerer genoverføringsmetoder for å målrette mot store populasjoner av ekstiatoriske nevroner i frontal cortex, inkludert PFC, med atferdsparadigmer som ikke bare gjør det mulig å studere celle- og kretsnivåendringer, men gjør det også mulig å overvåke atferd gjennom tidlig postnatal utvikling og voksen alder. Først beskrevet er en metode for bilateralt å transfisere store populasjoner av lag (L) 2/3 pyramidale nevroner i frontale kortikale regioner. Deretter er oppgaver for å analysere sosial atferd hos unge og voksne mus skissert. Celletellinger kan oppnås ved fullføring av atferdsoppgaver for å kvantifisere omfanget og plasseringen av celletransfeksjon. Videre kan antall celler som er transfisert, korreleres med atferdsdata for å avgjøre om et større antall trans infiserte celler fører til større perturbasjoner i atferd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle eksperimentelle protokoller ble utført i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for dyreforskning og ble godkjent av Boston University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. DNA-løsningspreparat

  1. Kjøp en kommersiell plasmid eller subclone et gen av interesse i plasmid med ønsket promotor. Her ble en plasmid som inneholder EGFP under CAG-arrangøren (pCAG-EGFP) brukt.
    MERK: Bestem ønsket promotor basert på uttrykksnivået som trengs. Generelt kan plasmider under CAG-arrangøren brukes til å oppnå høye nivåer av transgene, mens celletypespesifikke arrangører (f.eks. synapsin for nevroner) har en tendens til å være mindre aktive. Eksperimentereren bør empirisk bestemme de riktige uttrykksnivåene for hver plasmid.
  2. Forvandle bakterier og vokse bestander i bakterielle medier med riktig antibiotika.
    1. Fjern kompetente celler (DH5α celler) fra -80 °C og tin på is i 20 min.
    2. Bland 100 pg -100 ng av plasmid DNA med 30 μL av kompetente celler. Inkuber blandingen på is i 20 min.
    3. Utfør varmesjokk ved å inkubere i et 42 °C vannbad i 45 s og deretter returnere røret tilbake til is i 2 min.
    4. Tilsett 200 - 1000 μL LB-medier til de transformerte kompetente cellene og vokse i 45 min ved 37 °C på en ristende inkubator.
    5. Plate 200 μL av de transformerte cellene til en LB agar plate som inneholder riktig antibiotika og inkubere platen over natten ved 37 °C.
    6. Neste dag inkuber en bakteriell koloni i 200 ml LB kjøttkraft med riktig antibiotika ved 37 °C på en ristende inkubator over natten.
  3. Rens plasmid DNA ved hjelp av et maxiprep kit.
    1. Følg instruksjonene i det oppnådde maxiprep-settet. For elution trinn, ikke elute DNA inn i elution buffer. I stedet, elute DNA ved hjelp av enten 200 μL av sterile 1x PBS eller molekylær karakter vann.
    2. Sørg for at den endelige konsentrasjonen av DNA er større enn 1 μg/μL. Hvis plasmiden som inneholder genet av interesse ikke inneholder et reportergen, så også forberede en plasmid å samtidig transfekte med en reporter molekyl, for eksempel grønn fluorescerende protein (GFP), for å tillate visualisering av trans infiserte celler.
  4. Forbered DNA-løsningen for operasjonen ved å fortynne plasmid-DNA i 1x PBS til 1 μg/μL endelig konsentrasjon av hver plasmid. Tilsett raskt grønt fargestoff til DNA-løsningen til en endelig konsentrasjon på 0,1%. For bilaterale injeksjoner, klargjør 60 μL oppløsning per demning (for ca. 10 valper).
    MERK: Hvis plasmid ikke inneholder et reportergen, må det samarbeide med GFP. Co-elektroporasjon priser er vanligvis 95% eller høyere. I våre hender ble transinfeksjonseffektivitet ikke påvirket av samtidig transfeksjon. Alle elektroporerte plasmider skal fortynnes til 1 μg/μL.

2. Bestilling eller avl tidsbesparende-gravide mus

  1. Hvis du bestiller tidsbevisste drektige mus, må du bestille mus til å ankomme på embryonisk dag (E) 13 eller tidligere for å gi demningene tilstrekkelig tid til å akklimatisere seg til dyrehus.  I denne protokollen brukes CD-1 utavlede mus til alle eksperimenter.
    MERK: Bestilling noen dager i forveien vil redusere dyrets stress og føre til en høyere overlevelsesrate hos valpene.
  2. Hvis avl tidsbesparet-gravid mus, par kvinnelige mus med en mann over natten, en gang i uken. Se etter tilstedeværelsen av en vaginal plugg neste morgen (E0.5). Bestem graviditeten ved å overvåke vekten av de kvinnelige musene.
    MERK: Ulike musestammer har forskjellige vektøkninger gjennom graviditet, så bestem typisk vektøkning for musestammen som brukes.
  3. Enten du bestiller eller avler musene, for å redusere stress av demningene, plasser en hekkepute og musehus i buret. Redusere stress kan bidra til å øke overlevelsesraten til valpene.

3. Design og montering av tre spisselektrode

  1. Bruk grade 2 titan ark med en tykkelse på 0,063 i som et lagermateriale for elektrodekontakter.
  2. Bruk standard maskineringsteknikker eller presisjonshåndverktøy, lag elektroder med følgende dimensjoner: 20 mm x 5 mm med avrundet spiss og rillet rygg. Fjern eventuelle grove kanter eller grader ved hjelp av fint grus sandpapir.
  3. For å koble elektrodekontaktene, pakk 22 G strandet kobbertråd rundt sporene på elektroden og fest ved lodde. Beskytt denne skjøten ved hjelp av varmekrymperør.
  4. Deretter fester du den tilkoblede elektroden til autoklaverbare, ikke-ledende tang ved hjelp av en ekstra varmekrymperør for å gjøre de to negative elektrodene. Fest enkeltpositiv elektrode til et autoklaverbart, ikke-ledende materiale (for eksempel et tannbørstehåndtak med et saget av hodet). Monter den åpne enden av ledningen med en standard bananplugg.

4. Forberedelse til kirurgi

  1. Ta med gravide dammer til operasjonsområdet minst 30 minutter før operasjonen for å tillate reduksjon i stressnivåer etter transport fra dyreanlegget.
  2. Steriliser hele operasjonsstedet ved hjelp av sterilisering av bakteriedrepende kluter og deretter 70% etanol. Bytt hansker før operasjonen begynner.
  3. Steriliser autoklaverede verktøy i en glassperlesterilisator.
  4. Overfør sterile 1x PBS (ca. 50 ml per demning) til 50 ml koniske rør og legg det i et rørstativ i vannbadet oppvarmet til 38-40 °C. Kontroller den sterile saltvannstemperaturen med et termometer.
  5. Slå på vannoppvarmingspumpen slik at den varmes opp til 37 °C før operasjonen starter. Dette vil opprettholde musens kroppstemperatur i løpet av operasjonen.
  6. Slå på trykkinjektoren og elektroporatoren og sørg for riktig funksjon før operasjonen.
  7. Spinn kort plasmid DNA-løsningen (oppnådd i trinn 1.4) på en bordplate sentrifuge og legg den på is.
  8. Trekk glasspipetter på en pipette avtrekker slik at tuppen av pipetten i trukket glass er ca. 50 μm i diameter.
  9. Fyll pipetten med 20-40 μL DNA-oppløsning (oppnådd i trinn 1.4).
  10. Sett opp alle nødvendige elementer for kirurgi, inkludert hår fjerne lotion, jod, 70% etanol, bomull swaps, øye salve, suturer, gasbind, etc.
  11. Forbered et operasjonsark og fyll ut nødvendig informasjon, for eksempel muse-ID og vekt, operasjonsdato, kirurgnavn, etc.

5. I utero elektroporasjon kirurgi

  1. Vei musen før operasjonen og noter dette på operasjonsarket.
  2. Bedøve en gravid mus (E16) ved innånding i et induksjonskammer med 4 % (v/v) oksygenisofluranblanding. Når musen er indusert, flytte til en maske innånding og opprettholde isofluran ved 1-1,5% (v / v) og overvåke puste gjennom hele operasjonen. Kontroller at musen er fullstendig bedøvet, bør pustehastigheten være ~ 55-65 åndedrag per min.
  3. Administrer preoperative analgeics: buprenorfin (3,25 mg/kg; SC) og meloksikam (1–5 mg/kg; SC) med et maksimalt volum på 10-30 ml/kg.
  4. Bruk hårfjerningskrem eller bruk forsiktig en barberhøvel for å fjerne pelsen fra magen. Steriliser magen ved å vattpinne med povidon-jod og 70% etanol og gjenta dette minst 3 ganger. Lag et sterilt felt rundt magen ved hjelp av en steril gasbind, steril drapering kan også brukes.
  5. Lag et midtlinjet snitt (3-4 cm) i bukhuden, sørg for å løfte huden opp med tang for å unngå å skjære gjennom muskelen. Deretter skjære gjennom muskelen, igjen tar vare på å løfte muskelen opp for å unngå å kutte vitale organer.
  6. Trekk livmorhornene forsiktig ut av demningen ved hjelp av ringtøyer og plasser dem forsiktig på det sterile feltet, og pass på at livmorhornet støttes med polstring og ikke rykker for langt unna demningen. Fra dette punktet, hold livmorhornet fuktet gjennom resten av operasjonen med den forvarmede sterile 1x PBS.
  7. Plasser et embryo ved hjelp av enten tang eller fingre. Sett forsiktig inn den trukket glasspipetten i en 45 graders vinkel med hensyn til det horisontale planet i hodet og satt inn i sideåpningen, som kan visuelt identifiseres mellom midtlinjen i hjernen og øyet. Injiser ca 2-3 μL i hver lateral ventrikkel ved enten å sette pipetten inn i den ene og deretter den andre ventrikkelen (anbefales) eller ved å injisere DNA-løsningen i en ventrikkel til den passerer inn i begge laterale ventriklene. Ventrikkelen har blitt målrettet hvis en halvmåneform er til stede etter injeksjon.
    MERK: Tuppen av glasspipetten kan brekke under operasjonen. Hvis dette skjer, skift ut glasspipetten, slik at livmorhornene holdes fuktet mens en ny pipette er forberedt og fylt med DNA-løsningen.
  8. For å transfect celler bilateralt i frontal cortex, plasser de to negative elektrodene på sidene av embryoene hodet like lateral og litt caudal til laterale ventriklene og plassere den positive elektroden mellom øynene, like foran den utviklende snuten.
  9. Sørg for at embryoet er sjenerøst fuktet. Påfør fire firkantede pulser (pulsvarighet = 50 ms varighet, pulsalitud = 36 V, interpulse intervall = 500 ms).
  10. Injiser og elektroporate alle embryoer, går en etter en slik at hvert embryo blir elektroporert umiddelbart etter DNA-injeksjonen. Når alle embryoer er elektroporert, sett forsiktig livmorhornene tilbake i bukhulen. I løpet av dette trinnet, belegge bukhulen i steril PBS (1x) for å hjelpe livmor horn plassering.
  11. Fyll bukhulen med steril 1x PBS slik at ingen luftlommer forblir etter at suturingen er fullført. Sutur muskelen med absorberbare suturer og huden med silke ikke-absorberbare suturer.
  12. La demningen komme seg helt ut i et oppvarmet kammer i minst 1 time. I de neste 48 timer, sjekk på demningene regelmessig. Etter hvert som demningen gjenoppretter fra anestesi og gjenvinner bevisstheten, vil den begynne å bevege seg og vispe.
  13. Administrer postoperative analgeics hvis dammer viser tegn på smerte, for eksempel balling kroppene opp og puste raskt. Administrer bare hvis det er tegn på smerte siden SC injeksjoner kan stresse ut demningene, men hvis det administreres til eksperimentell gruppe også administrere til kontrollgruppen, eller omvendt.

6. Analysere tidlig sosial atferd i en mors interaksjonsoppgave

MERK: Denne protokollen er tilpasset fra tidligere publikasjoner5,25. Utfør denne oppgaven etter at mus er født fra postnatal dag (P) 18-21.

  1. Maternal homing atferd i mors interaksjon I (MI1) oppgave.
    1. Kontroller at bursengetøy ikke endres i uken før oppgaven utføres.
    2. Få tak i eller bygg en åpen feltarena (OF) som enkelt kan rengjøres (akryl anbefales) med følgende dimensjoner: 50 x 50 x 30 cm (lengdebreddehøyde). Lysforholdene under utførelse av atferd kan variere avhengig av eksperimentelt spørsmål og kan påvirke nivåer av opphisselse og angstlignende oppførsel. Registrer atferdseksperimenter under et svakt lys (ca. 20 lux) plassert over midten av arenaen.
    3. I to dager før atferdstestingen akklimatiseres demningen til arenaen ved å plassere den under en nettingtrådkopp (for eksempel en blyantkopp) i et hjørne av arenaen i fem minutter per dag.
    4. På testdagen, som kan være fra P18-21, før mus har blitt avvent, rengjør arenaen grundig med sanitiseringsservietter og 70% etanol.
    5. Sett opp arenaen med to motsatte hjørner som begge inneholder rent sengetøy og ett hjørne som inneholder skittent reirsengetøy fra valpens hjemmebur.
    6. La hver valp utforske arenaen i 3 min, og plasser hver valp i det nøytrale, tomme hjørnet i starten.
      MERK: Ta opp virkemåten med et videokamera med 30 bps. Rengjør arenaen grundig mellom hver valp og skift ut det friske sengetøyet. Alternativ hvilket hjørne som er det friske kontra reirsenget som en kontroll for å unngå hjørnepreferanser av andre grunner (det vil si omgivelsesstøy eller lys). Hvis du kjører flere kull over P18-21 utviklingsvinduet, kjører du atferdseksperimenter samtidig mellom dager. Sørg også for at kontroll og eksperimentelle grupper kjøres parallelt i løpet av en gitt dag.
  2. Maternal sosial interaksjon i mors interaksjon II (MI2) oppgave
    1. Utfør denne oppgaven umiddelbart etter MI1-oppgaven.
    2. Sett opp arenaen slik at det ene hjørnet inneholder en tom nettingkopp og motstanderhjørnet inneholder demningen under en nettingtrådkopp. Hvis mus er i stand til å flytte koppen, veie koppen ned med en vekt som kan teipes til toppen av koppen for å forhindre bevegelse. Sett skittent reir sengetøy fra hjemme bur i et annet hjørne.
    3. Kjør MI2-oppgaven. Plasser valpen i det tomme hjørnet og registrer atferd i fem minutter ved 30 fps, slik at valpen kan utforske. Kjør hver valp separat og rengjør hele arenaen og nettingkoppene mellom hver valp grundig.

7. Analysere voksen sosial atferd oppgave

  1. Kjør voksen sosial atferd i de samme musene som ble kjørt i MI1- og MI2-oppgaven når de er voksne (P60-P70 eller eldre). Data samlet inn her ble gjort i en egen kohort.
  2. Håndter de voksne musene i 3 sammenhengende dager for å tillate habituation til eksperimentereren. Sørg for at bare eksperimenterere som har blitt kjent med musene kjører atferdseksperimenter, ideelt sett har samme person kjøre alle oppgaver.
  3. Habituate mus til OF arena i 3 dager i 5 min hver dag.
  4. Analyseatferd i en ny objektgjenkjenningsoppgave for å måle generell bevegelse og interesse for et nytt objekt. Dette vil tillate mer meningsfylt tolkning av sosial atferd hvis mus har et bestemt underskudd i sosiale interaksjoner.
    1. Plasser mus i arenaen i 5 min med et nytt objekt (lite plastleketinn med glatte, rensbare overflater) i ett hjørne av arenaen. Rengjør arenaen grundig mellom mus med 70% etanol.
    2. For ny objektgjenkjenning plasserer du det tidligere eksponerte "romanobjektet", som nå er kjent, i det ene hjørnet og plasserer et nytt romanobjekt i det motsatte hjørnet. For alle oppgaver, bytt hjørnene mellom forsøk som en kontroll.
    3. For ny sosial interaksjon, sørg for at de nye musene er alder, belastning og kjønnsmatchet og akklimatiseres til mesh wire cup i 2 sammenhengende dager i 5 min hver dag. For hver prøve, plasser en ny mus under en mesh wire kopp og i motsatt hjørne plassere en tom mesh wire cup. La musene utforske arenaen i 5 min mens du registrerer atferd. Rengjør arenaen og nettingtrådkoppene grundig mellom hver prøve.

8. Analysere atferdsdata

  1. Bruk DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) til å utføre grunnleggende kroppsdelsporing). Detaljerte notater om hvordan du installerer og bruker DeepLabCut finner du på gitHub-siden. Også tilgjengelig er et tilpasset python-basert bibliotek "dlc_utils" (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) for videre analyse av dataene etter at grunnleggende kroppsdeler sporing er fullført. Du finner mer informasjon om hvordan du bruker dette biblioteket på GitHub-siden.
    1. Installer DeepLabCut ved hjelp av anaconda installasjonsprosessen. Installer en GUI-kompatibel CPU-versjon av DeepLabCut samt GPU-aktivert versjon for opplæring av nettverket.
    2. Følg instruksjonene som er tilgjengelige i linken nedenfor for å opprette et prosjekt for sporing av kroppsdeler. Breifly, velg et utvalg av rammer fra datasettet ditt og merk de relevante kroppsdelene manuelt i disse samplede rammene. Tren DeepLabCut-nettverket til å forutsi kroppsdelene og kontrollere at det opplærte nettverket fungerer tilstrekkelig.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
    3. For å spore kroppsposisjon og identifisere enkle interaksjoner i et åpent felt, identifisere dyrets centroid, hodet (operasjonelt definert som midtpunktet mellom ørene), venstre og høyre ører samt snute og bunnen av halen. Å ha flere kroppsdeler sporet gir riktig erstatning når noen kroppsdeler mangler i rammen på grunn av okklusjon.
    4. Bortsett fra dyrekroppsdeler, spor en rekke punkter relatert til miljøet: for eksempel kantene på atferdsbokser. Disse gir mulighet for repeterbar estimering av slike punkter på tvers av flere økter - selv om plasseringen av atferdsoppsettet endres litt i forhold til kameraet mellom øktene.
    5. Når du har sporet kroppsdelene fra atferdsdataene, må du filtrere de forventede kroppsdelplasseringene basert på tilliten knyttet til forutsigelsen på hver bilde av videoen. Lav tillit spådommer er vanligvis forbundet med okkluderte kroppsdeler. For slike spådommer, erstatte en gitt kroppsdel med en annen (hvis en slik erstatning er hensiktsmessig) eller bruke plasseringen av andre kroppsdeler for å forutsi hvor den aktuelle kroppsdelen er sannsynlig å være. For de fleste åpne feltapplikasjoner er centroid av gnageres kropp sjelden okkludert og kan forutsies med høy nøyaktighet og presisjon.
    6. Bruk den forventede plasseringen av centroid samt plasseringen av de sporede punktene i miljøet for å estimere en rekke funksjoner i dyrets oppførsel. For eksempel, i det åpne feltdataene, kan tidsderivatet av stillingen brukes til å beregne dyrets hastighet.
  2. For å unngå skjevhet, utfør alle eksperimenter "blinde" med hensyn til den eksperimentelle gruppen når det er mulig, spesielt når det er noe subjektivt element i vurderingen av resultatene. Test for effekten av kjønnsforskjeller på de viktigste eksperimentelle resultatene ved pooling av data i mannlige og kvinnelige grupper. Alle statistiske tester er utformet for å teste like mange dyr mellom grupper.

9. Post hoc celle telling for å karakterisere omfanget av celle transfection

  1. Bestem antall celler som er transfisert per mus, siden ikke alle mus vil ha vellykket transinfeksjon, og det vil være variasjon i antall trans infiserte celler. En metode for å oppnå dette innebærer å telle antall trans infiserte nevroner i vekslende koronarseksjoner etterfulgt av en interpolering for å estimere det totale antallet trans infiserte celler. For dette, bilde og telle annenhver koronar seksjon (50 μm).
    1. Bruk transcardial perfusjoner med 4% PFA for å fikse vev og deretter dissekere hjernen. Etter kryobeskyttelse, seksjoner hjernen i koronale seksjoner ved 50 μm.
    2. For frontal cortex teller du celler innenfor +2,75 og + 1,35 mm fra Bregma. Disse koordinatene inneholder kortikale frontområder og inkluderer en del av somatosensorisk cortex (S1).  Ved hjelp av denne metoden var det ingen observerte trans infiserte celler i mer kaudale kortikale regioner eller subkortikale områder.
    3. Pass på å betegne venstre fra høyre halvkule, for eksempel merking en halvkule med et nålehull under snitting, og telle celler bilateralt. Bruk en automatisert celletellingsprogramvare eller telle celler manuelt, noe som bekrefter tilstedeværelsen av en cellekropp ved hjelp av DAPI.
  2. Når celletellinger er oppnådd, angir du en terskel for inkludering. For eksempel inkluderer bare mus som er bilateralt elektroporert i analyse. For videre analyse korrelerer antall celler som er infisert med atferdsmessige svar for å se om det er en tilknytning. Denne teknikken vil målrette mot flere hjerneområder, så det er nødvendig å gi informasjon om hvilke hjerneregioner som har blitt genetisk manipulert.
    MERK: Det er mulig at manipulering av visse gener kan endre nevronal migrasjon, spesifikasjon og/eller død. Sørg under celletelling at hjernens anatomi undersøkes og hver transfected neuron er innenfor laget som angivelig ble transfisert (det vil si L2/3). Brutto anatomiske målinger som kortikal tykkelse kan også kvantifiseres ved å måle avstanden fra pia til kortikal L6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vellykket utvikling og implementering av en spesialbygd elektropotør og tre spisselektrode.
For IE-er ble en billig spesialbygd elektroporator bygget basert på en tidligere beskrevet design27 (figur 1A og figur 2). En tre pinner elektrode blelaget 23,24 ved hjelp av plast tang med 2 negative elektroder festet til spissene på spissene og den positive elektroden ble festet til enden av en tannbørste håndtak (Figur 1B). Elektropotøren og tre spisselektroden ble testet for å sikre riktig funksjon. IUE ble utført ved å utsette livmorhornene, injisere plasmid DNA og elektroporating hvert embryo (figur 1C). De tre spisse elektroden kan holdes ganske enkelt i to hender som vist (Figur 1B, høyre), ved hjelp av spissene for å stabilisere embryoets hode. L2/3 PFC pyramidale somas og deres prosesser ble merket med GFP via IUE, og dermed bekrefter suksessen til genoverføringseksperimentet.

Rettet mot en stor populasjon av nevroner bilateralt i frontal cortex av mus.
Det totale antallet trans infiserte celler og fordelingen av trans infiserte nevroner kan kvantifiseres for både unge og voksne mus5. Ved hjelp av denne bilaterale IUE-metoden ble ca 4000-6000 L2/3 pyramidale nevroner transfisert med pCAG-GFP plasmid (figur 3A). I tillegg ble de fleste av disse cellene lokalisert til frontale kortikale regioner, inkludert frontal assosiasjonscortex, motorforeningsområder, prelimbic og infralimbic cortex og orbital og fremre cingulate cortex (figur 3B). Et representativt eksempel viser rostral-caudal fordelingen av trans infiserte nevroner i en voksen kontrollmus (P60, figur 3C) og fordelingen mellom halvkuler (figur 3D). Dette bekrefter evnen til bilaterale IUEer å målrette og genetisk merke store populasjoner av L2/3 pyramidale nevroner i frontal cortex.

Sosial oppførsel hos unge og voksne mus.
Den første delen av mors interaksjonsoppgave testet evnen til kontroll P18 trans infiserte mus (IUE med pCAG-GFP plasmid) for å finne reirsengetøy (mors interaksjon 1 [MI1]). Dette tester de sensoriske evnene til de unge musene. Kontrollmus brukte mer tid på å utforske reiret sitt enn å utforske friskt sengetøy. Dermed tyder disse musene, som forventet, intakte sensoriske evner og utforskende atferd (figur 4A og figur 3B). Den andre delen av oppgaven (MI2) utnytter tendensen til mus å være motivert til å samhandle med og være nær sin mor. I denne oppgaven tilbrakte valper mesteparten av sin tid i nærheten av sin mor mens de brukte betydelig mindre tid på å utforske den tomme koppen eller reirsengetøy (Figur 4C,D). Disse resultatene tyder på at IUE-kontrollmus viser normal homing atferd.

Voksne kontrollmus (P60) brukte omtrent 35% av tiden på å utforske et nytt objekt (total tid brukt i arenaen = 5 min, figur 5A,B). Når presentert med en ny og kjent objekt, voksne mus brukt mer tid på å utforske romanen objektet, noe som tyder intakt interesse for nyhet (Figur 5C, D). I omgjengelighetsoppgaven brukte kontrollen av voksne mus lignende mengder tid på å utforske en ny mus og tom kopp (figur 5E,F). Denne virkemåten ble automatisk sporet ved hjelp av den fritt tilgjengelige DeepLabCut-programvaren26. Eksempel videoer viser vellykket merking av ulike punkter på en mus, inkludert lemmer, centroid, hode og ører (Video 1). DeepLabCut ble brukt til å bestemme når musene var oppdrett ved å undersøke lengden på musens kropp, siden denne avstanden blir kortere når musen rygger (Video 2).

Figure 1
Figur 1: In utero elektroporasjon ved hjelp av en spesialbygd elektroporator og en tredelt elektrode. (A) Bilde av den spesialbygde elektropotøren (venstre) og frontpanelet (høyre). 1: Strømindikator. 2: Strømbryter. 3: Pulsindikator. 4: Bryter for testmodus.  5: Spenningsvelger. 6: Pulsbreddekontroll. 7: Elektrode (+). 8: Ekstern utløser (TTL).  9: Elektrode (-). (B) Bilde av den spesialbygde tredelte elektroden (venstre) og den anbefalte metoden for å holde den tredelte elektroden under IUE (høyre). (C)Venstre: Diagram som viser IUE-kirurgi utført i E16-demninger. Høyre: representativt 20X konfokalbilde av IUE med GFP rettet mot L2/3 mPFC. Gul stjerne: L2/3 GFP + nevroner. Skalalinje for venstre panel = 250 μm. Skalalinje for høyre panel = 75 μm. Tall og data tilpasset fra Comer et al., 20205. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kretsdiagram av den skreddersydde elektropotøren. Et diagram som viser den skreddersydde elektroporatorkretsen basert på tidligere beskrevne eksempler27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Rettet mot store populasjoner av L2/3 frontal cortex nevroner ved hjelp av IUE. (A)Totalt antall GFP + celler i juvenile kontroll mus. N = 15 mus. (B) Prosentandel av GFP+ celler per område hos voksne kontrollmus. N = 22 kontrollmus. (C) Representative seksjoner som viser rostro-caudal omfanget av trans infiserte celler i frontal cortex. Bilder i venstre paneler zoomes områder fra høyre paneler (rød firkant). Frontal forening cortex: FrA. Tilleggsmotorbarken: M2. Prelimbic cortex: PL. Infralimbic cortex: IL. Fremre cingulate cortex: ACC. Medial orbitofrontal cortex: MO. Ventral orbitofrontal cortex: VO. Lateral orbitofrontal cortex: LO. Fremre insulær cortex: AI. Frontal cortex område 3: Fr3.  Primær motorcortex: M1.  Primær somatosensorisk cortex: S1. Piriform cortex: Pir. Fremre olfaktorisk kjerne: AO. Caudate-putamen: Cpu. Svarte tall: Bregma koordinater. Skalalinje for venstre panel = 0,5 mm. Skalalinje for høyre panel = 1 mm. ± SEM. (D) Data som viser antall celler som er elektroporert på høyre kontra venstre halvkule i hver mus. Viser uktolerte celletall fra 14 voksne mus elektroporert med pCAG-GFP plasmid. Paret t-test. p = 0,4757.  Data tilpasset fra Comer et al., 20205. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Vurdering av sensoriske evner, utforskende atferd og tidlige sosiale interaksjoner hos unge trans infiserte mus. (A) Representativt eksempel på veien reist (svart spor) av en P18 kontroll valp i MI1 oppgave. Friske sengetøy hjørner (frisk 1 og 2, rosa) og reir sengetøy hjørne (grønn). (B) Kontrollvalper brukte mer tid på å utforske reirets sengetøy enn det friske sengetøyet i MI1-oppgaven. p < 0,001, ****p < 0,0001. Toveis ANOVA og Sidaks posttest. (C) Representativt eksempel på veien reist (svart spor) av en P18 kontroll valp i MI2 oppgave.  Dam's cup (dam: blå), Tom kopp (tom kopp: gul), Nest sengetøy hjørne (rede: grønn). (D) Kontrollvalper brukte mer tid på å samhandle med demningen enn med den tomme koppen eller reirsengetøyet. Toveis ANOVA og Sidaks posttest. p < 0,0001. N = 15 kontrollmus. Tall og data tilpasset fra Comer et al., 20205. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Vurdere sosiale interaksjoner hos voksne trans infiserte mus. (A) Representativt eksempel på veien som er reist (svart spor) av P60, kontrollerer voksen mus i oppgaven for ny objektinteraksjon. rosa hjørne = plassering av nytt objekt. (B) Kontroll mus brukte ca 35% av tiden utforske romanen objektet (5 min total tid). Prosent tid brukt i hjørnet med nytt objekt vist. (C) Representative eksempler på veien reist (svart spor) av en P60 kontroll voksen mus i romanen objektgjenkjenning oppgave. rosa hjørne: plassering av romanen objekt. grønt hjørne: plassering av kjent objekt. (D) Kontroll mus brukt mer tid på å utforske romanen objektet enn det kjente objektet. Diskrimineringsindeks (DI) vist; DI = ((tid med nytt objekt – tid med kjent objekt) / (tid med nytt objekt + tid med kjent objekt)). (E) Representative eksempler på veien reist (svart spor) av P60 kontroll voksen mus i omgjengelighet oppgave. rosa hjørne: plassering av romanen mus under mesh wire cup. grønt hjørne: plassering av tom nettingtrådkopp. (F) Kontroll mus brukt i gjennomsnitt lik tid på å utforske en tom kopp og en kopp som inneholder en ny mus. Grafen viser DI ((tid med ny mus – tid med tom kopp) / (tid med ny mus + tid med tom kopp)). Siden mus ikke var sosialt isolert før oppgaven, kan pådrivet for å samhandle med en ny mus ha blitt redusert. Det var imidlertid fortsatt utforskning av den nye musen. N = 22 kontrollmus. Tall og data tilpasset fra Comer et al., 20205. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Bruke DeepLabCut til automatisk å spore dyrs posisjon i atferdsoppgaver. En representativ video av en voksen mus i den sosiale interaksjonsoppgaven som er merket ved hjelp av DeepLabCut. Ulike deler av musen kan merkes som lemmer og hode. Ved hjelp av centroid er hensiktsmessig å spore plasseringen av dyret, men andre punkter kan brukes til å identifisere mer komplekse atferd, for eksempel grooming eller oppdrett. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 2: Bruke DeepLabCut til automatisk å spore oppving i atferdsoppgaver. En representativ video av en voksen mus i den sosiale interaksjonsoppgaven som er merket ved hjelp av DeepLabCut. Den røde pilen viser lengden på musen med pilen pekende mot musens hode. Lengden på pilen kan brukes til å bestemme med musen er oppdrett, siden lengden på musen, og pilen, blir mindre når musen rygger. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her er en rørledning beskrevet som kombinerer manipulering av nye gener av interesse for store populasjoner av frontale kortikale nevroner med atferdsanalyser hos mus. Videre gjør denne rørledningen det mulig for den langsgående studien av atferd hos de samme musene både under tidlig postnatal utvikling og i voksen alder. Denne teknikken omgår behovet for å stole på genetiske dyremodeller som kan være kostbare når det gjelder tid og utgifter. Styrken i denne protokollen er at den kan brukes til å studere nevroutviklings- og nevropsykiatriske lidelser som nyere GWAS har oppdaget nye genetiskeassosiasjoner 28,29. Selv om denne metoden gir celletypespesifikt transfection av ekstiatoriske nevroner, er en begrensning at det er mindre mulig å målrette mot andre hjernecelletyper som interneuroner eller glialceller. Flere studier tyder imidlertid på en modifisert tilnærming til å målrette mot andre hjernecelletyper30,31. I tillegg, ved å endre plasseringen av elektrodene i forhold til embryoets hode og endre tidspunktet for IUE, kan andre hjerneregioner bli bilateralt transfected, inkludert hippocampus, amygdala, lillehjernen og den visuelle, somatosensoriske og motorkortikoner24,32. I tillegg kan ulike kortikale lag målrettes ved å utføre IUE på ulike utviklingsstadier.

Selv om IUE kan ha en høy suksessrate, er det kritiske trinn og feilsøking av metoden som kreves til tider. Det er nødvendig at plasmider er nøye utformet og validert i cellelinjer. Som med all kloning må det tas hensyn til å sikre riktig genuttrykk som å bekrefte at sekvensen er i ramme. I tillegg bør effekten av genmanipulering (f.eks. overuttrykk eller deaktivering) bekreftes med tanke på at uttrykksnivåene kan variere på tvers av utviklingstidsforløpet for musen og utviklingsdatoen for IUE. Western blot og qPCR kan brukes til å bestemme omfanget av genetisk overuttrykk5. Det anbefales å co-elektroporate en reporter genet, for eksempel GFP, i en egen plasmid siden proteiner merket med GFP kan bli feilfoldet eller miste sin funksjon. Alternativt, hvis en reporter ikke brukes, kan eksperimentereren bruke in situ hybridisering, qPCR eller vestlig flekk for å bestemme uttrykksnivåer av genet av interesse5.

Hvis plasmider har blitt verifisert, men det ikke er noen dyr som synes å være positive for transinfeksjon, må du kontrollere alt utstyr grundig, spesielt elektropotøren, for å sikre riktig funksjon. Når du leverer spenningspulser til embryoer, bør livmorhornene fuktes godt med oppvarmet saltvann og elektrodene skal produsere bobler ved generering av spenningspulsen. Hvis det ikke er bobler når spenningen leveres, er det sannsynligvis et problem med elektroporatoren.  Alternativt kan det hende at cDNA ikke har blitt injisert riktig i ventrikkelen. Når cDNA injiseres riktig i side ventrikkelen, vil det raske grønne fargestoffet være synlig i form av en halvmåne. Til slutt er plasseringen av elektrodene viktig. Hvis elektrodene er plassert litt feil, kan det hende at cellene ikke blir transfisert i interesseområdet. Derfor, når du ser etter en vellykket transfection, lagre noen flere kaudale hjerneseksjoner for å se, om kanskje feil hjerneregion ble transfisert. Når denne metoden har blitt praktisert, kan en erfaren kirurg forvente å oppnå en suksessrate på nesten 90%. Denne protokollen kan endres for å målrette mot andre hjerneområder av interesse. For eksempel er det mulig å målrette de fleste kortikale regioner bilateralt og til og med visse subkortikale regioner, inkludert hippocampus23 . Det er også mulig å ytterligere redusere kostnadene ved å bygge en tilpasset elektroporator, som ble brukt i dataene som presenteresher 5,27.

Fremtidige studier kan benytte seg av denne metoden for å forstå rollen som nyoppdagede genkandidater i ulike nevrologiske sykdommer. Den presenterte rørledningen tilbyr en relativt rask analyse for å teste effekten av spesifikke genetiske manipulasjoner på tidlig postnatal utvikling og atferd i voksen alder. Fremtidig innsats ved hjelp av denne metoden har potensial til å oppdage hvilke gener som spiller en årsaksrolle i visse hjernesykdommer, inkludert SCZ og autismespekterforstyrrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Lisa Kretsge for kritiske tilbakemeldinger og redigering til manuskriptet. Vi takker alle forskningsassistenter i Cruz-Martín-laboratoriet som var uvurderlige for å hjelpe til med perfusjoner og celletelling av atferdshjerner. Vi takker Andrzej Cwetsch for innspill på utformingen av tripolarelektroden, og Todd Blute og Boston University Biology Imaging Core for bruk av det konfokale mikroskopet. Dette arbeidet ble støttet av en NARSAD Young Investigator Grant (AC-M, #27202), Brenton R. Lutz Award (ALC), I. Alden Macchi Award (ALC), NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DGE1633516) og Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (WWY). Funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
13mm Silk Black Braided Suture Havel's SB77D Suture skin
Adson Forceps F.S.T. 11006-12 IUE
C270 Webcam Logitech N/A Record behavior
Electroporator Custom-built N/A See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps Bio Basic Inc. BS466 Pladmid preparation
Fast Green FCF Sigma F7252-5G Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp F.S.T. 14060-09 IUE
Fisherbrand Gauze Sponges Fisher Scientific 1376152 IUE
Gaymar Heating/Cooling Braintree TP-700 Heating Pad
Glass pipette puller Sutter Instrument, P-97 IUE
Glass pipettes Sutter Instrument, BF150-117-10 IUE
Hair Removal Lotion Nair N/A Hair removal
Hartman Hemostats F.S.T. 13002-10 IUE
Open field maze- homemade acrylic arena Custom-built N/A 50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP Addgene 11150 Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III Parker Hannifin N/A pressure injector
Retractor - 2 Pronged Blunt F.S.T. 17023-13 IUE
Ring forceps F.S.T. 11103-09 IUE
Sterilizer, dry bead Sigma Z378569 sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY Havel's HJ398 Suture muscle
Water bath Cole-Parmer EW-12105-84 warming sterile saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8, (1), 144 (2018).
  2. Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511, (7510), 421-427 (2014).
  3. Howard, D. M., et al. Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions. Nature Neuroscience. 22, (3), 343-352 (2019).
  4. Grove, J., et al. Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nature Genetics. 51, (3), 431-444 (2019).
  5. Comer, A. L., et al. Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction. PLoS Biology. 18, (1), 3000604 (2020).
  6. Chini, M., et al. Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment. Neuron. 105, (1), 60-74 (2020).
  7. Clifton, N. E., et al. Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development. Translational Psychiatry. 9, (1), 74 (2019).
  8. Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness. European Journal of Neurosciences. 50, (6), 3072-3084 (2019).
  9. Batista-Brito, R., et al. Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits. Neuron. 95, (4), 884-895 (2017).
  10. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress. Neuron. 98, (2), 256-281 (2018).
  11. DeNardo, L., Luo, L. Genetic strategies to access activated neurons. Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).
  12. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).
  13. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Molecular Therapy. 18, (1), 80-86 (2010).
  14. Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses. Journal of Neurosciences. 35, (24), 8979-8985 (2015).
  15. Cruz-Martín, A., et al. A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex. Nature. 507, (7492), 358-361 (2014).
  16. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature Protocols. 1, (3), 1552-1558 (2006).
  17. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neurosciences. 30, (23), 7793-7803 (2010).
  18. Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering. Bioengineered. 7, (3), 166-174 (2016).
  19. Strecker, J., et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 365, (6448), 48-53 (2019).
  20. Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice. PLoS One. 7, (2), 32446 (2012).
  21. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. 19, Suppl 1 120-125 (2009).
  22. Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37 (2011).
  23. Szczurkowska, J., et al. Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe. Nature Protocols. 11, (3), 399-412 (2016).
  24. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
  25. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosciences. 17, (3), 400-406 (2014).
  26. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neurosciences. 21, (9), 1281-1289 (2018).
  27. Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Development Growth and Differentiation. 57, (5), 369-377 (2015).
  28. Li, Z., et al. Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia. Nature Genetics. 49, (11), 1576-1583 (2017).
  29. Ripke, S., et al. Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia. Nature Genetics. 45, (10), 1150-1159 (2013).
  30. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. Journal of Visualized Experiment. (90), e51518 (2014).
  31. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, (2), 151-158 (2005).
  32. Soma, M., et al. Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. Journal of Comparative Neurology. 513, (1), 113-128 (2009).
En rørledning ved hjelp av bilateral in utero elektroporasjon for å avhøre genetiske påvirkninger på gnageratferd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).More

Comer, A. L., Sriram, B., Yen, W. W., Cruz-Martín, A. A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior. J. Vis. Exp. (159), e61350, doi:10.3791/61350 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter